ES2908071T3 - Composición de vacuna y usos de la misma - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende: (i) un adyuvante, en el que el adyuvante es una emulsión de agua en aceite; y (ii) al menos un péptido de fusión conjugado con una proteína transportadora, en donde la proteína transportadora es la variante de la toxina diftérica CRM-197 (SEQ ID NO: 61) y en donde el al menos un péptido de fusión comprende dos o más epítopos de células B no contiguos de Her2/neu seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID Nos: 1-7.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de vacuna y usos de la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a una composición de vacuna que comprende fragmentos de la proteína Her2/neu relacionada con el cáncer, y esta composición para su uso en la prevención o el tratamiento de un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de la proteína Her2/neu.
Antecedentes
El antígeno tumoral Her2/neu, codificado por el protooncogén erbB2/neu, es una proteína de 185 kDa que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano. Consiste en un dominio extracelular rico en cisteína (ECD, por sus siglas en inglés, de los aminoácidos 23 a 652) con varios sitios de glicosilación, un dominio transmembranal hidrófobo (de los aminoácidos 653 a 675) y un dominio de tirosina quinasa intracelular (de los aminoácidos 676 a 1255). El receptor Her2/neu se expresa en la membrana celular de una variedad de tipos de células epiteliales y regula aspectos del crecimiento y la división celular mediante la unión de factores de crecimiento específicos.
Her2/neu se expresa en niveles bajos en muchas células normales, pero se expresa en exceso en una variedad de cánceres, incluidos los cánceres de mama, de ovario, del endometrio, gástrico, pancreático, de próstata y de glándulas salivares. Por ejemplo, se ha demostrado que aproximadamente el 30% de los cánceres de mama metastásicos sobreexpresan Her2/neu. Esta sobreexpresión se asocia a un mal pronóstico para la paciente con cáncer de mama, ya que se corresponde con una disminución de los periodos libres de recaídas y un tiempo de supervivencia acortado. Actualmente, las formas más comunes de tratar el cáncer de mama implican cirugía, intervención química y/o radioterapia. A no ser que el cáncer esté restringido a un área definida, la cirugía por sí sola no puede eliminar el cáncer. Además, el tratamiento con radiación y la quimioterapia pueden tener efectos secundarios negativos graves.
En vista de las desventajas asociadas con las terapias actuales, se han realizado tentativas para encontrar planteamientos adicionales para tratar trastornos proliferativos como el cáncer de mama, incluida la inmunoterapia.
Las implicaciones clínicas de la sobreexpresión de Her2/neu en tumores han convertido a Her2/neu en una diana atractiva para la inmunoterapia mediada por anticuerpos, solo o como complemento de la quimioterapia convencional. Por ejemplo, se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) 4D5 reduce el crecimiento de tumores que expresan Her2/neu en ratones mediante mecanismos directos e indirectos como la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) o la citotoxicidad dependiente de complemento, (CDC, por sus siglas en inglés). Con base en estos resultados, se probó una forma humanizada de este anticuerpo, trastuzumab (Herceptin®), en ensayos clínicos. Se observó un aumento de la supervivencia general de pacientes con tumores de mama que sobreexpresaban Her2/neu después del tratamiento citotóxico más Herceptin®, en comparación con la quimioterapia o trastuzumab solos. Ahora se usa Herceptin® como monoterapia, pero muestra una eficacia aún mayor en combinación con quimioterapia citotóxica. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, por lo general, trastuzumab solo es eficaz en el cáncer de mama en el que el receptor Her2/neu está sobreexpresado. Además, normalmente se requieren múltiples infusiones, lo que genera elevados costes de tratamiento.
Un planteamiento alternativo para el tratamiento o la prevención de los cánceres asociados a Her2/neu utilizando inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales como trastuzumab, se basa en la inducción de respuestas inmunitarias humorales y/o celulares específicas a tumores y en la identificación de antígenos reconocidos por linfocitos humanos B y T. Por ejemplo, se han generado numerosos anticuerpos dirigidos contra el dominio extracelular (ECD) de Her2/neu mediante la inmunización de ratones con células que expresan Her2/neu. El efecto biológico de estos anticuerpos parece ser específico al epítopo; es decir, se basa en el reconocimiento específico de una subsecuencia corta dentro del ECD de Her2/neu. Sin embargo, algunos anticuerpos no tienen efecto alguno o incluso estimulan activamente el crecimiento del tumor.
Dicha inmunoterapia con vacunas para el cáncer se ha basado en antígenos contra los cuales se provocan respuestas humorales y/o celulares. Idealmente, estos antígenos deberían ser expresados o sobreexpresados exclusivamente por células tumorales, a menudo denominados antígenos asociados a tumores (AAT). Uno de los primeros AAT descritos para el cáncer de mama fue Her2/neu. Mientras tanto, se han probado varios AAT que representan diferentes epítopos pero, hasta ahora, ninguno se ha introducido con éxito en la práctica clínica.
Según el tipo de respuesta inmunitaria que se pretenda (es decir, respuesta de célula B o células T), normalmente se aplican diferentes estrategias. Por ejemplo, para inducir una respuesta de célula B (es decir, anticuerpo), los antígenos deberían comprender un epítopo de célula B. Como se entiende generalmente en la técnica, un epítopo de célula B es una parte de un antígeno que es reconocida y objeto de unión por un receptor de célula B. Los lípidos, polisacáridos y proteínas/péptidos pueden contener epítopos de células B que, tras la introducción en un organismo elegido, provocan que las células B produzcan anticuerpos que se unen específicamente al epítopo introducido.
En la técnica se conocen fragmentos individuales del ECD de Her2/neu, incluidos los epítopos de célula B. Por ejemplo, el documento WO 2002/068474 describe una vacuna que comprende un péptido de 9-25 aminoácidos cuya secuencia se produce en la parte extracelular de la proteína Her2/neu. Además, el documento WO 2007/118660 describe una vacuna multipeptídica que comprende una combinación específica de péptidos que presentan diferentes secuencias de aminoácidos como ocurre en la parte extracelular de la proteína Her2/neu. Estos péptidos se pueden administrar individualmente o en combinación, en forma de múltiples péptidos diferenciados, cada uno preferiblemente conjugado por separado a un sistema de administración. En otro ejemplo más, el documento WO 2011/020604 describe péptidos de fusión que comprenden múltiples epítopos de célula B de Her2/neu acoplados a un sistema de administración de virosomas. Se demostró que estos virosomas inducen un título de anticuerpos más alto contra un solo epítopo de célula B en comparación con los mismos péptidos de fusión formulados con Montanide™, o un sistema de administración basado en ISCOM.
A pesar de varios intentos de desarrollar una vacuna adecuada para inducir inmunidad contra e1Her2/neu, todavía no existe una vacuna eficaz en uso clínico. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición mejorada adecuada para su uso como vacuna para tratar o prevenir una afección tal como el cáncer que se caracteriza por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu.
Compendio de la invención
La presente memoria descriptiva describe una composición de vacuna que comprende:
(i) un adyuvante, en el que el adyuvante es una emulsión de agua en aceite; y
(ii) al menos un péptido de fusión conjugado con una proteína transportadora,
en el que la proteína transportadora es la variante de toxina diftérica CRM-197 (n° de entrada de GenBank 1007216A; SEQ ID NO: 61) y en el que al menos un péptido de fusión comprende dos o más epítopos de células B no contiguos de Her2/neu seleccionados entre los grupos constituidos por las SEQ ID Nos: 1-7.
La presente memoria descriptiva también describe una composición farmacéutica que comprende la composición de vacuna como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente memoria descriptiva también describe un método para tratar o prevenir un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que lo necesite, comprendiendo el método la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de la composición de vacuna descrita en el presente documento o de la composición farmacéutica descrita en el presente documento.
La presente memoria descriptiva también da a conocer el uso de la composición de vacuna descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente necesitado de la misma.
La presente memoria descriptiva también describe la composición de vacuna o la composición farmacéutica como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que lo necesite.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra títulos de anticuerpos anti-P4 en muestras de suero obtenidas después de la cuarta inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 2 muestra títulos de anticuerpos anti-P6 en muestras de suero obtenidas después de la cuarta inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 3 muestra títulos de anticuerpos anti-P7 en muestras de suero obtenidas después de la cuarta inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 4 muestra títulos de anticuerpos anti-P467 en muestras de suero obtenidas después de la cuarta inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 5 muestra títulos de anticuerpos anti-P647 en muestras de suero obtenidas después de la cuarta inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 6 muestra títulos de anticuerpos anti-P467 en muestras de suero obtenidas dos semanas después de las inmunizaciones segunda (BA1; 1a extracción de sangre), tercera (BA2; 2a extracción de sangre) y cuarta (BA3; 3a
extracción de sangre) ya sea con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o con los conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 7 muestra títulos de anticuerpos anti-P647 en muestras de suero obtenidas dos semanas después de las inmunizaciones segunda (BA1; 1a extracción de sangre), tercera (BA2; 2a extracción de sangre) y cuarta (BA3; 3a extracción de sangre) ya sea con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o con los conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 8 muestra que los anticuerpos de las muestras de suero obtenidas dos semanas después de las inmunizaciones segunda (BA1; 1a extracción de sangre) y tercera (BA2; 2a extracción de sangre) ya sea con formulaciones de virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 (15, 30, 50 pg) o con conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM; 30 pg) son capaces de unirse a un ECD recombinante de Her2/neu. Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 9 muestra anticuerpos recombinantes específicos de Her2/neu de muestras de suero obtenidas dos semanas después de la segunda inmunización (BA1; 1 a extracción de sangre) ya sea con formulaciones de virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 (15, 30, 50 pg) o con conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM; 30 pg). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 10 muestra anticuerpos recombinantes específicos de Her2/neu de muestras de suero obtenidas dos semanas después de la cuarta inmunización (BA3; 3a extracción de sangre) ya sea con formulaciones de virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 (15, 30, 50 pg) o con conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM; 30 pg). Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 11 muestra la cinética de los títulos de anticuerpos recombinantes específicos de Her2/neu después de las inmunizaciones segunda, tercera y cuarta con conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM; 30 pg) que comprenden los péptidos de fusión P467 o P647. Los sueros se sometieron a ensayo a una disolución de 1:4.000. Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 12 muestra una comparación directa de los títulos de anticuerpos después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a con el péptido de fusión P467 conjugado con virosomas o con CRM197 a una concentración de 30 pg. De izquierda a derecha en cada grupo: Prerrepositorio (sangre extraída antes de la inmunización); TIRIV (virosoma vacío); P467-30 mg/ratón (conjugado con virosoma); P467-30 mg/ratón-CRM (conjugado con CRM197). Todos los sueros se sometieron a ensayo a la misma disolución. Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 13 muestra una comparación directa de los títulos de anticuerpos después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a con el péptido de fusión P647 conjugado con virosomas o con CRM197 a una concentración de 30 pg. De izquierda a derecha en cada grupo: Prerrepositorio (sangre extraída antes de la inmunización); TIRIV (virosoma vacío); P647-30 mg/ratón (conjugado con virosoma); P647-30 mg/ratón-CRM (conjugado con CRM197). Todos los sueros se sometieron a ensayo a la misma disolución. Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 14 muestra la inmunización con virosomas que incorporan los péptidos de fusión P467 o P647 o los anticuerpos inducidos por conjugados de CRM197-proteína de fusión (CRM) que son capaces de unirse a Her2/neu nativo expresado en la superficie de las células de cáncer de mama SKBR-3. Los datos se presentan como valores de DO.
La Figura 15A muestra el título de anticuerpos IgG anti-P467 en ratones después de tres dosis de la proteína de fusión P467-CRM197 a 10 pg, 25 pg y 50 pg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los títulos de anticuerpos se compararon con los niveles observados en animales de control a los que se administró el péptido P467 solo (P467; 25 pg), alumbre de Brenntag (Alum (Brenntag)) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como valores de DO; *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.
La Figura 15B muestra el título de anticuerpos IgG1 anti-P467 en ratones después de tres dosis de la proteína de fusión P467-CRM197 a 10 pg, 25 pg y 50 pg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los títulos de anticuerpos se compararon con los niveles observados en animales de control a los que se administró el péptido P467 solo. Los datos se presentan como valores de DO; *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.
La Figura 15C muestra el título de anticuerpos IgG2a anti-P467 en ratones después de tres dosis de la proteína de fusión P467-CRM197 a 10 pg, 25 pg y 50 pg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los títulos de anticuerpos se compararon con los niveles observados en animales de control a los que se les administró el péptido P467 solo (P467; 25 pg), alumbre de Brenntag (Alum (Brenntag)) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como valores de DO; *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.
La Figura 16A muestra el título de anticuerpos IgG anti-Her2/neu extracelular en ratones después de tres dosis de la proteína de fusión P467-CRM197 a 10 pg, 25 pg y 50 pg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag
(P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los títulos de anticuerpos se compararon con los niveles observados en animales de control a los que se administró el péptido P467 solo (P467; 25 gg), alumbre de Brenntag (Alum (Brenntag)) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como valores de DO; *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.
La Figura 16B muestra el título de anticuerpos IgG1 anti-Her2/neu extracelular en ratones después de tres dosis de la proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los títulos de anticuerpos se compararon con los niveles observados en animales de control a los que se administró el péptido P467 solo (P467; 25 gg), alumbre de Brenntag (Alum (Brenntag)) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como valores de DO; *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.
La Figura 17A muestra la producción de IL-2 por esplenocitos activados con CRM197 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IL-12 (pg/ml) se compararon con los niveles de IL-2 observados en esplenocitos activados con CRM197 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; **p<0,01 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 17B muestra la producción de IL-2 por esplenocitos activados con P467 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IL-12 (pg/ml) se compararon con los niveles de IL-2 observados en esplenocitos activados por P467 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; *p<0,05, **p<0,01 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 18A muestra la producción de IFNy por esplenocitos activados con CRM197 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IFNy (pg/ml) se compararon con los niveles de IFNy observados en esplenocitos activados con CRM197 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; *p<0,05 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 18B muestra la producción de IFNy por esplenocitos activados con P467 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IFNy (pg/ml) se compararon con los niveles de IFNy observados en esplenocitos activados por P467 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 19A muestra la producción de IL-5 por esplenocitos activados con CRM197 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IL-5 (pg/ml) se compararon con los niveles de IL-5 observados en esplenocitos activados con CRM197 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (alumbre (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; *p<0,05, **p<0,01 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 19B muestra la producción de IL-5 por esplenocitos activados por P467 derivados de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada sola (P467-CRM), con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los niveles de IL-5 (pg/ml) se compararon con los niveles de IL-5 observados en esplenocitos activados con P467 derivados de animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como pg/ml; ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 20A muestra la distribución de esplenocitos CD3+CD4+ (linfocitos T) en el sacrificio en ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD3+CD4+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD3+CD4+ observado en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; ns = no estadísticamente significativo.
La Figura 20B muestra la distribución de esplenocitos CD3+CD8+ (linfocitos T) en el sacrificio en ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD3+CD8+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD3+CD8+ observado en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 20C muestra la distribución de esplenocitos CD3-CD19+ (células B) en el sacrificio en ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD3-CD19+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD3-CD19+ observados en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 20D muestra la distribución de esplenocitos CD335+ (células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés)) en el sacrificio en ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD335+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD335+ observados en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; *p<0,05 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 21A muestra la distribución de esplenocitos CD3+CD4+IFNy+ (células T productoras de IFNy) en el sacrificio de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD3+CD4+IFNy+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD3+CD4+IFNy+ observados en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 21B muestra la distribución de esplenocitos CD3+CD8+IFNy+ (células T productoras de IFNy) en el sacrificio de ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD3+CD8+IFNy+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD3+CD8+IFNy+ observados en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; *p<0,05 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 21C muestra la distribución de esplenocitos CD335+IFNy+ (células T productoras de IFNy) en el sacrificio en ratones inmunizados con proteína de fusión P467-CRM197 a 10 gg, 25 gg y 50 gg, administrada con alumbre de Brenntag (P467-CRM+Alum), con alumbre de Serva (P467-CRM+Alum (Serva)) o con Montanide™ (P467-CRM+Montanide). El porcentaje de esplenocitos CD335+IFNy+ se comparó con el porcentaje de esplenocitos CD335+IFNy+ observado en animales de control a los que se había administrado alumbre solo (Alum (Brenntag)), Montanide™ solo (Montanide) o CRM197 sola (CRM). Los datos se presentan como un porcentaje del número total de células; *p<0,05 y ns = estadísticamente no significativo.
La Figura 22 muestra los títulos de anticuerpos IgG específicos al péptido P467 a las 3 semanas (BA2), 8 semanas (BA3), 16 semanas (BA4) y 6 meses (BA5) después de la última dosis del constructo peptídico P467-CRM administrado a 10 gg, 25 gg y 50 gg, ya sea con alumbre (P467-CRM+Alum) o Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los datos se presentan como valores de DO. De izquierda a derecha en cada grupo: BA2, BA3, BA4, BA5 y presangrado.
La Figura 23 muestra los títulos de anticuerpos IgG específicos de Her2/neu a las 3 semanas (BA2), 8 semanas (BA3), 16 semanas (BA4) y 6 meses (BA5) después de la última dosis del constructo peptídico P467-CRM administrada a 10 gg, 25 gg y 50 gg con alumbre (P467-CRM+Alum) o Montanide™ (P467-CRM+Montanide). Los datos se presentan como valores de DO. De izquierda a derecha en cada grupo: BA2, BA3, BA4, BA5 y presangrado.
Descripción detallada
La terminología utilizada en este documento tiene el fin solo de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante. A no ser que se defina algo diferente, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente una persona con un dominio normal de la técnica a la que pertenece la presente descripción. Se puede utilizar cualquier material y método similares o equivalentes a los descritos en este documento para poner en práctica la presente invención. Los profesionales pueden referirse a Sambrook etal., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva
York, y Ausubel etal. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York, Murphy et al. (1995), Virus Taxonomy, Springer Verlag: 79-87, para definiciones y términos de la técnica y otros métodos conocidos por la persona experta en la técnica.
En toda esta memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera algo diferente, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicado, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
Con "consistir en" se quiere decir que incluye, sin limitación, lo que siga a la expresión "consistir en". Por lo tanto, la expresión "que consiste en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Con "consistir esencialmente en" se quiere decir que incluye cualquier elemento enumerado después de la expresión, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresión " consistir esencialmente en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no la actividad o a la acción de los elementos enumerados.
Como se usan en el presente documento, las formas singulares "un", "una", “el” y "la" incluyen aspectos plurales a no ser que el contexto dicte claramente algo diferente. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una sola célula, así como dos o más células; la referencia a "un organismo" incluye un organismo, así como dos o más organismos; etcétera.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se denominan mediante números identificadores de secuencia (SEQ ID NO:). Las SEQ ID NO: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <400>1, <400>2, etc. En el presente documento se proporciona un compendio de los identificadores de secuencia.
La presente descripción se basa, al menos en parte, en el sorprendente hallazgo de los inventores de que una composición de vacuna que comprende (i) un adyuvante y (ii) un péptido de fusión de múltiples epítopos de célula B derivados del dominio extracelular (ECD) de Her2/ neu conjugado con la variante no tóxica de la toxina diftérica CRM-197 (n° de entrada de GenBank 1007216A), puede provocar una respuesta de anticuerpos específicos a antígeno que es muy superior a la que se puede lograr mediante el uso de un sistema de administración como los virosomas.
Así, en un aspecto, se proporciona una composición de vacuna que comprende:
(i) un adyuvante, en el que el adyuvante es una emulsión de agua en aceite; y
(ii) al menos un péptido de fusión conjugado con una proteína transportadora,
en el que la proteína transportadora es la variante de toxina diftérica CRM-197 (n° de entrada de GenBank 1007216A; SEQ ID NO: 61) y en el que al menos un péptido de fusión comprende dos o más epítopos de células B no contiguos de Her2/neu seleccionados entre los grupos constituidos por las SEQ ID Nos: 1-7.
Epítopos de célula B
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de células B" se refiere a una parte de una molécula que es reconocida por un receptor de células B (anticuerpo). Así, un "epítopo de célula B" debe entenderse como una pequeña subsecuencia de un antígeno, siendo dicha subsecuencia de epítopo capaz de ser reconocida por un anticuerpo. Un antígeno puede contener múltiples epítopos de células B y, por lo tanto, puede unirse a múltiples anticuerpos distintos, pero cualquier fragmento epitópico dado de este antígeno normalmente se unirá a un solo anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, los términos "péptido" y "polipéptido" se usan en su sentido más amplio para referirse a una molécula de dos o más residuos de aminoácido, o análogos de aminoácido. Los residuos de aminoácido pueden estar unidos por enlaces peptídicos o, alternativamente, por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc., pero en la mayoría de los casos estarán unidos por enlaces peptídicos.
Como se usa en el presente documento, los términos "aminoácido" o "residuo de aminoácido" abarcan aminoácidos tanto naturales como no naturales o sintéticos, incluidas las formas D o L y los análogos de aminoácido. Un "análogo de aminoácido" debe entenderse como un aminoácido de origen no natural que difiere de su correspondiente aminoácido de origen natural en uno o más átomos. Por ejemplo, un análogo de aminoácido de cisteína puede ser homocisteína.
Los expertos en la técnica sabrán cómo determinar si un péptido es o no un epítopo de célula B de Her2/neu. En un ejemplo ilustrativo, se puede identificar con un alto grado de precisión que un péptido es, o comprende, un epítopo de célula B usando programas informáticos establecidos que comparan la secuencia del péptido en cuestión con una base de datos de secuencias conocidas y/o secuencias parciales que se sabe que son reconocidas por anticuerpos codificados por la línea germinal humana o murina. Alternativamente, un epítopo de célula B dentro de un péptido o polipéptido dado puede ser identificado por análisis asistido por ordenador usando diversas combinaciones de
correlaciones de antigenicidad tales como accesibilidad a la superficie, flexibilidad de la cadena, perfiles de hidropatía/hidrofilicidad, estructura secundaria predicha, etc. Alternativamente, se puede identificar que un péptido en cuestión es, o comprende, un epítopo de célula B inmunizando a un animal con el péptido en cuestión al menos una vez, permitiendo que se desarrolle una respuesta inmunitaria y, luego, analizando el suero del animal en busca de anticuerpos que específicamente se unen a al menos una parte del péptido administrado usando, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), un radioinmunoensayo, un análisis de transferencia Western o un análisis de transferencia por manchas. A continuación, en los Ejemplos 6 y 7 se proporciona una descripción más detallada de cómo determinar si un péptido en cuestión es o no un epítopo de células B.
La Tabla 1, a continuación, presenta las secuencias de aminoácidos de los epítopos de célula B del dominio extracelular de Her2/neu, incluidos sus derivados:
Tabla 1:
En un aspecto divulgado en el presente documento, los dos o más epítopos de células B se seleccionan del grupo constituido por las SEQ ID Nos: 1-7 y 15-60, como se muestra en la Tabla 1 y 2, y secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 85% a cualquiera de las anteriores (es decir, que tienen al menos una identidad de secuencia de 85% con cualquiera de las SEQ ID Nos: 1-7 y 15-60). Según la invención, los dos o más epítopos de células B se seleccionan del grupo constituido por las SEQ ID Nos: 1-7. Cabe señalar que ninguno de estos epítopos de célula B son contiguos en el Her2/neu nativo.
Como se usa en el presente documento, los términos "nativo" y "natural" se refieren a la forma de una molécula que se produce normalmente de forma natural. Como tal, la secuencia "nativa" del ECD de Her2/neu se refiere a los residuos de aminoácidos 23-652 de la secuencia de aminoácidos de Her2/neu publicada anteriormente (n° de entrada de la base de datos Swiss-Prot P04626; ERBB2_HUMAN). Por el contrario, una secuencia "no nativa", que incluye un "conector no nativo", es cualquier secuencia de aminoácidos que no pertenezca a la secuencia nativa del ECD de Her2/neu. Por lo tanto, en una realización descrita en el presente documento, un "conector no nativo" peptídico no representa una extensión de ninguno de los fragmentos de Her2/neu a los que se conecta en la secuencia nativa contigua de Her2/neu.
Péptidos de fusión
El diseño de composiciones de vacunas inmunopreventivas y/o inmunoterapéuticas para cánceres que expresan Her2/neu o que sobreexpresan Her2/neu basadas en epítopos/péptidos múltiples ha conllevado la administración de tales péptidos como péptidos diferenciados (es decir, separados). Esto tiene ciertas desventajas implícitas. Por ejemplo, la administración simultánea de múltiples péptidos dentro de la misma composición corre el riesgo de que estos péptidos se agrupen, disminuyendo así su disponibilidad prevista para el sistema inmunitario del anfitrión. En casos extremos, la solubilidad de tales agregados puede disminuir de tal manera que los agregados precipiten y no están disponibles para el sistema inmunitario del anfitrión. Al mismo tiempo, la administración por separado de tales péptidos en diferentes disoluciones y en diferentes momentos disminuye la probabilidad de que los efectos inmunogénicos de tales péptidos puedan combinarse de manera ventajosa.
Surgen dificultades adicionales cuando se usan múltiples epítopos individuales con ciertos tipos de sistemas de administración, tales como virosomas, liposomas o partículas de tipo viral (VLP, por sus siglas en inglés). Para permitir la producción de vacunas reproducibles, es ventajoso presentar los epítopos en concentraciones definidas. Sin embargo, cuando se acoplan (es decir, se asocian covalentemente) múltiples fragmentos peptídicos a un solo sistema de administración, tal como un virosoma o liposoma, es difícil garantizar que se acople el mismo número de epítopos a cada sistema de administración. Invariablemente, existen fluctuaciones en el número de acoplamientos por sistema de administración. Aunque se pueda estar relativamente seguro de que cada sistema de administración viable se combinará, por ejemplo, con cada uno de los epítopos A y B, algunos sistemas de administración se asociarán con algo más del epítopo A de lo previsto, mientras que el epítopo B superará ligeramente las cantidades previstas en otros. Aunque la distribución gaussiana de los epítopos A y B tenderá a centrarse en la proporción deseada de los fragmentos A:B, cualquier distribución gaussiana, por definición, contiene valores atípicos, y son estos valores atípicos los que potencialmente restan valor a la máxima eficacia inmunogénica, y que se vuelven cada vez más costosos y
laboriosos de excluir a medida que los requisitos para mantener la proporción de epítopos prevista en el sistema de administración se vuelven más estrictos. Hay inquietudes similares cuando se combinan sistemas de administración tales como virosomas asociados con diferentes fragmentos de epítopos en un intento de lograr una proporción deseada de un fragmento ECD de Her2/neu con respecto a otro.
En el presente documento se describe un planteamiento que supera o al menos alivia parcialmente las desventajas anteriores. Al unir al menos dos epítopos de células B no contiguos del ECD de Her2/neu, o derivados del mismo, en un solo péptido de fusión, se puede lograr una formulación homogénea en la que solo está presente un tipo de péptido de fusión. Los elementos del péptido de fusión (es decir, los epítopos del ECD de Her2/neu que en el ECD nativo no son contiguos) son iguales en todos los péptidos, y pueden elegirse (o elegirse y modificarse) de modo que se minimicen las interacciones intra e interpolipeptídicas no deseadas.
En una realización descrita en el presente documento, la composición de la vacuna comprenderá un solo tipo de péptido de fusión. En consecuencia, la proporción de epítopos de célula B presentes está dictada en última instancia por la proporción de estos fragmentos en el péptido de fusión. Esto significa que cualquier relación deseada para provocar una respuesta inmunogénica se puede fijar de forma sencilla y fiable al nivel de la construcción y el diseño del péptido de fusión.
Finalmente, cuando se usa la variante no tóxica de la toxina diftérica CRM-197 como proteína transportadora para administrar los péptidos de fusión descritos en el presente documento, la variabilidad relacionada con la distribución relativa de cada epítopo de célula B de Her2/neu en la composición de la vacuna se puede minimizar o evitar porque la proporción de un epítopo de célula B de Her2/neu a cualquier otro epítopo de célula B no contiguo de forma nativa, permanecerá constante independientemente de cuántos péptidos de fusión estén unidos a la proteína transportadora ya que, como se mencionó anteriormente, esta proporción se determina al nivel de un solo péptido de fusión.
En otras realizaciones descritas en el presente documento, la composición de la vacuna comprenderá más de un tipo de péptido de fusión.
La composición de vacuna divulgada en el presente documento provoca una respuesta de anticuerpos específica al antígeno en un anfitrión al que se la administra. Sorprendentemente, la respuesta específica al antígeno provocada por la composición de la vacuna es de órdenes de magnitud mayores que la respuesta inmunitaria que se puede obtener usando epítopos de célula B de Her2/neu individualmente o usando sistemas de administración alternativos tales como virosomas. Por lo tanto, la presente invención evita o al menos minimiza los inconvenientes de los procesos complejos de fabricación para incorporar péptidos en los virosomas, la variabilidad que a menudo se asocia con el intento de incorporar múltiples péptidos individuales en un sistema de administración y las posibles interacciones adversas entre fragmentos separados de epítopos de célula B, que podrían degradar la eficacia de la composición de vacuna resultante.
Como se usa en el presente documento, la expresión "péptido de fusión" se refiere a un péptido no nativo compuesto por dos o más epítopos de célula B no contiguos del ECD de Her2/neu (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o más epítopos de célula B no contiguos del ECD de Her2/neu), unidos entre sí, por ejemplo, a través de enlaces peptídicos (amídicos). En una realización descrita en el presente documento, los dos o más epítopos de célula B del ECD de Her2/neu no son contiguos en su estado nativo; es decir, en el ECD de Her2/neu nativo.
En una realización descrita en el presente documento, el péptido de fusión comprende al menos tres epítopos de célula B no contiguos del ECD de Her2/neu. En una realización, el péptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 8-14.
La Tabla 2, a continuación, proporciona una lista de epítopos seleccionados de célula B, así como péptidos de fusión según algunas de las realizaciones descritas en el presente documento:
Tabla 2:
En una realización descrita en el presente documento, el péptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (designada péptido de fusión P467) o la SEQ ID NO: 9 (designada péptido de fusión P647), como se muestra en la Tabla 2 anterior.
También se contemplan en el presente documento, péptidos de fusión que comprenden dos o más epítopos de célula B del ECD de Her2/neu seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID NO: 1-7, concatenadas dos o más veces en una repetición en tándem. Por ejemplo, los péptidos de fusión contemplados en el presente documento pueden comprender dos o más repeticiones en tándem de la SEQ ID NO: 1, dos o más repeticiones en tándem de la SEQ ID NO: 2, dos o más repeticiones en tándem de la SEQ ID NO: 3, dos o más repeticiones en tándem de la SEQ ID NO:4, dos o más repeticiones en tándem de la SEQ ID NO:5, y así sucesivamente. Sin embargo, se entenderá que es más probable que la incorporación de dos o más epítopos de célula B diferentes en el péptido de fusión genere una respuesta inmunitaria más beneficiosa provocando anticuerpos que reconozcan específicamente múltiples epítopos de célula B del ECD de Her2/neu. Por lo tanto, en una realización descrita en el presente documento, el péptido de fusión comprende al menos dos epítopos de célula B diferentes del ECD de Her2/neu seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID NO: 1-7.
En una realización divulgada en el presente documento, el péptido de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 8-14. En aún otra realización, el péptido de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (designada como péptido de fusión P467) o la SEQ ID NO: 9 (designada como péptido de fusión P647).
En los epítopos de célula B individuales de las SEQ ID NO: 3 y 4, como se ha expuesto anteriormente en la Tabla 2, la SEQ ID NO: 4 comprende un conector C-terminal adicional que termina en Cys (es decir, GGGGGC) no encontrado en la SEQ ID NO:3. Este conector C-terminal en la SEQ ID NO: 4 termina en Cys, lo que permite que este único epítopo se acople a la proteína transportadora, como se ilustra en algunos de los ejemplos que se exponen a continuación. Cuando se usa como parte del péptido de fusión de la invención, el epítopo de célula B de la SEQ ID NO:4 está presente en este péptido de fusión en forma de la SEQ ID NO:3. En los experimentos en los que se emplea el epítopo de célula B de la SEQ ID NO:4, la porción de la SEQ ID NO:4 correspondiente a la SEQ ID NO:3 que funciona como el epítopo de célula B.
Los métodos adecuados para preparar un péptido de fusión como se describe en el presente documento resultarán familiares para los expertos en la técnica. Un ejemplo ilustrativo incluye la síntesis de péptidos que implica la formación secuencial de enlaces peptídicos que unen cada epítopo de célula B a su epítopo de célula B vecino respectivamente, como se describe en otra parte del presente documento, y la recuperación de dicho péptido de fusión. Los métodos de síntesis de péptidos adecuados serán conocidos en la técnica. Los ejemplos ilustrativos incluyen los métodos descritos en "Amino Acid and Peptide Synthesis" (Oxford Chemistry Primers; de John Jones, Oxford University Press). Los péptidos sintéticos también se pueden crear mediante síntesis en fase líquida o síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés) en diferentes soportes sólidos (por ejemplo, poliestireno, poliamida o PEG). La SPPS puede incorporar el uso de F-moc (9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo) o t-Boc (terc-butoxicarbonilo). También hay disponibles péptidos a medida de varios fabricantes comerciales.
Alternativamente, el péptido de fusión se puede preparar mediante metodología recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de fusión puede ser transfectada en una célula anfitriona adecuada capaz de expresar dicha secuencia de ácido nucleico, incubando dicha célula anfitriona en condiciones adecuadas para la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico y recuperando dicho péptido de fusión. Los expertos en la técnica también conocerán métodos adecuados para preparar una molécula de ácido nucleico que codifique el/los péptido(s) de fusión de interés, en función del conocimiento del código genético, que posiblemente incluya codones de optimización basados en la naturaleza de la célula anfitriona (por ejemplo, un microorganismo) que ha de usarse para expresar y/o secretar el/los péptido(s) de fusión recombinantes. Las células anfitrionas adecuadas también serán conocidas por los expertos en la técnica, ejemplos ilustrativos de las cuales incluyen células procariotas (por ejemplo, E. coli) y células eucariotas (por ejemplo, P. pastoris). Se hace referencia a "Short Protocols in Molecular Biology”, 5a edición, colección en 2 volúmenes: “A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology” (de Frederick M. Ausubel (autor, editor), Roger Brent (editor), Robert E. Kingston (editor), David D. Moore (editor), JG Seidman (editor), John A. Smith (editor), Kevin Struhl (editor), J Wiley & Sons, Londres).
Como se usa en el presente documento, los términos "codificar", "codificando" y similares se refieren a la capacidad de un ácido nucleico para proporcionar otro ácido nucleico o un polipéptido. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ácido nucleico "codifica" un polipéptido si puede ser transcrita y/o traducida, normalmente en una célula anfitriona,
para producir el polipéptido o si puede ser procesar en una forma que pueda ser transcrita y/o traducida para producir el polipéptido. Tal secuencia de ácido nucleico puede incluir una secuencia codificante o tanto una secuencia codificante como una secuencia no codificante. Por lo tanto, los términos "codificar", "codificando" y similares incluyen un producto de ARN resultante de la transcripción de una molécula de ADN, una proteína resultante de la traducción de una molécula de ARN, una proteína resultante de la transcripción de una molécula de ADN para formar un producto de ARN y la traducción posterior del producto de ARN, o una proteína resultante de la transcripción de una molécula de ADN para proporcionar un producto de ARN, el procesamiento del producto de ARN para proporcionar un producto de ARN procesado (por ejemplo, ARNm) y la traducción posterior del producto de ARN procesado. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica los epítopos de célula B o los péptidos de fusión descritos en el presente documento tienen codones optimizados para la expresión en una célula anfitriona adecuada. Por ejemplo, cuando el péptido de fusión ha de usarse para inducir una respuesta inmunitaria contra Her2/neu en un sujeto humano, las secuencias de ácido nucleico se pueden optimizar con codones humanos. Los expertos en la técnica conocerán métodos adecuados para la optimización de codones, como el uso de la opción "Traducción inversa" de la herramienta "Diseño de genes" situada en "Herramientas de soporte lógico" en el portal de internet Build a Genome de la Universidad John Hopkins.
Los dos o más epítopos de célula B no contiguos de Her2/neu, como se describe en el presente documento, pueden unirse entre sí dentro del péptido de fusión por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Los términos "enlace" y "enlazado" incluyen el enlace directo de dos epítopos de célula B de Her2/neu no contiguos a través de un enlace peptídico; es decir, el extremo C-terminal de un epítopo de Her2/neu se une covalentemente a través de un enlace peptídico al extremo N-terminal de otro epítopo nativo no contiguo. Los términos "enlace" y "enlazado" también incluyen dentro de su significado el enlace de dos epítopos de Her2/neu nativos no contiguos a través de un elemento conector interpuesto.
En una realización descrita en el presente documento, al menos dos de dichos epítopos de célula B, o derivados de los mismos, están unidos entre sí a través de una secuencia peptídica conectora no nativa.
Como se usa en el presente documento, el término "conector" se refiere a una secuencia polipeptídica corta interpuesta entre dos epítopos vecinos de célula B de Her2/neu, o derivados de los mismos, dentro del péptido de fusión. En una realización, el conector es un conector polipeptídico de 1-10 aminoácidos, preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 de origen natural o no natural. En una realización, el conector es un conector de carbohidratos. Los conectores de carbohidratos adecuados serán conocidos por los expertos en la técnica. En otra realización descrita en el presente documento, el péptido de fusión comprende uno o más conector(es) peptídico(s) o polipeptídicos junto con uno o más conector(es) no peptídico(s) o no polipeptídico(s). Además, se pueden incorporar diferentes tipos de conectores, peptídicos o no peptídicos, en el mismo péptido de fusión según se considere apropiado. En el caso de que se use un conector peptídico o polipeptídico para unir dos respectivos fragmentos epitópicos de célula B del ECD de Her2/neu, el conector se incorporará ventajosamente, de modo que su extremo N-terminal se una mediante un enlace peptídico al extremo C- extremo terminal de un fragmento epitópico y su extremo C-terminal a través de un enlace peptídico con el extremo N-terminal del otro fragmento. Los fragmentos epitópicos de célula B individuales dentro del péptido de fusión también pueden tener uno o más aminoácidos añadidos a uno o ambos extremos, preferiblemente al extremo C-terminal. Así, por ejemplo, se pueden añadir aminoácidos conectores o separadores al extremo N o C de los péptidos, o a ambos, para unir los péptidos no contiguos y permitir el acoplamiento conveniente de los péptidos entre sí y/o para un sistema de administración, tal como un virosoma a través de una molécula lipídica en el virosoma que sirve como ancla. Un ejemplo ilustrativo de un conector peptídico adecuado es LP (leucina-prolina), como se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO:8.
Los expertos en la técnica entenderán que, cuando el acoplamiento de un péptido de fusión a la proteína transportadora se realiza a través de un conector, es preferible efectuar tal acoplamiento mediado por conector desde el extremo C-terminal del péptido de fusión, ya que el acoplamiento del conector del N-terminal puede, en algunos casos, tener una influencia negativa sobre la respuesta inmunitaria deseada que se va a provocar.
Proteína transportadora
CRM-197 (N° de entrada de GenBank 1007216A; SEQ ID NO: 61) es una forma enzimáticamente inactiva y no tóxica de toxina diftérica que contiene una sola sustitución de aminoácido (Gly-Glu) en el residuo de aminoácido 52. Una sola mutación de GCA que conduce a la sustitución Glu52 distingue a la CRM-197 de sus especies de forma natural. La ausencia de toxicidad de CRM-197 parece deberse a la pérdida de actividad enzimática de su fragmento A, que en las especies de forma natural cataliza la modificación química del factor 2 de elongación (translocasa) en las células infectadas, que es esencial para la síntesis de proteínas. Esta propiedad no tóxica hace de la CRM-197, una proteína transportadora adecuada para la preparación de vacunas conjugadas.
SEQ ID NO: 61 (CRM-197; N2 de entrada de GenBank 1007216A)
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGL SLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEI NFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIES
LKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVA QSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQ PFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVN KSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIH SNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
Los métodos mediante los cuales se puede acoplar un péptido de fusión a CRM-197 son conocidos por los expertos en la técnica.
Los ejemplos ilustrativos incluyen los descritos por Chang et al. (1998, FEBS Letters, 427:362-366) y Berti et al. (2004, Biophysical Journal, 86: 3-9), así como los expuestos a continuación en el Ejemplo 1, en lo que sigue.
La conjugación de un péptido de fusión, tal como se describe en el presente documento, con CRM-197 se logra normalmente mediante la activación de los residuos de lisilo utilizando agentes reticulantes adecuados. Dado que la CRM-197 contiene 40 residuos de lisina y muchos de ellos están disponibles para la reticulación, los productos finales de la conjugación de CRM-197 son invariablemente heterogéneos. Sin estar ligado a ninguna teoría o modo de acción particular, generalmente se entiende que la proporción de péptido de fusión:proteína transportadora depende del tamaño o peso molecular del péptido de fusión. Por ejemplo, cuando el péptido de fusión es relativamente pequeño (por ejemplo, de aproximadamente 10 aminoácidos de longitud), puede ser posible producir una proteína transportadora que se conjuga con 20-39 péptidos de fusión. Por el contrario, para un péptido de fusión más grande, la proteína transportadora puede conjugarse con hasta 20 péptidos de fusión o menos. En una realización descrita en el presente documento, la proteína transportadora comprende de 2 a 39 péptidos de fusión. En otra realización, la proteína transportadora comprende al menos 20 péptidos de fusión. En otra realización más, la proteína transportadora comprende de 6 a 12 péptidos de fusión.
El péptido de fusión normalmente se acopla a la proteína transportadora mediante un enlace covalente. Sin embargo, en algunas realizaciones, el péptido de fusión puede acoplarse a la proteína transportadora mediante una asociación no covalente. Cuando el péptido de fusión está asociado de forma no covalente con la proteína transportadora, la asociación no covalente normalmente implicará una interacción electromagnética entre uno o más átomos del péptido de fusión con uno o más átomos de la proteína transportadora. Los ejemplos ilustrativos incluyen enlaces iónicos (es decir, la atracción formada entre dos iones cargados de forma opuesta en virtud de esta carga opuesta), fuerzas de Van der Weals (es decir, fuerzas entre dipolos permanentes y/o inducidos de enlaces covalentes existentes dentro del péptido de fusión y la proteína transportadora) y/o interacciones hidrófobas (es decir, fuerzas resultantes de la tendencia de las porciones hidrófobas/alifáticas dentro del/de los péptido(s) de fusión descritos en el presente documento a asociarse con porciones hidrófobas de la proteína transportadora).
Adyuvantes
Como se usa en el presente documento, el término "adyuvante" generalmente se refiere a una clase de sustancia que puede aumentar la magnitud de la respuesta inmunitaria provocada por el conjugado de péptido de fusión-proteína transportadora más allá de lo que se esperaría, ya sea del péptido de fusión solo o del conjugado de péptido de fusiónproteína transportadora descrito en el presente documento en ausencia de un adyuvante.
Los adyuvantes adecuados serán conocidos por los expertos en la técnica y son, según la invención, emulsiones de agua en aceite (por ejemplo, adyuvante de Freund y Montanide™). La composición de vacuna como se describe en el presente documento también se puede asociar con agentes inmunomoduladores, incluidos, por ejemplo, citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. También se contemplan en el presente documento mezclas de dos o más adyuvantes dentro de la misma composición de vacuna.
En una realización, el adyuvante es Montanide™.
En una realización descrita en el presente documento, la composición de la vacuna comprende, además, un inhibidor regulador. Los expertos en la técnica entenderán que la expresión "inhibidor regulador” significa moléculas que inhiben, reducen o interfieren de otro modo o modulan una o más proteínas reguladoras, ya sea total o parcialmente. Los ejemplos ilustrativos de inhibidores reguladores adecuados incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, fragmentos Fab). Las proteínas reguladoras adecuadas serán conocidas por los expertos en la técnica, ejemplos ilustrativos de las cuales incluyen CTLA-4 y sus ligandos CD80 y CD86; PD1 y sus ligandos PDL1 y PDL2; OX40 y su ligando OX40L; LAG-3 y su ligando MHC clase I o II; TIM-3 y su ligando GAL-9; y un atenuador de linfocitos B y T (BTLA, por sus siglas en inglés) y su ligando mediador de entrada del virus del herpes (HVEM, por sus siglas en inglés).
Composición Farmacéutica
La presente memoria descriptiva también describe una composición farmacéutica que comprende la composición de vacuna como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocerán vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados (por ejemplo, excipientes, diluyentes, etc.). Por ejemplo, se puede utilizar una variedad de vehículos acuosos (farmacéuticamente aceptables), como agua
tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas o se pueden esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden comprender, además, sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes y reguladores del pH, agentes reguladores de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, sacarosa u otros carbohidratos, entre muchos otros. Los métodos adecuados para preparar compuestos administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practise of Pharmacy” 20a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., editores, 7a ed., Lippincott, Williams & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., editores, 3a ed., Amer. Pharmaceutical Assoc.
La composición farmacéutica puede estar en una forma adecuada para administración parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa) o en forma de aerosol adecuada para administración por inhalación, tal como inhalación intranasal u oral.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también se pueden proporcionar en un equipo. El equipo puede comprender componentes adicionales para ayudar en la realización de los métodos descritos en el presente documento, como el/los dispositivo(s) de administración, el/los excipiente(s) y/o el/los diluyente(s). Los equipos pueden incluir recipientes para albergar los diversos componentes e instrucciones para usar los componentes del equipo en tales métodos.
En una realización descrita en el presente documento, la composición farmacéutica comprende además un inhibidor regulador, como se describe en otra parte del presente documento.
Usos y métodos para tratar o prevenir el cáncer
También se describe en el presente documento la composición de vacuna para usar en un método de tratamiento o prevención de un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que la necesite, comprendiendo el método la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de la composición de vacuna como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
La presente descripción también se extiende al uso de la composición de vacuna, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que la necesite.
La presente divulgación también se extiende a la vacuna, como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que la necesite.
Los expertos en la técnica estarán familiarizados con el tipo de cánceres que se caracterizan por la expresión o sobreexpresión de la proteína de Her2/neu. Los ejemplos ilustrativos incluyen cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de glándulas salivares. En una realización, el cáncer es cáncer de mama. En otra realización, el cáncer es cáncer gástrico.
La vacuna o las composiciones farmacéuticas, tal como se describen en el presente documento, se administran normalmente en una "cantidad efectiva"; es decir, una cantidad efectiva para provocar uno cualquiera o más entre otros de un efecto terapéutico o profiláctico. Los expertos en la técnica podrían determinar, mediante experimentación rutinaria, una cantidad no tóxica eficaz para incluir en una composición farmacéutica o administrar para obtener el resultado deseado. En general, la vacuna y/o las composiciones farmacéuticas, como se describe en el presente documento, se pueden administrar de manera compatible con la vía de administración y las características físicas del receptor (incluido el estado de salud) y de tal manera, que produzca el/los efecto(s) deseado(s) (es decir, terapéuticamente efectivos, inmunogénicos y/o protectores). Por ejemplo, la dosificación apropiada de una composición puede depender de una variedad de factores que incluyen, entre otros, las características físicas de un sujeto (por ejemplo, edad, peso, sexo), si la composición se usa como agente único o como parte de una terapia adjunta, la progresión (es decir, estado patológico) de cualquier cáncer subyacente, y otros factores que puedan ser reconocidos por los expertos en la técnica. Se analizan otros ejemplos ilustrativos de consideraciones generales que pueden tenerse en cuenta al determinar, por ejemplo, una dosificación apropiada de las composiciones en Gennaro (2000, “Remington: The Science and Practise of Pharmacy”, 20a edición, Lippincott, Williams & Wilkins; y Gilman et al., (editores), (1990), "Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press).
Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de métodos conocidos por los expertos en la técnica, teniendo en cuenta algunas de las consideraciones descritas anteriormente.
Una cantidad eficaz de péptido de fusión (conjugado con la proteína transportadora), como se describe en el presente documento, estará generalmente en un intervalo entre aproximadamente 5 gg y aproximadamente 1,0 mg de péptido de fusión por sujeto, entre aproximadamente 10 gg y aproximadamente 500 gg de péptido de fusión por sujeto, o entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 60 gg de péptido de fusión por sujeto. Se puede determinar una cantidad eficaz, por ejemplo, mediante métodos estándar que impliquen la medición de títulos de anticuerpos específicos de antígeno. El nivel de inmunidad proporcionado por las composiciones en el presente documento descritas puede controlarse para determinar la necesidad, si la hay, de refuerzos. Por ejemplo, después de una evaluación de un título de anticuerpo específico de antígeno en el suero, normalmente días o semanas después de la primera administración de la composición en un sujeto, pueden ser necesarias y/o deseadas inmunizaciones de refuerzo opcionales. Es probable que los títulos de anticuerpos específicos de antígeno mejoren mediante el uso de múltiples dosis, como se ilustra en los Ejemplos a continuación.
La vacuna y/o las composiciones farmacéuticas, descritas en el presente documento, se pueden administrar a un sujeto que la necesite de forma aislada o en combinación con agente(s) terapéutico(s) adicional(es); es decir, como parte de una terapia complementaria. En el contexto de la terapia complementaria, la administración puede ser simultánea o secuencial; es decir, la vacuna y/o la composición farmacéutica se administran primero, seguidas de la administración de los agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales, o la vacuna y/o la composición farmacéutica se administran después de la administración del o de los agentes terapéuticos adicionales. Por lo tanto, cuando se administran dos o más entidades a un sujeto "conjuntamente", pueden administrarse en una sola composición al mismo tiempo, o en composiciones separadas al mismo tiempo, o en composiciones diferenciadas separadas en el tiempo.
El/los agente(s) terapéutico(s) adicional(es) pueden comprender un inhibidor regulador, como se describe en otra parte en este documento. Por lo tanto, en una realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden, además, la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un inhibidor regulador, como se describe en el presente documento.
Será evidente para los expertos en la técnica que la cantidad y la separación óptimos de las dosis individuales, si se requieren para inducir la respuesta inmunitaria deseada, pueden determinarse, por ejemplo, por la forma, vía y sitio de administración, y la naturaleza del sujeto particular que ha de ser tratado, como se describe en otra parte del presente documento. Las condiciones óptimas se pueden determinar utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
En algunos casos, puede ser deseable tener varias o múltiples administraciones de la vacuna y/o composiciones farmacéuticas, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más veces. Las administraciones pueden ser intervalos de aproximadamente un día a intervalos de aproximadamente doce semanas, y en ciertas realizaciones intervalos de aproximadamente una a aproximadamente cuatro semanas. Es posible que se requiera una readministración periódica para lograr un resultado terapéutico deseable, como una reducción en el tamaño del tumor y/o una reducción en la incidencia de metástasis. También será evidente para los expertos en la técnica que el curso óptimo de administración se puede determinar utilizando el curso de tratamiento convencional o pruebas de determinación del estado o eficacia inmunitario.
Se entenderá que "inducir" una respuesta inmunitaria o de anticuerpos específicos de antígenos, como se contempla en el presente documento, incluye provocar o estimular una respuesta inmunitaria y/o potenciar una respuesta inmunitaria previamente existente para obtener un efecto fisiológico deseado, como una reducción del tamaño del tumor y/o una reducción en la incidencia de metástasis. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de la incidencia del cáncer, prevención total o parcial de la incidencia de metástasis y/o prevención total o parcial de un síntoma asociado con dicho cáncer.
Como se usa en el presente documento, los términos "administración" o "administrar" generalmente se refieren a la etapa de introducir la vacuna y/o las composiciones farmacéuticas, como se describe en el presente documento, en el cuerpo de un paciente para que el sistema inmunitario del paciente genere una respuesta a los múltiples epítopos de célula B de Her2/neu dentro del/de los péptido(s) de fusión. Como se usa en el presente documento, un "paciente que la necesite" incluye un individuo al que se le ha diagnosticado cáncer, en el que las células cancerosas expresan o sobreexpresan la proteína de Her2/neu. También incluye a los individuos a los que aún no se les ha diagnosticado cáncer, como aquellas personas que no han presentado ningún síntoma, pero que pueden tener, por ejemplo, antecedentes familiares de cáncer y, por lo tanto, una sospecha de predisposición genética a desarrollar cáncer. En su sentido más amplio, la expresión "un paciente que la necesite" engloba por tanto a las personas con una necesidad ya presente, así como individuos que están en riesgo de desarrollar un cáncer asociado a Her2/neu.
Como se usa en el presente documento, un medicamento que "previene" el cáncer reducirá el riesgo de un individuo de desarrollar cáncer, idealmente hasta cero. Además, este término también se refiere a la prevención de un nuevo desarrollo del cáncer, por ejemplo, después de la cirugía de un tumor primario. Tal como se usa en el presente documento, un medicamento que "trata" el cáncer idealmente eliminará la enfermedad por completo al eliminar su causa subyacente de manera que, tras el cese de la administración de la composición, la enfermedad no vuelve a desarrollarse, sino que permanece en remisión. Como se usa en el presente documento, un medicamento que "mejora" el cáncer no elimina la causa subyacente de la enfermedad, pero reduce la gravedad de la enfermedad según lo
medido por cualquier sistema de clasificación establecido y/o según lo medido por una mejora en el bienestar del paciente, por ejemplo, la disminución del dolor y/o el malestar.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad de una preparación farmacéutica que sola, o junto con dosis adicionales según una posología establecida, efectúa la prevención, el tratamiento o la mejora deseados, como se analiza en otra parte del presente documento.
La vía y la posología de administración pueden variar según la etapa o la gravedad de la afección a tratar, y debe determinarlos el médico experto. Por ejemplo, una vacuna o composición farmacéutica según la presente invención, descrita en el presente documento, puede administrarse en forma subcutánea, intradérmica, intralinfática o tópica o mucosal (nasal) o intramuscular. Todas estas formas son bien conocidas por los expertos en las técnicas farmacéuticas.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar por vía intramuscular, subcutánea, intralinfática o intranasal conocidas por las personas con un dominio normal en la técnica.
Como se analiza en otra parte del presente documento, se selecciona la posología que utiliza las composiciones descritas en el presente documento según una variedad de factores, que incluyen, por ejemplo, la edad, el peso y la condición médica del paciente, la etapa y la gravedad de la afección que se ha de ser tratados, y del o de los péptidos de fusión particulares destinados a la administración. Un médico con un dominio normal puede determinar y recetar fácilmente la cantidad eficaz, por ejemplo, de la proteína transportadora (que comprende uno o más péptido(s) de fusión acoplado(s) a la misma) requerida para prevenir, tratar o mejorar el progreso o la gravedad de un tumor maligno. La posología también tendrá en cuenta la cantidad de adyuvante que se administrará, que se espera que varíe dependiendo de al menos algunos de los factores que regirán la cantidad de proteína transportadora/péptido(s) de fusión que ha de administrarse al sujeto, tales como la edad, el peso y la condición médica del paciente. Precisión óptima para lograr una concentración de proteína transportadora/péptido(s) de fusión y/o adyuvante con el intervalo que produce eficacia (es decir, una cantidad efectiva), ya sea sin toxicidad o con una toxicidad no más que aceptable, requiere una posología basada, al menos en parte, en la cinética de la disponibilidad de la proteína transportadora/péptido(s) de fusión y/o adyuvante en el/los sitio(s) diana. Este proceso normalmente implicará una consideración de la distribución, el equilibrio y la eliminación de la proteína transportadora/péptido(s) de fusión y/o adyuvante, que estará dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Ahora se describirán ciertas realizaciones de la invención con referencia a los siguientes ejemplos que están destinados únicamente a fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la generalidad descrita anteriormente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos están dirigidos a la conjugación de dos péptidos de fusión (epítopos de célula B no contiguos derivados de Her2/neu) con la toxina diftérica detoxificada recombinante, CRM197. Se realizaron análisis iniciales de los conjugados de péptido de fusión-proteína transportadora mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Finalmente, los conjugados de péptido de fusión-proteína transportadora se enviaron a Austria para el estudio inicial de inmunogenicidad en animales.
Ejemplo 1: Conjugación de antígenos peptídicos de Her2/neu con la variante de toxina diftérica recombinante destoxificada, c Rm -197
La vacuna contra el cáncer de mama a base de virosomas, PEV6A/B, se probó con éxito en un ensayo clínico de fase I (Wiedermann et al, Breast Cancer Res Treat. 2010). Sin embargo, esta formulación de vacuna presentaba limitaciones técnicas sustanciales con respecto a la estabilidad y a la compatibilidad de los componentes, mejor ilustradas por el hecho de que eran inevitables dos inyecciones separadas.
El planteamiento con PEV6C supera las limitaciones técnicas de PEV6A/B. La PEV6C combina los tres antígenos (P6, P7 y P4; SEQ ID NO: 1-3; respectivamente) en una sola cadena peptídica (ver también el documento WO 2011/020604A1; Multi-epitope vaccine for her2/neu-associated cancers) y se puede formular como una forma de aplicación de dosis única estable y liofilizable.
Preparación y Resultados
Se usaron las siguientes proteínas de fusión para la conjugación con la proteína transportadora CRM-197:
Péptido 1: P467 (antes de la conjugación):
Sal acetato de H-Pro-Glu-Ser-Phe-Asp-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro-Leu-Gln-Pro-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Leu-Pro-Arg-Glu-Tyr-Val-Asn-Ala-Arg-His-Ser-Leu-Pro-Tyr-Met-Pro-Ile-Trp-Lys-Phe-Pro-Asp-Glu-Glu-Gly-Ala-Cys (SEQ ID NO: 8); y
Péptido 2: P647 (antes de la conjugación):
Sal acetato de H-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Leu-Pro-Arg-Glu-Tyr-Val-Asn-Ala-Arg-His-Ser-Pro-Glu-Ser-Phe-Asp-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro-Leu-Gln-Pro-Tyr-Met-Pro-Ile-Trp-Lys-Phe-Pro-Asp-Glu-Glu-Gly-Ala-Cys (SeQ ID NO: 9).
Se realizó la reacción de conjugación en un tampón PBS con un pH 7,4, utilizando el agente reticulante sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC). Este reactivo reacciona primero con las aminas primarias (es decir, residuos de lisina) en la proteína transportadora CRM-197 antes de que se le permita reaccionar con grupos tiol (es decir, residuos de cisteína). En CRM-197, teóricamente estaban disponibles 39 residuos de lisina para una reacción con el reactivo de reticulación. Para lograr una buena distribución del antígeno peptídico sobre la proteína transportadora, se ajustó la relación péptido de fusión:proteína transportadora para lograr una conjugación promedio de 20 moléculas de péptido de fusión por molécula de CRM197. Se permitió que la reacción prosiguiera durante 45 minutos a temperatura ambiente (TA), de la siguiente manera:
Tabla 3: Material
Procedimiento
1. Retirar los péptidos de fusión de -20°C y dejar reposar a temperatura ambiente (TA) durante unos 10 min, antes de abrir los viales.
2. Pesar los péptidos de fusión en viales de vidrio de 3 ml:
(a) P467, 7,8 mg, resuspendido con 
780 gl de agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés); (b) P467, 7,1 mg, resuspendido con 
710 gl de dimetilsulfóxido (DMSO, por sus siglas en inglés); (c) P647, 6,9 mg, resuspendido con 
690 gl de WFI;
(d) P647, 9,0 mg, resuspendido con
900 gl de DMSO;
Todas las disoluciones se resuspendieron fácilmente y no se observaron agregados ni turbidez.
3. Diluir la disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x a PBS 1x con agua Milli Q y añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés) hasta una concentración final de 1 mM.
4. Reconstituir 6 viales de CRM197 con 0,5 ml de WFI a 2 mg/ml. Combinar 3 viales para obtener 2 lotes y almacenar a 4°C (1,5 ml por lote, cada 3 mg).
5. Tomar un vial de Sulfo-SMCC (2 mg) y agregar 200 gl de PBS/ETDA 1 mM y disolver (disolución madre de 10 mg/ml; la disolución permaneció turbia).
6. Añadir 75 gl de Sulfo-SMCC (10 mg/ml) a cada vial de 3 mg de CRM197. Volumen total: 1,575 ml.
7. Incubar los viales durante 45 minutos a temperatura ambiente con mezcla lenta (rotación, 25 rpm). Durante ese tiempo, equilibrar columnas de desalinización Zeba Spin x2 con tampón PBS/EDTA.
8. Después de la etapa 7 de incubación, la reacción se transfiere a la columna equilibrada Zeba Spin (1,5 ml) y se añaden 200 gl de PBS/EDTA, y luego se centrifuga a 1000 x g durante 4 min.
9. Se recuperó 1,8 ml de cada disolución.
10. Añadir a un vial nuevo de 3 ml, de la siguiente manera:
(a) Vial 1: 600 gl P467 (10 mg/ml en WFI); y
(b) Vial 2: 600 gl P647 (10 mg/ml en WFI).
11. A cada vial, añadir 50 gl de PBS 20x para elevar el pH de la disolución a aproximadamente 7.
12. A cada vial, añadir 1,8 ml de CRM197-SMCC desalinizado.
13. Incubar los viales durante 45 min a temperatura ambiente con mezcla lenta (rotación), luego almacene los viales a 4°C hasta el análisis. Durante la incubación, se observó que los precipitados se hicieron visibles en el Vial 2. Sin embargo, los precipitados desaparecieron después de calentar la disolución.
Compendio
Péptido P467-CRM197, aproximadamente 2,449 mg/ml P467, aproximadamente 1,22 mg/ml de CRM197, aproximadamente 2450 gl; en PBS 1 x/EDTA 1 mM, lote 140829-1_am.
Péptido P647-CRM197, aproximadamente 2,449 mg/ml P647, aproximadamente 1,22 mg/ml de CRM197, aproximadamente 2450 gl; en PBS 1 x/EDTA 1 mM, lote 140829-2_am.
Se observó que el conjugado peptídico P647-CRM197 mostró una tendencia a agregarse mientras transcurría la reacción. Con el conjugado peptídico P467-CRM197, no hay agregación visible a simple vista.
Ejemplo 2: Tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia de conjugados de antígeno CRM197 utilizando antisuero E de ratón
Las formulaciones de conjugados fueron analizadas por SDS-PAGE y evaluadas por tinción del gel con azul de Coomassie y por inmunotransferencia, utilizando un suero de ratón generado previamente frente a la combinación de antígenos peptídicos P4, P6 y P7 conjugados con toxoide tetánico (antisuero E).
Tabla 4: Materiales
Procedimiento
Se prepararon dos geles SDS-PA de la siguiente manera:
• La disolución madre de CRM197 (2 mg/ml) se diluyó 1:10 en PBS con un pH de 7,4
• Las disoluciones de anticonjugado se diluyeron 1:10 en PBS con un pH 7,4
• Los péptidos de fusión no conjugados se prepararon como disoluciones madre de 10 mg/ml y se diluyeron 1:20 en PBS con un pH de 7,4
En total, se prepararon 36 gl de cada muestra y se cargaron 15 gl por carril. Se prepararon dos geles idénticos: el Gel 1 se tiñó con azul de Coomassie y el Gel 2 se usó para la transferencia Western. La distribución de muestras en Gel 1 y Gel 2 se resume en la Tabla 5, a continuación:
Tabla 5
Resultados
Gel 1: Tinción con azul de Coomassie
Se sumergió el Gel 1 en tinción Bio-Safe de azul de Coomassie durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación y luego se enjuagó con agua Milli Q durante 1 hora a temperatura ambiente.
Gel 2: Transferencia Western
Después de la electroforesis, se retiró el Gel 2 del casete y se enjuagó brevemente con agua Milli Q. A continuación, se preparó la doble fase de transferencia según las instrucciones del fabricante (BioRad) y se instaló en una máquina Turbo Transfer Blot. Después de la transferencia, se controló la membrana de nitrocelulosa para comprobar la presencia completa de las proteínas marcadoras preteñidas. Sólo quedaron visibles cantidades mínimas de marcador en el gel SDS PA. A continuación, la membrana se incubó en tampón SuperBlock durante 1 hora a temperatura ambiente. El repositorio E de suero murino se diluyó 1:500 en SuperBlock y se incubó en la membrana durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se lavó tres veces con PBS 1x durante 5 min cada vez. A continuación, la membrana se incubó con IgG antirratón (KPL, 074-1802; Ab20), diluida 1:5000 en SuperBlock, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se lavó tres veces con PBS 1 x durante 5 min cada vez y se reveló con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) durante 5 min a temperatura ambiente.
Los resultados mostraron un cambio claro en el peso molecular de cada conjugado de CRM197 hacia pesos moleculares mayores, lo que indica una fuerte conjugación de los péptidos de fusión con CRM197. Las bandas anchas de conjugado observadas en ambos casos también sugirieron la distribución relativamente grande de los péptidos de fusión en la proteína transportadora, como se esperaba de la reacción de conjugación. Los resultados también sugirieron que no queda ninguna cantidad (o es mínima) de proteína CRM197 no conjugada. Por otro lado, se observó una fracción menor de péptidos de fusión, estimada en <10% del total de péptidos de fusión utilizados.
Conclusiones
Se observó un cambio claro en los conjugados CRM197, lo que indica la conjugación satisfactoria de los péptidos de fusión P467 y P647 con la proteína transportadora CRM197.
No se observaron diferencias significativas entre los conjugados P467-CRM197 y P647-CRM197.
Se observó una cantidad limitada de péptidos de fusión libres en ambas reacciones de conjugación.
La inmunotransferencia con el antisuero utilizado demostró cierta reactividad cruzada con la toxina diftérica CRM197, aunque aumentó con los conjugados peptídicos de toxoide tetánico. Confirma el cambio de la molécula CRM197 después de la conjugación, pero como esto no es específico para los dos péptidos de fusión, no se pudo confirmar su conjugación con la proteína. El antisuero tiñe los péptidos de fusión no conjugados libres, con P467 ligeramente mejor que P647.
Ejemplo 3: Inmunotransferencia de conjugados de antígeno CRM197 usando antisuero D de ratón
Las formulaciones de conjugados se analizaron mediante SDS-PAGE y se evaluaron mediante inmunotransferencia utilizando un suero de ratón generado previamente frente a la combinación de antígenos peptídicos P4, P6 y P7 conjugados con virosomas de influenza (antisuero D). La presencia de los péptidos de fusión P467 y P647 en la proteína transportadora CRM197 se confirmó por separado mediante una inmunotransferencia con antisuero D.
Tabla 6: Material
Procedimiento
Se preparó un gel SDS-PA de la siguiente manera:
Todas las disoluciones que comprendían CRM197, conjugados de péptido de fusión-CRM197 o péptidos de fusión no conjugados se diluyeron a 1 mg/ml en PBS con un pH de 7,4. En total, se prepararon 36 pl de cada muestra y se cargaron 15 pl por carril. La distribución de muestras en Gel 1 y Gel 2 se resume en la Tabla 7, a continuación:
Tabla 7:
Resultados
Transferencia Western - Después de la electroforesis, se retiró el gel del casete y se enjuagó brevemente con agua Milli Q. Se preparó una fase doble de transferencia según las instrucciones del fabricante (BioRad) y se instaló en una máquina Turbo Transfer Blot. Después de la transferencia, se controló la presencia completa de las proteínas marcadoras preteñidas en la membrana de nitrocelulosa. Sólo quedaron visibles cantidades mínimas de marcador en el gel SDS PA. A continuación, se incubó la membrana de nitrocelulosa en una disolución salina leche al 5% tamponada con fosfato con Tween 20 (MPBST, por sus siglas en inglés) durante 1 hora a temperatura ambiente.
El repositorio D de suero murino se diluyó 1:500 en MPBST y se incubó en la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la membrana tres veces con MPBST 1 x durante 5 min cada vez y luego se incubó con IgG antirratón (KPL, 074-1802; Ab20), diluida 1:5000 en MPBST, durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la membrana tres veces con MPBST 1 x durante 5 min cada vez y se reveló con disolución de TMB durante 10 min a temperatura ambiente.
Conclusiones
La inmunotransferencia con el antisuero D usado mostró reactividad únicamente con los conjugados de CRM197-péptido de fusión. No se observó reactividad cruzada con la CRM197 no conjugada. Estos resultados indicaron que una cantidad significativa de péptido de fusión se conjugó con la proteína transportadora y confirman que el cambio observado en la migración en el gel para los conjugados de CRM197-péptido de fusión se debe a la conjugación de los péptidos de fusión con la proteína transportadora, y no al entrecruzamiento intermolecular de la CRM197. Se detectó una señal atribuida a los péptidos de fusión no conjugados libres, bien porque el antisuero no reacciona con ellos o bien porque los péptidos de fusión migraron al fondo del gel y no se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa.
El antisuero D reaccionó ligeramente más fuerte con el conjugado P647-CRM197 que con el conjugado P467-CRM197. Los resultados sugirieron que el antisuero reaccionó más intensamente con los péptidos de fusión conjugados que con los péptidos de fusión libres.
Ejemplo 4: Transferencia por manchas de P467-CRM197 y P647-CRM197
La presencia de los péptidos de fusión P467 y P647 en la proteína transportadora CRM197 también se confirmó en un experimento de transferencia por manchas utilizando antisuero D.
Muestras
• CRM197, 1 mg/ml en PBS pH 7,4;
• antígeno P467, 1 mg/ml en PBS pH 7,4;
• antígeno P647, 1 mg/ml en PBS pH 7,4;
• P467-CRM197, 1 mg/ml en PBS pH 7,4 (concentración calculada); y
• P647-CRM197, 1 mg/ml en PBS pH 7,4 (concentración calculada).
Tabla 8: Material
Procedimiento
Se usó una membrana de nitrocelulosa precortada y se dibujaron líneas con un lápiz. Se realizaron disoluciones dobles de cada muestra en PBS a pH 7,4 en tubos Eppendorf, comenzando con 1 mg/ml (1 pg/pl). Las concentraciones teóricas por mancha (1 pl) fueron 1 pg/500 ng/250 ng/125 ng/62,5 ng/31,25 ng. Para cada mancha, se transfirió aproximadamente 1 pl de cada muestra a la membrana (por duplicado), como se describe a continuación:
• Línea A: CRM197;
• Línea B: Antígeno P467 (péptido de fusión libre sin conjugación lipídica);
• Línea C: Antígeno P647 (péptido de fusión libre sin conjugación lipídica);
• Línea D: P467-CRM197 (comenzando con 1 gg de péptido de fusión y 0,5 gg de CRM197); y
• Línea E: P647-CRM197 (comenzando con 1 gg de péptido de fusión y 0,5 gg de CRM197)
Se dejó secar la membrana al aire durante 10 min a temperatura ambiente y posteriormente se bloqueó con leche al 5% en PBST (MPBST) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se incubó la membrana con el anticuerpo primario (repositorio D de antisuero murino, diluido 1:500 en MPBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la membrana tres veces con MPBST durante 5 min cada una y luego se incubó con anticuerpo secundario (IgG antirratón; KPL, 074-1802; Ab20; diluido 1:5000 en MPBST) durante 30 min a temperatura ambiente. Después de esta incubación, se lavó la membrana tres veces con MPBST durante 5 min cada vez y luego se incubó con disolución de TMB a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 min, seguido de un lavado con agua Milli Q antes del secado.
Conclusiones
La transferencia de manchas con el antisuero D de ratón mostró reactividad únicamente con los conjugados de CRM197-péptido de fusión. Hubo una reactividad cruzada mínima con la proteína CRM197 no conjugada. Dado que la cantidad de CRM197 en los conjugados fue de alrededor del 50% en comparación con la cantidad de péptido de fusión, el segundo plano mínimo en esta muestra probablemente se debió a la reactividad cruzada con la variante de la toxina diftérica.
Los péptidos de fusión libres (no conjugados) (péptidos de fusión sin conjugado de lípidos) dieron una señal con el antisuero solo en el caso de P647, pero no con P467. La razón de esto no es inmediatamente clara. Sin embargo, en las primeras disoluciones de muestra de P647, la señal fue algo más débil que en las siguientes disoluciones. Esto puede indicar la presencia de un inhibidor al sitio de unión del anticuerpo o una unión reducida a la membrana de nitrocelulosa. Se desconoce la naturaleza de este inhibidor, pero puede atribuirse al DMSO que se usó originalmente para preparar la solución madre de alta concentración del péptido de fusión (10 mg/ml).
El antisuero D de ratón reaccionó muy intensamente con los conjugados P467-CRM197 y P647-CRM197, confirmando la conjugación de la mayoría de los péptidos de fusión con la proteína transportadora.
Debido a la desigual reactividad en antisuero de los péptidos de fusión libres en comparación con los conjugados de péptido de fusión-CRM197, no fue posible cuantificar la cantidad de antígeno. Sin embargo, como no se aplicaron etapas de purificación después de la reacción de conjugación, es aceptable calcular con las concentraciones iniciales teóricas para los péptidos de fusión.
En resumen, los resultados sugieren que el antisuero reaccionó más intensamente con los péptidos de fusión conjugados que con los péptidos de fusión libres.
Ejemplo 5: Preparación de muestras para estudios de titulación de dosis en ratones
A continuación se describe la preparación de conjugados de péptido de fusión-CRM197 para experimentos de titulación de dosis en ratones.
Tabla 9: Material
Procedimiento
Para la preparación de muestras para estudios en animales, las disoluciones de reacción conjugadas se diluyeron a una concentración diana definida. Para las siguientes preparaciones, se supuso que la eficacia de conjugación del péptido con la proteína era de al menos el 90%.
Preparación de muestras para los grupos de dosis elevadas (Grupo 1):
Se esperaba que estas muestras contuvieran aproximadamente 420 gg de péptido de fusión conjugado por tubo (1,2 mg/ml):
Tubo 1:
• 1045 gl de P467-CRM197
• 880 gl de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se mezcló bien y se transfirieron 350 gl a cinco viales de vidrio (2,5 ml cada uno) y se etiquetaron de la siguiente manera: P467-CRM197; Grupo 1 - Dosis elevada; concentración estimada de P467: ~1,2 mg/ml; lote 140903-1_am.
Tubo 2:
• 1045 gl de P647-CRM197 (fuertemente agitado antes de pipetear)
• 880 gl de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se mezcló bien y se transfirieron 350 gl a cinco viales de vidrio (2,5 ml cada uno) y se etiquetaron de la siguiente manera: P647-CRM197; Grupo 1 - Dosis elevada; concentración estimada de P647: ~1,2 mg/ml; lote 140903-4_am.
Preparación de muestras para los grupos de dosis medias (Grupo 2):
Se esperaba que estas muestras contuvieran aproximadamente 210 gg de péptido de fusión conjugado por tubo (0,6 mg/ml):
Tubo 1:
• 525 gl de P467-CRM197
• 1400 gl de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se mezcló bien y se transfirieron 350 gl de cada uno a cinco viales de vidrio de 2,5 ml y se etiquetaron como sigue: P467-CRM197; Grupo 2 - Dosis medias; concentración estimada de P467: ~0,6 mg/ml; lote 140903-2_am. Tubo 2:
• 525 gl de P647-CRM197 (fuertemente agitado antes de pipetear)
• 1400 gl de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se agitó bien y se transfirieron 350 gl a cinco viales de vidrio de 2,5 ml y se etiquetaron de la siguiente manera: P647-CRM197; Grupo 2 - Dosis medias; concentración estimada de P647: ~0,6 mg/ml; lote 140903-5_am. Preparación de muestras para los grupos de dosis bajas (Grupo 3):
Se esperaba que estas muestras contuvieran aproximadamente 105 gg de péptido de fusión conjugado por tubo (0,3 mg/ml):
Tubo 1:
• 262 Ml de P467-CRM197
• 1663 Ml de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se mezcló bien y se transfirieron 350 mI de cada uno a cinco viales de vidrio de 2,5 ml y se etiquetaron como sigue: P467-CRM197; Grupo 3 - Dosis bajas; concentración estimada de P467: ~0,3 mg/ml; lote 140903-3_am. Tubo 2:
• 262 mI de P647-CRM197 (fuertemente agitado antes de pipetear)
• 1663 Ml de (1x) PBS pH 7,4
Esta disolución se agitó bien y se transfirieron 350 Ml de cada uno a cinco viales de vidrio de 2,5 ml y se etiquetaron de la siguiente manera: P647-CRM197; Grupo 3 - Dosis bajas; concentración estimada de P647: ~0,3 mg/ml; lote 140903-6_am.
Ejemplo 6: Estudios de inmunización
Antígenos peptídicos
Se sintetizaron dos péptidos de fusión, P467 (SEQ ID NO: 8) y P647 (SEQ ID NO: 9) en Bachem (Suiza). Ambos híbridos se acoplaron a virosomas (envolturas virales del virus de la influenza A/Brisbane/59/2007 inactivado) que son adecuados como sistema de administración de antígenos y no requieren adyuvantes adicionales. Se probaron tres concentraciones, calculadas para la cantidad del péptido de fusión: 15 Mg, 30 Mg y 50 Mg por inyección. A modo de comparación, ambos péptidos de fusión se acoplaron a CRM197 y se usaron en un experimento directo a una concentración de 30 Mg por inyección. Todos los procedimientos de conjugación (CRM y virosomas) se llevaron a cabo en Mymetics (Suiza).
Las formulaciones virosómicas se recibieron congeladas y formaron una suspensión turbia después de descongelarlas.
Después del acoplamiento, el conjugado de CRM-P647 se recibió como una formulación precipitada, mientras que CRM-P467 permaneció soluble en tampón a base de agua.
Los tres epítopos de célula B derivados de Her-2/neu P4 (SEQ ID NO: 3), P6 (SEQ ID NO: 1) y P7 (SEQ ID NO: 2) se sintetizaron y acoplaron a KLH (hemocianina de lapa de ojo de cerradura) en piChem (Austria) y se utilizaron como antígenos de recubrimiento para evaluar las respuestas de anticuerpos a péptidos individuales mediante ELISA. Para evaluar las respuestas de anticuerpos dirigidas a los péptidos de fusión no conjugados, se usaron P467 y P647 como antígenos de recubrimiento en los ensayos ELISA.
Protocolo de inmunización
Se inmunizaron ratones hembra Balb/C por vía subcutánea en intervalos de 2-3 semanas según el siguiente diseño de estudio:
Los grupos que recibieron conjugados virosómicos fueron sensibilizados una vez con el virus de la influenza inactivado (A/Brisbane/59/2007 Inactivado). Las inmunizaciones con construcciones conjugadas comenzaron 16 días después de la sensibilización. Todas las formulaciones virosómicas se recibieron listas para su uso y se aplicaron 100mI por inyección sin aditivos.
Se diluyeron soluciones madre de conjugados de CRM-péptido de fusión con una disolución de NaCl y se mezclaron con una suspensión en gel de hidróxido de aluminio antes de la administración por inyección. Se agitó CRM-P647 (precipitado) y la suspensión se usó de la misma manera que CRM-P467.
Los grupos de control recibieron virosomas vacíos (TIRIV) o una disolución de NaCI más hidróxido de aluminio. Animales
60 Ratones hembra Balb/C, 6-8 semanas en el momento del parto (29.10.2014), origen: Charles River, Alemania. 10 grupos: n=5 ratones por grupo - Instalación para animales: Hospital general de Viena/Unidad biomédica.
Grupos
• Grupo A - virosomas vacíos (TIRIV) - 100 Ml/ratón;
• Grupo B - P467-virosomas - 50 Mg/ratón en 100 mI;
• Grupo C - P467-virosomas - 30 pg/ratón en 100 pl;
• Grupo D - P467-virosomas - 15 pg/ratón en 100 pl;
• Grupo E - P647-virosomas - 50 pg/ratón en 100 pl;
• Grupo F - P647-virosomas - 30 pg/ratón en 100 pl;
• Grupo G - P647-virosomas - 15 pg/ratón en 100 pl;
• Grupo H - NaCl hidróxido de aluminio (control) -100 pl/ratón;
• Grupo I - P467-CRM hidróxido de aluminio - 30 pg/ratón en 150 pl; y
• Grupo J - P647-CRM hidróxido de aluminio - 30 pg/ratón en 150 pl.
Se extrajo sangre antes de la inmunización, tres semanas después de la 2a inmunización, dos semanas después de la 3a inmunización y dos semanas después de la 4a inmunización. Luego, las muestras de sangre se analizaron para:
• Títulos de anticuerpos (IgG) específicos a péptido;
• Títulos de anticuerpos (IgG) específicos a constructos;
• Títulos de anticuerpos específicos para Her-2/neu extracelular recombinante (IgG); y
• Especificidad al Her-2/neu nativo expresado en células cancerosas SKBR-3.
Protocolos ELISA
(1) ELISA específico a péptidos
Las placas de microtitulación se recubrieron con conjugados de péptido de fusión KLH a 0,5 pg/pocillo. Para la estimación del segundo plano, los pocillos se recubrieron solo con KLH. Después del bloqueo, se añadieron sueros diluidos. La IgG unida se detectó con anticuerpo marcado con HRP (IgG de conejo antirratón POX, fragmento Fc específico, N.° 315-035-008; Jackson Immuno Research) y la subsiguiente tinción con TMB. Las placas se leyeron después de agregar la disolución de detención a 450 frente a 630 nm.
(2) ELISA específico de péptidos de fusión
Los péptidos de fusión no modificados P467 y P647 se usaron como antígenos de recubrimiento a una concentración de 0,5/pg/pocillo en tampón de carbonato. A continuación, se añadieron sueros diluidos y se analizaron como se describe en el protocolo específico de péptido anterior.
(3) ELISA específico a Her-2/neu extracelular
Se uso una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular recombinante de Her-2/neu humano (residuos de aminoácidos 23-652 de Her2/neu) y la región Fc de la IgG 1 humana (quimera ErbB2/Fc, n° de catálogo 1129-ER R&D Systems) como antígeno de recubrimiento. Las placas se recubrieron con 0,1 pg/pocillo de proteína y BSA al 0,1% para la estimación del segundo plano. A continuación, se añadieron sueros diluidos y se analizaron, como se ha descrito anteriormente, después de sustraer la señal del segundo plano de los pocillos solo de BSA.
(4) Ensayo celular específico a Her-2/neu utilizando células SKBR3
Se usó la línea celular de cáncer de mama humano SKBR-3 (HTB30, ATCC, EE. UU.) que sobreexpresa Her-2/neu como fuente de proteína Her2/neu nativa. Las células se recogieron tres días después del pase y se almacenaron a -80°C. La lisis celular se realizó como se describió previamente en Godell V y Disis ML J. Immunol. Meth (2005), con algunas modificaciones menores: Variante 1: las placas se recubrieron con el anticuerpo humanizado anti-Her-2/neu Herceptin (proporcionado por el Hospital general de Viena); Variante 2: las placas se recubrieron con el anticuerpo humanizado anti-Her-2/neu Perjeta (proporcionado por el Hospital general de Viena). El contenido de proteínas en los lisados celulares se cuantificó con el equipo de ensayo proteico Pierce BCA n° 23227 directamente antes de su uso. Los lisados se diluyeron a una concentración de 100 pg/pocillo en BSA/PBS al 1%. Después del bloqueo, los lisados celulares se añadieron a los pocillos. Para controlar el segundo plano individual, se añadió BSA/PBS. Para la detección de la IgG, se utilizó IgG de oveja antirratón ligada a HRP (Amersham/GE Healthcare). La tinción con TMB se realizó como se indicó anteriormente. Para cada muestra de suero, el valor de la DO se calculó como la diferencia entre la lectura de la DO de los pocillos recubiertos con SKBR-3 menos la de los pocillos recubiertos con BSA.
Ejemplo 7: Anticuerpos específicos a péptidos
Se usaron sueros del sangrado final (es decir, después de cuatro inmunizaciones). Se analizaron diferentes disoluciones de sueros de ratones inmunizados con virosoma y CRM197, de la siguiente manera:
• Grupos tratados con formulaciones virosómicas: disolución 1:5.000;
• Grupos tratados con conjugados de CRM-péptidos de fusión: disolución 1:100.000.
Los datos se representaron en valores de DO. Se restó el segundo plano de los pocillos revestidos con KLH (véanse las Figuras 1-3).
Resultados
Se obtuvieron anticuerpos contra los tres péptidos individuales en todos los grupos de tratamiento (Grupos B-G e I-J). No se detectaron anticuerpos específicos de péptido en los grupos de control (Grupos A y H). Se observaron diferencias notables en los títulos de anticuerpos.
Cuatro inmunizaciones con los conjugados de CRM-péptido de fusión indujeron títulos de anticuerpos aproximadamente diez veces más altos para los tres péptidos individuales en comparación con cuatro inmunizaciones con las formulaciones virosómicas correspondientes.
Ambos constructos (P467 y P647), independientemente de la pareja de acoplamiento, indujeron el título de anticuerpos más alto contra el epítopo de célula B P7 (SEQ ID NO: 2), mientras que los títulos más bajos se indujeron contra el epítopo de célula B P4 (SEQ ID NO: 3).
Como se muestra en las Figuras 4 y 5, también se produjeron anticuerpos que se unieron a los péptidos de fusión. Estos resultados se derivaron de experimentos en los que se usaron sueros del sangrado final después de la cuarta inmunización. Para los grupos inmunizados con virosomas, los sueros se diluyeron 1:5.000. Para los grupos inmunizados con los conjugados de CRM197-péptido de fusión, los sueros se diluyeron 1:100.000. Los datos representados en las Figuras 4 y 5 se dan en valores DO. Según los resultados específicos de péptido que se muestran en las Figuras 1-3, se observaron títulos de anticuerpos aproximadamente diez veces más altos en los grupos inmunizados con los conjugados de CRM197-péptido de fusión en comparación con los inmunizados con las formulaciones virosómicas correspondientes. En general, se observaron títulos más altos para P647 que para P467.
Ejemplo 8: Cinética de anticuerpos en el curso de la inmunización con conjugados de CRM
Se extrajo sangre dos semanas después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a y se midieron los anticuerpos específicos para ambos péptidos de fusión (P467 y P647) (los sueros se diluyeron 1:100.000). Como se muestra en las Figuras 6 y 7, los títulos de anticuerpos específicos de la proteína de fusión ya eran bastante altos después de la 2a inmunización y aumentó ligeramente después de las inmunizaciones 3a y 4a. El pequeño aumento en los títulos de anticuerpos específicos de la proteína de fusión después de las inmunizaciones 3a y 4a indican que dos o tres inmunizaciones (es decir, dos o tres dosis consecutivas) con un conjugado de CRM197-péptido de fusión puede ser suficiente para generar una respuesta inmunitaria eficaz. (BA1- extracción de sangre después de dos inmunizaciones; BA2- extracción de sangre después de tres inmunizaciones; BA2- extracción de sangre después de cuatro inmunizaciones).
Ejemplo 9: Anticuerpos específicos al Her-2/neu extracelular
Se extrajo sangre en dos momentos: BA1 (sangre extraída después de dos inmunizaciones) y BA2 (sangre extraída después de tres inmunizaciones). Se analizaron diferentes disoluciones de sueros: los sueros de los grupos inmunizados con formulaciones virosómicas se diluyeron 1:400 y los sueros de los grupos inmunizados con conjugados de CRM-péptido de fusión se diluyeron 1:2.000. Los datos representados en la Figura 8 son valores de DO.
Como se muestra en la Figura 8, ambos constructos de péptidos de fusión (conjugados con virosoma y con CRM197) indujeron la unión de anticuerpos a la proteína de Her-2/neu extracelular recombinante. No se observó una reactividad significativa de Her-2/neu en los ratones tratados con simulación y en los sueros previos a la inmunización. Según los resultados específicos al péptido y a los péptidos de fusión, se observaron títulos específicos a1 Her-2/neu significativamente más altos en los grupos inmunizados con conjugados de CRM-péptido de fusión en comparación con las formulaciones virosómicas a una concentración de 30 pg. También se observó un título de anticuerpos significativo después de la tercera inmunización con virosomas. En ratones ya inmunizados con conjugados de CRM-péptido de fusión después de la 2a inmunización, los títulos de anticuerpos eran altos, lo que no aumentó notablemente después de la 3a inmunización.
El análisis de los títulos de anticuerpos en suero después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a reveló diferentes cinéticas de respuestas de anticuerpos con conjugados de virosomas en comparación con conjugados de CRM. Después de los 2a inmunización (6 semanas después del comienzo de la inmunización) se observaron títulos de anticuerpos más altos en animales inmunizados con conjugados de CRM-péptido de fusión en comparación con conjugados de virosoma (véase la Figura 9). Después de la 3a inmunización con el conjugado de virosoma, se observó un aumento significativo en el título de anticuerpos (véase la Figura 8). Después de la 4a inmunización, los títulos de anticuerpos
específicos de Her-2/neu fueron comparables entre los ratones inmunizados con virosoma y CRM (véase la Figura 10). En ratones inmunizados con los conjugados de CRM-péptido de fusión, hubo un pequeño aumento en el título de anticuerpos entre las inmunizaciones 3a y 4a, lo que indica una fuerte inmunogenicidad después de la 2a inmunización, con una inmunogenicidad aún más fuerte después de la 3a inmunización (véase la Figura 11).
Como se muestra en la Figura 12, una comparación de la cinética de las respuestas de anticuerpos contra Her-2/neu recombinante después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a con 30 gg del conjugado P467-virosoma o 30 gg del conjugado P467-CRM revela que, incluso después de la 2a inmunización, el título de anticuerpos anti-Her-2/neu después de la inmunización con el conjugado de CRM (cuarta columna en cada grupo) fue significativamente más alto que el título de anticuerpos después de la inmunización con el conjugado de virosoma correspondiente (tercera columna en cada grupo). Después de la 4a inmunización, ambos conjugados conducen a títulos de anticuerpos anti-Her-2/neu recombinantes comparables.
Como se muestra en la Figura 13, una comparación de la cinética de las respuestas de anticuerpos contra Her-2/neu recombinante después de las inmunizaciones 2a, 3a y 4a con 30 gg del conjugado P647-virosoma o 30 gg del conjugado P647-CRM revela que, incluso después de la 2a inmunización, el título de anticuerpos anti-Her-2/neu después de la inmunización con el conjugado de CRM (cuarta columna en cada grupo) fue significativamente más alto que el título de anticuerpos después de la inmunización con el conjugado de virosoma correspondiente (tercera columna en cada grupo).
Estos resultados demuestran la llamativa diferencia en la cinética de los títulos de anticuerpos específicos de Her-2/neu utilizando virosomas o CRM197 como sistema de administración de los péptidos de fusión. El aumento de los títulos de anticuerpos observado con los conjugados de virosoma fue significativamente más lento que con los conjugados de CRM y, por lo general, se necesitaron cuatro inmunizaciones (en relación con el péptido de fusión P467) para alcanzar niveles similares a los observados con las correspondientes inmunizaciones de CRM. En relación con el péptido de fusión P647, los conjugados de virosoma fueron inferiores a los conjugados de CRM, ya que no indujeron títulos de anticuerpos comparables incluso después de la 4a inmunización (Figura 13).
Ejemplo 10: Especificidad a la proteína Her-2/neu nativa
Se analizaron los sueros derivados de la muestra de sangre final extraída después de cuatro inmunizaciones. Los datos se presentan como valores de DO y todos los sueros se diluyeron 1:100.
Como se muestra en la Figura 14, los anticuerpos generados reconocieron la forma nativa de Her-2/neu que se sobreexpresa en las células de cáncer de mama SKBR-3. Las disoluciones bajas de suero fueron necesarias para trabajar dentro del intervalo del ELISA con lisado celular no purificado y estaban en línea con los datos previos de los inventores. A pesar de los títulos de anticuerpos significativamente más bajos contra los péptidos y la proteína Her-2/neu extracelular recombinante en los grupos inmunizados con conjugados de virosoma, los valores de DO fueron comparables entre los conjugados de virosoma y de CRM197-péptido de fusión. Estos resultados podrían explicarse por la reactividad de los anticuerpos generados contra el enlace lipídico o algunas partes de los virosomas con componentes en los lisados de células SKBR-3 (por ejemplo, membranas celulares). Este enlace no está presente en los conjugados de CRM197-péptido de fusión.
Ejemplo 11: Evaluación de respuestas inmunitarias tras la inmunización con péptido P467-CRM con Alum/Al(OH)3 o Montanide™
Preparación de reactivos
La proteína de fusión P467 (49 aminoácidos de longitud; sintetizada en Bachem, Suiza) se acopló a CRM197 (mutante de toxina diftérica; PiChem/Graz/Austria) y se administró a una concentración de solución madre de 0,4 mg/ml. Se evaluó una respuesta inmunitaria mediada por P467-CRM en ratones en presencia o ausencia de tres adyuvantes:
1) ALHIDROGEL®"85" (Hidróxido de aluminio de Brenntag, Dinamarca; contenido de aluminio 10 mg/ml, lote n° 85563; usado a una disolución de 1/10 según las instrucciones del fabricante);
2) Suspensión Alu-Gel-S (Hidróxido de aluminio de Serva, Alemania; 1,3% de pureza, estéril, contenido de aluminio 5,9-7,1 mg/ml, n° de catálogo 12261, n° de lote 111589; utilizado con una disolución de 1/3 según con las instrucciones del fabricante); y
3) Montanide ISA 51VG (de Seppic, Francia, n° de catálogo 36362ZFL2R3; n° de lote 2423395).
El protocolo de inmunización se describe en “Protocolo de inmunización", a continuación. Sucintamente, se ensayaron tres concentraciones de constructo peptídico: 10 gg, 25 gg y 50 gg por inyección. El hidróxido de aluminio de Serva, que se había utilizado en los estudios con animales descritos en los Ejemplos anteriores, se probó en dos grupos de ratones (véase 'Protocolo de inmunización) y en comparación con el uso de hidróxido de aluminio de Brenntag. La cantidad de P467-CRM utilizada con hidróxido de aluminio de Serva en estos dos grupos fue de 10 gg y 25 gg.
Emulsificación del constructo peptídico con Montanide™
Se realizó la emulsificación de P467-CRM, PBS o NaCI con Montanide™ según las instrucciones del fabricante (Seppic, Francia). El constructo peptídico de P467-CRM se mezcló ya fuera con PBS (para hidróxido de aluminio, Brenntag) o NaCl (para hidróxido de aluminio, Serva). A continuación, se añadieron los adyuvantes a la disolución y se agitaron completamente a temperatura ambiente. A continuación, las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 45 minutos antes de la administración.
Protocolo de inmunización
Ratones hembra Balb/C (Charles River, Alemania, 6-8 semanas en el momento del parto) se inmunizaron por vía subcutánea a intervalos de 3 semanas (n= 8 ratones por grupo; grupos de control n=4).
Grupos de ratones, es decir, A a O, fueron inmunizados de la siguiente manera:
Grupo A (P467-CRM, 10 gg/Inyección): 250 gl de P467-CRM junto con 1250 gl de NaCl (1500 gl). 150 gl/ratón (=10 gg/ratón)
Grupo B (P467-CRM, 25 gg/inyección): 625 gl de P467-CRM junto con 875 gl de NaCl (1500 gl). 150 gl/ratón (=25 gg/ratón)
Grupo C (P467-CRM, 50 gg/Inyección): 1250 gl de P467-CRM junto con 250 gl de NaCl (1500 gl). 150 gl/ratón (=50 gg/ratón)
Grupo D (P467-CRM-Alum Brenntag, 10 gg/inyección): 250 gl de P467-CRM junto con 175 gl de Alum Brenntag+1325 gl de PBS (1750 gl). 175 gl/ratón (=10 gg/ratón)
Grupo E (P467-CRM-Alum Brenntag, 25 gg/inyección): 625 gl de P467-CRM junto con 175 gl de Alum Brenntag+950 gl de PBS (1750 gl). 175 gl/ratón (=25 gg/ratón)
Grupo F (P467-CRM-Alum Brenntag, 50 gg/Inyección): 1250 gl de P467-CRM junto con 175 gl de Alum Brenntag+325 gl de PBS (1750 gl). 175 gl/ratón (=50 gg/ratón)
Grupo G (P467-CRM-Alum Serva, 10 gg/Inyección): 250 gl de P467-CRM junto con 1000 gl de Alum Serva+250 gl de NaCl (1500 gl). 150 gl/ratón (=10 gg/ratón)
Grupo H (P467-CRM-Alum Serva, 25gg/inyección): 625 gl de P467-CRM junto con 1000 gl de Alum Serva (1625 gl).
160 gl/ratón (=10 gg/ratón)
Grupo I (P467-CRM-Montanide, 10 gg/Inyección): 300 gl de P467-CRM junto con 300 gl de NaCl+600 gl de Montanide.
100 gl/ratón
Grupo J (P467-CRM-Montanide, 25 gg/Inyección): 700 gl de P467-CRM junto con 700 gl de Montanide. 126 gl/ratón Grupo K (P467-CRM-Montanide, 50 gg/Inyección): 1300 gl de P467-CRM junto con 1300 gl de Montanide. 252 gl/ratón Grupo L (P467-Monómero, 25 gg/inyección): 250 gl de P467-CRM junto con 1250 gl de NaCl. 150 gl/ratón (=25 gg/ratón)
Grupo M (Montanide): 1000 gl de NaCl+1000 gl de Montanide. 252 gl/ratón
Grupo N (Alum Brenntag): 1575 gl de PBS+175 gl de alumbre Brenntag. 175 gl/ratón
Grupo O (CRM, 50 gg/inyección): Concentración de solución madre: 2mg/ml. Diluida 1:4 en NaCl (150+450 NaCl).
100 gl/ratón
Los grupos de control recibieron CRM, hidróxido de aluminio (Brenntag) o Montanide™ solo.
Se recolectó sangre de los animales antes de la primera dosis (BA0), 20 días después de la 2a inmunización (BA1) y 18 días después de la 3a inmunización (BA2). Para la evaluación de la cinética del título de anticuerpos, también se extrajo sangre 8 semanas después de la 3a inmunización (BA3).
En los 4 ratones restantes de cada grupo (excepto los grupos de control M, N y O en los que se sacrificaron todos los ratones), se evaluaron adicionalmente los títulos de anticuerpos a las 8 y 16 semanas después de la 3a inmunización (BA4 y BA5, respectivamente) para determinar la cinética del anticuerpo y los intervalos de refuerzo necesarios. Preparación y cultivo de células del bazo
Se sacrificaron los ratones (n=4/grupo) y se extrajeron sus bazos en condiciones asépticas, se trituraron y se filtraron a través de filtros estériles. Se prepararon suspensiones celulares como se ha descrito anteriormente (Wiedermann et al, Int. inmunol., 1999; Oct: 11 (10): 1717-24). Los esplenocitos se colocaron en placas a una concentración de 0,5 x 106 por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos y estimulados con CRM o P467 a una concentración de 20
gg/ml durante 72 horas. Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta su análisis. La estimulación con ConA se llevó a cabo como control.
Protocolos ELISA
(i) Medición de niveles de anticuerpos específicos a péptidos
Se usó el péptido de fusión P467 no conjugado (Bachem, Suiza), diluido en tampón de carbonato, como antígeno de recubrimiento a una concentración de 0,5 gg/pocillo de microtitulación. Los sueros (n=8/grupo) se diluyeron, se añadieron a los pocillos y se detectaron los anticuerpos de IgG unidos con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) marcada con IgG de conejo antirratón POX (fragmento Fc específico, n.° de catálogo 315-035 008; Jackson Immuno Research) seguido de la adición de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Se añadió una disolución de detención y se leyeron las placas a 450 frente a 630 nm.
Para la detección de los subconjuntos IgG 1 e IgG2a de IgG, se aplicaron los sueros disoluciones a los pocillos recubiertos con antígeno de una placa de microtitulación, seguido por ya sea anticuerpos IgG1 de rata antirratón o IgG2a de rata antirratón. A continuación, se usó un anticuerpo secundario IgG de ratón antirrata marcado con HRP para la detección, seguido por TMB. Se añadió una disolución de detención y se leyeron las placas a 450 frente a 630 nm.
(ii) Medición de niveles de anticuerpos específicos a Her-2/neu
Los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular recombinante de Her-2/neu humano (residuos de aminoácidos 23-652) conjugado con la región Fc de la IgG 1 humana. Cada pocillo se recubrió con 0,1 gg de la proteína de fusión. A continuación, se analizaron los sueros de ratones diluidos, como se ha descrito anteriormente.
Para la detección de los subconjuntos IgG1 e IgG2a de IgG, se aplicaron los sueros diluidos al pocillo recubierto con antígeno, seguido de la adición de IgG1 de rata antirratón o IgG2a de rata antirratón. Para la detección se usó un anticuerpo secundario IgG (H+L) de ratón antirrata marcado con HRP.
(iii) Medición de la producción de citoquinas in vitro IL-2, IL-5 e IFNy
Los sobrenadantes de esplenocitos estimulados con CRM o P467 se recolectaron y analizaron para determinar la concentración de IL-2, IL-5 e IFNy mediante ELISA según las instrucciones del fabricante (Affymetrix eBioscience, EE. UU.). Los sobrenadantes se usaron sin diluir o diluidos 1:10 - 1:20 antes del análisis.
Análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Se realizó FACS en células del bazo recién aisladas (2,5 x 106 células/ml en placas de fondo plano de 24 pocillos). Las células se incubaron durante 2 horas en presencia de acetato de miristato de forbol (PMA, por sus siglas en inglés; 10 ng/ml) e ionomicina (1,25 gM) y durante 4 horas adicionales a 37°C en presencia de Brefeldin A (10 gg/ml). A continuación, las células se mantuvieron a 4°C durante la noche y se tiñeron a la mañana siguiente con anticuerpos antirratón contra las siguientes dianas:
(i) Protocolo de tinción:
Las células se recogieron y se dividieron en tubos micrónicos (1 x 106/células por tubo). Se realizó una única tinción para cada muestra de ratón con el cóctel de anticuerpos mencionado anteriormente.
A continuación, las células se lavaron, se bloquearon con bloque Fc (CD16/32 antirratón) y se tiñeron con anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, CD19 y CD335, seguido de la fijación/permeabilización y tinción intracelular para IFNy y Granzima B.
Se realizaron análisis para la caracterización de las poblaciones de esplenocitos: células T (CD3+CD4+ y CD3+CD8+), células B (CD3-CD19+) y células NK (CD3-CD335+). Los análisis también incluyeron la detección de la proteína IFNy intracelular.
Análisis estadístico
Se aplicó la prueba t no pareada (dos colas, intervalos de confianza del 95%) en Prism para el análisis de los resultados de ELISA. Se indican diferencias significativas con uno o más asteriscos (* valor P <0,05, ** 0,01<valor P<0,001, *** valor de P <0,001). La falta de significación se indica como 'ns'. Cuando se compararon más de dos grupos se aplicó un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) en Prism. Para el análisis de los resultados de FACS se aplicó en Prism el ensayo de Mann Whitney (dos colas, intervalos de confianza del 95%).
Resultados
Respuestas humorales
(i) Niveles de anticuerpos específicos a péptidos
Los sueros derivados del sangrado final después de tres inmunizaciones, así como los sueros previos a la inmunización, se diluyeron a 1:100.000 (para IgG e IgG1) o a 1:100 (para IgG2a). Los títulos de anticuerpos para IgG, IgG1 e IgG2a en suero total se muestran en las Figuras 15A-C, respectivamente.
En las figuras, los siguientes grupos (enmarcados) se compararon entre sí y se evaluaron estadísticamente:
• D, E, F: Alumbre: 10 pg, 25 pg, 50 pg
• I, J, K: Montanide™: 10 pg, 25 pg, 50 pg
Los datos muestran que se provocaron anticuerpos anti P467 en todos los ratones inmunizados con P467-CRM. No se indujo ninguna respuesta de anticuerpos en los animales de control ni en los ratones inmunizados con P467 solo. En comparación con alumbre (Brenntag), los niveles de anticuerpos para IgG, IgG1 e IgG2a fueron significativamente más altos cuando se administró P467-CRM con Montanide™. Los títulos de IgG2a fueron generalmente más bajos que los de IgG1, aunque fue evidente que los títulos de IgG2a fueron considerablemente más altos en animales inmunizados con P467-CRM Montanide.
(ii) Niveles de anticuerpos específicos a Her-2/neu
Los sueros derivados del sangrado final después de tres inmunizaciones y los sueros previos a la inmunización se diluyeron a 1:2500 (a 10.000) (IgG), a 1:10.000 (IgG 1) y a 1:100 (IgG2a). En las Figuras 16A-C, se muestran los títulos de anticuerpos para IgG, IgG 1 e IgG2a en suero, respectivamente.
Los títulos altos de anticuerpos IgG e IgG1 anti-Her-2/neu extracelular fueron evidentes en todos los animales inmunizados con P467-CRM. No se evidenció respuesta de anticuerpos anti-Her-2/neu en los grupos de control o en ratones inmunizados con P467 solo. En comparación con alumbre (Brenntag), los títulos de anticuerpos IgG e IgG1 fueron significativamente más altos cuando se administró el constructo peptídico P467-CRM con Montanide™.
Producción de citoquinas in vitro (IL-2, IFNy, IL-5)
(i) Producción de IL-2 después de la estimulación con CRM o P467
Los niveles de IL-2 fueron más altos en esplenocitos estimulados con CRM derivados de ratones inmunizados con P467-CRM en presencia de Montanide™ en comparación con esplenocitos estimulados con CRM derivados de ratones inmunizados con P467-CRM en presencia de alumbre (véanse las Figuras 17A y 17B).
(ii) Producción de IFNy después de la estimulación con CRM o P467
Las Figuras 18A y 18B muestran la concentración de IFNy en el sobrenadante de esplenocitos que han sido cultivados in vitro en presencia de CRM (Figura 18A) o P467 (Figura 18B). En ratones inmunizados con 25 pg de P467-CRM con Montanide™, el nivel de IFNy se encontraba fuera del intervalo. Se excluyeron los datos de este ratón y se realizó un análisis adicional, como se muestra en la Figura 18C (estimulación por CRM) y la Figura 18D (estimulación por P467).
La producción de IFNy fue inducida por estimulación de CRM en esplenocitos derivados de todos los ratones inmunizados con P467-CRM en presencia de alumbre o Montanide™. Con Montanide™ (en el grupo de 10 pg), los niveles de IFNy fueron más altos que en el grupo correspondiente inmunizado con P467-CRM en presencia de alumbre (Brenntag). Tras la estimulación con P467-CRM, los niveles de IFNy tuvieron máxima intensidad en el grupo de Montanide™ inmunizado con 50 pg de P467-CRM
(iii) producción de IL-5 después de la estimulación con CRM o P467
Las Figuras 19A y 19B muestran la concentración de IL-5 en el sobrenadante de esplenocitos que han sido cultivados in vitro en presencia de CRM (Figura 19A) o P467 (Figura 19B).
Los niveles de IL-5 fueron significativamente más altos en esplenocitos estimulados con CRM derivados de ratones inmunizados con P467-CRM en presencia de Montanide™. Después de la estimulación con el constructo peptídico P467-CRM, se indujo algo de producción de IL-5 en ratones inmunizados con Montanide™, aunque el nivel de IL-5 fue aproximadamente 10 veces menor en comparación con los niveles después de la estimulación con CRM.
Caracterización de esplenocitos por análisis FACS; tinción intracelular de la producción de IFNy
Para evaluar si el uso de diferentes adyuvantes (es decir, alumbre frente Montanide™) altera la distribución de los linfocitos, en particular, los linfocitos CD8+ y CD4+, se llevó a cabo un análisis FACS de los esplenocitos después de la inmunización con diferentes concentraciones de P467 en presencia de Montanide™ o alumbre. Se aislaron esplenocitos de los ratones y se analizaron los porcentajes de células T (CD3+CD4+, Figura 20A y CD3+CD8+, Figura 20B), células B (CD3-CD19+, Figura 20C) y células NK (CD3-CD335+, Figura 20D).
Los datos muestran una reducción significativa de células NK en esplenocitos derivados de ratones que fueron inmunizados con dosis más altas de P467-CRM (es decir, 25 mg y 50 mg) junto con Montanide™, en comparación con alumbre (Brenntag).
Detección de esplenocitos productores de IFNy mediante análisis FACS
Para investigar si la inmunización con los diferentes adyuvantes conduciría a un cambio en la distribución de células CD4+ o CD8+ productoras de IFNy, se aislaron esplenocitos de ratones de todos los grupos y se midió el IFNy intracelular en células T (CD4+, Figura 21A, y CD8+, Figura 21B) y células NK (CD3-CD335+, Figura 21C).
Los datos muestran que las células T CD4+ produjeron IFNy, lo cual era más pronunciado en ratones inmunizados con concentraciones crecientes de P467-CRM. Todos los grupos de control (y ratones no modificados) mostraron niveles similares de IFNy. Por el contrario, los niveles de IFNy fueron más altos en las células T CD8+ derivadas de ratones inmunizados con 25 pg de P467-CRM con Montanide™. Los datos también muestran la producción de IFNy por células NK derivadas de ratones inmunizados con P467-CRM Montanide™.
Cinética de las respuestas de anticuerpos anti-Her2 y péptido P467
Para evaluar la cinética de las respuestas de anticuerpos, se tomaron muestras de sangre a las 8 semanas, 16 semanas y 6 meses después de la última inmunización. A continuación, se analizaron las muestras de sangre para títulos de anticuerpos específicos de Her2/neu y específicos de péptido P467 según los métodos divulgados en el presente documento.
Como se muestra en la Figura 22, los títulos de anticuerpos IgG específicos al péptido P467 permanecieron elevados a las 8 semanas (BA3), 16 semanas (BA4) y 6 meses (BA5) después de la última dosis del constructo peptídico P467-CRM administrado con alumbre o Montanide™. De manera similar, como se muestra en la Figura 23, los títulos de anticuerpos IgG específicos a Her2/neu permanecieron elevados a las 8 semanas (BA3), 16 semanas (BA4) y 6 meses (BA5) después de la última dosis del constructo peptídico P467-CRM administrada con alumbre o Montanide™.
Compendio
Tanto los conjugados de CRM197-péptido de fusión como las formulaciones virosómicas que comprenden los péptidos de fusión generaron anticuerpos específicos para los epítopos de célula B individuales (P4, P6 y P7), así como para los péptidos de fusión (P467 y P647). También se debe señalar que estos anticuerpos también se unieron al dominio extracelular recombinante de Her-2/neu y a la proteína Her2/neu nativa expresada en células de cáncer de mama SKBR-3.
Los conjugados de CRM197-péptido de fusión fueron más efectivos en la inducción de anticuerpos específicos a epítopo de célula B y a Her2/neu; es decir, se generaron títulos de anticuerpos significativamente más altos (aproximadamente de 10 a 20 veces) en comparación con las formulaciones virosómicas correspondientes.
Sobre la base de los títulos de anticuerpos contra Her-2/neu recombinante, hubo una clara diferencia en la cinética de las respuestas de anticuerpos en el curso de la inmunización, mostrando los resultados que los conjugados de CRM conducen a un aumento más precoz en los títulos de anticuerpos (ya después de la 2a inmunización, con un pico después de la 3a inmunización), mientras que el aumento de los títulos de anticuerpos con conjugados de virosoma fue más lento y necesitó cuatro inmunizaciones para alcanzar los niveles observados en ratones inmunizados con los correspondientes conjugados de CRM.
Los virosomas son generalmente un sistema de administración de antígenos adecuado. Sin embargo, los resultados divulgados en este documento muestran claramente un aumento retardado en los títulos de anticuerpos después de la inmunización con conjugados de virosoma, así como la necesidad de cuatro inmunizaciones para lograr títulos similares observados en animales inmunizados con conjugados de CRM correspondientes. Tanto el tiempo como las dosis para las respuestas de anticuerpos óptimas son factores importantes a tener en cuenta para la aplicación clínica
de las composiciones de vacuna de Her-2/neu. Por lo tanto, estos resultados muestran que CRM197 es una proteína transportadora más adecuada para los péptidos de fusión de Her-2/neu en el contexto de la administración de vacunas.
Se demostró que tanto alumbre (Brenntag) como Montanide™ aumentaban adicionalmente las respuestas de anticuerpos mencionadas anteriormente del constructo peptídico P467-CRM. Los títulos de anticuerpos IgG, así como IgG1, específicos anti-P467, fueron significativamente más altos en todos los ratones inmunizados con Montanide™ (en todas las dosis) en comparación con el alumbre. Los títulos de anticuerpos IgG2a anti-P467 también fueron más altos en ratones inmunizados con Montanide™ (en todas las dosis) en comparación con el alumbre. Los títulos de anticuerpos IgG e IgG 1 anti Her-2/neu fueron significativamente más altos en ratones inmunizados con Montanide™ cuando se coadministró con los constructos peptídicos en todas las dosis que se investigaron. A diferencia de los anticuerpos específicos al péptido P467, se detectaron pocos o ningún anticuerpo IgG2a anti-Her-2/neu.
Los esplenocitos produjeron cantidades significativamente mayores de IFNy cuando se cultivaron las células in vitro en presencia de CRM, en comparación con células cultivadas en presencia de P467. Después de la estimulación con CRM, los niveles de IFNy fueron significativamente más altos en los grupos que recibieron las dosis más bajas de la construcción peptídica cuando se aplicaron con Montanide™, en comparación con los grupos que recibieron las mismas dosis del constructo cuando se aplicó con alumbre (Brenntag). Los datos indican que Montanide™ induce títulos de anticuerpos más altos, pero también niveles de citoquinas más altos que el alumbre.
Claims (11)
1. Una composición de vacuna que comprende:
(i) un adyuvante, en el que el adyuvante es una emulsión de agua en aceite; y
(ii) al menos un péptido de fusión conjugado con una proteína transportadora,
en donde la proteína transportadora es la variante de la toxina diftérica CRM-197 (SEQ ID NO: 61) y en donde el al menos un péptido de fusión comprende dos o más epítopos de células B no contiguos de Her2/neu seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID Nos: 1-7.
2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que el péptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NOs: 8-14.
3. La composición de vacuna de la reivindicación 2, en la que el péptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.
4. La composición de vacuna de la reivindicación 3, en la que el péptido de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.
5. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína transportadora comprende de 2 a 39 péptidos de fusión.
6. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que el adyuvante es Montanide™.
7. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, un inhibidor regulador.
8. Una composición farmacéutica que comprende la composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de Her2/neu en un paciente que lo necesite.
10. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 9, en la que el cáncer es cáncer de mama.
11. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 9, en la que el cáncer es cáncer gástrico.
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