WO2008129103A1 - Empleo de la hemaglutinina del virus de la peste porcina africana como adyuvante - Google Patents

Empleo de la hemaglutinina del virus de la peste porcina africana como adyuvante Download PDF

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antigen
protein
fusion protein
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Jordi Marques Arguilaget
Eva Perez Martin
Natalia Fernandez-Borges
Fernando Rodriguez Gonzalez
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    • C12N2710/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates, in general, to the use of hemagglutinin (HA) of African swine fever virus (VPPA) as an adjuvant to enhance the immune response against an antigen in a subject.
  • HA hemagglutinin
  • VPPA African swine fever virus
  • the invention also relates to gene constructs that comprise, in whole or in part, the coding sequence of said viral hemagglutinin fused to the coding sequence of an antigen and its applications.
  • Vaccines are a successful and widely accepted method in the prevention and treatment of infectious diseases. They are effective and do not induce resistance against antibiotics of the target pathogen or affect the host's usual flora. In many cases, such as when antiviral immunity is induced, vaccines can prevent a disease for which there is no viable palliative curative treatment.
  • Vaccines work in a way that causes the immune system to trigger a response to an agent, or antigen, typically an infectious organism or a portion thereof that is introduced into the body in a non-infectious or pathogenic way. Once the immune system has been sensitized with said agent, a subsequent exposure in time to said organism results in a rapid and robust immune response that destroys the pathogen before it can multiply and infect enough cells in the host organism as to cause symptoms of the disease.
  • agent typically an infectious organism or a portion thereof that is introduced into the body in a non-infectious or pathogenic way.
  • the agent, or antigen, used to develop the immune response may be the microorganism that causes the disease in its complete form in a less infective state, known as an attenuated microorganism, or, in some cases, components of the organism (in the form of subunits) , such as carbohydrates, proteins or peptides that represent various structural components of the organism. Also, among the new technologies, it is worth noting the immunization with recombinant plasmids of transient expression or DNA vaccines.
  • DNA vaccines are based on immunization with a plasmid that contains the genetic information of one or more genes that encode immunogenic proteins of one or more specific pathogens, against which (or to whom) it is desired to induce a protective immune response in the subject vaccinated
  • Said plasmid acts as a vector that conveys the introduction of the genetic information of interest inside the host cells for its expression, processing and presentation to the immune system, in what would be an imitation of what happens during infection with the pathogen full.
  • the generated immune response, humoral or cellular prepares the vaccinated subject to counteract an infection with the pathogen, so that its use prophylactically constitutes a potential tool to apply, especially in those diseases that require both branches of the immune response, such as those caused by viruses.
  • DOTAP cationic liposome formulation
  • transporter molecules or “carriers” capable of specifically targeting the vaccine antigen to the antigen presenting cells (CPA), that is, to the "site” of induction of an immune response in the body, has several advantages over adjuvants.
  • Classics used so far. On the one hand, they reduce the toxicity by activating in a very specific, local and controlled way, only the cells that express the specific receptor that the transporter recognizes, being on the other hand those CPAs responsible for presenting the vaccine antigen to the immune system ( Lew AM, Brady BJ, Boyle BJ. Site-directed immune responses in DNA vaccines encoding ligand-antigen fusions.Vaccine. 2000 Feb 25; 18 (16): 1681-5.).
  • CTLA4 molecule as an adjuvant in DNA vaccination protocols, initially described in the late 1990s (Boyle JS, Brady JL, Lew AM. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998 Mar 26; 392 (6674): 408-11).
  • CTLA4 molecule to direct vaccine antigens to CPAs expressing their receptors (B7.1 and B7.2)
  • this T-cell surface antigen could have unwanted side effects, such as nonspecific blockade of The T response.
  • the invention relates to a new vaccine strategy that allows both the humoral response (antibodies) and the cellular response induced after vaccination to be enhanced.
  • the inventors have found, surprisingly, that hemagglutinin (HA) of African swine fever virus (VPPA) enhances the immune response against an antigen in a subject, both the humoral response and the cellular response induced after vaccination with an antigen , thus exerting an adjuvant effect when used in DNA vaccination.
  • This HA of the VPPA seems to have the ability to direct an antigen specifically to professional CPAs (macrophages and dendritic cells, mainly), which enhances the immune response against an antigen in a subject.
  • DNA vaccines have been developed by fusing a polynucleotide encoding a specific antigen and a polynucleotide encoding the soluble fraction of HA (sHA) of VPPA, and the immune response has been evaluated in pigs immunized with said DNA vaccines (Example 1), it being observed that, after immunization of pigs with said DNA vaccines, a high immune response against said antigen, much greater than that observed in control animals, which shows that the antibody response and the cellular response specifically directed against an antigen after DNA vaccination is enhanced if said antigen is fused to said HA of VPPA or a functionally equivalent variant thereof.
  • sHA soluble fraction of HA
  • the invention relates to a gene construct comprising (a) a polynucleotide (A) selected from (i) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the hemagglutinin (HA) of the plague virus African swine (VPPA); (ii) a functionally equivalent fragment of said polynucleotide defined in (i); and (iii) a functionally equivalent variant of said polynucleotide defined in (i) showing a minimum identity of 80% with respect to the HA coding sequence of the VPPA; and (b) a polynucleotide (B) comprising the nucleotide sequence encoding an antigen.
  • A a polynucleotide
  • A selected from (i) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the hemagglutinin (HA) of the plague virus African swine (VPPA); (ii) a functionally
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising said gene construct.
  • the invention relates to a fusion protein obtainable by expression of said gene construct or of the coding sequence contained in said vector.
  • the process for the production of said fusion protein constitutes an additional aspect of this invention.
  • the invention relates to a host cell containing said gene construct, said vector or said fusion protein.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of said gene construct, or said vector, or said fusion protein, or said host cell together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention relates to the use of said gene construct, or said vector, or said fusion protein, or said host cell in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease caused by an organism that expresses or contains said antigen.
  • the invention relates to a method for enhancing the immune response against an antigen that comprises administering to said subject said gene construct in which said polynucleotide (B) comprises the nucleotide sequence encoding said antigen, or a vector which comprises said gene construct, or a fusion protein such as the one mentioned previously comprising said antigen.
  • the invention relates to the use of the HA of the VPPA, or of a functionally equivalent fragment thereof, or of a functionally equivalent variant thereof that shows a minimum identity of 80% with respect to the sequence of HA amino acids of VPPA, as an adjuvant in the preparation of a pharmaceutical composition, such as a vaccine or immunotherapeutic composition comprising an antigen.
  • the invention relates to the use of the HA of the VPPA, or of a functionally equivalent fragment thereof, or of a functionally equivalent variant thereof that shows a minimum identity of 80% with respect to the sequence of HA amino acids of the VPPA, as an adjuvant in the elaboration of a composition to enhance the immune response against an antigen administered in conjunction with said potentiated composition of the immune response.
  • the invention relates to an antibody or fragment thereof that recognizes said fusion protein, to pharmaceutical compositions comprising said antibody or fragment thereof that recognizes said fusion protein, and to the use of said antibody or fragment of the which recognizes said fusion protein in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease caused by an organism containing the antigen present in said fusion protein.
  • the invention relates to an isolated immune system cell capable of recognizing said fusion protein, with pharmaceutical compositions comprising said immune system cell, and with the use of said immune system cell in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease caused by an organism that contains the antigen present in said fusion protein.
  • Figure 1 illustrates how cells expressing the VPPA HA are able to bind red blood cells forming a typical rosette image;
  • Figure 1 schematically shows the fusion strategy of the soluble fraction of HA (sHA) of VPPA into an antigen, paying special attention to the homology domains with the CD2 leukocyte surface antigen.
  • sHA soluble fraction of HA
  • Figure 2 schematically illustrates the basis of this invention, based on enhancing the immune response induced against an antigen by its fusion to the sHA fraction of the VPPA, taking advantage of its possible "targeting" ability to CPA.
  • Figure 3 schematically shows the fusion protein resulting from the fusion of (i) the VP54 p54 and p30 proteins that form the fusion protein identified as Chimera Protein or PQ in this description, and (ii) the sHA fraction of the
  • VPPA said p54 and ⁇ 30 proteins are two inrnunorelevant antigens of the VPPA which justifies the choice of said PQ as a vaccine antigen.
  • Figure 4 is a schematic representation of plasmid pCMV-PQ and the expressed product (PQ), that is, the fusion protein formed by the p54 and p30 proteins of VPPA.
  • Figure 5 is a schematic representation of plasmid pCMV-sHAPQ and the expressed product (sHAPQ), that is, the fusion protein resulting from the fusion of (i) proteins ⁇ 54 and ⁇ 30 of VPPA (PQ) and (ii) the sHA fraction of the VPPA.
  • sHAPQ expressed product
  • Figure 6 is a graph showing the results obtained by vaccinating pigs with different DNA vaccines (pCMV-PQ, pCMV-sHAPQ and pCMV), observing a high antibody response induced against the ⁇ 30 protein of VPPA when plasmid pCMV is used -sHAPQ.
  • the standard deviations within each group (8 pigs) are represented.
  • Figure 7 is a graph showing the results obtained by vaccinating pigs with different DNA vaccines (pCMV-PQ and pCMV-sHAPQ), showing a better cellular response induced against the p30 protein of VPPA when the plasmid pCMV-sHAPQ is used.
  • the standard deviations within each group (8 pigs) are represented.
  • the invention relates to a gene construct, hereinafter "gene construct of the invention", comprising: a) a polynucleotide (A) selected from: (i) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the hemagglutinin (HA) of African swine fever virus (VPPA); (ii) a functionally equivalent fragment of said polynucleotide defined in (i); and (iii) a functionally equivalent variant of said polynucleotide defined in (i) showing a minimum identity of 80% with respect to the HA coding sequence of the VPPA; and b) a polynucleotide (B) comprising the nucleotide sequence encoding an antigen.
  • the polynucleotide (A) comprises the nucleotide sequence encoding the
  • the polynucleotide (A) comprises, or is constituted by, the nucleotide sequence encoding the HA of the full length VPPA.
  • VPPA HA refers, in general, to a protein whose amino acid sequence comprises or is constituted by the amino acid sequence of the hemagglutinin (HA) of the VPPA and includes any HA of any strain or isolate of VPPA, independently of its origin; said protein (HA) is responsible for adhesion of erythrocytes to infected cells (Ruiz-Gonzalvo F & CoIl JM. Characterization of a soluble hemagglutinin induced in African swine fever virus-infected celia. Virology. 1993, 196 (2): 769 -77; Ruiz-Gonzalvo F et al. Functional and immunological properties of the baculovirus-expressed hemagglutinin of African swine fever virus. Virology, 1996, 218: 285-289).
  • the first two sequences of the VPPA HA were published almost simultaneously in 1994, corresponding to the sequences from (i) a Spanish isolate of the VPPA isolated in Badajoz in 1971, adapted to Vero cells (Rodr ⁇ guez JM et al. Afi ⁇ can swine fever virus encoded to CD2 homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infected cells. J Virol. 1993 Sep; 67 (9): 5312 -20) and (ii) a virulent African isolate (Borca MV et al. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption. Virology. 1994; 199 (2): 463-8) .
  • the HA has been sequenced from several hemadsorbent isolates (capable of binding to erythrocytes) whose sequences maintain a high degree of similarity, all characterized by having a series of extracellular domains with great homology to the CD2 lymphocyte surface antigen ( Borca et al., 1994, cited supra; Rodr ⁇ guez et al., 2004, cited supra.).
  • the present invention includes the use of any HA or functionally equivalent fragment of the HA of the VPPA regardless of its origin.
  • said HA of the VPPA is the HA of the isolated BA71 of the VPPA, whose amino acid sequence, full length (SEQ ID NO: 1), can be found in NCBI, accession number Ll 6864, together with the nucleotide sequence coding of said HA of the VPPA.
  • VPPA refers to the African swine fever virus (VPPA) and includes any strain of VPPA, regardless of its origin, for example, the Spanish strain Spain 75 (E75) , a highly virulent strain, the Spanish strain BA71, which corresponds to a VPPA strain isolated in Badajoz in 1971 and adapted to the stable Vero (V) monkey kidney cell line; said strain (BA71) is apatogenic and completely sequenced (accession number Ul 8466) (Yanez RJ et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology. 1995 Apr 1; 208 (l): 249-78 ), etc.
  • the polynucleotide (A) comprises, or is constituted by a functionally equivalent fragment of said polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA.
  • the expression "functionally equivalent fragment of said polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA" [or “functionally equivalent fragment of said polynucleotide defined in (i)", as indicated in the definition of the gene construct of the invention] refers to a fragment of a polynucleotide that comprises, or is constituted, by a nucleotide sequence encoding a functionally equivalent fragment of the VPPA HA.
  • the expression "functionally equivalent fragment of the HA of the VPPA” refers to a part or portion of the HA of the VPPA that retains the ability to direct or transport an antigen to which it is bound to a CPA or a sequence that is obtained from said HA of the VPPA by modifying a variable number of residues but also retaining the ability to direct or transport an antigen to which it is bound to a CPA.
  • This ability to transport the antigen to which it is bound to a CPA seems to be due to the existence in the HA of the VPPA of regions that have a high degree of homology to the binding domains of the CD2 surface leukocyte antigen to its receptors in CPA .
  • said functionally equivalent fragment contains the sequence between amino acids 21 and 204 of the HA of the VPPA, region of the HA of the VPPA substantially homologous (ie, having a high degree of identity) to the domain of binding of CD2 to its receptors in the CPAs (Borca et al., 2004, cited supra; Rodr ⁇ guez et al., 2004, cited supra).
  • the ability to transport the antigen to which said fragment is bound to a CPA and thus induce an immune response in animals can be determined by conventional methods such as the tests described in Example 1.
  • the functionally equivalent fragment of the HA of VPPA that maintains the ability to transport said antigen to a CPA is a peptide that comprises, or is constituted by the sequence between amino acids 21 and 204 of the HA of VPPA, referred to herein as "soluble fraction of hemagglutinin” (sHA) of the VPPA (SEQ ID NO: 2).
  • the polynucleotide (A) comprises or is constituted by a functionally equivalent variant of said polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA showing a minimum identity of 80% with respect to the coding sequence of the HA of the VPPA.
  • said functionally equivalent variant of said polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA showing a minimum identity of 80% with respect to the coding sequence of the HA of the VPPA encoding a variant of the HA of the VPPA which It is functionally equivalent to the HA of the VPPA.
  • the polynucleotide (A) comprises or is constituted by a functionally equivalent variant of said polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA showing at least 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96% or 98% identity at the level of the nucleotide sequence encoding the HA of the VPPA.
  • the polynucleotide (B) comprises the nucleotide sequence encoding an antigen.
  • antigen refers to a molecule, of a peptide or protein nature, capable of binding to an antibody or a T-cell receptor when presented by major histocompatibility complex (CMH) molecules. Therefore, said term includes any substance, of a peptide or protein nature, capable of being recognized by the immune system of a subject and / or capable of inducing in a subject a humoral immune response or a cellular immune response that leads to the activation of B and / or T lymphocytes when introduced into a subject, which may sometimes require that the antigen contain or be bound to a Th cell epitope.
  • An antigen may have one or more epitopes (B and T epitopes) .
  • said antigen may be: (a) a peptide or protein capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against an infectious disease;
  • a peptide or protein capable of (appropriate or designed to) induce an immune response in animals for example, humans and pets, including farm animals and pets
  • peptide or "protein”, as used in this description, includes post-translational modifications of the peptide or protein, for example, glycosylations, acetylations, phosphorylations and the like.
  • said antigen is a peptide or protein capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against an infectious disease, such as an infectious disease in animals caused by pathogenic microorganisms of animals, including humans, for example, viruses, bacteria, fungi, infectious parasites, pylons, etc., relevant in human or animal health.
  • infectious disease such as an infectious disease in animals caused by pathogenic microorganisms of animals, including humans, for example, viruses, bacteria, fungi, infectious parasites, pylons, etc., relevant in human or animal health.
  • the antigens expressed by the gene construct of the invention are recombinant products, identical or similar to the natural antigens of a microorganism, and capable of inducing a specific immune response for that microorganism.
  • infectious viruses found in animals include viruses of the families: Arteriviridae, Retro viridae, Picornaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxviriridaeviridaeviridae, Biroviridae, Biroviridaeidaviridaeviridaeviridae, Biroviridaeviridaeviridae, Birroviridae, Virus , Parvoviridae (parvo virus), Papovaviridae, Adeno viridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae, etc.
  • infectious viruses are pathogens of pigs, for example, African swine fever virus (VPPA), classical swine fever virus (VPPC), porcine parvovirus (PPV), reproductive and respiratory syndrome virus swine (PRRSV), Aujesky's disease virus (ADV), aged fever virus (FDMV), transmissible swine gastroenteritis virus (TGEV), porcine circovirus, etc., cattle cattle pathogens, such such as bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine rhinotrcheitis virus (IBRV), bluetongue virus (BTV), etc., rabbit pathogens, such as rabbit hemorrhagic disease virus ( RHDV), etc., bird pathogens, for example, avian infectious bursitis virus (IBDV) or Gumboro disease, avian pneumovirus, etc.
  • VPPA African swine fever virus
  • VPPC classical swine fever virus
  • PDV porcine parvovirus
  • PRRSV reproductive and respiratory syndrome virus s
  • bacteria include both Gram positive bacteria, eg, Pasteurella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Etc., and Gram negative bacteria, eg, Escherichia coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp., Etc. .
  • infectious bacteria include: Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumoplailia, Mycobacteria sp. (eg, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M.
  • infectious fungi include Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis and Candida albicans.
  • Infectious parasites include, by way of illustration, not limitation, protozoa, such as Plasmodium sp., Causing malaria, e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc., Leishmania sp., Causing lesihmaniasis, eg, L. major, L. donovani, L. infantum, L. braziliensis, L. panamensis, L Mexican, etc., Toxoplasma gondii, Schistosoma sp., etc., as well as parasitic nematodes, such as Dirofilaria immitis, etc.
  • protozoa such as Plasmodium sp.
  • Causing malaria e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc.
  • Leishmania sp. Causing lesihmaniasis, eg, L. major, L. donovani,
  • Prions, or prion proteins are acellular, pathogenic and transmissible particles, which produce diseases that affect the central nervous system (CNS), among which are transmissible spongiform encephalopathies.
  • CNS central nervous system
  • prion diseases in humans include classical Creutzeldt-Jakob disease (ECJ), Creutzeldt-Jakob disease variant (ECJ), Gertsmann-Straüssler-Scheinker disease, fatal familial insomnia , etc.
  • prion diseases in other animals bovine spongiform encephalopathy, ovine scrapie (scrapie), transmissible visions encephalopathy, feline spongiform encephalopathy, spongiform ungulate encephalopathy, chronic wear diseases (mules, deer, elk, etc.), etc.
  • said antigen is a peptide or protein capable of (appropriate or designed to) induce an immune response in animals, for example, humans and domestic animals, including farm animals and pets.
  • said antigen is a peptide or protein associated with a tumor or a cancer ("tumor marker") capable of (appropriate or designed to) induce an immune response against a tumor or cancerous cell, whereby the construction gene of the invention can be used in the treatment of cancers by stimulating an antigen specific immune response against a tumor antigen
  • cancers that could potentially be treated in accordance with the teachings of the present invention include biliary tract cancer, brain cancer, breast cancer, cervical cancer, choriocarcinoma, colon cancer, endometrial cancer, cancer esophagus, stomach cancer, intraepithelial neoplasms, lymphomas, liver cancer, lung cancer (eg, small cell and non-small cell lung cancer), melanoma, neuroblastomas, mouth cancer, ovarian cancer, pancreas cancer, Prostate cancer, rectal cancer, sarcomas, skin cancer, testicular cancer, thyroid cancer, and kidney cancer, as well as other carcinomas and
  • tumor antigens or antigenic determinants for the treatment of cancers can be performed by one skilled in the art in view of the state of the art [Renkvist et al., Immunol Cancer. Immunother 50: 3-15 (2001)], said antigens and antigenic determinants being included within the scope of the present invention.
  • antigens or antigenic determinants include: Her2 (breast cancer); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (malignant glioblastoma); CEA (medullary thyroid cancer); CD52 (leukemia); human melanoma gplOO protein; melanoma-A / MART-1 human melanoma protein; tyrosinase; NA17-A protein; MAGE-3 protein; p53 protein; HPV16E7 protein; and antigenic fragments of said peptides or proteins.
  • said antigen is a peptide or protein capable of
  • allergen refers to a peptide or protein to which a subject is sensitive and causes an immune reaction, for example, allergenic extracts of pollens, allergenic extracts of insects, allergenic extracts of food. or food products, components present in saliva, tweezers or stingers of insects that induce a sensitivity reaction in a subject, components present in plants that induce a sensitivity reaction in a subject, etc.
  • allergens include protein extracts from pollens, eg, from Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Sécale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, Chemismispopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, Olea Europea, Platanus sp., Cupressus sp., etc .; Protein extracts of insects, eg, from Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siró, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyr
  • said antigen is a peptide or protein capable of (appropriate or designed to) induce an improved response to a self-antigen.
  • auto-antigen refers to peptides or proteins encoded by the subject's DNA and products generated by proteins or RNA encoded by the subject's DNA. Examples of auto-antigens are described in WO 02/56905.
  • said antigen is a fragment of any of said previously defined peptides or proteins (a) - (e); in general, said fragment will include an antigenic domain of said peptides or proteins.
  • said antigen is a fusion protein comprising the p54 and ⁇ 30 proteins of VPPA.
  • the gene construct of the invention comprises a polynucleotide (A) and a polynucleotide (B).
  • Said polynucleotides (A) and (B) can be linked in any order.
  • the 3 'end of said polynucleotide (A) is attached to the 5' end of said polynucleotide (B), while, in another particular embodiment, the 5 'end of said polynucleotide (A) is attached to the 3 'end of said polynucleotide (B).
  • Both polynucleotides (A) and (B) can be linked directly or through a polynucleotide (C), which codes for a spacer peptide, between said polynucleotides (A) and (B).
  • a polynucleotide (C) which codes for a spacer peptide, between said polynucleotides (A) and (B).
  • spacer peptides could be from marker peptides against which there is a specific antibody that facilitates the monitoring of the expression of the fusion (eg c-myc), to any peptide that is artificially generated as a result of the fusion of the sequences specific to HA and the specific antigen.
  • the polynucleotide (B) it would be possible for the polynucleotide (B) to comprise the nucleotide sequences encoding two or more antigens (eg, arranged in tandem), in order to immunize the animal against different pathogens in the same immunization; and yes, in theory, and even that the polynucleotide (A) it was attached, at the 5 'end to a polynucleotide (B) and at the 3' end to another polynucleotide (B).
  • two or more antigens eg, arranged in tandem
  • the gene construct of the invention comprises the nucleotide sequence defined in SEQ ID NO: 5.
  • the gene construct of the invention can be obtained by employing techniques widely known in the state of the art [Sambrook et al. , "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989] and, if desired, can be inserted into an appropriate vector.
  • the invention relates to a vector, hereinafter "vector of the invention", which comprises a gene construct of the invention.
  • Said vector may be a storage, multiplication or expression vector, typically an expression vector, and, if desired, may be used to transform cells or organisms susceptible to being transformed by said vector.
  • Said cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the vector of the invention is a vector useful for transforming eukaryotic cells, e.g., animal cells, advantageously, mammalian cells.
  • the vector of the invention comprises a gene construct of the invention operatively linked to a sequence regulating the expression of said polynucleotides (A) and (B) [and, where appropriate, (C)] constituting this mode a "cassette" expression.
  • operably linked means that the protein encoded by said polynucleotides (A) and (B) [and, where appropriate, (C)], is expressed in the correct reading frame under the control of control or regulatory expression sequences.
  • Expression control or regulatory sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, the translation of a protein, and include promoter sequences, coding sequences for transcriptional regulators, ribosome binding sequences (RBS) and / or transcription terminator sequences.
  • said expression control sequence is functional in prokaryotic cells and organisms, for example, bacteria, etc.
  • said expression control sequence is functional in eukaryotic cells and organisms, for example, mammalian cells, mammalian cell lines, etc.
  • the vector of the invention further comprises a marker or gene encoding a motif or a phenotype that allows the selection and / or localization of cells or organisms transformed with said vector.
  • the vector of the invention is a plasma that, when introduced into a host cell, is integrated (or not) into the genome of said cell.
  • vectors from which the gene construct of the invention can be inserted include the pCMV vector marketed by Clontech.
  • Obtaining vector of the invention may be performed by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 VoI 1 -3].
  • the invention relates to a cell, eukaryotic or prokaryotic, comprising the gene construct of the invention or the vector of the invention.
  • said cell is a prokaryotic cell, e.g., a bacterial cell;
  • said cell is a eukaryotic cell, such as an animal cell, e.g., a mammalian cell.
  • the invention relates to a fusion protein, hereinafter "fusion protein of the invention", encoded by the coding sequence present in the gene construct of the invention. Therefore, said fusion protein of the invention comprises: a) a polypeptide (A ') selected from:
  • said polypeptide (A ') comprises, or is constituted by, the amino acid sequence of the complete HA of the VPPA; in a specific embodiment, said polypeptide (A ') comprises, or is constituted, by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponding to the amino acid sequence of the HA of the BA71 isolate of the VPPA.
  • said polypeptide (A ') comprises, or is constituted by, a functionally equivalent fragment of the HA of the VPPA, such as a region of the HA of the VPPA comprising the region homologous to the binding domains of CD2 a CPA;
  • said polypeptide (A ') comprises, or is constituted by, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 corresponding to the amino acid sequence of the sHA fraction of the VPPA.
  • said polypeptide (A ') comprises, or is constituted by, a functionally equivalent variant of said polypeptide comprising the amino acid sequence of the VPPA HA showing a minimum identity of 80% with respect to the sequence of HA amino acids of VPPA;
  • said polypeptide (A ') comprises a functionally equivalent variant of the HA of the VPPA which shows at least 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94 %, 96% or 98% identity at the level of the amino acid sequence of the VPPA HA.
  • Polypeptide (B ') comprises, or is constituted by, the amino acid sequence of an antigen; in particular, by the antigen encoded by polynucleotide (B) present in the gene construct of the invention. Therefore, in a particular embodiment, said polypeptide (B ') comprises, or is constituted, by the amino acid sequence of an antigen such as any of those previously defined in relation to the polynucleotide (B).
  • polypeptide (B ') is a fusion protein comprising the p54 and p30 proteins of the VPPA.
  • polypeptide of the invention has the sequence SEQ ID NO: 4.
  • Said polypeptides (A ') and (B') can be linked in any order.
  • the carboxyl terminal end of said polypeptide (A ') is attached to the amino terminal end of said polypeptide (B'), while, in another particular embodiment, the amino terminal end of said polypeptide (A ' ) is attached to the carboxyl terminus of said polypeptide (B ').
  • Both polypeptides (A ') and (B') can be linked directly or through a polypeptide (C), a spacer peptide, between said polypeptides (A ') and (B').
  • the fusion protein of the invention can be used for therapeutic purposes, eg, in the preparation of vaccines and immunotherapeutic compositions.
  • the invention relates to a host cell, hereinafter "host cell of the invention” containing the gene construct of the invention, or the vector of the invention, or the fusion protein of the invention.
  • Said host cell of the invention is capable of expressing the protein of the invention and can be obtained by transformation, transfection or infection with a vector of the invention, as previously mentioned, by conventional methods known to those skilled in the art [ Sambrok et al., 1989].
  • Suitable host cells include prokaryotic cells, yeasts or eukaryotic cells, more preferably, an antigen presenting cell (CPA).
  • CPA antigen presenting cell
  • Various expression systems can be used to express the fusion protein of the invention, for example, expression systems based on the cultivation of insect cells, mammalian cells, etc.
  • NS / 0 cells L cells, C 127, 3T3, Chinese hamster ovary (CHO) cells, human embryonic kidney cells (HEK-293) , HeLa and BHK; CV-I cells (ATCC CCL70) and COS-7 cells, both derived from monkey kidney, etc.
  • the host cell is an antigen presenting cell (CPA), in particular, a dendritic cell, a macrophage or a B cell, and, among the dendritic cells, preferably, Langerhans cells or follicular dendritic cells, of the medulla Bone or blood.
  • CPA antigen presenting cell
  • the invention relates to a method of producing the fusion protein of the invention.
  • the fusion protein of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example, by expressing the nucleotide sequence of the gene construct of the invention encoding said fusion protein in appropriate host cells.
  • the fusion protein of the invention can be obtained by a method comprising culturing a host cell of the invention, which comprises the gene construct of the invention or the vector of the invention, under appropriate conditions for the expression of said protein.
  • the fusion protein of the invention thus obtained can be isolated, and, optionally, purified, by conventional methods.
  • the fusion protein of the invention can be obtained by conventional methods of chemical synthesis of proteins known to those skilled in the art.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition, hereinafter "pharmaceutical composition of the invention", which comprises a therapeutically effective amount of a gene construct of the invention, or of a vector of the invention, or of a protein of fusion of the invention, or of a host cell of the invention, together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutical composition of the invention which comprises a therapeutically effective amount of a gene construct of the invention, or of a vector of the invention, or of a protein of fusion of the invention, or of a host cell of the invention, together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the invention will be presented in an appropriate pharmaceutical form of administration.
  • the pharmaceutical composition of the invention will include the pharmaceutically acceptable carriers and excipients necessary for the preparation of the pharmaceutical form of administration chosen.
  • the pharmaceutical form of administration of the active component (gene construct of the invention, vector of the invention, fusion protein of the invention or host cell of the invention) present in the pharmaceutical composition of the invention can vary within a wide range of possibilities. known to those skilled in the art, depending, among other factors, on the nature of said active component (nucleic acid, protein or cell) and on the route of administration chosen. In this sense, the pharmaceutical composition of the invention can be administered to a subject by any appropriate route of administration, e.g., oral, parenteral, etc.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a gene construct of the invention or a vector of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • said gene construct or vector of the invention can be administered in the form of a naked DNA (that is, simply diluted in a physiological solution), administered in any of its possible forms and using the most diverse inoculation pathways (reviewed on the website: www.dnavaccine.com).
  • the Gene construct of the invention will be included in a vector of the invention suitable for administration to a subject.
  • said vector of the invention may be a viral vector, for example, a vector based on a retrovirus, or an adenovirus, etc., or a non-viral vector, eg, a DNA-liposome complex, a DNA-polymer complex, a DNA-polymer-liposome complex, etc. [see “Nonviral Vectors for Gene Therapy", edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)].
  • Such vectors can be administered directly to the subject by conventional methods.
  • said vectors can be used to transform, transfect or infect cells, for example, mammalian cells, ex vivo, and subsequently implant them in the animal body to obtain the desired therapeutic effect.
  • said cells will be formulated in a suitable medium that does not adversely affect the viability of said cells.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a fusion protein of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated, by way of illustration, not limitation, in a pharmaceutical form of solid administration (eg, tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, etc.) or liquid (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) for oral, parenteral (eg, intramuscular, subcutaneous, intravenous, etc.) administration, etc.
  • pharmaceutically acceptable carriers and excipients appropriate for the pharmaceutical form of administration and route of administration chosen will be chosen.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a host cell of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the host cells of the invention can be administered to the subject to express the fusion protein directly on the subject itself.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises at least one active component, such as a gene construct of the invention, a vector of the invention, a host cell of the invention or a fusion protein of the invention, in a therapeutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of active component calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the active component and the therapeutic effect. to get.
  • the dose of active component to be administered to a subject will be a therapeutically effective amount and may vary within a wide range.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered one or more times a day for preventive or therapeutic purposes.
  • the dose of active component to be administered will depend on numerous factors, including the characteristics of the product to be administered, such as, for example, its activity and biological half-life, the concentration of the product in the pharmaceutical composition, the pharmaceutical form of elected administration, etc. For this reason, the doses mentioned in this invention should be considered only as guidelines for the person skilled in the art, and he must adjust the doses according to the variables mentioned above.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered one or more times a day, in a typical amount between 100 ⁇ g and 1,000 ⁇ g of vector / subject, preferably between 200 ⁇ g. and 800 ⁇ g vector / subject although variations may arise depending on the response of the individual subject to said pharmaceutical composition, as well as the type of the pharmaceutical formulation chosen and the period of time and interval in which such administration is performed.
  • the dose of pharmaceutical composition of the invention can be repeated, depending on the condition of the subject and its evolution, at intervals of time (days, weeks or months) that will have to be established in each case by the specialist.
  • the pharmaceutical composition of this invention will be administered, in general, from one to up to four doses of vaccine each day.
  • the term "subject” includes any animal that possesses an immune system, preferably mammals, for example, suidae (eg, pigs, etc.).
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used to treat any subject, in a particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is especially useful for treating swine (eg, pigs, etc.).
  • the invention relates to the use of a gene construct of the invention, or of a vector of the invention., Or of a fusion protein of the invention or of a host cell of the invention, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a disease caused by an organism that expresses or contains said antigen.
  • said gene construct of the invention, vector of the invention, host cell of the invention or fusion protein of the invention can be used in the elaboration of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention in suids of a disease. caused by a porcine pathogen that expresses or contains said antigen.
  • porcine pathogens have been previously included.
  • the fusion protein of the invention can be used to produce, by conventional methods known to those skilled in the art, antibodies that recognize said fusion protein of the invention.
  • Said antibodies, or fragments thereof capable of binding to said fusion protein of the invention may be useful for the prevention and / or treatment of a disease caused by an organism, eg, a pathogenic organism, which contains the antigen present in the fusion protein of the invention.
  • Said antibodies, or fragments thereof capable of binding to said fusion protein of the invention hereinafter antibody of the invention, constitute a further aspect of this invention.
  • said antibody recognizes a specific epitope of an antigen as previously mentioned.
  • the term "antibody” is intended to include both chimeric or recombinant antibodies as well as monoclonal antibodies and polyclonal antibodies or proteolytic fragments thereof, such as fragments, Fab or F (ab ') 2, etc.
  • the DNA encoding the variable region of the antibody can be inserted into other antibodies to thereby produce chimeric antibodies.
  • Single chain antibodies scFv
  • Single chain antibodies can be polypeptides composed of single chains that possess the capacity of an antigen binding antibody and that comprise a couple of sequences of amino acids homologous or analogous to the variable regions of the light and heavy chains of an immunoglobulins (VH-VL or scFv junction).
  • Polypeptides analogous to the variable regions of the light and heavy chains of an antibody can be linked, if desired, through a binding polypeptide. Methods for the production of antibodies are widely known to those skilled in the art and are collected in the state of the art.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody of the invention. Also, in another aspect, the invention relates to the use of an antibody of the invention, which recognizes a fusion protein of the invention, in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease caused by a disease. organism containing said antigen present in said fusion protein.
  • the fusion protein of the invention can be used to produce immune system cells, such as B cells, T cells, dendritic cells, etc., that recognize said protein.
  • Said cells capable of recognizing said fusion protein of the invention isolated, hereinafter cells of the immune system of the invention, may be useful for the prevention and / or treatment of a disease caused by a pathogenic organism containing the present antigen. in the fusion protein of the invention and constitute an additional aspect of this invention.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a cell of the immune system of the invention.
  • the invention relates to the use of a cell of the immune system of the invention, such as a B cell, a T cell, a dendritic cell, etc., which recognizes a fusion protein of the invention, in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease caused by an organism containing said antigen present in said fusion protein.
  • a cell of the immune system of the invention such as a B cell, a T cell, a dendritic cell, etc.
  • the invention in another aspect, relates to a method of enhancing the immune response against an antigen comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a gene construct of the invention in which said polynucleotide (B) comprises the nucleotide sequence. encoding said antigen, or of a vector of the invention comprising said gene construct, or of a fusion protein of the invention comprising said antigen or of a host cell expressing the antigen.
  • the administration of said gene construction of the invention, or of said vector of the invention or of said fusion protein of the invention will be carried out in the form of a pharmaceutical composition, the characteristics of which have already been mentioned (pharmaceutical composition of the invention).
  • the experiments carried out by the inventors show that, after immunization of pigs with a gene construct encoding a fusion protein comprising the sHA fraction of the VPPA and a specific antigen, a high immune response is produced against said antigen, which is much greater than that observed in control animals.
  • the HA of the VPPA, or a functionally equivalent fragment thereof, such as the sHA fraction of the VPPA, capable of transporting the antigen to which it is bound to a CPA exerts an adjuvant effect on DNA vaccination when administered together with an antigen producing a potentiating or stimulating effect of the immune response in the subject after administration to said subject. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of the HA of the
  • VPPA or a functionally equivalent fragment thereof or a functionally equivalent variant thereof showing a minimum identity of 80% with the HA of the VPPA as an adjuvant in the preparation of a pharmaceutical composition, such as a vaccine or immunotherapeutic composition, which comprises an antigen.
  • the invention relates to the use of the HA of the VPPA or a functionally equivalent fragment thereof or of a functionally equivalent variant thereof showing a minimum identity of 80% with the HA of the VPPA in the preparation of a composition to enhance the immune response against an antigen administered in conjunction with said immune response enhancing composition.
  • a fusion protein comprising the amino acid sequence of the p30 protein and the p54 protein of the African swine fever virus (VPPA) (SEQ ID NO: 3) is described. ).
  • the sequence corresponding to the p30 protein of the VPPA is included between amino acids 138 and 139 of the p54 protein and comprises from residue 139 to 341 of the chimeric protein, PQ maintaining both the antigenic and immunogenic properties of both VPPA proteins (Barderas MG , Rodr ⁇ guez F, Gomez- Puertas P, Aviles M, Beitia F, Alonso C, Escribano JM.
  • the DNA sequence encoding said PQ fusion protein (Barderas et al, 2001, cited supra) was cloned into the plasmid pCMV (Clontech), under the control of the immediately early promoter of human cytomegalovirus (CMV) to generate the plasmid pCMV-PQ, as shown in Figure 4.
  • Said plasmid pCMV-PQ is capable of expressing said PQ fusion protein, resulting from the fusion of the p30 and p54 proteins of VPPA.
  • the DNA fragment encoding said PQ was cloned into said vector (pCMV) as a fusion molecule with the DNA sequence encoding the soluble hemagglutinin fraction (sHA) of VPPA.
  • sHA soluble hemagglutinin fraction
  • two additional amino acids are introduced: arginine 185 and serine 186 (Arg 185 and Ser 136 in SEQ ID NO: 4). generating plasmid pCMV-sHAPQ ( Figure 5).
  • Said plasmid is capable of expressing said PQ protein (formed by the p30 and p54 proteins of the VPPA) as a fusion protein with the sHA fraction (identified as sHA-PQ in Figure 5) (SEQ ID NO: 4).
  • the DNA fragment encoding the sHA fraction of the VPPA was obtained by polymerase chain reaction using the primers: Up HA Not I 5'-GCGGCCGCCATGTGGAGTACTTTAAATCAAAC-S 'Down HA Eagl 5'-CGGCCGAGATCTTGTGGATAAATAATTTTG-SG-STT-G the DNA of the VPPA BA71 isolate as the reaction template.
  • the PCR reaction consisted of 30 cycles each consisting of reaction within 30 seconds of denaturation at 95 0 C, followed by 1 minute annealing at 55 0 C and 2 minutes extension at 72 0 C.
  • the amplification product corresponding to the ORF of the VPHA sHA fraction was subcloned into the pGEMT-easy vector (Promega) and, after digestion with the restriction enzymes Eagl and Notl, allowed its purification and cloning at the single Notl site of the pCMV (Clontech) to obtain the vector pCMV-sHA.
  • Three groups of Large white / landrace pigs (8 pigs per group) were inoculated intramuscularly with each of the following plasmids: pCMV (control plasmid), pCMV-PQ and pCMV-sHAPQ. Up to 4 doses of vaccine spaced in 15 days were supplied by inoculating 600 ⁇ g (1.5 ml of physiological saline) of plasmid per pig (distributed between the muscles of the neck and hindquarters and subcutaneously in the ear).
  • the animals were bled before each dose of vaccine and 6 weeks after the last dose administered (time in which the memory response has already been established), to be able to measure, from the serum obtained, the antibodies specifically directed against the VPPA antigens. Said measurement can be carried out by conventional techniques, such as by an ELISA or by Western Blot. The results shown correspond to an assay in which the VPPA recombinant p30 protein expressed in virus virus was used as an antigen for cover the ELISA plates ( Figure 6) as described previously (Oviedo et al. 1997, J Virol Methods 64: 27-35).
  • the immune response when the construct is injected (pCMV-sHAPQ), which encodes the sHA-PQ fusion protein, is far superior to that produced when a plasmid encoding the PQ fusion protein is injected without the fraction sHA (pCMV-PQ) or with the control plasmid (pCMV).
  • the cellular response was measured in all pigs immunized with the control plasmid (pCMV) and with the plasmids pCMV-PQ and pCMV-sHAPQ , 6 weeks after the last dose of vaccine was given (to measure the memory T response), using the specific ELISPOT technique for interferon gamma (IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ interferon gamma

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Abstract

La invención se relaciona, en general, con el empleo de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) como adyuvante para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto. La invención proporciona una construcción génica que comprende la totalidad o parte de la secuencia codificante de dicha HA fusionada a la secuencia codificante de un antígeno. De aplicación en sanidad humana y animal.

Description

EMPLEO DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA
AFRICANA COMO ADYUVANTE
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con el empleo de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) como adyuvante para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto. La invención también se relaciona con construcciones génicas que comprenden, completa o parcialmente, la secuencia codificante de dicha hemaglutinina viral fusionada a la secuencia codificante de un antígeno y con sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las vacunas constituyen un método exitoso y ampliamente aceptado en la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas. Son efectivas y no inducen resistencia frente a antibióticos del patógeno diana o afectan a la flora habitual del hospedador. En muchos casos, tales como cuando se induce una inmunidad antiviral, las vacunas pueden prevenir una enfermedad para la que no existe un tratamiento curativo paliativo viable.
Las vacunas funcionan de manera que hacen que el sistema inmune desencadene una respuesta frente a un agente, o antígeno, típicamente un organismo infectivo o una porción del mismo que se introduce en el cuerpo en forma no infecciosa o patogénica. Una vez que se ha sensibilizado al sistema inmune con dicho agente, una exposición posterior en el tiempo a dicho organismo resulta en una respuesta inmune rápida y robusta que destruye al patógeno antes de que éste se pueda multiplicar e infectar suficientes células en el organismo hospedador como para causar síntomas de la enfermedad.
El agente, o antígeno, empleado para desarrollar la respuesta inmune puede ser el microorganismo que provoca la enfermedad en su forma completa en un estado menos infectivo, conocido como microorganismo atenuado, o, en algunos casos, componentes del organismo (en forma de subunidades), tales como hidratos de carbono, proteínas o péptidos que representan varios componentes estructurales del organismo. Asimismo, entre las nuevas tecnologías, merece la pena destacar la inmunización con plásmidos recombinantes de expresión transitoria o vacunas ADN. Las vacunas ADN se basan en la inmunización con un plásmido que contiene la información genética de uno o varios genes que codifican proteínas inmunogénicas de uno o más patógenos determinados, frente al que (o a los que) se desea inducir una respuesta inmune protectora en el sujeto vacunado. Dicho plásmido actúa como un vector que vehiculiza la introducción de la información genética de interés al interior de las células del hospedador para su expresión, procesamiento y presentación al sistema inmune, en lo que sería una imitación de lo que ocurre durante la infección con el patógeno completo. La respuesta inmune generada, humoral o celular, prepara al sujeto vacunado para contrarrestar una infección con el patógeno, de manera que su utilización de forma profiláctica constituye una potencial herramienta a aplicar, sobre todo en aquellas enfermedades que requieren ambas ramas de la respuesta inmune, tales como las causadas por virus.
Es conocido el empleo de monofosforil lípido A o saponina QS-21 como adyuvantes químicos en vacunación con ADN. Asimismo, se ha descrito el uso de una formulación de liposomas catiónicos (DOTAP) en vacunación con ADN (Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997, 78:1577-1580), observándose un efecto adyuvante cuando se administraba por vía oral, pero no cuando se administraba por vía intranasal. El DOTAP también se ha empleado en vacunas ADN que codifican la hemaglutinina del virus de la influenza, sin embargo, su administración inhibe la respuesta inmune. La utilización de moléculas transportadoras o "carriers" capaces de dirigir específicamente el antígeno vacunal a las células presentadoras de antígeno (CPA), es decir, al "sitio" de inducción de una respuesta inmune en el organismo, presenta varias ventajas respecto a los adyuvantes clásicos utilizados hasta ahora. Por un lado, reducen la toxicidad al activar de una manera muy específica, local y controlada, únicamente a las células que expresan el receptor específico que reconoce el transportador, siendo por otro lado esas CPA las encargadas de presentar el antígeno vacunal al sistema inmune (Lew AM, Brady BJ, Boyle BJ. Site-directed immune responses in DNA vaccines encoding ligand-antigen fusions.Vaccine. 2000 Feb 25; 18(16): 1681-5.). Un buen ejemplo del éxito de este tipo de estrategias proviene de la utilización de la molécula CTLA4 como adyuvante en protocolos de vacunación con ADN, descrito inicialmente a final de los 90 's (Boyle JS, Brady JL, Lew AM. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusión antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998 Mar 26; 392(6674) :408- 11). A pesar de que ha sido demostrada la eficacia de la molécula de CTLA4 para dirigir los antígenos vacunales a las CPA que expresan sus receptores (B7.1 y B7.2), la utilización de este antígeno de superficie de linfocitos T como transportador podría tener efectos secundarios no deseados, tales como el bloqueo inespecífico de la respuesta T. De hecho, la misma molécula que se utiliza en protocolos de vacunación con ADN como adyuvante y transportador de antígenos, se ha propuesto recientemente como inmunosupresor en protocolos de transplante (Li S, Salgar SK, Thanikachalam M, Murdock AD, Gammie JS, Demetris AJ, Zeevi A, Pham SM. CTLA4-Ig-based conditioning régimen to induce tolerance to cardiac allografts. J Surg Res. 2006 Dec; 136(2) :238-46. Epub 2006 Oct 13.), o para tratar procesos autoinmunes (Pollard LC. Inhibiting costimulatory activation of T cells: a viable treatment option for rheumatoid arthritis? Drugs. 2007; 67(1): 1-9.).
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevas moléculas transportadoras o "carriers" capaces de dirigir específicamente el antígeno vacunal a las CPA con el fin de potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con una nueva estrategia vacunal que permite potenciar tanto la respuesta humoral (anticuerpos) como la respuesta celular inducida tras la vacunación. Los inventores han encontrado, sorprendentemente, que la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) potencia la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto, tanto la respuesta humoral como la respuesta celular inducida tras la vacunación con un antígeno, ejerciendo, por tanto, un efecto adyuvante cuando se utiliza en vacunación con ADN. Dicha HA del VPPA parece tener la capacidad de dirigir un antígeno específicamente a las CPA profesionales (macrófagos y células dendríticas, principalmente), lo que potencia la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto. Aunque los inventores no desean estar vinculados por ninguna teoría, se cree que la capacidad de dicha HA del VPPA de dirigir antígenos específicamente a las CPA profesionales es debida a que dicha proteína presenta una elevada homología con el antígeno de superficie leucocitario CD2, el cual, como es conocido, tiene receptores en CPA.
En los ensayos realizados por los inventores se han desarrollado unas vacunas ADN fusionando un polinucleótido que codifica un antígeno determinado y un polinucleótido que codifica la fracción soluble de la HA (sHA) del VPPA, y se ha evaluado la respuesta inmune en cerdos inmunizados con dichas vacunas ADN (Ejemplo 1), observándose que, tras la inmunización de cerdos con dichas vacunas ADN, se produce una elevada respuesta inmune frente a dicho antígeno, mucho mayor que la observada en animales control, lo que pone de manifiesto que la respuesta de anticuerpos y la respuesta celular específicamente dirigida contra un antígeno tras la vacunación con ADN se potencia si dicho antígeno se fusiona a dicha HA de VPPA o a una variante funcionalmente equivalente de la misma.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende (a) un polinucleótido (A) seleccionado entre (i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA); (ii) un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i); y (iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA; y (b) un polinucleótido (B) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha construcción génica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible por expresión de dicha construcción génica o de la secuencia codificante contenida en dicho vector. El procedimiento para la producción de dicha proteína de fusión constituye un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora que contiene dicha construcción génica, dicho vector o dicha proteína de fusión. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha construcción génica, o de dicho vector, o de dicha proteína de fusión, o de dicha célula huésped junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha construcción génica, o de dicho vector, o de dicha proteína de fusión, o de dicha célula hospedadora en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que expresa o contiene dicho antígeno. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno que comprende administrar a un sujeto dicha construcción génica en la que dicho polinucleótido (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho antígeno, o un vector que comprende dicha construcción génica, o una proteína de fusión tal como la mencionada previamente que comprende dicho antígeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la HA del VPPA, o de un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA, como adyuvante en la elaboración de una composición farmacéutica, tal como una vacuna o composición inmunoterapéutica que comprende un antígeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la HA del VPPA, o de un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA, como adyuvante en la elaboración de una composición para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno administrado conjuntamente con dicha composición potenciadota de la respuesta inmune. En otro aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce dicha proteína de fusión, con composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce dicha proteína de fusión, y con el uso de dicho anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce dicha proteína de fusión en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula del sistema inmune aislada con capacidad para reconocer dicha proteína de fusión, con composiciones farmacéuticas que comprenden dicha célula del sistema inmune, y con el uso de dicha célula del sistema inmune en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 ilustra cómo las células que expresan la HA del VPPA son capaces de unir eritrocitos formando una típica imagen de roseta; además, muestra de forma esquemática la estrategia de fusión de la fracción soluble de la HA (sHA) del VPPA a un antígeno, prestando especial atención a los dominios de homología con el antígeno de superficie leucocitario CD2.
La Figura 2 ilustra esquemáticamente el fundamento de esta invención, basado en potenciar la respuesta inmune inducida contra un antígeno mediante su fusión a la fracción sHA del VPPA, aprovechando su posible capacidad "direccionadora" a las CPA.
La Figura 3 muestra esquemáticamente la proteína de fusión resultante de la fusión de (i) las proteínas p54 y p30 del VPPA que forman la proteína de fusión identificada como Proteína Quimera o PQ en esta descripción, y (ii) la fracción sHA del
VPPA; dichas proteínas p54 y ρ30 son dos antígenos inrnunorelevantes del VPPA lo que justifica la elección de dicha PQ como antígeno vacunal.
La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido pCMV-PQ y el producto expresado (PQ), es decir, la proteína de fusión formada por las proteínas p54 y p30 del VPPA.
La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido pCMV-sHAPQ y el producto expresado (sHAPQ), es decir, la proteína de fusión resultante de la fusión de (i) las proteínas ρ54 y ρ30 del VPPA (PQ) y (ii) la fracción sHA del VPPA.
La Figura 6 es una gráfica que muestra los resultados obtenidos al vacunar cerdos con distintas vacunas de ADN (pCMV-PQ, pCMV-sHAPQ y pCMV), observándose una elevada respuesta de anticuerpos inducida contra la proteína ρ30 del VPPA cuando se utiliza el plásmido pCMV-sHAPQ. Se representan las desviaciones estándar dentro de cada grupo (8 cerdos).
La Figura 7 es una gráfica que muestra los resultados obtenidos al vacunar cerdos con distintas vacunas de ADN (pCMV-PQ y pCMV-sHAPQ), observándose una mejor respuesta celular inducida contra la proteína p30 del VPPA cuando se utiliza el plásmido pCMV-sHAPQ. Se representan las desviaciones estándar dentro de cada grupo (8 cerdos). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica, en adelante "construcción génica de la invención", que comprende: a) un polinucleótido (A) seleccionado entre: (i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA); (ii) un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i); y (iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA; y b) un polinucleótido (B) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno. El polinucleótido (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la
HA del VPPA, o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA, o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA. En una realización particular, el polinucleótido (A) comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA, longitud completa.
El término "HA del VPPA" se refiere, en general, a una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina (HA) del VPPA e incluye cualquier HA de cualquier cepa o aislado de VPPA, independientemente de su procedencia; dicha proteína (HA) es la responsable de la adhesión de eritrocitos a células infectadas (Ruiz-Gonzalvo F & CoIl JM. Characterization of a soluble hemagglutinin induced in African swine fever virus- infected celia. Virology. 1993, 196(2): 769-77; Ruiz-Gonzalvo F et al. Functional and immunological properties of the baculovirus-expressed hemagglutinin of African swine fever virus. Virology, 1996, 218:285-289).
Las dos primeras secuencias de la HA del VPPA fueron publicadas casi simultáneamente en 1994, correspondiendo con las secuencias procedentes de (i) un aislado español del VPPA aislado en Badajoz en 1971, adaptado a células Vero (Rodríguez JM et al. Afiϊcan swine fever virus encodes a CD2 homolog responsible for the adhesión of erythrocytes to infected cells. J Virol. 1993 Sep; 67(9):5312-20) y de (ii) un aislado africano virulento (Borca MV et al. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption. Virology. 1994; 199(2):463-8). A partir de ese momento, se ha secuenciado la HA de varios aislados hemadsorbentes (capaces de unirse a eritrocitos) cuyas secuencias mantienen un alto grado de similitud, caracterizadas todas por poseer una serie de dominios extracelulares con gran homología al antígeno de superficie linfocitaria CD2 (Borca et al., 1994, citado supra; Rodríguez et al., 2004, citado supra.). Así pues, la presente invención incluye la utilización de cualquier HA o fragmento funcionalmente equivalente de la HA del VPPA independientemente de su procedencia. En una realización particular, dicha HA del VPPA es la HA del aislado BA71 del VPPA, cuya secuencia de aminoácidos, longitud completa (SEQ ID NO: 1), puede encontrarse en NCBI, número de acceso Ll 6864, junto con la secuencia de nucleótidos codificante de dicha HA del VPPA.
El término "VPPA", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al virus de la peste porcina africana (VPPA) e incluye cualquier cepa de VPPA, independientemente de su procedencia, por ejemplo, la cepa española España 75 (E75), una cepa altamente virulenta, la cepa española BA71, que corresponde a una cepa de VPPA aislada en Badajoz en 1971 y adaptada a la línea celular estable Vero (V) de riñon de mono; dicha cepa (BA71) es apatógena y está secuenciada completamente (número de acceso Ul 8466) (Yanez RJ et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology. 1995 Apr 1; 208(l):249-78), etc. En otra realización particular, el polinucleótido (A) comprende, o está constituido por un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA. Tal como aquí se utiliza, la expresión "fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA" [o "fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i)", tal como se indica en la definición de la construcción génica de la invención] se refiere a un fragmento de un polinucleótido que comprende, o está constituido, por una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento funcionalmente equivalente de la HA del VPPA. Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "fragmento funcionalmente equivalente de la HA del VPPA" se refiere a una parte o porción de la HA del VPPA que conserva la capacidad de dirigir o transportar un antígeno al que está unido a una CPA o a una secuencia que se obtiene a partir de dicha HA del VPPA mediante modificación de un número variable de residuos pero que también conserva la capacidad de dirigir o transportar un antígeno al que está unido a una CPA. Dicha capacidad para transportar el antígeno al que está unido a una CPA parece ser debida a la existencia en la HA del VPPA de unas regiones que presentan un alto grado de homología a los dominios de unión del antígeno leucocitario de superficie CD2 a sus receptores en CPA. Por tanto, en una realización particular, dicho fragmento funcionalmente equivalente contiene la secuencia comprendida entre los aminoácidos 21 y 204 de la HA del VPPA, región de la HA del VPPA sustancialmente homologa (es decir, que presenta un elevado grado de identidad) al dominio de unión de CD2 a sus receptores en las CPAs (Borca et al., 2004, citado supra; Rodríguez et al., 2004, citado supra). La capacidad para transportar el antígeno al que está unido dicho fragmento a una CPA y así inducir una respuesta inmune en animales se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo 1. En una realización particular, el fragmento funcionalmente equivalente de la HA de VPPA que mantiene la capacidad para transportar dicho antígeno a una CPA es un péptido que comprende, o está constituido por la secuencia comprendida entre los aminoácidos 21 y 204 de la HA del VPPA, denominado en esta descripción "fracción soluble de la hemaglutinina" (sHA) del VPPA (SEQ ID NO: 2).
En otra realización particular, el polinucleótido (A) comprende o está constituido por una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA. En general, dicha variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA codifica una variante de la HA del VPPA que es funcionalmente equivalente a la HA del VPPA.
En otra realización particular, el polinucleótido (A) comprende o está constituido por una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA que muestra, al menos, un 80%, 82% ,84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96% ó 98% de identidad a nivel de la secuencia de nucleótidos que codifica la HA del VPPA.
El polinucleótido (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno. El término "antígeno", tal como aquí se utiliza, se refiere a una molécula, de naturaleza peptídica o proteica, capaz de unirse a un anticuerpo o a un receptor de células T cuando es presentado por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Por tanto, dicho término incluye cualquier sustancia, de naturaleza peptídica o proteica, capaz de ser reconocida por el sistema inmune de un sujeto y/o capaz de inducir en un sujeto una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T cuando se introduce en un sujeto, lo que puede requerir que, en ocasiones, el antígeno contenga o esté unido a un epítopo de células Th. Un antígeno puede tener uno o más epí topos (epítopos B y T).
A modo ilustrativo, no limitativo, dicho antígeno puede ser: (a) un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a una enfermedad infecciosa;
(b) un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune en animales, por ejemplo, seres humanos y animales domésticos, incluyendo animales de granjas y mascotas; (c) un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a una célula cancerosa;
(d) un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a un alérgeno;
(e) un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta mejorada frente a un auto-antígeno; o
(f) un fragmento (p ej., un dominio) de cualquiera de dichos péptidos o proteínas (a)-(e).
El término "péptido" o "proteína", tal como se utiliza en esta descripción, incluye modificaciones post-traduccionales del péptido o proteína, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.
En una realización particular, dicho antígeno es un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad infecciosa en animales causada por microorganismos patógenos de animales, incluyendo el ser humano, por ejemplo, virus, bacterias, hongos, parásitos infecciosos, pilones, etc., relevantes en sanidad humana o animal. Los antígenos expresados por la construcción génica de la invención son productos recombinantes, idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo, y capaces de inducir una respuesta inmune específica para ese microorganismo.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de virus infecciosos encontrados en animales incluyen virus de las familias: Arteriviridae, Retro viridae, Picornaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae (parvo virus), Papovaviridae, Adeno viridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae, etc. Entre dichos virus infecciosos se encuentran patógenos de ganado porcino, por ejemplo, el virus de la peste porcina africana (VPPA), el virus de la peste porcina clásica (VPPC), el parvovirus porcino (PPV), el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), el virus de la enfermedad de Aujesky (ADV), el virus de la fiebre añosa (FDMV), el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV), el circovirus porcino, etc., patógenos de ganado bovino, tales como el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus de la rinotrqueitis bovina (IBRV), el virus de la lengua azul (BTV), etc., patógenos de conejos, tales como el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), etc., patógenos de aves, por ejemplo, el virus de la bursitis infecciosa aviar (IBDV) o enfermedad de Gumboro, el pneumovirus aviar, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de bacterias incluyen tanto bacterias Gram positivas, e.g., Pasteurella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., etc., como bacterias Gram negativas, e.g., Escherichia coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp., etc. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumoplailia, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogefaes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (sp. anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus aratracis, Corynebacteriumdiphtlzeriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfríngers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pyzeunaoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponemapallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinornyces israelli, Chlamydia, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de hongos infecciosos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans.
Entre los parásitos infecciosos se incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, protozoos, tales como Plasmodium sp., causantes de la malaria, e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc., Leishmania sp., causantes de lesihmaniasis, e.g., L. major, L. donovani, L. infantum, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, etc., Toxoplasma gondii, Schistosoma sp., etc., así como nematodos parásitos, tales como Dirofilaria immitis, etc. Los priones, o proteínas priónicas, son partículas acelulares, patógenas y transmisibles, que producen enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), entre las que se encuentran las encefalopatías espongiformes transmisibles. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades priónicas en seres humanos incluyen la enfermedad de Creutzeldt-Jakob (ECJ) clásica, la variante de la enfermedad de Creutzeldt-Jakob (ECJ), la enfermedad de Gertsmann-Straüssler-Scheinker, el insomnio familiar fatal, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades priónicas en otros animales la encefalopatía espongiforme bovina, la tembladera (scrapie) ovina, la encefalopatía transmisible de los visiones, la encefalopatía espongiforme felina, la encefalopatía espongiforme de ungulados, las enfermedades crónicas de desgaste (muías, ciervos, alces, etc.), etc.
En otra realización particular, dicho antígeno es un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune en animales, por ejemplo, seres humanos y animales domésticos, incluyendo animales de granjas y mascotas.
En otra realización particular, dicho antígeno es un péptido o proteína asociado a un tumor o a un cáncer ("marcador tumoral") capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a una célula tumoral o cancerosa, por lo que la construcción génica de la invención puede ser utilizada en el tratamiento de cánceres mediante la estimulación de una respuesta inmune específica de antígeno frente a un antígeno tumoral. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de cánceres que podrían ser potencialmente tratados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen cáncer del tracto biliar, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de estómago, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (e. g., cáncer de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas), melanoma, neuroblastomas, cáncer de boca, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de recto, sarcomas, cáncer de piel, cáncer de testículos, cáncer de tiroides, y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. La selección de antígenos tumorales o determinantes antigénicos para el tratamiento de cánceres puede ser realizada por un experto en la materia a la vista del estado de la técnica [Renkvist et al., Cáncer Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001)], estando dichos antígenos y determinantes antigénicos incluidos dentro del ámbito de la presente invención. Ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos incluyen: Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gplOO de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; y fragmentos antigénicos de dichos péptidos o proteínas. En otra realización particular, dicho antígeno es un péptido o proteína capaz de
(apropiado o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a un alérgeno.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alérgeno" se refiere a un péptido o proteína a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de alérgenos incluyen extractos proteicos de pólenes, e.g., de Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Sécale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, Artemisia vulgaris, Chenopodium álbum, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, Olea europea, Platanus sp., Cupressus sp., etc.; extractos proteicos de insectos, e.g., de Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siró, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, etc.; extractos proteicos de hongos o de epitelios animales, e.g., Penicillium sp., Alternaría alternata, Cladosporium herbarum, epitelio de perro, epitelio de gato, epitelio de caballo, etc.; extractos proteicos de alimentos o productos alimenticios, etc.
En otra realización particular, dicho antígeno es un péptido o proteína capaz de (apropiado o diseñado para) inducir una respuesta mejorada trente a un auto-antígeno. El término "auto-antígeno", tal como aquí se utiliza, se refiere a péptidos o proteínas codificados por el ADN del sujeto y productos generados por proteínas o RNA codificado por el ADN del sujeto. Ejemplos de auto-antígenos se describen en WO 02/56905.
En otra realización particular, dicho antígeno es un fragmento de cualquiera de dichos péptidos o proteínas (a)-(e) previamente definidos; en general, dicho fragmento incluirá un dominio antigénico de dichos péptidos o proteínas.
En otra realización particular, dicho antígeno es una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y ρ30 del VPPA.
La construcción génica de la invención comprende un polinucleótido (A) y un polinucleótido (B). Dichos polinucleótidos (A) y (B) pueden estar unidos en cualquier orden. Así, en una realización particular, el extremo 3' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 5' de dicho polinucleótido (B), mientras que, en otra realización particular, el extremo 5' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 3' de dicho polinucleótido (B). Ambos polinucleótidos (A) y (B) pueden estar unidos directamente o a través de un polinucleótido (C), que codifica para un péptido espaciador, entre dichos polinucleótidos (A) y (B). Ejemplos de péptidos espaciadores podrían ser desde péptidos marcadores frente a los cuales exista un anticuerpo específico que facilita el seguimiento de la expresión de la fusión (ej: c-myc), hasta cualquier péptido que se genere artificialmente como consecuencia de la fusión de las secuencias específicas de la HA y del antígeno concreto. En una realización particular, sería posible que el polinucleótido (B) comprendiera las secuencias de nucleótidos codificantes de dos o más antígenos (e.g., dispuestas en tándem), con el fin de inmunizar al animal frente a diferentes patógenos en una misma inmunización; y si, en teoría, e incluso que el polinucleótido (A) estuviera unido, por el extremo 5' a un polinucleótido (B) y por el extremo 3' a otro polinucleótido (B).
En una realización particular, la construcción génica de la invención comprende la secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO: 5. La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 1989] y, si se desea, puede ser insertada en un vector apropiado.
Por tanto, en otra realización particular, la invención se relaciona con un vector, en adelante "vector de Ia invención", que comprende una construcción génica de la invención. Dicho vector puede ser un vector de almacenamiento, multiplicación o expresión, típicamente, un vector de expresión, y, si se desea, puede ser utilizado para transformar células u organismos susceptibles de ser transformados por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. En una realización particular, el vector de la invención es un vector útil para transformar células eucariotas, e.g., células animales, ventajosamente, células de mamíferos.
En una realización particular, el vector de la invención comprende una construcción génica de la invención operativamente unida a una secuencia reguladora de la expresión de dichos polinucleótidos (A) y (B) [y, en su caso, (C)] constituyendo de este modo un "cassette" de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que la proteína codificada por dichos polinucleótidos (A) y (B) [y, en su caso, (C)], es expresada en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión. Las secuencias de control o reguladoras de expresión son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de una proteína, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. Aunque, en una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., ventajosamente, en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de mamífero, líneas celulares de mamífero, etc. Adicionalmente, si se desea, el vector de la invención comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o un fenotipo que permita la selección y/o localización de las células u organismos transformados con dicho vector.
En una realización particular, el vector de la invención es un plasmado que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra (o no) en el genoma de dicha célula. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de vectores de la en los que puede insertarse la construcción génica de la invención incluyen el vector pCMV comercializado por Clontech.
La obtención del vector de la invención puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3].
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula, eucariota o procariota, que comprende la construcción génica de la invención o el vector de la invención. En una realización particular, dicha célula es una célula procariota, e.g., una célula bacteriana; en otra realización particular, dicha célula es una célula eucariota, tal como una célula animal, e.g., una célula de mamífero.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión, en adelante "proteína de fusión de la invención", codificada por la secuencia codificante presente en la construcción génica de la invención. Por tanto, dicha proteína de fusión de la invención comprende: a) un polipéptido (A') seleccionado entre:
(i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA); (ii) un fragmento rancionalmente equivalente de dicho polipéptido definido en (i); y
(iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA; y b) un polipéptido (B') que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno.
En una realización particular, dicho polipéptido (A') comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos de la HA completa del VPPA; en una realización concreta, dicho polipéptido (A') comprende, o está constituido, por la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la HA del aislado BA71 del VPPA.
En otra realización particular, dicho polipéptido (A') comprende, o está constituido por, un fragmento funcionalmente equivalente de la HA del VPPA, tal como una región de la HA del VPPA que comprende la región homologa a los dominios de unión de CD2 a CPA; en una realización concreta, dicho polipéptido (A') comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la fracción sHA del VPPA.
En otra realización particular, dicho polipéptido (A') comprende, o está constituido por, una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA; en una realización concreta, dicho polipéptido (A') comprende una variante funcionalmente equivalente de la HA del VPPA que muestra, al menos, un 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96% ó 98% de identidad a nivel de la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA.
El polipéptido (B') comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos de un antígeno; en concreto, por el antígeno codificado por el polinucleótido (B) presente en la construcción génica de la invención. Por tanto, en una realización particular, dicho polipéptido (B') comprende, o está constituido, por la secuencia de aminoácidos de un antígeno tal como cualquiera de los definidos previamente en relación con el polinucleótido (B).
En una realización particular, el polipéptido (B') es una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y p30 del VPPA. En otra realización particular, el polipéptido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.
Dichos polipéptidos (A') y (B') pueden estar unidos en cualquier orden. Así, en una realización particular, el extremo carboxilo terminal de dicho polipéptido (A') está unido al extremo amino terminal de dicho polipéptido (B'), mientras que, en otra realización particular, el extremo amino terminal de dicho polipéptido (A') está unido al extremo carboxilo terminal de dicho polipéptido (B'). Ambos polipéptidos (A') y (B') pueden estar unidos directamente o a través de un polipéptido (C), un péptido espaciador, entre dichos polipéptidos (A') y (B'). La proteína de fusión de la invención puede ser utilizada con fines terapéuticos, e.g., en la elaboración de vacunas y composiciones inmunoterapéuticas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedador, en adelante "célula hospedadora de la invención" que contiene la construcción génica de la invención, o el vector de la invención, o la proteína de fusión de la invención. Dicha célula hospedadora de la invención es capaz de expresar la proteína de la invención y puede ser obtenida mediante transformación, transfección o infección con un vector de la invención, tal como se ha mencionado previamente, por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989]. Células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, levaduras o células eucariotas, más preferentemente, una célula presentadora de antígenos (CPA). Para expresar la proteína de fusión de la invención pueden utilizarse diversos sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas de expresión basados en el cultivo de células de insecto, células de mamíferos, etc. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas en células de insectos son bien conocidos en el estado de la técnica. Asimismo, algunos ejemplos de líneas celulares de mamíferos hospedadoras adecuadas incluyen pero no se limitan a células NS/0, células L, C 127, 3T3, células de ovario de hámster chino (CHO), células embrionarias humanas de riñon (HEK-293), HeLa y BHK; células CV-I (ATCC CCL70) y células COS-7, ambas derivadas de riñon de mono, etc. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígenos (CPA), en particular, una célula dendrítica, un macrófago o una célula B, y, entre las células dendríticas, preferentemente, las células de Langerhans o células dendríticas foliculares, de la médula ósea o sanguíneas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir la proteína de fusión de la invención. En una realización particular, la proteína de fusión de la invención puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión de la secuencia de nucleótidos de la construcción génica de la invención que codifica dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas. Así, la proteína de fusión de la invención se puede obtener mediante un procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora de la invención, que comprende la construcción génica de la invención o el vector de la invención, bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína. Si se desea, la proteína de fusión de la invención así obtenida puede ser aislada, y, opcionalmente, purificada, por métodos convencionales.
Alternativamente, la proteína de fusión de la invención puede ser obtenida por métodos convencionales de síntesis química de proteínas conocidos por los expertos en la materia. En una realización particular, podría ser conveniente o deseable que dicha proteína de fusión incluyera alguna secuencia peptídica que ayudara a su aislamiento o purificación (e.g., una cola de histidinas, un epítopo frente al que existan anticuerpos (p.ej., c-myc), etc.
En otro aspecto, la invención de relaciona con una composición farmacéutica, en adelante "composición farmacéutica de la invención", que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una construcción génica de la invención, o de un vector de la invención, o de una proteína de fusión de la invención, o de una célula hospedadora de la invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Para su administración a un sujeto, la composición farmacéutica de la invención se presentará en una forma farmacéutica de administración apropiada. Para ello, la composición farmacéutica de la invención incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración elegida. La forma farmacéutica de administración del componente activo (construcción génica de la invención, vector de la invención, proteína de fusión de la invención o célula hospedadora de la invención) presente en la composición farmacéutica de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo de posibilidades conocidas por los expertos en la materia, dependiendo, entre otros factores, de la naturaleza de dicho componente activo (ácido nucleico, proteína o célula) y de la vía de administración elegida. En este sentido, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada a un sujeto por cualquier vía de administración apropiada, e.g., oral, parenteral, etc.
En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una construcción génica de la invención o un vector de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En este caso, dicha construcción génica o vector de la invención puede ser administrada en forma de un ADN desnudo (es decir, simplemente diluido en una solución fisiológica), administrado en cualquiera de sus posibles formas y utilizando las más diversas vías de inoculación (revisadas en la página web: www.dnavaccine.com). En general, para su administración a un sujeto, la construcción génica de la invención estará incluida en un vector de la invención apropiado para su administración a un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho vector de la invención puede ser un vector viral, por ejemplo, un vector basado en un retrovirus, o en un adenovirus, etc., o un vector no viral, e.g., un complejo ADN- liposoma, un complejo ADN-polímero, un complejo ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores pueden ser administrados directamente al sujeto por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al sujeto receptor dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas células.
En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una proteína de fusión de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En este caso, la composición farmacéutica de la invención puede ser formulada, a modo ilustrativo no limitativo, en una forma farmacéutica de administración sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, grageas, granulos, supositorios, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) para su administración por vía oral, parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), etc. En cada caso se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de la proteína de fusión de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, Ia Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una célula hospedadora de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las células hospedadoras de la invención pueden ser administradas al sujeto para que expresen la proteína de fusión directamente sobre el propio sujeto. La composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, un componente activo, tal como una construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula hospedadora de la invención o una proteína de fusión de la invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva. Tal como aquí se utiliza, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de componente activo calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias del componente activo y el efecto terapéutico a conseguir. Por tanto, la dosis de componente activo a administrar a un sujeto será una cantidad terapéuticamente efectiva y puede variar dentro de un amplio intervalo. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos. La dosis de componente activo a administrar dependerá de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del producto a administrar, tales como, por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración del producto en la composición farmacéutica, la forma farmacéutica de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. A modo simplemente ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar una o más veces al día, en una cantidad típica comprendida entre 100 μg y 1.000 μg de vector/sujeto, preferentemente, entre 200 μg y 800 μg vector/sujeto aunque pueden surgir variaciones dependiendo de la respuesta del sujeto individual a dicha composición farmacéutica, así como del tipo de la formulación farmacéutica elegida y del periodo de tiempo e intervalo en el cual se efectúa tal administración. La dosis de composición farmacéutica de la invención puede ser repetida, dependiendo del estado del sujeto y su evolución, a intervalos de tiempo (días, semanas o meses) que tendrán que ser establecidos en cada caso por el especialista. A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, la composición farmacéutica de esta invención se administrará, en general, de una a hasta cuatro dosis de vacuna cada día. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "sujeto" incluye a cualquier animal que posee sistema inmunitario, preferentemente, mamíferos, por ejemplo, suidos (p. ej., cerdos, etc.). Aunque, en principio, la composición farmacéutica de la invención puede ser utilizado para tratar cualquier sujeto, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es especialmente útil para tratar suidos (e.g., cerdos, etc.).
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una construcción géniea de la invención, o de un vector de la invención., o de una proteína de fusión de la invención o de una célula hospedadora de la invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada por un organismo que expresa o contiene dicho antígeno. En una realización particular, dicha construcción génica de la invención, vector de la invención, célula hospedadora de la invención o proteína de fusión de la invención, pueden ser utilizados en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención en suidos de una enfermedad causada por un patógeno porcino que expresa o contiene dicho antígeno. Ejemplos ilustrativos de patógenos porcinos han sido incluidos previamente. La proteína de fusión de la invención puede ser utilizada para producir, mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, anticuerpos que reconocen dicha proteína de fusión de la invención. Dichos anticuerpos, o fragmentos de los mismos con capacidad para unirse a dicha proteína de fusión de la invención, pueden ser útiles para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo, p.ej., un organismo patógeno, que contiene el antígeno presente en la proteína de fusión de la invención. Dichos anticuerpos, o fragmentos de los mismos con capacidad para unirse a dicha proteína de fusión de la invención, en adelante anticuerpo de Ia invención, constituyen un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho anticuerpo reconoce un epítopo específico de un antígeno según se ha mencionado previamente.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "anticuerpo" pretende incluir tanto anticuerpos quiméricos o recombinantes como anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales o fragmentos proteolíticos de los mismos, tales como fragmentos, Fab or F(ab')2, etc. Además, el ADN que codifica para la región variable del anticuerpo puede insertarse en otros anticuerpos para producir de este modo anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos de cadena sencilla (scFv) pueden ser polipéptidos compuestos por cadenas sencillas que poseen la capacidad propia de un anticuerpo de unión a un antígeno y que comprenden un par de secuencias de aminoácidos homologas o análogas a las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulinas (unión VH-VL o scFv). Los polipéptidos análogos a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo pueden unirse, si se desea, a través de un polipéptido de unión. Métodos para la producción de anticuerpos son ampliamente conocidos por el experto en la materia y están recogidos en el estado de la técnica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención. Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo de la invención, que reconoce una proteína de fusión de la invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene dicho antígeno presente en dicha proteína de fusión.
Además, la proteína de fusión de la invención puede ser utilizada para producir células del sistema inmune, tales como células B, células T, células dendríticas, etc., que reconocen dicha proteína. Dichas células con capacidad para reconocer a dicha proteína de fusión de la invención, aisladas, en adelante células del sistema inmune de la invención, pueden ser útiles para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo patógeno que contiene el antígeno presente en la proteína de fusión de la invención y constituyen un aspecto adicional de esta invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una célula del sistema inmune de la invención. Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una célula del sistema inmune de la invención, tal como una célula B, una célula T, una célula dendrítica, etc., que reconoce una proteína de fusión de la invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene dicho antígeno presente en dicha proteína de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una construcción génica de la invención en la que dicho polinucleótido (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho antígeno, o de un vector de la invención que comprende dicha construcción génica, o de una proteína de fusión de la invención que comprende dicho antígeno o de una célula hospedadora que expresa el antígeno. La administración de dicha construcción génica de la invención, o de dicho vector de la invención o de dicha proteína de fusión de la invención se llevará a cabo en forma de una composición farmacéutica, cuyas características ya se han mencionado (composición farmacéutica de la invención).
Tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña la presente descripción, los experimentos llevados a cabo por los inventores ponen de manifiesto que, tras la inmunización de cerdos con una construcción génica que codifica una proteína de fusión que comprende la fracción sHA del VPPA y un antígeno específico, se produce una elevada respuesta inmune frente a dicho antígeno, que es mucho mayor que la observada en animales control. Así, la HA del VPPA, o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, tal como la fracción sHA del VPPA, con capacidad para transportar el antígeno al que está unido a una CPA, ejerce un efecto adyuvante en vacunación con ADN cuando se administra junto con un antígeno produciéndose un efecto potenciador o estimulador de la respuesta inmune en el sujeto tras su administración a dicho sujeto. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la HA del
VPPA o de un fragmento funcionalmente equivalente de la misma o de una variante funeionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con la HA del VPPA como adyuvante en la elaboración de una composición farmacéutica, tal como una vacuna o composición inmunoterapéutica, que comprende un antígeno.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la HA del VPPA o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con la HA del VPPA en la elaboración de una composición para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno administrado conjuntamente con dicha composición potenciadora de la respuesta inmune.
El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Construcción de los plásmidos pCMV-PO y pCMV-sHAPO e inmunización de cerdos con dichos plásmidos Construcción de los plásmidos pCMV-PO v pCMV-sHAPO
Se describe la obtención de una proteína de fusión, identificada genéricamente como Proteína Quimérica (PQ), que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína p30 y de la proteína p54 del virus de la peste porcina africana (VPPA) (SEQ ID NO: 3). La secuencia correspondiente a la proteína p30 del VPPA se incluye entre los aminoácidos 138 y 139 de la proteína p54 y comprende desde el residuo 139 al 341 de la proteína quimérica, manteniendo PQ tanto las propiedades antigénicas como inmunogénicas de ambas proteínas del VPPA (Barderas MG, Rodríguez F, Gomez- Puertas P, Aviles M, Beitia F, Alonso C, Escribano JM. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins. Arch Virol. 2001; 146(9):1681-91). Como consecuencia de la fusión de la sHA con PQ se produce la sustitución del aminoácido 138 de la p54 del VPPA, reemplazando la prolina por una treonina (Thr 138 en SEQ ID NO: 3).
Brevemente, la secuencia de ADN que codifica dicha proteína de fusión PQ (Barderas et al, 2001, citado supra) se clonó en el plásmido pCMV (Clontech), bajo el control del promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus (CMV) humano para generar el plásmido pCMV-PQ, tal como se muestra en la Figura 4. Dicho plásmido pCMV-PQ es capaz de expresar dicha proteína de fusión PQ, resultante de la fusión de las proteínas p30 y p54 de VPPA. Tras la digestión del plásmido de transferencia a baculovirus pBacpakp54/p30
(Barderas et al, 2001, citado supra) con la enzima de restricción BamHI, se obtuvo el fragmento de ADN correspondiente a la fase de lectura abierta que codifica la proteína de fusión PQ, flanqueada por extremos cohesivos compatibles para su ligación en el plásmido pCMVLII (modificado por Rodríguez et al. Journal of Virology, 2001, 75:10421-10430), así como en el plásmido pCMV-sHA (descrito a continuación).
Por otro lado, el fragmento de ADN que codifica dicha PQ se clonó en dicho vector (pCMV) como una molécula de fusión con la secuencia de ADN que codifica la fracción soluble de la hemaglutinina (sHA) de VPPA. Como consecuencia de la fusión de la sHA con PQ se introducen dos aminoácidos adicionales: arginina 185 y serina 186 (Arg 185 y Ser 136 en SEQ ID NO: 4). generando el plásmido pCMV-sHAPQ (Figura 5). Dicho plásmido es capaz de expresar dicha proteína PQ (formada por las proteínas p30 y p54 del VPPA) como proteína de fusión con la fracción sHA (identificada como sHA-PQ en la Figura 5) (SEQ ID NO: 4). Brevemente, el fragmento de ADN que codifica la fracción sHA del VPPA se obtuvo mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores: Up HA Not I 5'-GCGGCCGCCATGTGGAGTACTTTAAATCAAAC-S ' Down HA Eagl 5'-CGGCCGAGATCTTGTGGATAAATAATTTTG-S', y el ADN del aislado VPPA BA71 como molde de la reacción. La reacción de PCR consistió en 30 ciclos de reacción consistentes cada uno en 30 segundos de desnaturalización a 950C, seguidos de 1 minuto de anillamiento a 550C y 2 minutos de extensión a 720C.
El producto de amplificación correspondiente a la ORF de la fracción sHA de VPPA fue subclonado en el vector pGEMT-easy (Promega) y, tras su digestión con las enzimas de restricción Eagl y Notl, permitió su purificación y clonaje en el sitio único Notl del pCMV (Clontech) para obtener el vector pCMV-sHA.
Finalmente, el ADN que codifica la PQ, producto de la digestión del pBacpackp5/p30 (ver arriba), se clonó como molécula de fusión al ADN que codifica el fragmento fusionado a la fracción sHA tras la digestión del plásmido pCMV-sHA con BgIII, para obtener el plásmido final pCMV-sHAPQ (Figura 5), que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5, el cual es capaz de expresar la proteína de fusión sHA-PQ.
Inoculación de animales con las construcciones pCMV-PO y pCMV-sHAPQ
Se inocularon intramuscularmente 3 grupos de cerdos Large white/landrace (8 cerdos por grupo) con cada uno de los plásmidos siguientes: pCMV (plásmido control), pCMV-PQ y pCMV-sHAPQ. Se suministraron hasta 4 dosis de vacuna espaciadas en 15 días inoculando 600 μg (1,5 mi de solución salina fisiológica) de plásmido por cerdo (repartidos entre los músculos del cuello y de los cuartos traseros y subcutáneamente en la oreja).
Los animales se sangraron antes de cada dosis de vacuna y 6 semanas después de la última dosis administrada (tiempo en el que la respuesta de memoria ya se ha establecido), para poder medir, a partir del suero obtenido, los anticuerpos específicamente dirigidos contra los antígenos de VPPA. Dicha medida se puede realizar por técnicas convencionales, tales como mediante un ELISA o mediante un Western Blot. Los resultados mostrados corresponden a un ensayo en el que se utilizó la proteína p30 recombinante de VPPA expresada en báculo virus como antígeno para cubrir las placas de ELISA (Figura 6) según se ha descrito con anterioridad (Oviedo et al. 1997, J Virol Methods 64:27-35). Como se puede observar, la respuesta inmune cuando se inyecta la construcción (pCMV-sHAPQ), que codifica la proteína de fusión sHA-PQ, es muy superior a la producida cuando se inyecta un plásmido que codifica la proteína de fusión PQ sin la fracción sHA (pCMV-PQ) o con el plásmido control (pCMV).
Para estudiar la inducción de la respuesta celular (células T-CD4+ y células T- CD8+), se midió la respuesta celular en todos los cerdos inmunizados con el plásmido control (pCMV) y con los plásmidos pCMV-PQ y pCMV-sHAPQ, 6 semanas después de haber sido suministrada la última dosis de vacuna (para medir la respuesta T de memoria), usando para ello la técnica de ELISPOT específico para interferón gamma (IFN-γ). Esta metodología permite cuantificar el número de células T que específicamente secretan IFN-γ al reconocer un antígeno concreto (un péptido, una proteína, virus completo...), tras la vacunación con los distintos plásmidos. Así, a partir de una muestra de sangre completa se obtuvieron las células blancas (PBLs) independientemente de los eritrocitos, para, a continuación, ser cultivadas in vitro en placas de cultivo (Millipore) pre-tapizadas con un anticuerpo anti-IFN-γ, (Pharmingen), siguiendo protocolos convencionales (Immunological Methods 2006). Las células se crecieron durante 18 horas en presencia de la proteína p30 recombinante de VPPA (Figura 7) o en presencia de una proteína irrelevante (albúmina), control negativo. Finalmente, las células se retiraron y las placas se revelaron como si de un ELISA normal se tratara utilizando reactivos específicos de la casa comercial Pharmingen. Cada uno de los puntos observados tras el revelado (véase el inserto en la Figura 7) corresponde a una célula específica para el estímulo concreto.
Mejora de la respuesta inmune inducida tras la vacunación con ADN
En ninguno de los cerdos inmunizados con pCMV-PQ (plásmido que expresa las proteínas ρ30 y p54 fusionadas, es decir, PQ), se detecta una respuesta específica de anticuerpos frente a la proteína ρ30 de VPPA detectables por ELISA (Figura 6). Al igual que sucede para la respuesta de anticuerpos, ningún animal inmunizado con pCMV-PQ induce respuesta celular (Figura 7). A pesar de que esta misma construcción es inmunogénica en ratones (datos del laboratorio no publicados), no resulta funcional en el cerdo. A modo de resumen, los resultados obtenidos permiten efectuar los siguientes comentarios:
A) todos los animales inmunizados con pCMV-sHAPQ desarrollaron una elevada respuesta de anticuerpos específicos trente a la proteína antigénica p30 de VPPA (Figura 6); así pues, la respuesta de anticuerpos inducida tras la vacunación se potencia dirigiendo los antígenos del VPPA a las células presentadoras de antígeno (CPA) mediante su fusión a la sHA;
B) la respuesta de anticuerpos inducida por pCMV-sHAPQ llega a un plato tras la 3a dosis de vacunación, con lo que dosis adicionales de vacuna parecen no tener ningún efecto adicional (Figura 6); y
C) todos los cerdos vacunados con pCMV-sHAPQ desarrollaron una respuesta celular; todos los animales inmunizados con pCMV-sHAPQ desarrollaron una elevada respuesta de IFN-γ tras la estimulación con p30 de VPPA (Figura 7); así pues, la respuesta celular inducida tras la vacunación se potencia dirigiendo los antígenos del VPPA a las células presentadoras de antígeno mediante su fusión a la fracción sHA.
Tales resultados permiten concluir que la respuesta de anticuerpos y celular específicamente dirigida contra los antígenos del VPPA tras la vacunación con ADN se puede mejorar si éstos se fusionan a la fracción sHA del VPPA.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una construcción génica que comprende: c) un polinucleótido (A) seleccionado entre: (i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA); (ii) un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i); y (iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA; y d) un polinucleótido (B) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno.
2. Construcción génica según la reivindicación 1, en la que el extremo 3' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 5' de dicho polinucleótido (B).
3. Construcción génica según la reivindicación 1, en la que el extremo 5' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 3' de dicho polinucleótido (B).
4. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en la que dicho polinucleótido (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la fracción soluble de la hemaglutinina (sHA) del virus de la peste porcina africana (VPPA).
5. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.
6. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polinucleótido (B) codifica una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y p30 del VPPA.
7. Construcción génica según la reivindicación 6, en la que el polinucleótido (B) codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.
8. Construcción génica según la reivindicación 1, 4, 5, 6 ó 7, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.
9. Un vector que comprende una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una proteína de fusión obtenible por expresión de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9.
11. Una proteína de fusión que comprende: a) un polipéptido (A") seleccionado entre: (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA);
(ii) un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polipéptido definido en (i); y (iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA; y b) un polipéptido (B') que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno.
12. Proteína según la reivindicación 11, en la que el extremo carboxilo de dicho polipéptido (A) está unido al extremo amino de dicho polipéptido (B).
13. Proteína según la reivindicación 11, en la que el extremo amino de dicho polipéptido (A') está unido al extremo carboxilo de dicho polipéptido (B').
14. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicho polipéptido (A') comprende la fracción soluble de la hemaglutinina (sHA) del virus de la peste porcina africana (VPPA).
15. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que dicho polipéptido (A') comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
16. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en la que el polipéptido (B') es una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y p30 del VPPA.
17. Proteína según la reivindicación 16, en la que dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.
18. Una célula hospedadora que contiene una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector según la reivindicación 9, o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.
19. Una célula hospedadora según la reivindicación 18, en la que dicha célula es una célula presentadora de antígenos (CPA).
20. Método para producir una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que comprende introducir en una célula hospedadora una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un vector según la reivindicación 9, y recuperar la proteína de fusión del medio de cultivo o del interior de la célula hospedadora.
21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, o de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22. Uso de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, o de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada por un organismo que expresa o contiene dicho antígeno.
23. Uso de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA), o de un fragmento fimcionalmente equivalente de la misma, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA, como adyuvante en la elaboración de una composición farmacéutica.
24. Uso de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA), o de un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA, como adyuvante en la elaboración de una composición para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno administrado conjuntamente con dicha composición potenciadora de la respuesta inmune.
25. Un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.
26. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 25.
27. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 25, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión.
28. Una célula del sistema inmune, aislada, con capacidad para reconocer a una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.
29. Una composición farmacéutica que comprende una célula del sistema inmune según la reivindicación 28.
30. Uso de una célula del sistema inmune según la reivindicación 28, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión.
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