ES2639577T3

ES2639577T3 - Vacuna para la prevención de la recurrencia del cáncer de mama

Info

Publication number: ES2639577T3
Application number: ES09832462.7T
Authority: ES
Inventors: George Peoples; Sathibalan Ponniah
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: EP2355843A1; CN105435218A; US9737596B2; AU2009324707B2; US20110256164A1; JP2012511578A; KR20170097234A; US9114099B2; US20160022790A1; WO2010068647A1; KR20110106338A; CA2744035A1; CA2744035C; BRPI0922849A2; EP2355843A4; EP2355843B8; EP2355843B1; CN102245197A; BR122021010546B1; AU2009324707A1

Abstract

Composición que comprende un portador farmacéuticamente eficaz, un péptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, y en la que, aparte del péptido GP2, la composición no contiene ningún otro péptido derivado de HER2/neu, tal como un péptido E75 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, para utilizar en prevenir la recurrencia del cáncer de mama en un sujeto, en la que el sujeto es humano y está en remisión después del tratamiento con una evolución estándar de la terapia; y en la que las células cancerosas del sujeto tienen una sobreexpresión de HER2/neu, y en la que la sobreexpresión de HER2/neu es una calificación de inmunohistoquímica, "IHC", de 3+ o una calificación de hibridación fluorescente in situ, "FISH", de 2,0 o mayor para la expresión del gen HER2/neu.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna para la prevencion de la recurrencia del cancer de mama LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias, que ha sido presentada a traves de EFS-Web y se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 7 de diciembre de 2009, tiene como nombre HMJ106PCT.txt, y tiene 11.473 bytes de tamano.

INTERES DEL GOBIERNO

[0002] La presente invencion se realizo en parte con el apoyo del Gobierno. El Gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invencion.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0003] La presente solicitud reivindica el beneficio de, y depende de la fecha de presentacion de, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos numero 61/121.220, presentada el 10 de diciembre de 2008, toda la descripcion de la cual se incorpora en el presente documento por referencia.

ANTECEDENTES

[0004] El cancer de mama (BCa) es el diagnostico de cancer mas comun en mujeres y la segunda causa principal de muerte por cancer entre las mujeres (Ries LAG, et al. (Eds) SEER Cancer Statistics Review., 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Los principales avances en el tratamiento del cancer de mama en los ultimos 20 anos han dado lugar a una mejora significativa en la tasa de supervivencia libre de enfermedad (DFS). Por ejemplo, las terapias que utilizan anticuerpos reactivos contra antlgenos relacionados con el tumor han sido utilizadas para bloquear procesos celulares especlficos con el fin de retardar el avance de la enfermedad o prevenir la recurrencia de la enfermedad. A pesar de los recientes avances en el tratamiento del cancer de mama, un numero significativo de pacientes en ultima instancia moriran de enfermedad recurrente.

[0005] Las vacunas son un modelo atractivo para prevenir, retardar, o prohibir el desarrollo de la enfermedad recurrente debido a su facilidad de administracion, y debido a su alta tasa de exito observada para las enfermedades infecciosas. El concepto basico de la construccion de una vacuna contra el cancer es sencillo en teorla. El desarrollo de vacunas eficaces contra el cancer para tumores solidos en la practica, sin embargo, ha tenido un exito limitado. Por ejemplo, un grupo que intento administrar una vacuna de peptido dirigido contra el melanoma metastasico observo una tasa de respuesta objetiva de solo el 2,6% (Rosenberg sA et al (2004) Nat Med 10: 909-15).

[0006] Hay muchas explicaciones posibles para esta baja tasa de exito (Campoli M et al. (2005) Cancer Treat. Res. 123: 61-88). Por ejemplo, incluso si un antlgeno se asocia especlficamente con un tipo particular de celulas tumorales, las celulas tumorales pueden expresar solamente niveles bajos de antlgeno, o pueden estar situadas en un sitio crlptico o en cualquier caso protegidas de la deteccion inmunologica. Ademas, los tumores a menudo cambian su perfil antigenico mediante la propagacion de antlgenos a medida que desarrollan. Tambien contribuye a la baja tasa de exito el hecho de que las celulas tumorales pueden expresar niveles muy bajos de protelnas del MHC y otras protelnas coestimuladoras necesarias para generar una respuesta inmune.

[0007] Los problemas adicionales a los que se enfrentan los intentos de vacunacion contra tumores surgen en pacientes con canceres en etapa avanzada. Tales pacientes tienden a tener tumores primarios y metastasicos mas grandes, y las celulas en el interior del tumor no pueden ser accesibles debido al mal flujo sangulneo. Esto concuerda con la observation de que las estrategias de vacunacion han tendido a tener mas exito para el tratamiento de neoplasias malignas hematologicas (Radford KJ et al. (2005) Pathology 37: 534-50; y, Molldrem JJ (2006) Biol Bone Marrow Transplant 12: 13-8). Ademas, a medida que los tumores se vuelven metastasicos, pueden desarrollar la capacidad de liberar factores inmunosupresores en su microentorno (Campoli, 2005; y, Kortylewski M et al. (2005) Nature Med 11: 1314-1321). Los tumores metastasicos tambien se han asociado con una disminucion en el numero de linfocitos de sangre periferica, y la disfuncion de celulas dendrlticas (Gillanders WE et al (2006) Breast Diseases: A Year Book and Quarterly 17: 26-8).

[0008] Mientras que algunos o todos estos factores pueden contribuir a la dificultad en el desarrollo de una vacuna preventiva o terapeutica eficaz, el principal reto subyacente es que la mayorla de los antlgenos tumorales son antlgenos propios o tener un alto grado de homologla con antlgenos propios, y por tanto se espera que sean objeto de una tolerancia inmune estricta. De este modo, es evidente que muchas vacunas contra el cancer basadas en peptidos, con o sin adyuvantes estimulantes del sistema inmune, pueden estar condenados a solo un exito limitado en la practica cllnica debido a la baja inmunogenicidad y la falta de especificidad.

[0009] Las vacunas prototipo contra el cancer de mama basadas en antlgenos individuales han tenido un exito

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moderado en la induccion de una respuesta inmune medible en experimentos con animales y en ensayos cllnicos con pacientes con cancer de mama. La respuesta inmune observada, sin embargo, no se ha traducido en una inmunidad protectora cllnicamente significativa contra la recurrencia de la enfermedad puesta en remision por la terapia estandar (por ejemplo, cirugla, radioterapia, y quimioterapia).

[0010] HER2/neu es un proto-oncogen que se expresa en muchos tumores malignos epiteliales (Slamon DJ et al. (1989) Science 244: 707-12). HER2/neu es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidermico y codifica un receptor de tirosina quinasa de 185 kd implicado en la regulacion del crecimiento y la proliferacion celular. (Popescu NC et al (1989) Genomics 4: 362-366; Yarden Y et al (2001) Nat Rev Mol Cell Bio 2: 127-137). La sobreexpresion y/o amplificacion de HER2/neu se encuentra en el 25-30% de los canceres de mama invasivos (BCa) y se asocia con tumores mas agresivos y un resultado cllnico mas malo. (Slamon DJ et al Science (1987) 235: 177182; Slamon DJ et al Science (1989) 244: 707-12; Toikkanen S et al J Clin Oncol (1992) 10: 1044-1048; Pritchard KI et al (2006) N. Engl J. Med 354: 2103-11).

[0011] La determinacion de HER2/neu se realiza predominantemente a traves de dos pruebas, inmunohistoqulmica (IHC) e hibridacion fluorescente in situ (FISH). IHC detecta la sobreexpresion de la protelna HER2/neu y se describe en una escala semicuantitativa de 0 a 3+ (0 = negativa, 1+ = baja expresion, 2+ = intermedia y 3+ = sobreexpresion). FISH, por otro lado, detecta la amplificacion (exceso de copias) del gen HER2/neu y se expresa como una relacion de copias de genes HER2/neu con respecto a las copias del gen del cromosoma 17 y se interpreta como "sobreexpresion" si FISH es > 2,0 copias. (Hicks DG et al Hum Pathol (2005) 36: 250-261). La tasa de concurrencia de IHC y FISH es de aproximadamente el 90%. (Jacobs et al J Clin Oncol (1999) 17: 1533-1541). FISH se considera el patron de oro, ya que el analisis retrospectivo revela que es un mejor predictor de la respuesta de trastuzumab (Tz); es mas objetivo y reproducible. (Press MF et al J Clin Oncol (2002) 14: 3095-3105; Bartlett J et al J Pathol (2003) 199: 411417; Wolff AC et al J Clin Oncol (2007) 25: 118-145).

[0012] La identificacion y cuantificacion de HER2/neu como un proto-oncogen ha llevado a la inmunoterapia humoral o pasiva basada en anticuerpos, incluyendo el uso de trastuzumab (Herceptin® Genentech Inc., South San Francisco, cA). Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado que se une el dominio yuxtamembrana extracelular de la protelna HER2/neu (Plosker GL et al. Drugs (2006) 66: 449-475). Tz esta indicado para pacientes BCa de nodulos positivos que sobreexpresan HER2/neu (IHC 3+ o FISH > 2,0) y metastasicos, (Vogel CL et al J Clin Oncol (2002) 20: 719-726; Piccart-Gebhart MJ et al N Engl J Med (2005) 353: 1659-1672) y muestra una actividad muy limitada en pacientes con una expresion de HER2/neu de baja a intermedia (Herceptin® (Trastuzumab), el prospecto del producto con receta, Genentech Inc., South San Francisco, CA: revision de septiembre del ano 2000).

[0013] Otra forma de inmunoterapia que se persigue es la vacunacion e inmunoterapia activa que dirige una respuesta inmune celular a epltopos en antlgenos asociados a tumores, tales como HER2/neu. HER2/neu es una fuente de varios peptidos inmunogenicos que pueden estimular el sistema inmune para reconocer y matar las celulas cancerosas que expresan HER2/neu. (Fisk B et al J Exp Med (1995) 181: 2109-2117). Dos de tales peptidos se denominan E75 y GP2. E75 y GP2 son ambos peptidos de nueve aminoacidos que esta limitados a A2-antlgeno leucocitario humano (HLA) y estimulan CTL para reconocer y lisar celulas cancerosas que expresan HER2/neu (Fisk B et al J Exp Med (1995) 181: 2109-2117; Peoples GE et al Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92: 432-436).

[0014] E75 se deriva del dominio extracelular de la protelna HER2/neu y corresponde a los aminoacidos 369-377 (KIFGSLAFL) (SEQ ID NO: 3) de la secuencia de aminoacidos de HER2/neu y se describe como SEQ ID NO: 11 en la patente de los Estados Unidos. No. 6.514.942, patente que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. La secuencia de protelna de longitud completa de HER2/neu se expone a continuacion y se describe como SEQ ID NO: 2 en la patente de Estados Unidos N° 5.869.445, patente que se incorpora en el presente por referencia en su totalidad:

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MKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFL

QDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGA

SPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSR

ACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPK

HSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLST

DVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEF

AGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDL

SVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTV

PWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQ

ECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFC

VARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSI

ISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQM

RILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDE

AYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQ

IAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPI

KWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQP

PICTIDVYMIMVKCWlyllDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDS

TFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLT

LGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTV

PLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPG

KNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPP

SGFKGTPTAENPEYLGLDVPV (SEQ ID NO:l)

[0015] Se han hecho intentos para utilizar E75 como una vacuna contra el cancer, por ejemplo, como una vacuna de un solo peptido combinado con diferentes inmunoadyuvantes en pacientes con cancer avanzado que sobreexpresan la protelna HER2/neu (Zaks TZ et al. (1998) Cancer Res 58: 4902-8; Knutson KL et al (2002) Clin Cancer Res 8: 10148; y, Murray JL et al (2002) Clin Cancer Res 8: 3407-18); cargado en celulas dendrlticas autologas y reinfundido (Brossart P et al (2000) Blood 96: 3102-8; y, Kono K et al (2002) Clin Cancer Res 8: 3394-3400); o incrustado en peptidos mas largos capaces de unirse a moleculas HLA de clase II con el fin de reclutar celulas T auxiliares CD4 (Disis ML et al (1999) Clin Cancer Res 5: 1289-1297; y, Disis ML et al (2002 ) J. Clin Oncol 20: 2624-32). Cada estrategia ha estimulado una respuesta inmune mediada por celulas T citotoxicas especlfica de E75, pero ninguna ha demostrado una inmunidad terapeutica o protectora cllnicamente significativa en mujeres con cancer de mama en fase avanzada. La incapacidad de los demas para mostrar un beneficio cllnico significativo usando preparaciones de vacuna con E75 se deriva, en parte, del hecho de que E75 deriva de un antlgeno tumoral "propio". Vacunas contra el cancer que reconocen "antlgenos tumorales propios”, como los derivados de HER2/neu, presentan desaflos unicos debido a la caracterlstica de tolerancia inmunologica de las protelnas propias. Ademas, los estudios anteriores se han centrado en los pacientes de cancer con enfermedad avanzada, como la etapa III o IV del cancer, en lugar de los pacientes que estan siguiendo terapias estandar libres de enfermedad. Por lo tanto, ninguno de estos intentos de utilizar E75 como una vacuna contra el cancer ha demostrado la capacidad de la vacuna para prevenir o retrasar la recurrencia de la enfermedad despues de la remision. Sobre la base de estos estudios de E75, otros han llevado a cabo mas recientemente ensayos cllnicos para determinar si la inmunidad inducida por E75 transmite un beneficio cllnico mediante la prevencion de la recurrencia en pacientes con cancer de mama de alto riesgo Peoples GE et al, J.

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Clin Oncol (2005) 23: 7536-45; Peoples GE et al, Clin Cancer Res (3) (2008) 14: 797-803; Holmes et al, Cancer (2008) 113: 1666-1675. Los datos de estos estudios indican que el aumento in vivo de respuestas de DTH inducidas por E75 se correlacionan con una recurrencia reducida y un aumento del tiempo de supervivencia para los que presentaron recurrencia.

[0016] GP2, descrita inicialmente por Peoples et al., es un peptido de nueve aminoacidos derivado de la parte transmembrana de la protelna HER2/neu correspondiente a los aminoacidos 654-662 de la secuencia de longitud completa (es decir, IISAVVGIL: SEQ ID NO: 2) (Peoples GE et al, Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92: 432-436, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). El peptido se aislo usando linfocitos asociados a tumores de pacientes con cancer de mama y de ovario, y mas tarde se encontro que era compartido entre varios tumores malignos epiteliales incluyendo cancer de pulmon de celulas no pequenas y cancer de pancreas (Linehan DC et al., J Immunol (1995) 155: 4486-4491; Peiper M et al, Surgery (1997) 122: 235-242; Yoshino I et al, Cancer Res (1994) 54: 3387-3390; Peiper M et al, Eur J Immunol (1997) 27: 1115-1123).

[0017] E75 tiene una alta afinidad de union para la molecula de HLA-A2 y se considera el peptido inmunodominante de la protelna HER2/neu. Como tal, es el peptido derivado de HER2/neu mas estudiado en estudios de laboratorio y cllnicos. Peoples et al., J. Clin. Oncol. (2005) 23: 7536-45. Como peptido inmunodominante, tambien se espera que E75 induzca una respuesta inmune mas potente. GP2, por otro lado, tiene una afinidad de union a HLA-A2 relativamente mala y se considera un epltopo subdominante. (Fisk B, et al J Exp Med (1995) 181: 2109-2117). Esta es una de las razones de que las estrategias de vacunas que dirigen una respuesta inmune celular a epltopos de HER-2/neu se han centrado en E75 en lugar de GP2.

[0018] Los estudios previos de GP2 han utilizado celulas dendrlticas autologas pulsadas con GP2 (y otros peptidos) ex vivo y se han reinyectado por via subcutanea (Brossart P et al Blood (2000) 96: 3102-3108) o intravenosa (Dees EC et al. Cancer Immunol Immunother (2004) 53:777-785) en los pacientes HER2/neu+ con cancer de mama o cancer de ovario metastasicos para inducir una respuesta de CTL. Brossart et al. detectaron una respuesta de CTL especlfica de peptido (GP2 y E75) in vivo, y observaron que ambos peptidos mostraron una respuesta inmune similar a pesar de las diferencias conocidas en las afinidades de union a HLA-A2. Dees et al. evaluaron las celulas dendrlticas pulsadas con GP2 en pacientes con cancer de mama metastasico y fueron capaces de documentar la enfermedad cllnicamente estable en dos pacientes. Es importante destacar, sin embargo, que ninguno de los estudios utilizo la GP2 como una vacuna de peptidos. Mas bien, en ambos estudios, los pacientes fueron inyectados con celulas dendrlticas que hablan sido pulsadas con GP2. Por otra parte, al igual que con los estudios de E75, los estudios de GP2 se limitaron a los pacientes con cancer avanzado. Por tanto, ni Brossart ni Dees demostraron la capacidad de las celulas dendrlticas pulsadas con GP2 para prevenir o retrasar la recurrencia de la enfermedad tras la remision. Al igual que con E75, las vacunas contra el cancer dirigidas a antlgenos tumorales propios, como HER2/neu de la que se deriva GP2, presentan desaflos unicos debido a la caracterlstica de tolerancia inmunologica de protelnas propias.

[0019] Peoples et al. han evaluado previamente el uso de GP2 para un ensayo de vacuna contra el cancer de mama basado en peptidos mediante la realizacion de ensayos de citotoxicidad in vitro con celulas dendrlticas pulsadas con GP2 y celulas T CD8 obtenidas de pacientes con cancer de mama. (Mittendorf EA et al Cancer (2006) 106: 23092317). Si bien los resultados de estos experimentos in vitro confirmaron la presencia de linfocitos T citotoxicos precursores especlficos de GP2 en mujeres con cancer de mama HER2/neu+, se concluyo que debido a la variabilidad de la respuesta a un peptido determinado y la heterogeneidad de la expresion del antlgeno in vivo, la vacunacion con multiples peptidos diferentes, incluyendo el peptido inmunodominante E75, sera necesaria para proporcionar una respuesta inmunitaria adecuada. (Mittendorf Ea et al Cancer (2006) 106: 2309-2317).

[0020] Como se senalo anteriormente, el trastuzumab esta indicado para pacientes con cancer de mama metastasico, de nodulos positivos (NP), que sobreexpresan HER2/neu (IHC 3+ o FISH > 2,0), y muestra una actividad muy limitada en pacientes con una expresion de HER2/neu de baja a intermedia. Del mismo modo, en los estudios discutidos anteriormente, se seleccionaron los pacientes que recibieron vacunas basadas en E75 y GP2, en parte, en base a la presencia de tumores que sobreexpresaban HER2/neu. En consecuencia, no se esperarla que una vacuna de peptido GP2 fuera eficaz en pacientes con cancer con niveles bajos e intermedios de expresion de tumor HER2/neu.

DESCRIPCION RESUMIDA

[0021] La presente invention se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones. En particular, la presente invencion se refiere a una composition que comprende un portador farmaceuticamente eficaz, un peptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ Id NO: 2 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos, y en la que, aparte del peptido GP2, la composicion no contiene ningun otro peptido derivado de HER2/neu, tal como un peptido E75 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, para utilizar en un procedimiento para prevenir la recurrencia del cancer de mama en un sujeto, en la que el sujeto es humano y esta en remision despues del tratamiento con una evolution estandar de la terapia; y en la que las celulas cancerosas del sujeto tienen una sobreexpresion de HER2/neu, y en la que la sobreexpresion de HER2/neu es una calificacion de inmunohistoqulmica, "IHC", de 3+ o una calificacion de hibridacion fluorescente in situ, "FISH", de 2,0 o mayor para la expresion del gen HER2/neu. En una realizacion, la evolucion estandar de la terapia es el tratamiento con trastuzumab, cuyo tratamiento puede continuar simultaneamente con los procedimientos descritos en el presente documento. Los

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procedimientos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composicion que comprende un portador farmaceuticamente eficaz y un peptido GP2. El peptido GP2 tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. Ademas, aparte del peptido GP2, la composicion no contiene ningun otro peptido derivado de HER2/neu, incluyendo, por ejemplo, el peptido inmunodominante E75. La administracion puede realizarse por cualquier medio adecuado en la tecnica, tal como inoculacion o inyeccion, y, mas particularmente, inyeccion intradermica, que pueden tener lugar con una o mas dosis separadas. Tales dosis pueden comprender una concentracion igual del peptido y un inmunoadyuvante, se pueden administrar sustancialmente al mismo tiempo, y se pueden administrar en un sitio de inoculacion o espaciados uno del otro en la superficie de la piel. La composicion se puede administrar de aproximadamente tres a seis veces o mas sobre una base mensual hasta que se establezca una inmunidad protectora. En algunos aspectos, la composicion comprende ademas un adyuvante, tal como factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) y preferiblemente GM-CSF humano recombinante.

[0022] En algunos aspectos, la composicion se administra al sujeto conjuntamente con una dosis de vacuna de refuerzo, que comprende una cantidad eficaz de una composicion que comprende un portador farmaceuticamente eficaz y un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, la composicion de la dosis de refuerzo comprende ademas un adyuvante, tal como GM-CSF y, preferiblemente, GM-CSF humano recombinante. La administracion de una dosis de refuerzo se puede llevar a cabo mediante cualquier medio adecuado en la tecnica, tal como la inoculacion o inyeccion y, mas particularmente, la inyeccion intradermica, que pueden tener lugar con una o mas dosis separadas. Tales dosis pueden comprender una concentracion igual del peptido y un inmunoadyuvante, se puede administrar sustancialmente al mismo tiempo, y se pueden administrar en un sitio de la inoculacion o espaciados uno de otro en la superficie de la piel. Normalmente, la dosis de refuerzo se administra despues de completar un programa de inmunizacion primaria y, preferiblemente, cada seis o 12 meses despues de la inmunizacion primaria, segun sea necesario.

[0023] El sujeto es un humano. En ciertos aspectos, el ser humano es positivo para el antlgeno mayor de histocompatibilidad de tipo sangulneo como antlgeno leucocitario humano A2 o antlgeno leucocitario humano A3. Segun la presente invencion, las celulas cancerosas del ser humano son positivas para la expresion de niveles detectables de HER2/neu. En algunos aspectos que no forman parte de la invencion, las celulas cancerosas muestran una expresion de HER2/neu de baja a intermedia. Por ejemplo, las celulas cancerosas del ser humano tienen una calificacion de inmunohistoqulmica (IHC) de 1+ o 2+ y/o una calificacion de hibridacion fluorescente in situ (FISH) de menos de 2,0). En otros aspectos segun la presente invencion, las celulas cancerosas del ser humano tienen una calificacion de IHC de 3+. Segun la presente invencion, las celulas cancerosas del ser humano muestran una sobreexpresion de HER2/neu. Las celulas cancerosas del ser humano tienen una calificacion de inmunohistoqulmica (IHC) de 3+ y/o una calificacion de hibridacion fluorescente in situ (FISH) mayor o igual a 2,0). En otras realizaciones, el ser humano no tiene inmunidad preexistente a GP2 (SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4).

[0024] En otra realization, la presente invencion proporciona composiciones para utilizar en los procedimientos descritos en esta solicitud. En un aspecto, las composiciones comprenden un portador farmaceuticamente aceptable, una cantidad eficaz de un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, y un adyuvante, tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos. Las composiciones se administran preferiblemente en un programa de inmunizacion optimizado. En una realizacion, la composicion de vacuna comprende 0,1-1 mg/ml de peptido y 0,125-0,5 mg/ml de adyuvante. En algunos aspectos especlficos, las concentraciones y programaciones de la composicion de vacuna preferidos incluyen: (1) 1 mg/ml de peptido y 0,25 mg/ml de adyuvante, (2) 0,5 mg/ml de peptido y 0,25 mg/ml de adyuvante, (3) 0,1 mg/ml de peptido y 0,25 mg/ml de adyuvante, (4) 1 mg/ml de peptido y 0,125 mg/ml de adyuvante, y (5) 0,5 mg/ml de peptido y 0,125 mg/ml de adyuvante, cada uno con inoculaciones mensuales durante al menos 6 meses consecutivos, seguido por inoculaciones de refuerzo periodicas (preferiblemente semianuales o anuales) durante 1 ano, 2 anos, o 3 o mas anos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0025] Los dibujos adjuntos, que se incluyen para proporcionar una comprension adicional de la invencion y se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran aspectos de la invencion y junto con la description sirven para explicar los principios de la invencion. En los dibujos:

La figura 1 muestra las reacciones locales promedio vs. dosis GM-CSF por grupos de dosis. Los pacientes fueron vacunados con peptido y GM-CSF en cuatro grupos de dosis. A. Grupo de dosis de 100 mcg de peptido/250 mcg de GM-CSF. B. Grupo de dosis de 500 mcg de peptido/250 mcg de GM-CSF. C. Grupo de dosis de 1000 mcg de peptido/250 mcg de GM-CSF. D. Grupo de dosis de 500 mcg de peptido/125 mcg de GM-CSF. Las reacciones locales fueron medidas en millmetros (llneas continuas). Una reaction local > 100 mm de endurecimiento necesitaba una reduction de la dosis del 50% en la dosis de GM-CSF (llneas de trazos). No hubo reducciones de la dosis de peptidos. La figura 2 muestra la toxicidad y las respuestas inmunologicas de todos los pacientes incluidos en el ensayo de fase I con GP2. A. Toxicidad, ningun paciente experimenta toxicidades locales o sistemicas de grado 3-5. B. Respuesta inmune ex vivo, - % celulas T CD8+ especlficas pre-max aumento estadlsticamente (p = 0,001). C. Respuesta inmune in vivo, DTH a GP2 pre-post aumento estadlsticamente (p = 0,0002). El control de solution salina normal (NS) tambien se muestra para la comparacion.

La figura 3 muestra la toxicidad y respuestas inmunologicas de los pacientes inscritos en ensayo de fase I con GP2 que comparan ninguna inmunidad preexistente (pre-dlmero <0,03) vs. inmunidad preexistente (pre-dlmero > 0,03). A.

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Toxicidad, las toxicidades se incrementaron ligeramente en los pacientes sin inmunidad preexistentes, aunque no significativamente. B. Respuesta inmune ex vivo, los pacientes sin inmunidad preexistente mostraron aumentos estadlsticamente significativos en el % de celulas T CD8+ especlficas pre-max, pre-post, y pre-a largo plazo (p = 0,003, p = 0,03, y p = 0,01, respectivamente) en respuesta a la vacunacion. C. Respuesta inmune in vivo, ambas respuestas de DTH pre-post aumentaron estadlsticamente (Ninguno p = 0,03 y Pre-E p = 0,0004). No se observo diferencia estadlstica entre las respuestas DTH post (p = 0,3).

La figura 4 muestra la toxicidad y respuestas inmunologicas de los pacientes inscritos en el ensayo de fase I con GP2 que compararon las dosis de GM-CSF 125 mcg vs. 250 mcg. A. Toxicidad, las toxicidades se incrementaron ligeramente en los pacientes con 250 mcg de GM-CSF, aunque no significativamente. B. Respuesta inmune ex vivo, el % de celulas T CD8+ especlficas pre-max con 125 mcg de GM-CSF no aumento estadlsticamente (p = 0,17), pero el % de celulas T CD8+ especlficas pre-max con 250 mcg de GM-CSF aumento estadlsticamente (p = 0,005). C. Respuesta inmune in vivo, DTH pre-post con 125 mcg y 250 mcg de GM-CSF aumento estadlsticamente (respectivamente, p = 0,009 y p = 0,008). No hubo signification estadlstica entre post DTH con 125 mcg de GM-CSF y dTh post con 250 mcg de GM-CSF (p = 0,1).

La figura 5 muestra la respuesta inmune ex vivo y la difusion de epltopo en respuesta a GP2. Se midieron los linfocitos T CD8+ especlficos de E75 promedio en respuesta a la vacunacion con la vacuna de peptido GP2. Se compararon la pre-vacunacion de dlmero de E75 vs. max (0,8 ± 0,2% vs. 2,0 ± 0,2%, p = 0,0001), pre vs. post (0,8 ± 0,2% vs. 1,2 ± 0,2%, p = 0,1), y pre vs. a largo plazo (0,8 ± 0,2% vs. 1,0 ± 0,2%; p = 0,6). No se observaron diferencias estadlsticas entre los valores de GP2 y E75, pero se observo una tendencia hacia la respuesta maxima de dlmero E75 mas grande (2,0 ± 0,2% vs. 1,4 ± 0,2%; p = 0,07).

La figura 6 muestra la respuesta inmune in vivo de pacientes inscritos en el ensayo de fase II con GP2. La mediana de la reaction DTH a GP2 aumento significativamente desde el nivel de pre-vacunacion al nivel de post-vacunacion en el grupo de peptido GP2 (PG) (1,0 ± 0,8 cm a 18,0 ± 3,1 cm; p <0,0001) y en menor medida en el grupo de adyuvante de control (AG) (0,0 ± 1,0 cm a 0,5 ± 3,3 cm; p <0,01). DTH post-vacunacion fue significativamente mayor en el PG en comparacion con el AG (18,0 ± 3,1 cm vs 0,5 ± 3,3 cm, p = 0,002).

DESCRIPCION DETALLADA

[0026] Varios terminos relacionados con los procedimientos y otros aspectos de la presente invention se utilizan en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones. A tales terminos se les da su significado ordinario en la tecnica a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos especlficamente deben interpretarse de un modo consistente con la definicion proporcionada en este documento.

[0027] El termino "prevenir" o "prevention" se refiere a cualquier exito o indicio de exito en el impedimento o retraso de la recurrencia/recalda del cancer de mama en pacientes en remision cllnica, medido mediante cualquier parametro objetivo o subjetivo, incluyendo los resultados de un examen radiologico o flsico.

[0028] "Cantidad eficaz" o "cantidad terapeuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, material o composition, tal como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biologico particular, tal como, pero no limitado a, resultados biologicos dados a conocer, descritos o ejemplificados en la presente memoria. Tales resultados pueden incluir, pero no se limitan a, la prevencion de cancer de mama, y mas particularmente, la prevencion del cancer de mama recurrente, por ejemplo, la prevencion de la recalda en un sujeto, tal como se determina por cualquier medio adecuado en la tecnica. La cantidad terapeutica optima se refiere a la dosis, la programacion y el uso de dosis de refuerzo para lograr el mejor resultado terapeutico.

[0029] "Farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacologico/toxicologico y para el qulmico farmaceutico fabricante desde un punto de vista flsico/qulmico con respecto a la composicion, formulation, estabilidad, la aceptacion del paciente y biodisponibilidad. "Portador farmaceuticamente aceptable" se refiere a un medio que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica del principio o principios activos y no es toxico para el huesped al que se administra.

[0030] "Inmunidad protectora" o "respuesta inmune protectora", significa que el sujeto produce una respuesta inmune activa a un componente inmunogenico de un antlgeno, tal como los antlgenos de cancer de mama descritos y ejemplificados en el presente documento, de manera que tras la posterior exposition al antlgeno, el sistema inmune del sujeto es capaz de reconocer y destruir las celulas que expresan el antlgeno, lo que disminuye la incidencia de la morbilidad y la mortalidad de la recurrencia del cancer en el sujeto. La inmunidad protectora en el contexto de la presente invencion es preferiblemente, pero no exclusivamente, conferida por los linfocitos T.

[0031] "Inmunidad preexistente" se define como un nivel de dlmero especlfico de peptido de al menos el 0,3%. El nivel de dlmero especlfico de peptido se puede medir usando ensayos convencionales, tales como el ensayo de dlmero de inmunoglobulina HLA-A2 descrito en esta solicitud.

[0032] El termino "aproximadamente", tal como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible, tal como una cantidad, una duration temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ± 20% o ± 10%, mas preferiblemente ± 5%, incluso mas preferiblemente ± 1%, y aun mas preferiblemente ± 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los procedimientos descritos.

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[0033] "Peptido" se refiere a cualquier peptido que comprende dos o mas aminoacidos unidos entre si por enlaces peptldicos o enlaces peptldicos modificados, es decir, isosteros peptldicos. Polipeptido se refiere tanto a cadenas cortas, comunmente denominadas peptidos, oligopeptidos u oligomeros, como a cadenas mas largas, generalmente denominadas protelnas. Los polipeptidos pueden contener aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. Los polipeptidos incluyen secuencias de aminoacidos modificadas ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante tecnicas de modificacion qulmica que son bien conocidas en la tecnica. Tales modificaciones estan bien descritas en textos basicos y en monograflas mas detalladas, as! como en una voluminosa bibliografla de investigation. Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier parte en un polipeptido, incluyendo el esqueleto peptldico, las cadenas laterales de aminoacidos y los extremos amino o carboxilo terminales. Se entendera que el mismo tipo de modificacion puede estar presente en los mismos o diferentes grados en varios sitios en un polipeptido dado. Tambien, un polipeptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipeptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinacion, y pueden ser clclicos, con o sin ramification. Los polipeptidos clclicos, ramificados y clclicos ramificados pueden resultar de procesos postraduccionales naturales o pueden fabricarse mediante procedimientos sinteticos. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un llpido o derivado de llpido, union covalente de fosfatidilinositol, reticulation, ciclacion, formation de enlace disulfuro, desmetilacion, formation de reticulaciones covalentes, formacion de cistina, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glicosilacion, formacion de anclajes GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidation, procesamiento proteolltico, fosforilacion , prenilacion, racemizacion, selenoilacion, sulfatacion, adicion mediada por ARN de transferencia de aminoacidos a protelnas, tales como arginilacion y ubiquitinacion.

[0034] "Refuerzo" se refiere a una dosis de un inmunogeno administrado a un paciente para mejorar, prolongar o mantener la inmunidad protectora y para superar la regulation por descenso de las respuestas de celulas T mediadas por las celulas T reguladoras.

[0035] "Libre de cancer de mama" o "libre de enfermedad" o NED (sin evidencia de enfermedad) significa que el paciente esta en remision cllnica inducida por el tratamiento con el estandar actual de terapias de cuidado. Por "remision" o "remision cllnica", que se utilizan como sinonimos, se quiere decir que los signos cllnicos, los signos radiologicos, y slntomas de cancer de mama se han reducido significativamente o han desaparecido por completo basandose en el diagnostico cllnico, aunque todavla pueden existir celulas cancerosas en el cuerpo. Por lo tanto, se contempla que la remision abarca la remision parcial y completa. La presencia de celulas cancerosas residuales se puede enumerar mediante ensayos, tales como CTC (celulas tumorales circulantes) y puede ser predictivo de recurrencia.

[0036] "Recalda" o "recurrencia" o "resurgimiento" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren al diagnostico radiografico de retorno, o los signos y los slntomas de retorno de cancer de mama despues de un perlodo de mejorla o remision.

[0037] El cancer de mama es un importante problema de salud para las mujeres en todo el mundo. Las vacunas contra el cancer de mama que se han intentado hasta la fecha han sido limitadas en su eficacia, en particular con respecto a la prevention de la recalda en pacientes que estan en remision despues de una evolution estandar de terapia. Como se ha discutido en esta solicitud, se ha determinado que la administration de un peptido del oncogen HER2/neu, GP2 (SEQ ID NO: 2), puede inducir una respuesta inmune potente in vivo que se sabe que se correlaciona con una tasa reducida de recurrencia de cancer de mama en pacientes libres de enfermedad.

[0038] El peptido GP2 esta asociado con MHC HLA-A2, y por lo tanto puede inducir inmunidad protectora en los pacientes que tienen el haplotipo HLA-A2. El haplotipo HLA-A2 se ha implicado como un factor de pronostico negativo en cancer de ovario (Gamzatova et al, Gynecol Oncol (2006) 103: 145-50) y cancer de prostata (Hueman et al, Clin Cancer Res (2005) 11: 7470-79; de Petris et al, Med Oncol (2004) 21: 49-52) y este hallazgo probablemente se extiende al cancer de mama tambien. Por lo tanto, los pacientes HLA-A2+ parecen representar un riesgo mayor de desarrollar la recurrencia del cancer despues de la remision. Sin embargo, se demostro que de forma inesperada una composition de vacuna que comprende GP2 + GM-CSF inducla de manera efectiva una potente respuesta inmune in vivo en pacientes HLA-A2+ que se sabe que se correlaciona con un menor riesgo de recurrencia del cancer de mama y una supervivencia libre de enfermedad mas larga en comparacion con los pacientes de control HLA-A2-. Ademas, se encontro sorprendentemente que los pacientes tratados con GP2 (el epltopo subdominante) y GM-CSF mostraron respuestas de DTH mas robustas en comparacion con composiciones de vacuna que comprendlan E75 (el epltopo inmunodominante) y GM-CSF. Notablemente, estos resultados no fueron obtenidos mediante la combination de GP2 con otro epltopo, tal como E75, para generar una vacuna multiepltopo, sino que, en cambio, se obtuvieron con una vacuna con un unico epltopo (es decir, GP2). Ademas, basandose en los datos preliminares, parece que GP2 tambien puede inducir inmunidad protectora en pacientes que tienen el haplotipo HLA-A3.

[0039] Debido a que GP2 deriva de la protelna HER2/neu, se esperarla que los pacientes que sobreexpresan HER2/neu exhibirlan una mejor respuesta a una vacuna basada en GP2 que aquellos con una expresion de HER2/neu de baja a intermedia. Por ejemplo, otra terapia basada en HER2/neu, trastuzumab (Herceptin® Genentech Inc., South

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San Francisco, CA), solamente esta indicada para pacientes con cancer de mama metastasico, de nodulos positivos (NP), que sobreexpresan HER2/neu (IHC 3+ o FISH > 2,0) y muestra una actividad muy limitada en pacientes con una expresion de HER2/neu de baja a intermedia. Sin embargo, se observo inesperadamente que los pacientes que tienen niveles de expresion de HER2/neu de bajos a intermedios experimentaron potente respuestas inmunes a GP2, similares en magnitud a las respuestas inducidas por GP2 en pacientes que sobreexpresan HER2/neu.

[0040] Por consiguiente, una realizacion de la presente invencion presenta composiciones de vacuna para inducir inmunidad protectora contra la recalda o la recurrencia del cancer de mama. Otra realizacion proporciona procedimientos para inducir y para el mantenimiento de la inmunidad protectora contra el cancer de mama, y mas particularmente, contra el cancer de mama recurrente. En algunos aspectos, los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composicion que comprende un portador farmaceuticamente eficaz, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, y, opcionalmente, un inmunoadyuvante, tal como GM-CSF. Las variantes de la SEQ ID NO: 2, incluyendo las que tienen cadenas laterales modificadas de aminoacidos, tal como se describen por la Patente de los Estados Unidos. de No. de publicacion 20050169934, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad, son adecuadas para usar en las composiciones de vacuna y procedimientos de esta solicitud.

[0041] Ademas, se ha identificado un polimorfismo de origen natural en el codon 655 (sustitucion de isoleucina a valina) produciendo un peptido GP2 polimorfico que tiene la secuencia IVSAVVGIL (SEQ ID NO: 4) (Papewalis et al, Nucleic Acid Res (1991) 19: 5452). Este peptido GP2 polimorfico tambien es adecuado para usar en las composiciones de vacunas y procedimientos de esta solicitud. Del mismo modo, varios grupos han investigado sustituciones de aminoacidos individuales, dobles y triples introducidas en diversos sitios en el peptido GP2, incluyendo los residuos de anclaje (posiciones 2 y 9), y se encontro que ciertas sustituciones de aminoacidos conducen a una mayor union de GP2 a HLA-A2 (Tanaka et al, Int J Cancer (2001) 94: 540-44; Kuhns et al, J Biol Chem (1999) 274: 36422-427; Sharma et al, J Biol Chem (2001) 276: 21443-449, cada una de estas referencias se incorpora por referencia en su totalidad). Por lo tanto, un experto en la tecnica entenderla que ciertas sustituciones, en particular en los residuos de anclaje, podrlan hacerse en GP2 sin afectar negativamente a su capacidad para inducir una respuesta inmune protectora. En una realizacion, el peptido GP2 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 a excepcion de una sustitucion en un residuo que aumenta la afinidad del peptido GP2 a molecula HLA-A2. Preferiblemente, la sustitucion se produce en uno o ambos de los residuos de anclaje de GP2 (posiciones 2 y 9). Mas preferiblemente, la sustitucion comprende una sustitucion de isoleucina a leucina en la posicion 2 y/o una sustitucion de leucina a valina en la posicion nueve. En otra realizacion, el peptido GP2 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 a excepcion de una sustitucion en un residuo que no afecta a la afinidad del peptido GP2 a la molecula HLA-A2 en comparacion con la afinidad de un peptido GP2 de tipo salvaje que comprende la SEQ ID NO: 2 a la molecula HLA-A2. Los ensayos para probar la afinidad de union entre GP2 y HLA-A2 son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, el ensayo de ensamblaje de superficie celular t2 que se describe en Sharma et al, J Biol Chem (2001) 276: 21443-449.

[0042] En un aspecto, el peptido GP2 tiene no mas de 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoacidos. En una realizacion, el peptido GP2 no tiene mas de 9 residuos de aminoacidos. Preferiblemente, el peptido GP2 con no mas de 9 aminoacidos es la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una version mutante de la SEQ iD No: 2 o SEQ ID NO: 4 con una sustitucion en la posicion 2 y/o 9.

[0043] El sujeto puede ser cualquier animal, y preferiblemente es un mamlfero, tal como un humano, raton, rata, hamster, cobaya, conejo, gato, perro, mono, vaca, caballo, cerdo, y similares. Los seres humanos son los mas preferidos. En aspectos muy preferidos, los seres humanos son positivos para el haplotipo HLA-A2. En otros aspectos preferidos, los seres humanos son positivos para la expresion de HER2/neu humano, incluyendo preferentemente seres humanos con tumores que expresan HER2/neu de forma baja y/o intermedia, as! como los seres humanos que son sobreexpresores de HER2/neu.

[0044] Ademas, nuestro grupo ha demostrado previamente una posible sinergia entre trastuzumab y CTL estimulados por peptido GP2 ex vivo. El pretratamiento de las celulas cancerosas de mama con trastuzumab seguido por incubacion con CTL inducidos por peptido GP2 dio lugar a una citotoxicidad mejorada en tres llneas celulares tumorales en comparacion con el tratamiento con trastuzumab o CTL especlficos de GP2 solos (Mittendorf EA et al., Annals of Surgical Oncology (2006) 13 (8): 1085-98). En vista de los resultados de los experimentos con GP2 descritos en esta solicitud, estos hallazgos indican que la vacunacion concurrente de GP2 durante la terapia con trastuzumab puede ser una inmunoterapia de combinacion eficaz.

[0045] Las composiciones de vacuna se pueden formular como preparaciones liofilizadas o llquidas de acuerdo con cualquier medio adecuado en la tecnica. Los ejemplos no limitativos de preparaciones en forma llquida incluyen soluciones, suspensiones, jarabes, suspensiones espesas y emulsiones. Los portadores llquidos adecuados incluyen cualquier disolvente organico o inorganico adecuado, por ejemplo, agua, alcohol, solucion salina, solucion salina tamponada, solucion salina fisiologica, solucion de dextrosa, soluciones de propilenglicol en agua, y similares, preferiblemente en forma esteril.

[0046] Las composiciones de vacuna se pueden formular en formas neutras o salinas. Las sales farmaceuticamente

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aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de los polipeptidos activos) y que se forman con acidos inorganicos, tales como, por ejemplo, acidos clorhldrico o fosforico, o acidos organicos, tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres tambien se pueden derivar de bases inorganicas, tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o ferrico, y bases organicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procalna, y similares.

[0047] Las composiciones de vacuna se formulan preferentemente para la inoculacion o inyeccion en el sujeto. Para la inyeccion, las composiciones de vacuna de la invencion se pueden formular en soluciones acuosas, tales como agua o alcohol, o en tampones fisiologicamente compatibles, tales como solucion de Hanks, solucion de Ringer, o tampon de solucion salina fisiologica. La solucion puede contener agentes de formulacion, tales como agentes de suspension, agentes conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Las formulaciones de inyeccion tambien se pueden preparar como preparaciones en forma solida que estan destinadas a ser convertidas, poco antes del uso, en preparaciones en forma llquida adecuadas para la inyeccion, por ejemplo, por constitution con un vehlculo adecuado, tal como agua esteril, solucion salina, o alcohol, antes de utilizarse.

[0048] Las composiciones de vacuna tambien se pueden formular en vehlculos de liberation sostenida o preparaciones de deposito. Tales formulaciones de action prolongada pueden administrarse mediante inoculacion o implantation (por ejemplo subcutanea o intramuscular) o por inyeccion. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones de vacuna se pueden formular con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehlculos de suministro adecuados para su uso como portadores.

[0049] Las composiciones de vacuna pueden comprender agentes que mejoran la eficacia protectora de la vacuna, tales como adyuvantes. Los adyuvantes incluyen cualquier compuesto o compuestos que actuan para aumentar una respuesta inmune protectora al antlgeno peptido GP2, reduciendo as! la cantidad de antlgeno necesaria en la vacuna, y/o la frecuencia de administration necesaria para generar una respuesta inmune protectora. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, emulsionantes, dipeptidos de muramilo, avridina, adyuvantes acuosos, tales como hidroxido de aluminio, adyuvantes basados en quitosano, y cualquiera de las diversas saponinas, aceites y otras sustancias conocidas en la tecnica, tales como Amphigen, LPS, extractos de pared de celula bacteriana, ADN bacteriano, secuencias CpG, oligonucleotidos sinteticos y combinaciones de los mismos (Schijns et al (2000) Curr Opin Immunol 12: 456), extracto de pared celular de Mycobacterialphlei (M. phlei) (MCWE) (Patente de Estados Unidos No. 4.744.984), ADN de M. phlei (M-DNA), y complejo de pared celular (MCC) M-DNa-M. phlei. Los compuestos que pueden servir como emulsionantes incluyen agentes emulsionantes naturales y sinteticos, as! como tensioactivos anionicos, cationicos y no ionicos. Entre los compuestos sinteticos, los agentes emulsionantes anionicos incluyen, por ejemplo, las sales de potasio, sodio y amonio de acido laurico y oleico, las sales de calcio, magnesio y aluminio de acidos grasos, y sulfonatos organicos, tales como laurilsulfato de sodio. Los agentes cationicos sinteticos incluyen, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio mientras que los agentes no ionicos sinteticos se ejemplifican mediante glicerilesteres (por ejemplo, monoestearato de glicerilo), esteres y eteres de polioxietilenglicol, y los esteres de acidos grasos de sorbitan (por ejemplo, monopalmitato de sorbitan) y sus derivados de polioxietileno (por ejemplo, monopalmitato de sorbitan polioxietilenado). Los agentes emulsionantes naturales incluyen acacia, gelatina, lecitina y colesterol.

[0050] Otros adyuvantes adecuados se pueden formar con un componente de aceite, tal como un solo aceite, una mezcla de aceites, una emulsion de agua-en-aceite, o una emulsion de aceite-en-agua. El aceite puede ser un aceite mineral, un aceite vegetal, o un aceite animal. Los aceites minerales son hidrocarburos llquidos obtenidos a partir de vaselina mediante una tecnica de destilacion, y tambien se les conoce en la tecnica como parafina llquida, vaselina llquida, o aceite mineral blanco. Los aceites animales adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de hlgado de bacalao, aceite de halibut, aceite de sabalo, aceite de pez reloj anaranjado y aceite de hlgado de tiburon, todos disponibles comercialmente. Los aceites vegetales adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de canola, aceite de almendras, aceite de semilla de algodon, aceite de malz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de soja, y similares. El Adyuvante Completo de Freund (FCA) y el Adyuvante Incompleto de Freund (FIA) son dos adyuvantes comunes que se utilizan comunmente en preparaciones de vacunas, y tambien son adecuados para usar en la presente invencion. Tanto FCA y FIA son emulsiones de agua en aceite mineral; sin embargo, el FCA tambien contiene una Mycobacterium sp. muerta.

[0051] Las citoquinas inmunomoduladoras tambien pueden ser utilizadas en las composiciones de vacunas para aumentar la eficacia de la vacuna, por ejemplo, como un adyuvante. Los ejemplos no limitantes de tales citoquinas incluyen interferon alfa (IFN-a), la interleuquina-2 (IL-2), y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), o combinaciones de los mismos. El GM-CSF es altamente preferido.

[0052] Las composiciones de vacuna que comprenden los antlgenos de peptido GP2 y que comprenden ademas adyuvantes se pueden preparar usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a, mezcla, sonicacion y microfluidificacion. El adyuvante puede comprender de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% (v/v) de la composition de vacuna, mas preferiblemente de aproximadamente 20% a

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aproximadamente 40% (v/v), y mas preferiblemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% (v/v), o cualquier numero entero dentro de estos intervalos. Aproximadamente el 25% (v/v) es muy preferente.

[0053] La administration de las composiciones de vacuna puede ser por infusion o inyeccion (por ejemplo, por via intravenosa, intramuscular, intracutanea, subcutanea, intratecal, intraduodenal, intraperitoneal, y similares). Las composiciones de vacunas tambien se pueden administrar por via intranasal, vaginal, rectal, oral, o transdermica. Adicionalmente, las composiciones de vacuna se pueden administrar mediante sistemas de administracion "sin aguja". Preferiblemente, las composiciones se administran mediante inyeccion intradermica. La administracion puede ser bajo la direction de un medico o un medico asistente.

[0054] Las inyecciones se pueden dividir en multiples inyecciones, con tales inoculaciones divididas administradas preferiblemente sustancialmente al mismo tiempo. Cuando se administran como una inoculation dividida, la dosis del inmunogeno se proporciona, preferiblemente, pero no necesariamente, por igual en cada inyeccion separada. Si un adyuvante esta presente en la composition de vacuna, la dosis del adyuvante se proporciona, preferiblemente, pero no necesariamente, por igual en cada inyeccion separada. Las inyecciones separadas para la inoculacion dividida se administran preferiblemente sustancialmente proximales entre si en el cuerpo del paciente. En algunos aspectos preferidos, las inyecciones se administran al menos aproximadamente a 1 cm de distancia entre si en el cuerpo. En algunos aspectos preferidos, las inyecciones se administran al menos aproximadamente a 2,5 cm de distancia entre si en el cuerpo. En aspectos muy preferidos, las inyecciones se administran al menos aproximadamente a 5 cm de distancia entre si en el cuerpo. En algunos aspectos, las inyecciones se administran al menos aproximadamente a 10 cm de distancia entre si en el cuerpo. En algunos aspectos, las inyecciones se administran a mas de 10 cm de distancia entre si en el cuerpo, por ejemplo, al menos aproximadamente a 12,5, 15, 17,5, 20, o mas cm de distancia entre si en el cuerpo. Las inyecciones de inmunizacion primaria y las inyecciones de refuerzo se pueden administrar como una inoculacion dividida, tal como se describe y ejemplifica en este documento.

[0055] Se pueden emplear varios sistemas de administracion farmaceuticos alternativos. Los ejemplos no limitantes de tales sistemas incluyen liposomas y emulsiones. Tambien pueden emplearse ciertos disolventes organicos, tales como dimetilsulfoxido. Ademas, las composiciones de vacuna pueden administrarse usando un sistema de liberation sostenida, tal como matrices semipermeables de pollmeros solidos que contienen el agente terapeutico. Los diversos materiales de liberacion sostenida disponibles son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Las capsulas de liberacion sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza qulmica, liberar las composiciones de vacuna en un intervalo de varios dlas a varias semanas a varios meses.

[0056] Para evitar la recurrencia del cancer de mama en un paciente que esta en remision de cancer de mama, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion de vacuna al sujeto. Una cantidad terapeuticamente eficaz proporcionara un aumento cllnicamente significativo en el numero de linfocitos T citotoxicos (CD8+) especlficos de Gp2 en el paciente, as! como un aumento cllnicamente significativo en la respuesta de linfocitos T citotoxicos al antlgeno, tal como se mide por cualquier medio adecuado en la tecnica. Ademas, debido a la difusion de epltopo, una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion de vacuna con GP2 proporcionara un aumento en el numero de linfocitos T citotoxicos (CD8+) especlficos de E75 en el paciente, tal como se mide mediante cualquier medio adecuado en la tecnica. En el paciente en su conjunto, una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion de vacuna destruira la enfermedad microscopica residual y reducira o eliminara significativamente el riesgo de recurrencia del cancer de mama en el paciente.

[0057] La cantidad eficaz de la composicion de vacuna puede depender de cualquier numero de variables, incluyendo sin limitation, la especie, raza, tamano, altura, peso, edad, estado general de salud del paciente, el tipo de formulation, el modo o manera o administracion, o la presencia o ausencia de factores de riesgo que aumentan significativamente la probabilidad de que el cancer de mama reaparecera en el paciente. Tales factores de riesgo incluyen, pero no estan limitados a, el tipo de cirugla, el estado de los nodulos linfaticos y el numero positivo, el tamano del tumor, el grado histologico del tumor, la presencia/ausencia de receptores de hormonas (receptores de estrogeno y progesterona), la expresion de HER2/neu, la invasion linfovascular, y la predisposition genetica (BRCA 1 y 2). En algunos aspectos preferidos, la cantidad eficaz depende de si el paciente es positivo en nodulos linfaticos o negativo en nodulos linfaticos, y si el paciente es positivo en nodulos linfaticos, el numero y el alcance de los nodulos positivos. En todos los casos, la cantidad eficaz apropiada puede ser determinada rutinariamente por los expertos en la tecnica usando tecnicas rutinarias de optimization y el juicio experto e informado del practicante y otros factores evidentes para los expertos en la tecnica. Preferiblemente, una dosis terapeuticamente eficaz de las composiciones de vacuna descrita en el presente documento proporcionara el beneficio preventivo terapeutico sin causar toxicidad sustancial al sujeto.

[0058] La toxicidad y la eficacia terapeutica de las composiciones de vacuna pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La relation de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el Indice terapeutico y puede expresarse como la proportion LD50/ED50. Se prefieren composiciones de vacuna que exhiben Indices terapeuticos elevados. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificacion para su uso en pacientes. La dosificacion de tales composiciones de vacuna se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La

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dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada.

[0059] La information de toxicidad se puede utilizar para determinar con mayor precision las dosis utiles en un sujeto especlfico, tal como un ser humano. El medico puede terminar, interrumpir o ajustar la administracion debido a la toxicidad, o a disfunciones de organos, y puede ajustar el tratamiento segun sea necesario si la respuesta cllnica no es adecuada, para mejorar la respuesta. La magnitud de una dosis administrada en la prevention de cancer de mama recurrente variara con la gravedad de la condition del paciente, el riesgo relativo de recurrencia, o la via de administracion, entre otros factores. La gravedad de la condicion del paciente puede, por ejemplo, evaluarse, en parte, mediante procedimientos estandar de evaluation de pronostico.

[0060] Las composiciones de vacuna pueden administrarse a un paciente en cualquier programacion apropiada para inducir y/o mantener una inmunidad protectora contra la recalda del cancer de mama, y mas especlficamente para inducir y/o mantener una respuesta de linfocitos T citotoxicos a GP2 y/o E75 (debido a la difusion de epltopo). Por ejemplo, a los pacientes se pueden administrar una composition de vacuna como una inmunizacion primaria, tal como se describe y ejemplifica en este documento, seguido por la administracion de una dosis de refuerzo para reforzar y/o mantener la inmunidad protectora.

[0061] En algunos aspectos, a los pacientes se pueden administrar las composiciones de vacuna 1,2 o mas veces al mes. Una vez por mes durante seis meses consecutivos es preferente para establecer la respuesta inmune protectora, sobretodo con respecto al programa de inmunizacion primaria. En algunos aspectos, los refuerzos se pueden administrar a intervalos regulares, tales como cada 6 meses o mas despues de la finalization del programa de inmunizacion primaria. La administracion de la dosis de refuerzo es preferentemente cada 6 meses. Los refuerzos tambien se pueden administrar segun sea necesario.

[0062] El programa de administracion de vacunas, incluyendo la inmunizacion primaria y administracion de refuerzo, puede continuar tanto tiempo como sea necesario para el paciente, por ejemplo, en el transcurso de varios anos, a durante la vida del paciente. En algunos aspectos, la programacion de vacunas incluye una administracion mas frecuente en el principio del regimen de vacunas, e incluye una administracion menos frecuente (por ejemplo, refuerzos) con el tiempo para mantener la inmunidad protectora.

[0063] La vacuna se puede administrar en dosis mas bajas al inicio del regimen de vacuna, con dosis mas altas administradas con el tiempo. Las vacunas tambien se pueden administrar en dosis mas altas al comienzo del regimen de vacunas, con dosis mas bajas administradas con el tiempo. La frecuencia de la administracion de vacunas primarias y de refuerzo y la dosis de GP2 administrada se pueden adaptar y/o ajustar para satisfacer las necesidades particulares de los pacientes individuales, segun lo determinado por el medico de acuerdo con cualquier medio adecuado en la tecnica.

[0064] En algunos aspectos, las composiciones de vacuna, incluyendo composiciones para la administracion como un refuerzo, comprenden de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg de peptido GP2. En algunos aspectos preferidos, las composiciones comprenden aproximadamente 0,1 mg de GP2. En algunos aspectos preferidos, las composiciones comprenden aproximadamente 1 mg de GP2. En algunos aspectos mas preferidos, las composiciones comprenden aproximadamente 0,5 mg de GP2.

[0065] En algunos aspectos preferidos, las composiciones de vacuna que comprenden GP2, incluyendo composiciones para la administracion como refuerzo, comprenden, ademas, GM-CSF. Tales composiciones comprenden preferiblemente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,5 mg de GM-CSF. En algunos aspectos preferidos, las composiciones comprenden aproximadamente 0,125 mg de GM-CSF. En algunos aspectos preferidos, las composiciones comprenden aproximadamente 0,25 mg de GM-CSF.

[0066] En algunos aspectos particularmente preferidos, las composiciones de vacuna comprenden aproximadamente de 0,5 mg a 1 mg de peptido GP2 y de 0,125 a 0,250 mg de GM-CSF en un volumen total de 1 ml, y se administran mensualmente como una inoculation dividida de 0,5 ml cada una, administradas por medio de inyecciones a unos 5 cm de distancia en el cuerpo del paciente, y administradas simultaneamente o mezcladas. El programa de administracion es preferiblemente cada mes durante seis meses. Despues de un perlodo de aproximadamente 48 horas, el sitio de inyeccion se puede evaluar para la reaction local del eritema y el endurecimiento. Si las reacciones en ambos sitios son confluyentes y el area de endurecimiento total mide > 100 mm (o el paciente experimenta cualquier > grado 2 de toxicidad sistemica), entonces la dosis de GM-CSF se puede reducir, por ejemplo, a la mitad, aunque se entiende que la dosis de peptido sigue siendo la misma. Si el paciente presenta una reaccion robusta en las dosis posteriores, entonces se puede producir una reduction adicional de GM-CSF, por ejemplo, reduciendo a la mitad. Si el paciente no presenta una reaccion robusta, entonces el paciente puede continuar con la dosis mas alta de GM-CSF. En algunos aspectos, el programa de administracion y la dosificacion de la dosis de refuerzo se determina de manera similar, con dosis de refuerzo que comienzan con la administracion de composiciones de vacuna que comprenden 1 mg de GP2 y 0,25 mg de GM-CSF, administrados aproximadamente cada seis meses despues de la conclusion del programa de vacuna de inmunizacion primaria .

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[0067] Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invencion con mayor detalle. Pretenden ilustrar, no limitar, la presente invencion.

EJEMPLO 1: Ensayo en Fase I de GP2 + GM-CSF

Caracterfsticas de los pacientes y Protocolo clinico:

[0068] Esta es el primer ensayo en fase cllnica I del peptido GP2 derivado de HER2/neu con el inmunoadyuvante GM- CSF en pacientes con cancer de mama libres de la enfermedad. El ensayo fue aprobado por el Institucional Review Board y llevado a cabo en el Walter Reed Army Medical Center en virtud de una solicitud de nuevo farmaco en investigacion (BB-IND # 11730). Todos los pacientes hablan confirmado histologicamente cancer de mama con nodulos negativos que expresaban todos los niveles de HER2/neu por inmunohistoqulmica estandar (IHC 1-3 +). Los pacientes hablan completado un evolucion estandar de cirugla, quimioterapia y radioterapia (segun se requiera) antes de la inscripcion, y los pacientes en la quimioprevencion hormonal continuaron con su regimen especlfico. Despues de cribar por los criterios de elegibilidad y asesoramiento y consentimiento adecuado, los pacientes HLA-A2+ elegibles fueron incluidos en el estudio. Antes de la vacunacion, a los pacientes se les analizo la piel con un panel de antlgenos de recuerdo (prueba de Mantoux). Los pacientes fueron considerados inmunocompetentes si reaccionaban (> 5 mm) a > 2 antlgenos.

[0069] Se incluyeron y se vacunaron 18 pacientes con cancer de mama libres de enfermedad con nodulos negativos con todos los niveles de expresion de HER2/neu (IHC 1-3+). Ninguno de los pacientes se retiro de este estudio o se perdieron durante el seguimiento. Los datos demograficos del paciente, factores de pronostico y perfiles de tratamiento se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Datos demograficos del paciente, factores de pronostico y perfiles de tratamiento para el estudio en

fase I

: Pacientes GP2 (n = 18)

Mediana de edad, anos: 47

Intervalo, anos: 32-68

Raza blanca (%): 14 (77,8)

negra (%): 2 (11,1)

otras (%): 2 (11,1)

Tamano del tumor T2-T4, (%): 7 (38,9)

Grado histologico Grado III (%): 7 (38,9)

IHC 3+ o FISH+ de HER2/neu (%): 6 (33,3)

Receptor de hormona negativo (%): 8 (44,4)

Sin quimioterapia (%): 6 (33,3)

Sin XRT (%): 6 (33,3)

Terapia hormonal (%): 9 (50,0)

Vacunacion y protocolo clinico

[0070] Vacunas. El peptido GP2 (HER2/neu, 654-662) fue producido comercialmente de acuerdo con las directrices federales para las buenas practicas de fabricacion (GMP) por NeoMPS Inc. (San Diego, CA). La pureza del peptido (> 95%) se verifico por cromatografla llquida de alto rendimiento y espectrometrla de masas, y el contenido de aminoacidos se determino por analisis de aminoacidos. Las pruebas de esterilidad, endotoxinas (prueba de lisado de amebocitos de limulus), y de seguridad en general se llevaron a cabo por el fabricante. El peptido liofilizado se reconstituyo en solucion salina esteril a las concentraciones siguientes: 100 mcg/0,5 ml, 500 mcg/0,5 ml, y 1 mg/0,5 ml. El peptido GP2 se mezclo con GM-CSF (Berlex, Seattle, WA) a 250 mcg/0,5 ml, y la inoculacion de 1,0 ml se dividio y se administro por via intradermica en dos sitios con 5 cm de separacion en la misma extremidad.

[0071] Serie de vacunacion. El estudio se diseno y llevo a cabo como un ensayo de seguridad de escalada de la dosis para determinar la seguridad, la inmunogenicidad y mejor dosis optima del peptido GP2 en combinacion con el adyuvante GM-CSF. La mejor dosis optima se definio como la dosis minima de la vacuna y el adyuvante que da la mejor respuesta inmunologica in vivo y ex vivo.

[0072] Tres pacientes fueron asignados a cada uno de los tres primeros grupos de dosis que recibieron seis inoculaciones mensuales de GP2 y 250 mcg de GM-CSF. Los grupos de dosis se enumeran como peptido GP2 (mcg): GM-CSF (mcg): # de inoculaciones, e incluyen: 100: 250: 6, 500: 250: 6, y 1000: 250: 6. GM-CSF se redujo en un 50% si los pacientes desarrollaron una reaccion local que media > 100 mm o toxicidades sistemicas > grado 2. En el ultimo

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grupo de pacientes, GM-CSF se redujo a 125 mcg de modo que estos nueve pacientes recibieron 500: 125: 6.

[0073] Este ensayo de escalado de dosis utilizo una dosis de peptido GP2 creciente (100 mcg, 500 mcg y 1000 mcg) con 250 mcg de GM-CSF y 6 inoculaciones mensuales para los tres primeros grupos de dosis (abreviado: peptido GP2 (mcg): GM-CSF (mcg): # inoculaciones - 100: 250: 6, 500: 250: 6, y 1000: 250: 6). El GM-CSF se redujo en un 50% si los pacientes desarrollaron una reaccion local que media > 100 mm o toxicidades sistemicas > grado 2. Ocho de los primeros 9 pacientes (89%) requirieron reducciones de dosis de GM-CSF debido a reacciones locales robustas. Debido al numero de reducciones de la dosis requerida, la dosis inicial de GM-CSF se redujo de 250 mcg a 125mcg por inoculacion para el cuarto y ultimo grupo de 9 pacientes (500: 125: 6). Solo 2 de los 9 pacientes (22%) en el grupo de dosis final requirio una nueva reduccion de la dosis de GM-CSF. No se requirieron reducciones de la dosis de peptido para la serie de vacunacion. La figura 1 representa las reacciones locales promedio vs. la dosis de GM-CSF promedi para cada grupo de dosis. Las reacciones locales en el grupo de dosis final fluctuaron menos a lo largo de la serie de vacunacion utilizando una dosis de partida de GM-CSF de 125mcg por inoculacion.

[0074] Toxicidad. Los pacientes se observaron una hora despues de la vacunacion para la hipersensibilidad inmediata y regresaron 48-72 horas despues para medir sus puntos de inyeccion e ser interrogados sobre las toxicidades. Las toxicidades fueron clasificadas mediante NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events, v3.0 (CTCAE). La progresion de un grupo de dosis al siguiente se produjo solo en la ausencia de toxicidades limitantes de la dosis, lo que se define como la reaccion de hipersensibilidad de dos pacientes dentro de un grupo de la dosis que desarrollan una toxicidad > grado 3.

[0075] Aislamiento y cultivos de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). Se extrajo sangre antes de cada vacunacion y en un mes (post-vacuna) y seis meses (a largo plazo) tras la finalizacion de la serie de vacunas. Se extrajeron 50 ml de sangre y se aislaron las PBMC. Las PBMC se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo y se usaron como una fuente de linfocitos.

[0076] Ensayo de dimero de inmunoglobulina HLA-A2. La presencia de celulas T CD8+ especlficas de GP2 en PBMC recien aisladas de pacientes se evaluo directamente ex vivo mediante el ensayo de dimero al inicio del estudio, antes de cada vacunacion sucesiva, y a los 1, 6, y 12 meses despues de la finalizacion de la serie de vacunacion (Woll MM et al, J Clin Immunol (2004) 24: 449-461). Brevemente, el dimero de inmunoglobulina (Ig) HLA-A2 (PharMingen, San Diego, CA) se cargo con el peptido GP2, E75, o peptido de control (E37, la proteina de union a folato (25-33) RIAWARTEL) mediante la incubacion de 1 mcg de dimero con un exceso (5 mcg) de peptido y 0,5 mcg de p2- microglobulina (Sigma, St. Louis, MO) a 37°C durante la noche, despues se almaceno a 4°C hasta su uso. Las PBMC se lavaron y se resuspendieron en tampon “PharMingen Stain Buffer” (PharMingen) y se anadieron a 5x105 celulas/100 pl/tubo en tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (Becton Dickinson, Mountain View, CA) y se tineron con los dimeros y anticuerpos cargados. En cada paciente se determino el nivel de celulas CD8+ especificas de GP2 y especificas E75 en respuesta a cada vacunacion sucesiva, y se compararon los niveles promedio despues de la inoculacion con los niveles antes de la inoculacion.

[0077] Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Las reacciones de DTH al peptido GP2 se llevaron a cabo antes de, y despues de, la serie de vacunacion. Las inyecciones intradermicas, en la parte posterior o extremidad (lado opuesto de la vacunacion), usando 100 mcg de GP2 (sin GM-CSF) en 0,5 ml de solucion salina se compararon con un inoculo de control de volumen igual de solucion salina. Las reacciones de DTH se midieron en dos dimensiones a las 48-72 horas usando el procedimiento de boligrafo sensible y presentaron como la media ortogonal. Sokol JE, Measurement of delayed skin test responses. N Engl JMed (1975) 293: 501-501.

[0078] Analisis estadfstico. Los valores de p para los factores clinicopatologicos se calcularon utilizando Wilcoxon, prueba exacta de Fisher o c2 segun sea apropiado. Los valores de p para la comparacion de los ensayos de DTH y de dimero pre y post-vacunacion se calcularon utilizando la prueba t de Student, apareado o no apareado, segun sea apropiado. Las diferencias se consideraron significativas cuando p <0,05.

Resultados

[0079] Las composiciones que comprenden GP2 y GM-CSF son seguras y altamente inmunogenicas. Las respuestas inmunes, tanto ex vivo como in vivo, parecen estar influidas por la presencia o ausencia de inmunidad especifica de GP2 al inicio de la serie de inoculacion y por la dosis de GM-CSF utilizada. Ademas, la vacunacion de GP2 da lugar eficientemente a una difusion intraantigenica de epitopo.

[0080] La toxicidad se limito a reacciones leves locales (que se desean y sirven como una medida sustituta de la inmunogenicidad) y las respuestas sistemicas leves, muchas de las cuales son conocidos efectos secundarios de GM- CSF. No hubo toxicidades limitantes de la dosis, y las reducciones de dosis en GM-CSF fueron suficientes para limitar las reacciones locales encontradas con inoculaciones en serie hasta < grado 2. En general, la combination de vacunas se tolero bien.

[0081] Como se discute en mas detalle a continuation, se demostro la inmunogenicidad ex vivo de la vacuna, pero

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era principalmente evidente cuando se realiza el analisis de subgrupos de los pacientes sin inmunidad preexistente. Los pacientes sin inmunidad preexistente, como se define anteriormente como nivel de dimero especifico de peptido <0,3%, alcanzaron la mayor induccion de una respuesta de CTL a la vacunacion de GP2. Esta respuesta era uniforme sin tener en cuenta la dosis del peptido GP2. Los pacientes con inmunidad preexistente demostraron una menor respuesta de CTL que sugiere un nivel de tolerancia a las vacunas de peptidos o una respuesta inmune endogena previamente optimizada.

[0082] La inmunogenicidad in vivo de la vacuna GM-CSF + GP2 se demostro por un incremento en la reaccion de DTH en respuesta al peptido GP2 (sin GM-CSF) antes y despues de la serie de vacunacion. Esta diferencia en la respuesta alcanzo una significacion estadistica acumulativa y dentro de cada grupo de dosis. Es de destacar que los pacientes sin inmunidad preexistente mostraron una tendencia hacia reacciones de DTH mas grandes. Ademas, los pacientes que recibieron la dosis de 250 mcg de GM-CSF mostraron una tendencia hacia una respuesta de DTH mas grande, pero este hallazgo fue confundido por un mayor porcentaje de pacientes con inmunidad preexistente en el grupo de dosis de GM-CSF inferior. Por lo tanto, no esta claro si la diferencia observada en los pacientes con 250 mcg de GM-CSF se debe a la dosis de adyuvante o a la falta de tolerancia. En conjunto, estas respuestas de DTH indicarian que la inmunidad in vivo se mantiene y aumenta en todos los grupos en respuesta a la vacunacion.

[0083] Grupos de Dosis. Este ensayo de escalado de dosis utilizo una dosis creciente de peptido GP2 (100 mcg, 500 mcg y 1000 mcg) con 250 mcg de GM-CSF y 6 inoculaciones mensuales para los tres primeros grupos de dosis (abreviado: peptido GP2 (mcg): GM-CSF (mcg): # inoculaciones - 100: 250: 6, 500: 250: 6, y 1000: 250: 6). El GM- CSF se redujo en un 50% si los pacientes desarrollaron una reaccion local que media > 100 mm o toxicidades sistemicas > grado 2. Ocho de los primeros 9 pacientes (89%) requirieron reducciones de dosis de GM-CSF debido a reacciones locales robustas. Debido al numero de reducciones de la dosis requerida, la dosis inicial de GM-CSF se redujo de 250 mcg a 125mcg por inoculacion para el cuarto grupo y el ultimo grupo de 9 pacientes (500: 125: 6). Solo 2 de los 9 pacientes (22%) en el grupo de dosis final requirio una nueva reduccion de la dosis de GM-CSF. No se requirieron reducciones de dosis de peptidos para la serie de vacunacion. La figura 1 representa las reacciones locales promedio vs. la dosis de GM-CSF promedio para cada grupo de dosis. Las reacciones locales en el grupo de dosis final fluctuaron menos a lo largo de la serie de vacunacion utilizando una dosis de partida de GM-CSF de 125mcg por inoculacion.

[0084] Grupo de dosificacion combinada. No hubo toxicidades de grado 3-5 entre los 18 pacientes que recibieron un total de 108 dosis de GP2 + GM-CSF. Entre todos los pacientes, las toxicidades locales maximas que aparecieron durante toda la serie fueron de grado 1 (38,9%) o de grado 2 (61,1%). Las toxicidades sistemicas maximas durante la serie fueron de grado 0 (5,6%), grado 1 (61,1%), y de grado 2 (33,3%). Las reacciones locales mas comunes incluyeron eritema y endurecimiento (100% de los pacientes), prurito (25%) e inflamacion (23%). Las reacciones sistemicas mas comunes fueron fatiga de grado 1 (40%) y artralgia/mialgia de grado 1 (15%). Las tasas de toxicidad local y sistemica combinada general se observan en la Figura 2a.

[0085] La vacuna GP2 + GM-CSF fue capaz de provocar una respuesta inmune tanto ex vivo como in vivo. La respuesta inmune ex vivo se evaluo a traves del ensayo del dimero HLA-A2:Ig para detectar el porcentaje de celulas T CD8+ circulantes especificas de GP2. Las CTL especificas de GP2 se indican como el porcentaje promedio ± error estandar de la poblacion total de CD8+ circulante. Los puntos de tiempo analizados incluyeron pre-vacuna (pre = 0,5 ± 0,1%), un mes despues de la finalizacion de todas las inoculaciones (post = 0,6 ± 0,1%), valor maximo durante la serie (max = 1,4 ± 0,2%), y 6 meses despues de la finalizacion de todas las inoculaciones (a largo plazo = 0,9 ± 0,2%). Aunque se produjo un aumento estadisticamente significativo en los pacientes cuando se compararon los niveles de vacuna pre vs. maximo (p = 0,0003), no se observo un aumento significativo comparando niveles de dimero de vacuna pre vs. post o a largo plazo (p = 0,7 y p = 0,2, respectivamente) (Figura 2b).

[0086] La eficacia in vivo de la vacuna se analizo a traves de las respuestas de DTH a la serie pre y post-vacuna utilizando GP2 (sin GM-CSF), asi como un control de volumen de solucion salina. Se observo un aumento estadisticamente significativo en las respuestas de DTH a GP2 pre vs. post-vacuna (2,5 ± 1,4 mm vs. 35,1 ± 7,0 mm, p = 0,0002) (Figura 2c).

[0087] Para elucidar mejor la respuesta inmunologica a la vacuna con GP2, se realizaron dos analisis de subconjuntos diferentes: respuesta basada en la presencia de inmunidad especifica de GP2 preexistente y la respuesta basada en la dosis de GM-CSF. Se proporcionan a continuacion.

[0088] Inmunidad preexistente vs. inmunidad no preexistente. Tal como se define anteriormente, la inmunidad preexistente es un nivel de dimero especifico de peptido> 0,3% (Peoples GE et al, J Clin Oncol (2005) 23: 7.5367.545). Diez pacientes (56%) tenian niveles de dimero consistentes con la inmunidad preexistente a GP2, y 8 pacientes (44%) no tenian inmunidad preexistente. Hubo una diferencia estadistica entre los dos grupos de niveles de dimero de gP2 antes de la vacuna (0,8 + 0,1% vs. 0,06 + 0,02%, p = 0,0007).

[0089] Los pacientes sin inmunidad preexistente tuvieron un ligero aumento de reacciones locales con toxicidades locales ligeramente mas altas en comparacion con el grupo con inmunidad preexistente; aunque, esto no fue estadisticamente significativo (Figura 3a).

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[0090] Se observaron las respuestas inmunes ex vivo e in vivo en ambos grupos, pero fueron mas robustas en el grupo de pacientes sin inmunidad preexistente. Los niveles de dimero de GP2 del grupo sin inmunidad preexistente fueron pre vs. max (0,06 ± 0,02% vs. 1,4 ± 0,4%; p = 0,009), pre vs. post (0,06 ± 0,02% vs. 0,5 ± 0,2%; p = 0,07), y pre vs. a largo plazo (0,06 + 0,02% vs. 0,9 + 0,4%; p = 0,06). En los 10 pacientes con inmunidad preexistente, la respuesta de CTL a la vacunacion fue pre vs. max (0,8 ± 0,1% vs. 1,5 ± 0,2%; p = 0,02), pre vs. post (0,8 ± 0,1% vs. 0,6 ± 0,2%; p = 0,2), y pre vs. a largo plazo (0,8 ± 0,1 vs. 0,9 ± 0,2; p = 0,7) (Figura 3b).

[0091] Al comparar la respuesta inmune in vivo de los grupos, ambos grupos tenian aumentos estadisticamente significativos en sus respuestas de DTH pre vs. post (sin inmunidad preexistente = 3,3 ± 2,1mm vs. 43,9 ± 14,6mm; p = 0,02; e inmunidad pre-existente = 2,0 ± 2,0 mm vs. 28,0 ± 4,6 mm; p = 0,0001).

[0092] Los pacientes sin inmunidad preexistente tenian mayores respuestas de DTH post en comparacion con la respuesta de DTH post del grupo con inmunidad preexistente, pero esta diferencia no fue estadisticamente significativa (43,9 + 14,6 mm vs. 28,0 + 4,6 mm, respectivamente; p = 0,3) (Figura 3c).

[0093] GM-CSF 250 mcg vs. 125 mcg. Tambien se realizo analisis de los pacientes de acuerdo con las dos dosis de partida de GM-CSF. Ambos efectos toxicos locales y sistemicos se redujeron en el grupo de dosis final de 125 mcg GM-CSF, aunque no fue estadisticamente significativo (Figura 4a).

[0094] La respuesta de CTL a la vacunacion en los grupos de dosis de 250 mcg (n = 9) fueron pre vs. max (0,3 ± 0,1% vs. 1,1 ± 0,2%; p = 0,004), pre vs. post (0,3 ± 0,1 % vs. 0,5 ± 0,2%; p = 0,07), y pre vs. a largo plazo (0,3 ± 0,1% vs. 0,4 ± 0,09%; p = 0,2). La respuesta de CTL en el grupo de dosis de 125mcg (n = 9) fue pre vs. max (0,8 ± 0,2% vs. 1,8 ± 0,3%; p = 0,04), pre vs. post (0,8 ± 0,2% vs. 0,6 ± 0,2%; p = 0,5), y pre vs. a largo plazo (0,8 ± 0,2% vs. 1,4 ± 0,3%; p = 0,5) (Figura 4b). Tanto los grupos de 250 mcg como de 125 mcg de GM-CSF tuvieron aumentos significativos en la respuesta de dimero de pre a maxima, y el grupo de 250 mcg mostro una tendencia hacia la significacion. Este analisis puede ser confundido por el hecho de que el 33% (3/9) de los pacientes del grupo de 250 mcg tenia una inmunidad preexistente, mientras que el 77,8% (7/9) de los pacientes del grupo de 125 mcg tenian una inmunidad preexistente.

[0095] Para las respuestas inmunes in vivo, todos los pacientes, independientemente de la dosis de GM-CSF, tenian un aumento estadisticamente significativo en la respuesta de DTH comparando mediciones pre vs. post-vacuna (125 mcg = 3,8 ± 2,5 mm a 24,4 ± 5,5 mm; p = 0,009, y 250 mcg = 1,3 ± 1,3 mm a 45,7 ± 12,2mm; p = 0,008). Los pacientes que recibieron 250 mcg de GM-CSF tuvieron una tendencia hacia las respuestas de DTH post-vacunas mas grandes, aunque no estadisticamente significativas (45,7 ± 12,2mm vs. 24,4 ± 5,5 mm; p = 0,1) (Figura 4c).

[0096] Estado de expresion de HER2. Los datos de la respuesta inmune in vivo para pacientes agrupados de acuerdo con el nivel de expresion de HER2 (IHC 1+, IHC 2+, o IHC 3+) se analizaron, como se muestra en la Tabla 2 a continuacion. Los tres grupos produjeron reacciones de DTH sustanciales post-vacuna. Sorprendentemente, los pacientes que tenian una expresion de baja a intermedia de HER2/neu produjeron respuestas inmunitarias in vivo similares en magnitud a las respuestas de DTH post-vacuna observadas en pacientes IHC 3+. La expresion de bajo a intermedia que expresa de los pacientes con HER2/neu tambien mostraron una tendencia hacia diferencias mas estadisticamente significativas entre las respuestas de DTH pre y post-vacuna en comparacion con los pacientes con IHC 3+. Especificamente, los pacientes con IHC 2+ tuvieron un aumento estadisticamente significativo en la respuesta de DTH comparando las mediciones pre vs. post-vacuna (2,3 ± 2,3 mm a 32,5 ± 6,6 mm; p = 0,02). Los pacientes con IHC 1+ y IHC3+ tenian una tendencia hacia respuestas de DTH post-vacuna mas potentes, con los pacientes IHC 1 + mas cerca de la significacion estadistica que los pacientes IHC 3+ (IHC 1+ = 2,1 ± 2,1 mm a 33,0 ± 12,8 mm; p = 0,06, y IHC 3+ = 3,9 ± 3,9 mm a 44,0 ± 17,9 mm; p = 0,1). Cuando los datos de DTH de los pacientes de expresion de baja a intermedia se combinaron ("LE") y se compararon con los datos de DTH de los pacientes con IHC 3+ ("OE"), se observo inesperadamente que los pacientes LE tenian un aumento estadisticamente significativo en la respuesta de DTH comparando las mediciones pre vs. post-vacuna (2,0 ± 1,4 mm a 31,7 ± 7,1 mm; p = 0,002) en comparacion con los pacientes OE (3,9 ± 3,9 mm a 44,0 ± 17,9 mm; p = 0,1).

Tabla 2. Respuestas de DTH basadas en el nivel de expresion de HER2

: IHC 1 + IHC 2+ IHC 3+ No IHC

Numero: 7 5 5 1

GP2 pre-DTH

promedio ± SE: 2,1 ± 2,1 2,3 ± 2,3 3,9 ± 3,9

mediana (intervalo): 0 (0-14,5) 0 (0-11,5) 0 (0-19,5)

GP2 post-DTH

promedio ± SE: 33,0 ± 12,8 32,5 ± 6,6 44,0 ± 17,9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

mediana (intervalo): 23,5 (0-104) 28 (22,5-58,5) 30 (14,5-114,5)

valor p pre-post (prueba t): 0,06 0,03 0,1

: LE OE

Numero: 13 5

GP2 pre-DTH: 2,0 ± 1,4 3,9 ± 3,9

promedio ± SE: 0 (0-14,5) 0 (0-19,5)

mediana (intervalo)

GP2 post-DTH

promedio ± SE: 31,7 ± 7,1 44,0 ± 17,9

mediana (intervalo): 24,0 (0-104) 30 (14,5-114,5)

valor p pre-post (prueba t): 0,002 0,1

[0097] Difusion de epftopo. Por ultimo, se realizo la evaluacion para la evidencia de difusion de epltopo intraantigenico en respuesta a la vacunacion con GP2 + GM-CSF. Se realizao la medicion de CTL especlficas de GP2 y E75 antes de, durante, y despues de la vacunacion. Se observo que el porcentaje de CTL especlficas de E75 aumento de manera significativa cuando se compararon niveles pre vs. maximos (0,8 ± 0,2% vs 2,0 ± 0,2%; p = 0,0001), y aumento, pero no significativamente, pre vs. post-vacuna (0,8 ± 0,2% vs. 1,2 ± 0,2%; p = 0,1) y pre vs. a largo plazo (0,8 ± 0,2% vs. 1,0 ± 0,2%; p = 0,6) en respuesta a la vacunacion con peptido GP2 (Figura 5). Cabe indicar que estos niveles de CTL especlficas de E75 son similares en magnitud a la vacunacion primaria con E75 con la unica diferencia de una tendencia hacia respuestas de dlmero maximas de E75 mas grandes en comparacion con GP2 (2,0 ± 0,2% vs. 1,4 ± 0,2%; p = 0,07).

[0098] La observation de reacciones de DTH y reacciones locales mas robustas junto con mayores respuestas de CTL entre los pacientes empezando con dosis mas altas de GM-CSF sugiere que la dosis de inmunoadyuvante juega un papel en la inmunogenicidad, y, posiblemente, en la eficacia de las vacunas de peptidos HER2/neu. Como se indico anteriormente, las dosis mas grandes de E75 + GM-CSF llevaron a reacciones de DTH mas robustas y a tendencias hacia un menor numero de reapariciones con la mejora de la supervivencia en los pacientes que presentaron recurrencia (Peoples GE et al, Clin Cancer Res (2008) 14 (3): 797-803). Otro estudio reciente con E75 ha mostrado que la administration de E75 y GM-CSF en seis inoculaciones mensuales a pacientes con cancer de mama libre de enfermedad en el grupo de dosis optima (ODG) de 1000 mcg de E75 y 250 mcg de GM-CSF (1000: 250: 6) da lugar a una respuesta de DTH promedio post-vacunacion de 21,5 mm. Holmes et al, Cancer (2008) 113: 1666-1675. Las respuestas de DTH post-vacunacion del grupo de dosis suboptima (SDG) fueron significativamente menores que la OBD. Curiosamente, los pacientes en el ODG tenlan menos casos de recurrencia de la enfermedad a pesar de tener una enfermedad mas agresiva, lo que indica que la respuesta de DTH proporciona un marcador util para el resultado cllnico y, en particular, para medir la predisposition a la recurrencia de la enfermedad, correlacionando una menor DTH con una mayor predisposicion a la recurrencia de la enfermedad o de un tiempo de supervivencia libre de enfermedad mas corto y viceversa.

[0099] Sorprendentemente, a pesar de que GP2 tiene una afinidad de union relativamente mala a HLA-A2 y es el epltopo subdominante, los pacientes tratados con GP2 y GM-CSF mostraron respuestas de DTH notablemente mayores en comparacion con las inducidas con el epltopo inmunodominante, E75 (mas GM-CSF). En este ensayo con GP2, las respuestas de DTH mas grandes se observaron en los pacientes sin inmunidad preexistente (43,9 mm), as! como en los pacientes que recibieron la dosis de GM-CSF mas alta (45,7 mm). Especlficamente, la respuesta de DTH promedio despues de la vacunacion para todos los pacientes con GM-CSF + GP2 fue 35,1 mm, mientras que la respuesta de DTH promedio despues de la vacunacion para los pacientes GM-CSF + E75 fue de 11,3 mm (SDG) y 21,5 mm (ODG). Los pacientes tratados con GP2 y 250 mcg de GM-CSF tuvieron una DTH promedio despues de la vacunacion de mas de dos veces el tamano de los pacientes con OBD E75 tratados de manera similar (1000: 250: 6) (45,7 mm vs. 21,5 mm). Sorprendentemente, en comparacion con los ensayos anteriores con el peptido inmunodominante E75, la reaction de DTH promedio a GP2 fue aproximadamente dos veces el tamano de la inducida por E75 con la mitad en promedio de la dosis del peptido. No solo estos hallazgos ilustran adicionalmente la inmunogenicidad de GP2 y ponen de relieve su importancia cllnica, sino que los datos de DTH in vivo tambien sugieren fuertemente que GP2, a pesar de ser el epltopo subdominante, deberla ser mas eficaz en la reduction de la recurrencia del cancer de mama que E75.

EJEMPLO 2: Ensayo en Fase II de GP2 + GM-CSF

Procedimientos

[0100] Los pacientes con cancer de mama libres de enfermedad de alto riesgo que han completado la terapia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

adyuvante estandar se inscribieron en multiples sitios y se dispusieron al azar para recibir seis inoculaciones mensuales de 500 mcg de GP2 con 125 mcg de GM-CSF (grupo de peptido; PG) o 125 mcg de GM-CSF solo (grupo de adyuvante; AG). La toxicidad se evaluo despues de cada inoculacion. La respuesta inmunologica se controlo mediante las mediciones de las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) y un ensayo de dlmero de antlgeno HLA-A2: inmunoglobulina para detectar los linfocitos T cD8+ especlficos de GP2. Los pacientes fueron controlados cllnicamente, radiologicamente, y patologicamente para la recurrencia.

Resultados

[0101] Hasta el momento, 50 (27 PG, 23 AG) de los 200 pacientes planificados han completado la serie primaria. PG y AG tienen caracterlsticas demograficas/de pronostico similares (Tabla 3).

Tabla 3. Caracterfsticas demograficas y de pronostico de pacientes para el estudio de la fase II

Democ: raficas

: Peptido Adyuvante p =

N =: 27 23

Edad (mediana): 52 51 0,88

Nodulo positivo: 51,9% 69,6% 0,32

Grado 3: 51,9% 56,5% 1

Tumor >= 2 cm: 66,7% 52,2% 0,45

ER/PR neg: 40,7% 43,5% 0,92

sobreexpresa HER2: 59,3% 47,8% 0,6

[0102] Los perfiles de toxicidad en el PG y AG fueron casi identicos sin toxicidades locales de grado 4-5 y sin toxicidades sistemicas de grado 3-5 en cualquier brazo. La mediana de la reaccion DTH a GP2 aumento significativamente de nivel antes de la vacunacion despues de la finalizacion de la serie primaria (despues de la vacunacion) en el grupo de PG (1,0 ± 0,8 cm a 18,0 ± 3,1 cm; p <0,0001) y en menor medida en el grupo AG (0,0 ± 1,0 cm a 0,5 ± 3,3 cm; p <0,01) (Figura 6.). La DTH post-vacunacion fue significativamente mayor en el PG en comparacion con el AG (18,0 ± 3,1 cm vs 0,5 ± 3,3 cm, p = 0,002) (Figura 6). Todos los pacientes (27/27) PG mostraron inmunidad significativa (SI) por DTH (reaccion de mas de 1 cm) despues de la vacunacion en comparacion con 45,5% (10/22) de los pacientes AG. De los 10 pacientes AG con SI post-vacunacion, el 50% (5/10) tenia SI antes de la vacunacion en comparacion con solo el 16,6% (2/12) sin SI despues de la vacunacion (p = 0,38). El % linfocitos CD8+ especlficos de GP2 aumento significativamente de la llnea de base a los 6 meses despues de la finalizacion de la serie primaria en el PG (0,65 ± 0,15 a 1,82 ± 0,23, p = 0,002) y no cambio significativamente en el AG (1,08 ± 0,16 a 1,41 ± 0,49, p = 0,45).

[0103] Debido a que este es un estudio en curso de multiples sitios, con pacientes que participaron de forma continua, los datos de recurrencia aun no estan completos. Sin embargo, los datos preliminares muestran que los pacientes PG han experimentado una reduccion de aproximadamente el 50% en la tasa de recurrencia en comparacion con los pacientes AG de control, similar a las tasas de recurrencia observadas a los 24 meses en los pacientes tratados con E75 + GM-CSF (Peoples GE et al ., Clin Cancer Res (2008) 14 (3): 797-803). Mas especlficamente, en una mediana de seguimiento de 17,9 meses, la tasa de recurrencia en el PG es 7,4% (2/27) en comparacion con 13% (3/23) en el AG (p = 0,65). Mas datos de la tasa de recurrencia estaran disponibles a medida que mas pacientes se sometan a un seguimiento a los 24 meses y mas alla y a medida que mas pacientes se inscriban en el estudio.

[0104] Todas las patentes, solicitudes de patentes, y referencias publicadas citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. Si bien esta invencion se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, se entendera por los expertos en la tecnica que pueden hacerse diversos cambios en la forma y detalles en la misma sin apartarse del alcance de la invencion abarcado por las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0105]

<110> THE HENRY M. JACKSON FOUNDATION FOR THE ADVANCEMENT OF MILITARY MEDICINE, INC.

<120> VACUNA PARA LA PREVENCION DE LA RECURRENCIA DEL CANCER DE MAMA

<130> HMJ-106-PCT

<140>

<141>

<150> US 61/121,220

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<151> 2008-12-10 <160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 1225 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Met: Lys Leu Arg

1

Arg: His Leu Tyr



: 20

Thr: S_ 1- Leu Pro

: 35

Glu: Val Gln Gly

: 50

Pro: Leu Gln Arg

65

Asn: S_ 1- Ala Leu

Thr: Pro Val
Thr



: 100

Arg: Ser Leu Thr

: 115

Pro: Gl n Leu Cys

: 130

Lys: Asn Asn Gln

145

Ala: Cys His Pro

Glu: Ser Ser
Glu



: 180

Gly: Cys Ala Arg


: 195

Gln: Cys Ala Ala

: 210

Leu: Pro Ala Ser

5

Gln: Gly Cys
Gln

Thr: Asn Ala Ser



: 40

S_ 1-: Val Leu Ile

: 55

Leu: Arg Ile Val

: 70

Ala: Val Leu Asp

85

Gly: Ala Ser Pro

Glu: Ile Leu Lys



: 120

Tyr: Gln Asp Thr


: 135

Leu: Ala Leu Thr

: 150

Cys: Ser Pro Met

165

Asp: Cys Gl n Ser

Cys: Lys Gly Pro



: 200

Gly: Cys Thr
Gly


: 215

Pro: Glu Thr His

: 10

Val
Val: Gln Gly

25

Leu: Ser Phe
Leu

Ala: Hi s Asn Gl n



: 60

Arg: Gly Thr Gl n


: 75

Asn: Gly Asp Pro

: 90

Gly
Gly: Leu Arg

105

Gly
Gly: Val Leu

Ile: Leu Q_ L. 1- Lys



: 140

Leu: Ile Asp Thr


: 155

Cys: Lys Gly Ser

: 170

Leu: Thr Arg Thr

185

Leu: Pro Thr Asp

Pro: Lys His Ser



: 220

Leu: Asp Met 15
Leu

Asn: Leu 30 Glu Leu

Gln 45: Asp Ile Gln

Val: Arg Gln
Val

Leu: Phe Glu Asp 80

Leu: Asn Asn 95 Thr

Glu: Leu 110 Gln Leu

Ile 125: Gln Arg Asn

Asp: Ile Phe His

Asn: Arg Ser Arg 160

Arg: Cys Trp 175 Gly

Val: Cys 190 Ala Gly

Cys 205: Cys His Glu

Asp: Cys Leu Ala

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cys: Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala

225: 230 235 240

Leu: Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu



: 245 250 255

Gly: Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn



: 260 265 270

Tyr: Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His


: 275 280 285

Asn: Gl n Glu Val Thr Ala Gl u Asp Gly Thr Gl n Arg Cys Glu Lys Cys

: 290 295 300

Ser: Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu

305: 310 315 320

Arg: Gl u Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gl n Glu Phe Ala Gly


: 325 330 335

Cys: Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp



: 340 345 350

Gly: Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gl n Pro Glu Gl n Leu Gl n

355: 360 365

Val: Phe Glu Thr Leu Glu Gl u Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala

: 370 375 380

T rp: Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gl n Asn Leu Gl n Val

385: 390 395 400

Ile: Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Al a Tyr Ser Leu Thr Leu Gl n


: 405 410 415

Gly: Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu
Gly



: 420 425 430

Ser: Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His

: 435 440 445

Thr: Val Pro Trp Asp Gl n Leu Phe Arg Asn Pro His Gl n Ala Leu Leu

: 450 455 460

Hi s: Thr Ala Asn Arg Pro Gl u Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala

465: 470 475 480

Cys: His Gl n Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr




: 485 490 495

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gln: Cys Val Asn Cys Ser Gl n Phe Leu Arg Gly Gl n Glu Cys Val Glu



: 500 505 510

Glu: Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg


: 515 520 525

Hi s: Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gl n Asn Gly Ser Val

: 530 535 540

Thr: Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr

545: 550 555 560

Lys: Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro




: 565 570 575

Asp: Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala



: 580 585 590

cys: Gl n Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr Hi s Ser Cys Val Asp Leu Asp


: 595 600 605

Asp: Lys Gly Cys Pro Ala Gl u Gln Arg Al a Ser Pro Leu Thr Ser Ile

: 610 615 620

Ile: Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val

625: 630 635 640

Phe: Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr




: 645 650 655

Met: Arg Arg Leu Leu Gln Gl u Thr Glu Leu Val Gl u Pro Leu Thr Pro

: 660 665 670

Ser: Gly Ala Met Pro Asn Gl n Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr

: 675 680 685

Glu: Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val

: 690 695 700

Tyr: Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val

705: 710 715 720

Al a: Ile Lys Val Leu Arg Gl u Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu




: 725 730 735

Ile: Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val


: 740 745 750

Ser: Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr

: 755 760 765

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gln: Leu Met Pro S_ 1- Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg

: 770 775 780

Gly: Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala

785: 790 795 800

Lys: Gly Met Ser Tyr Leu Gl u Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu




: 805 810 815

Ala
Ala: Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr


: 820 825 830

Asp: Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Gl u Thr Glu Tyr His


: 835 840 845

Ala: Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys T rp Met Ala Leu Glu Ser Ile

: 850 855 860

Leu: Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val

865: 870 875 880

Thr: Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Al a Lys Pro Tyr Asp Gly Ile




: 885 890 895

Pro: Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu
Pro


: 900 905 910

Gln: Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys


: 915 920 925

Q_ L. 1-: Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser

: 930 935 940

Glu: Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln

945: 950 955 960

Asn: Gl u Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg



: 965 970 975

Ser: Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu



: 980 985 990

Tyr: Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro A" la Pro Gly

995 1000 1005

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1010 1015 1020

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1025 1030 1035

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Glu: Ala 1040 Pro Arg Ser Pro Leu 1045 Ala Pro Ser Glu Gly 1050 Ala Gly Ser

Asp: Val 1055 Phe Asp Gly Asp Leu 1060 Gly Met Gly Ala Ala 1065 Lys Gly Leu

Gln: Ser 1070 Leu Pro Thr His Asp 1075 Pro Ser Pro Leu Gln 1080 Arg Tyr Ser

Glu: Asp 1085 Pro Thr Val Pro Leu 1090 Pro Ser Glu Thr Asp 1095 Gly Tyr Val

Ala: Pro 1100 Leu Thr Cys Ser Pro 1105 Gln Pro Glu Tyr Val 1110 Asn Gln Pro

Asp: Val 1115 Arg Pro Gln Pro Pro 1120 Ser Pro Arg Glu Gly 1125 Pro Leu Pro

Ala: Ala 1130 Arg Pro Ala Gly Ala 1135 Thr Leu Glu Arg Pro 1140 Lys Thr Leu

Ser: Pro 1145 Gly Lys Asn Gly Val 1150 Val Lys Asp Val Phe 1155 Ala Phe Gly

Gly: Ala 1160 Val Glu Asn Pro Glu 1165 Tyr Leu Thr Pro Gln 1170 Gly Gly Ala

Ala: Pro 1175 Gln Pro His Pro Pro 1180 Pro Ala Phe Ser Pro 1185 Ala Phe Asp

Asn: Leu 1190 Tyr Tyr Trp Asp Gln 1195 Asp Pro Pro Glu Arg 1200 Gly Ala Pro

Pro: Ser 1205 Thr Phe Lys Gly Thr 1210 Pro Thr Al a Glu Asn 1215 Pro Glu Tyr

Leu: Gly 1220 Leu Asp Val Pro Val 1225

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5

5 <210> 4

<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

10 <400> 4

Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 1 5

15 <210> 5

<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

20 <400> 5

Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu 1 5

25

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

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REIVINDICACIONES

1. Composition que comprende un portador farmaceuticamente eficaz, un peptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos, y en la que, aparte del peptido GP2, la composition no contiene ningun otro peptido derivado de HER2/neu, tal como un peptido E75 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, para utilizar en prevenir la recurrencia del cancer de mama en un sujeto, en la que el sujeto es humano y esta en remision despues del tratamiento con una evolution estandar de la terapia; y en la que las celulas cancerosas del sujeto tienen una sobreexpresion de HER2/neu, y en la que la sobreexpresion de HER2/neu es una calificacion de inmunohistoqulmica, "IHC", de 3+ o una calificacion de hibridacion fluorescente in situ, "FISH", de 2,0 o mayor para la expresion del gen HER2/neu.
2. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la composition se administra mediante inyeccion o inoculation.
3. Composition para utilizar, segun la revindication 2, en la que la inyeccion es una inyeccion intradermica o en la que la composition se inyecta en una o mas dosis divididas.
4. Composition para utilizar, segun la revindication 3, en la que la composition se inyecta en una o mas dosis divididas y en la que los sitios de inyeccion en el sujeto se localizan aproximadamente a 5 cm separados entre si.
5. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la composition se administra cada mes durante seis meses.
6. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la composition se administra al sujeto conjuntamente con un refuerzo que comprende una cantidad eficaz de una composition de refuerzo de la vacuna que comprende un portador farmaceuticamente eficaz y un peptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
7. Composition para utilizar, segun la revindication 6, en la que la el refuerzo se administra cada seis o 12 meses despues de completar un programa de inmunizacion primaria.
8. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que el ser humano expresa el antlgeno leucocitario humano A2.
9. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos es un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos humano recombinante.
10. Composition para utilizar, segun la revindication 7, en la que la composition de refuerzo de vacuna comprende ademas un adyuvante.
11. Composition para utilizar, segun la revindication 10, en la que el adyuvante es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos.
12. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la administration de la composition induce una respuesta de linfocitos T citotoxicos al peptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
13. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que el sujeto no tiene una inmunidad preexistente al peptido GP2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
14. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la evolution estandar de terapia comprende el tratamiento con trastuzumab.
15. Composition para utilizar, segun la revindication 1, en la que la composition se administra al sujeto simultaneamente con trastuzumab.