BRPI0922849B1 - Composição de vacina com uma quantidade eficaz de um peptídeo gp2 e de gm-csf - Google Patents

Abstract

VACINA PARA A PREVENÇÃO DE RECORRÊNCIA DE CÂNCER DE MAMA. A presente invenção refere-se a processos para a indução e para a manutenção de uma resposta de linfócitos T citotóxicos protetora para um peptídeo de oncogene HER2/neu, GP2, com o efeito de indução e de manutenção de imunidade protetora ou terapêutica contra câncer de mama em uma paciente em remissão clínica, incluindo pacientes que possuem níveis baixos até intermediários de expressão de HER2/neu. Os processos compreendem a administração ao paciente de uma quantidade eficiente de composição para vacina que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável, um adjuvante tal como GM-CSF e o peptídeo GP2. Os processos podem compreender ainda a administração de uma dose periódica de vacina de reforço quando necessário por causa da imunidade de células T específicas para GP2 em declínio. São também fornecidas composições para vacina para uso nos processos.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0001] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida via EFS-Web e é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 7 de dezembro de 2009, é chamada de HMJ106PCT.txt e possui 11.473 bytes de tamanho.

INTERESSE DO GOVERNO

[0002] Esta invenção foi realizada em parte com apoio do governo. O governo pode ter certos direitos na invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

[0003] Este pedido de patente reivindica o benefício de e depende da data de depósito do pedido de Patente U.S. provisório N° 61/121.220, depositado em 10 de dezembro de 2008, cuja divulgação inteira é incorporada aqui como referência.

ANTECEDENTES

[0004] O câncer de mama (BCa) é o diagnóstico de câncer mais comum em mulheres e a segunda causa principal de morte relacionada a câncer entre as mulheres (Ries LAG et. al. (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Os avanços principais no tratamento de câncer de mama ao longo dos últimos 20 anos levaram a um aprimoramento significativo na taxa de sobrevivência livre de doença (DFS). Por exemplo, terapias que utilizam anticorpos reativos contra antígenos relacionados a tumores foram utilizadas para bloquear processos celulares específicos com a finalidade de retardar o progresso da doença ou de prevenir a recorrência da doença. Apesar dos avanços recentes no tratamento de câncer de mama, um número significativo de pacientes irão, em última análise, morrer de doença recorrente.

[0005] As vacinas são um modelo atraente para a prevenção, o retardo ou a proibição do desenvolvimento de doença recorrente devido a sua facilidade de administração e devido a sua alta taxa de sucesso observada para doenças infecciosas. O conceito básico de construir uma vacina para câncer é óbvio em teoria. O desenvolvimento de vacinas para câncer eficientes para tumores sólidos na prática, entretanto, encontrou sucesso limitado. Por exemplo, um grupo que tentou administrar uma vacina peptídica direcionada contra melanoma metastásico observou uma taxa de resposta objetiva de apenas 2,6% (Rosenberg SA et.al. (2004) Nat. Med. 10:909-15).

[0006] Há muitas explicações potenciais para esta baixa taxa de sucesso (Campoli M et. al. (2005) Cancer Treat. Res. 123:61-88). Por exemplo, mesmo se um antígeno estiver especificamente associado a um tipo particular de célula tumoral, as células tumorais podem expressar apenas baixos níveis do antígeno ou este pode estar localizado em um sítio críptico ou protegido de outra maneira da detecção imune. Em adição, os tumores frequentemente alteram seu perfil antigênico através da proteção dos antígenos à medida que se desenvolvem. Também contribuindo para a baixa taxa de sucesso é o fato de que as células tumorais podem expressar níveis muito baixos de proteínas de MHC e outras proteínas coestimuladoras necessárias para gerar uma resposta imunológica.

[0007] Problemas adicionais opõem-se às tentativas na vacinação contra tumores aparecem em pacientes com cânceres em estágio avançado. Tais pacientes tendem a ter tumores primários e metastásicos maiores e as células no interior do tumor podem não ser acessíveis devido ao fraco fluxo sanguíneo. Isto é coerente com a observação de que as estratégias de vacinação tendiam a ser mais bem sucedidas para o tratamento de malignidades hematológicas (Radford KJ et. al. (2005) Pathology37:534-50; e, Molldrem JJ (2006) Biol. Bone Marrow Transplant. 12:13-8). Em adição, à medida que os tumores se tornam metastásicos, estes podem desenvolver a capacidade de liberar fatores imunossupressores em seu microambiente (Campoli, 2005; e, Kortylewski M et. al. (2005) Nature Med. 11:1314-21). Os tumores metastásicos também foram associados a uma diminuição no número de linfócitos sanguíneos periféricos e disfunção em células dendríticas (Gillanders WE et. al. (2006) Breast Diseases: A Year Book and Quarterly 17:26-8).

[0008] Embora alguns ou todos estes fatores possam contribuir para a dificuldade em desenvolver uma vacina preventiva ou terapêutica eficiente, o desafio essencial principal é que a maioria dos antígenos de tumor é constituída de antígenos próprios ou possui um alto grau de homologia com antígenos próprios e é assim esperado que sejam submetidos à tolerância imunológica rigorosa. Assim, é evidente que muitas vacinas para câncer com base em peptídeos, com ou sem auxiliares do estímulo imunológico, podem ser condenadas apenas a um sucesso limitado na prática clínica devido à baixa imunogenicidade e à falta de especificidade.

[0009] As vacinas para câncer de mama modelos à base de antígenos isolados foram moderadamente bem sucedidas na indução de uma resposta imunológica mensurável em experimentos com animais e em testes clínicos com pacientes com câncer de mama. A resposta imunológica observada, entretanto, não se traduziu em uma imunidade protetora clinicamente significativa contra a recorrência de doença levada à remissão através de terapia padronizada (por exemplo, cirurgia, terapia de radiação e quimioterapia).

[0010] HER2/neu é um proto-oncogene expresso em muitas malignidades epiteliais (Slamon DJ et. al. (1989) Science 244:707-12). HER2/neu é um membro da família de receptores do fator de crescimento epidérmico e codifica um receptor de tirosina quinase de 185 kD envolvido na regulação do crescimento e da proliferação celular. (Popescu NC et. al. (1989) Genomics 4:362-366; Yarden Y et.al. (2001) Nat Rev Mol Cell Bio 2:127-137.) A superexpressão e/ou a amplificação de HER2/neu é observada em 25-30% de cânceres de mama invasivos (BCa) e e está associada com tumores mais agressivos e um resultado clínico mais fraco. (Slamon DJ et. al. Science (1987) 235:177-182; Slamon DJ et. al. Science (1989) 244:707-12; Toikkanen S et.al. J Clin Oncol (1992) 10:1044-1048; Pritchard KI et. al. (2006) N. Engl. J. Med. 354:2103-11.)

[0011] A determinação do estado de HER2/neu é realizada de forma predominante através de dois testes, imunohistoquímica (IHC) e hibridização com fluorescência in situ (FISH). A IHC detecta a superexpressão da proteína HER2/neu e é relatada em uma escala semiquantitativa de 0 até 3+ (0=negativa, 1+=baixa expressão, 2+=intermediária e 3+=superexpressão). A FISH por outro lado detecta a amplificação (cópias em excesso) do gene HER2/neu e é expressa na forma de uma proporção de cópias do gene HER2/neu em relação às cópias do gene do cromossomo 17 e é interpretada como “superexpressão” se FISH for >2,0 cópias. (Hicks DG et. al.Hum Pathol (2005) 36:250-261.) A taxa de concorrência de IHC e FISH é de aproximadamente 90%. (Jacobs et. al.J Clin Oncol (1999) 17:15331541.) A FISH é considerada o padrão ouro, uma vez que análises retrospectivas revelam que é um melhor prognosticador da resposta a trastuzumab (Tz); é mais objetiva e pode ser reproduzida. (Press MF et. al. J Clin Oncol (2002) 14:3095-3105; Bartlett J et. al. J Pathol (2003) 199:411-417; Wolff AC et.al. J Clin Oncol (2007) 25:118-145.)

[0012] A identificação e a quantificação de HER2/neu como um proto-oncogene levaram à imunoterapia passive humoral ou baseada em anticorpos, incluindo o uso de trastuzumab (Herceptin® Genentech Inc., South San Francisco, CA). Trastuzumab é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante que se liga ao domínio justa- membrana extracelular da proteína HER2/neu. (Plosker GL et. al. Drugs (2006) 66:449-475.) Tz é indicado para pacientes (IHC 3+ ou FISH >2,0) positivos em relação a nódulos (NP) e com BCa metastático, (Vogel CL et. al.J Clin Oncol (2002) 20:719-726; Piccart-Gebhart MJ et. al.N Engl J Med (2005) 353:1659-1672) e exibe atividade muito limitada em pacientes com expressão baixa à intermediária de HER2/neu. (Herceptin® (Trastuzumab), encarte do produto de prescrição, Genentech Inc, South San Francisco, CA: revisado em setembro de 2000).

[0013] Outra forma de imunoterapia que é adotada é a vacinação e a imunoterapia ativa que se direciona a resposta imunológica celular para os epítopos em antígenos associados a tumores, tal como HER2/neu. HER2/neu é uma fonte de vários peptídeos imunogênicos que podem estimular o sistema imunológico a reconhecer e matar células cancerosas expressando HER2/neu. (Fisk B et. al.J Exp Med (1995) 181:2109-2117.) Dois tais peptídeos são denominados de E75 e GP2. E75 e GP2 são ambos peptídeos de nove aminoácidos que são restritos ao antígeno de leucócito (HLA)-A2 e estimulam os CTL a reconhecer e a lisar células cancerosas que expressam HER2/neu (Fisk B et. al. J Exp Med (1995) 181:2109-2117; Peoples GE et. al.Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92:432-436).

[0014] E75 é derivada do domínio extracelular da proteína HER2/neu e corresponde aos aminoácidos 369-377 (KIFGSLAFL) (SEQ ID NO: 3) da sequência de aminoácidos de HER2/neu e é divulgada como a SEQ ID NO: 11 na Pat. U.S. N° 6.514.942, cuja patente é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A sequência da proteína HER2/neu de comprimento completo é apresentada abaixo e é divulgada como a SEQ ID NO: 2 na Patente U.S. N° 5.869;445, cuja patente é incorporada aqui como referência em sua totalidade: MKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPGNASLSFL QDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGA SPGGLRELQLRSLFEILKGGVLIQRNPQLCYQDYILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSR ACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPK HSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLST DVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEF AGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDL SVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTV PWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQ ECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFC VARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSI ISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQM RILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDE AYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQ IAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPI KWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQP PICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDS TFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLT LGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTV PLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPG KNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPP STFKGEPTAENPEYLGLDVPV (SEQ ID NO:1)

[0015] Foram feitas tentativas de utilizar utilize E75 como uma vacina anticâncer, por exemplo, na forma de uma vacina de peptídeo isolado combinado com imunoadjuvantes diferentes em pacientes com câncer avançado que superexpressam a proteína HER2/neu (Zaks TZ et. al. (1998) Cancer Res. 58:4902-8; Knutson KL et. al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:1014-8; e, Murray JL et. al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:3407-18); carregado em células dendríticas autólogas e reintroduzido (Brossart P et. al. (2000) Blood 96:3102-8; e, Kono K et. al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:3394-3400); ou embutido em peptídeos mais longos capazes de se ligar a moléculas de HLA de classe II com a finalidade de recrutar células T helper CD4 (Disis ML et. al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:1289-97; e, Disis ML et. al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:2624-32). Cada abordagem estimulou uma resposta imunológica mediada por células T citotóxicas específicas para E75, mas nenhuma demonstrou uma imunidade terapêutica ou protetora clincamente significativa em mulheres com câncer de mama em estágio avançado. A incapacidade de outras de mostrar um benefício clínico significativo utilizando preparações para vacina de E75 é derivada em parte do fato de que E75 é derivada de um antígeno de tumor “próprio”. As vacinas para cancer que se direcionam a antígenos de tumores “próprios”, como as derivadas de HER2/neu, apresentam desafios únicos por causa das características de tolerância imunológica de proteínas próprias. Além disso, os estudos anteriores se concentraram em pacientes com câncer com doença avançada, tal como câncer no Estágio III ou IV, ao invés de pacientes que estavam livres da doença após terapias padronizadas. Como tal, nenhuma destas tentativas de utilizar E75 como uma vacina anticâncer demonstrou a capacidade da vacina de prevenir ou de retardar a recorrência de doença após a remissão. Com base nestes estudos de E75, outros conduziram mais recentemente testes clínicos para determinar se a imunidade induzida por E75 leva a um benefício clínico através da prevenção da recorrência em pacientes de alto risco com câncer de mama. Peoples GE et. al., J. Clin. Oncol. (2005) 23:753645; Peoples GE et.al., Clin Cancer Res (2008) 14(3):797-803; Holmes et. al., Cancer (2008) 113:1666-75. Os dados provenientes destes estudos indicam que as maiores respostas de DTH induzidas por E75 in vivo se correlacionam com a recorrência reduzida e o maior tempo de sobrevivência para aqueles que sofreram recorrência.

[0016] GP2, inicialmente descrito por Peoples et. al., é um peptídeo de nove aminoácidos derivado da porção transmembrana da proteína HER2/neu que correspondem aos aminoácidos 654-662 da sequência de comprimento completo (isto é, IISAVVGIL: SEQ ID NO: 2) (Peoples GE et. al., Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92:432-436, que é incorporado aqui como referência em sua totalidade). O peptídeo foi isolado utilizando linfócitos associados a tumor de pacientes com câncer de mama e de ovário e posteriormente observados como sendo compartilhados entre várias malignidades epiteliais incluindo câncer pulmonar de células que não são pequenas e câncer pancreático (Linehan DC et. al., J I mmunol (1995) 155:4486-4491; Peiper M et. al., Surgery (1997) 122:235-242; Yoshino I et. al., Cancer Res (1994) 54:3387-3390; Peiper M et. al., Eur J I mmunol (1997) 27:1115-1123).

[0017] E75 possui uma alta afinidade pela molécula de HLA-A2 e é considerado o peptídeo imunodominante da proteína HER2/neu. Como tal, este é o peptídeo derivado de HER2/neu mais estudado em laboratório e estudos clínicos. Peoples et. al., J. Clin. Oncol. (2005) 23:7536-45. Como o peptídeo imunodominante, é também esperado que E75 induza uma resposta imunológica mais potente. GP2, por outro lado, possui uma atividade de ligação com HLA-A2 relativamente fraca e é considerado um epítopo subdominante. (Fisk B et. al. J Exp Med (1995) 181:2109-2117.) Esta é uma das razões pelas quais as estratégias de vacinas que se direcionam a uma resposta imunológica celular para epítopos de HER-2/neu se concentraram em E75 ao invés de GP2.

[0018] Estudos anteriores de GP2 utilizaram células dendríticas autólogas submetidas a pulsos com GP2 (et. al. peptídeos) ex vivo e reinjetados de forma subcutânea (Brossart P et.al. Blood (2000) 96:3102-3108) ou de forma intravenosa (Dees EC et. al. Cancer I mmunol I mmunother (2004) 53:777-785) em pacientes HER2/neu+ com câncer de mama ou de ovário metastásico para induzir uma resposta de CTL. Brossart et. al.detectaram uma resposta de CTL específica ao peptídeo (GP2 e E75) in vivo e observaram que ambos os peptídeos exibiam uma resposta imunológica similar apesar de diferenças conhecidas nas afinidades de ligação com HLA-A2. Dees e outros avaliaram células dendríticas que foram submetidas a pulsos com GP2 em pacientes com câncer de mama metastásico e foram capazes de documentar doença clinicamente estável em dois pacientes. De maneira importante, entretanto, nenhum estudo utilizou GP2 como uma vacina de peptídeo. Ao invest disso em ambos os estudos, os pacientes receberam injeção com células dendríticas que foram submetidas a pulsos com GP2. Além disto, como com os estudos de E75, os estudos de GP2 foram limitados a pacientes com câncer avançado. Portanto, nem Brossart nem Dees demonstraram a capacidade de células dendríticas submetidas a pulsos com GP2 de prevenir ou de retardar a recorrência de doença após a remissão. Como com E75, as vacinas para câncer que se direcionam a antígenos de tumor “próprios”, como HER2/neu do qual GP2 é derivado, apresentam desafios únicos por causa da característica de tolerância imunológica de proteínas próprias.

[0019] Peoples et.al. avaliaram anteriormente o uso de GP2 para um teste de vacina para câncer de mama baseada em peptídeo através da condução de ensaios de citotoxicidade in vitro com células dendríticas submetidas a pulsos com GP2 e células T CD8 obtidas de pacientes com câncer de mama. (Mittendorf EA et. al. Cancer (2006) 106:2309-2317.) Embora os resultados destes experimentos in vitro confirmassem a presence de linfócitos T citotóxicos precursors específicos para GP2 em mulheres com câncer de mama HER2/neu+, foi concluído que devido à variabilidade de resposta a certo peptídeo e à heterogenicidade de expressão de antígenos in vivo, a vacinação com vários peptídeos diferentes, incluindo o peptídeo imunodominante E75, será necessária para fornecer uma resposta imunológica adequada. (Mittendorf EA et. al.Cancer (2006) 106:2309-2317.)

[0020] Como citado anteriormente, trastuzumab é indicado para pacientes com câncer de mama metastásico positivos em relação a nódulos (NP) superexpressando HER2/neu (IHC 3+ ou FISH >2,0) e mostra atividade muito limitada em pacientes com expressão de HER2/neu baixa à intermediária. Similarmente, nos estudos discutidos anteriormente, os pacientes que receberam as vacinas baseadas em E75 e GP2 foram selecionados, em parte, com base na presença de tumores que superexpressavam HER2/neu. Consequentemente, não seria esperado que uma vacina com peptídeo GP2 fosse eficiente em pacientes com câncer com níveis baixos e intermediários de expressão de tumores HER2/neu.

SUMÁRIO

[0021] Em uma modalidade, a invenção apresenta métodos de prevenção de recorrência de câncer em um indivíduo que possui células tumorais que expressam HER2/neu. Em uma modalidade preferida, o método é direcionado para a prevenção de recorrência de câncer de mama em um indivíduo que está em remissão após o tratamento com um curso de terapia padronizada. Em uma modalidade, o curso de terapia padronizada é o tratamento com trastuzumab, cujo tratamento pode continuar de forma concorrente com os métodos descritos aqui. Os métodos compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de uma composição que compreende um carreador farmaceuticamente ativo e um peptídeo GP2. Preferencialmente o peptídeo GP2 possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, sem ser o peptídeo GP2, a composição não contém quaisquer outros peptídeos derivados de HER2/neu, incluindo, por exemplo, o peptídeo imunodominante E75. A administração pode ser realizada através de quaisquer meios adequados na arte, tal como inoculação ou injeção e mais particularmente injeção intradérmica, que pode ocorrer com uma ou mais doses separadas. Tais doses podem compreender uma concentração equivalente do peptídeo e um imunoadjuvante, podem ser administradas substancialmente de forma concorrente e podem ser administradas em um sítio de inoculação ou espaçadas de cada outra na superfície da pele. A composição pode ser administrada aproximadamente três até seis vezes ou mais em uma base mensal até que uma imunidade protetora seja estabelecida. Em alguns aspectos, a composição compreende ainda um adjuvante tal como fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) e preferencialmente GM-CSF humano recombinante.

[0022] Em alguns aspectos, os métodos compreendem ainda a administração ao indivíduo de uma dose de vacina de reforço, que compreende uma quantidade eficiente de uma composição que compreende um carreador farmaceuticamente ativo e um peptídeo que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em alguns aspectos, a composição do reforço compreende ainda um adjuvante tal como GM-CSF e preferencialmente GM-CSF humano recombinante. A administração de um reforço pode ser realizada através de quaisquer meios adequados na arte, tal como inoculação ou injeção e mais particularmente injeção intradérmica, que pode ocorrer com uma ou mais doses separadas. Tais doses podem compreender uma concentração equivalente do peptídeo e um imunoadjuvante, podem ser administradas substancialmente de forma concorrente e podem ser administradas em um sítio de inoculação ou espaçadas uma de cada outra na superfície da pele. Tipicamente o reforço é administrado após uma programação de imunização primária ter sido completada e preferencialmente a cada seis ou 12 meses após a imunização primária, quando necessário.

[0023] O indivíduo pode ser qualquer mamífero e é preferencialmente um ser humano. Em certos aspectos, o ser humano é positivo em relação ao antígeno de histocompatibilidade principal do tipo sanguíneo como o antígeno A2 de leucócito humano ou o antígeno A3 de leucócito humano. Em outros aspectos, as células cancerosas do ser humano são positivas em relação à expressão de níveis detectáveis de HER2/neu. Em alguns aspectos, as células cancerosas exibem expressão baixa ou intermediária de HER2/neu. Por exemplo, em alguns aspectos preferidos, as células cancerosas do ser humano possuem uma classificação imunohistoquímica (IHC) de 1+ ou 2+ e/ou uma classificação de hibridização com fluorescência in situ (FISH) menor que 2,0. Em outros aspectos, as células cancerosas do ser humano podem ter uma classificação de IHC de até 3+. Em outros aspectos, as células cancerosas do ser humano podem exibir superexpressão de HER2/neu. Por exemplo, em alguns aspectos preferidos, as células cancerosas do ser humano possuem uma classificação imunohistoquímica (IHC) de 3+ e/ou uma classificação de hibridização com fluorescência in situ (FISH) maior que ou igual a 2,0. Em outras modalidades, o ser humano não possui imunidade pré- existente para GP2 (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4).

[0024] Em outra modalidade, a invenção fornece composições para uso nos métodos descritos neste pedido de patente. Em um aspecto, as composições compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável, uma quantidade eficiente de um peptídeo que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e um adjuvante, tal como fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos. As composições são preferencialmente administradas em uma programação de imunização otimizada. Em uma modalidade, a composição para vacina compreende 0,1-1 mg/mL de peptídeo e 0,1250,5 mg/mL de adjuvante. Em alguns aspectos específicos, as concentrações preferidas e as programações da composição de vacina incluem: (1) 1 mg/mL de peptídeo e 0,25 mg/mL de adjuvante, (2) 0,5 mg/mL de peptídeo e 0,25 mg/mL de adjuvante, (3) 0,1 mg/mL de peptídeo e 0,25 mg/mL de adjuvante, (4) 1 mg/mL de peptídeo e 0,125 mg/mL de adjuvante e (5) 0,5 mg/mL de peptídeo e 0,125 mg/mL de adjuvante, cada uma com inoculações mensais durante pelo menos 6 meses consecutivos seguidas por inoculações de reforço periódicas (preferencialmente semianuais ou anuais) durante 1 ano, 2 anos ou 3 ou mais anos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] Os desenhos em anexo, que são incluídos para fornecer um entendimento adicional da invenção e são incorporados e fazem parte deste relatório descritivo, ilustram aspectos da invenção e junto com a descrição servem para explicar os princípios da invenção. Nos desenhos:

[0026] A figura 1 mostra as reações locais médias versus dose de GM-CSF por grupos de dose. Os pacientes foram vacinados com peptídeo e GM-CSF em quatro grupos de dose. A. 100 μg de peptídeo/250 μg de dose do grupo de GM-CSF. B. 500 μg de peptídeo/250 μg de dose do grupo de GM-CSF. C. 1000 μg de peptídeo/250 μg de dose do grupo de GM-CSF. D. 500 μg de peptídeo/125 μg de dose do grupo de GM-CSF. As reações locais foram medidas em milímetros (linhas inteiras). Uma enduração de reação local >100 mm necessitava de uma redução de dose de 50% na dose de GM- CSF (linhas pontilhadas). Não havia reduções de doses de peptídeo.

[0027] A figura 2 mostra a toxicidade e as respostas imunológicas de todos os pacientes registrados no teste de fase I de GP2. A. Toxicidade - nenhum paciente sofreu toxicidades locais ou sistêmicas de graus 3-5. B. Resposta imunológica ex vivo - a % pré-max de células T CD8+ específicas aumentou estatisticamente (p=0,001). C. Resposta imunológica in vivo - GP2 pré-pós DTH aumentou estatisticamente (p=0,0002). Controle de solução salina normal (NS) também mostrado para comparação.

[0028] A figura 3 mostra a toxicidade e as respostas imunológicas de pacientes registrados no teste de fase I de GP2 comparando nenhuma imunidade pré-existente (pré-dímero <0,03) versus imunidade pré-existente (pré-dímero >0,03). A. Toxicidade - as toxicidades eram ligeiramente mais altas nos pacientes com nenhuma imunidade pré- existente, embora de forma não significativa. B. Resposta imunológica ex vivo - Os pacientes sem imunidade pré-existente exibiam aumentos estatisticamente significativos na % pré-max, pré-pós e pré-longo prazo de células T CD8+ específicas (p=0,003, p=0,03 e p=0,01 respectivamente) em resposta à vacinação. C. Resposta imunológica in vivo - ambas as respostas pré-pós DTH aumentaram estatisticamente (Nenhuma p=0,03 e Pré-E p=0,0004). Não foi observada qualquer diferença estatística entre respostas pós-DTH (p=0,3).

[0029] A figura 4 mostra a toxicidade e as respostas imunológicas de pacientes registrados no teste de fase I de GP2 comparando a dose de GM-CSF 125 μg vs. 250 μg. A. Toxicidade - as toxicidades eram ligeiramente maiores nos pacientes com 250 μg de GM-CSF, embora de forma não significativa. B. Resposta imunológica ex vivo - a % de 125 μg de GM-CSF pré-max de células T CD8+ específicas não aumentaram estatisticamente (p=0,17), mas a % de 250 μg de GM-CSF pré-max de células T CD8+ específicas aumetaram estatisticamente (p=0,005). C. Resposta imunológica in vivo - 125 μg e 250 μg de GM- CSF pré-pós DTH aumentaram estatisticamente (respectivamente, p=0,009 e p=0,008). Não havia significância estatística entre 125 μg de GM-CSF pós-DTH e 250 μg de GM-CSF pós-DTH (p=0,1).

[0030] A figura 5 mostra a resposta imunológica ex vivo e o espalhamento do epítopo em resposta a GP2. A média dos linfócitos T CD8+ específicos para foi obtida em resposta à vacinação com a vacina com o peptídeo GP2. Dímero de E75 pré-vacinação versus máximo (0,8±0,2% versus 2,0±0,2%, p=0,0001), pré versus pós (0,8±0,2% versus 1,2±0,2%, p=0,1) e pré versus longo prazo (0,8+0,2% versus 1,0+0,2%; p=0,6) foi comparado. Não foram observadas quaisquer diferenças significativas entre os valores de GP2 e E75, mas foi observada uma tendência em direção à resposta ao dímero máximo de E75 maior (2,0+0,2% versus 1,4+0,2%; p=0,07).

[0031] A figura 6 mostra a resposta imunológica in vivo de pacientes registrados no teste de fase II de GP2. A reação de DTH média para GP2 aumentou significativamente partindo do nível de pré-vacinação até o nível de pós-vacinação no grupo do peptídeo GP2 (PG) (1,0+0,8 cm para 18,0 +3,1 cm; p<0,0001) e até uma menor extensão no grupo com adjuvante de controle (AG) (0,0+1,0 cm para 0,5+3,3 cm; p<0,01). A DTH pós-vacinação era significativamente maior no PG comparado com o AG (18,0 +3,1 cm versus 0,5+3,3 cm, p=0,002).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] Vários termos que se referem aos métodos e outros aspectos da presente invenção são utilizados ao longo de todo o relatório descritivo e as revindicações. Tais termos devem receber seu significado comum na arte a não ser que seja indicado de outra maneira. Outros termos definidos especificamente devem ser interpretados de uma maneira coerente com a definição fornecida aqui.

[0033] O termo “prevenir” ou “prevenção” refere-se a qualquer sucesso ou indícios de sucesso na prevenção ou no retardo de recorrência/reincidência de câncer de mama em pacientes em remissão clínica, que são medidos através de qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, incluindo os resultados de um exame radiológico ou físico.

[0034] “Quantidade eficiente” ou “quantidade terapeuticamente eficiente” são utilizadas de forma intercambiável aqui e referem-se a uma quantidade de um composto, um material ou uma composição, como descrito aqui eficiente para atingir um resultado biológico particular tal como, mas não limitado aos resultados biológicos divulgados, descritos ou exemplificados aqui. Tais resultados podem incluir, mas não estão limitados à prevenção de câncer de mama e mais particularmente, à prevenção de câncer de mama recorrente, por exemplo, à prevenção de reincidência em um indivíduo, que é determinada através de quaisquer meios adequados na arte. Quantidade terapêutica ótima refere-se à dose, à programação e ao uso de reforços para atingir o melhor resultado terapêutico.

[0035] “Farmaceuticamente aceitável” refere-se àquelas propriedades e/ou substâncias que são aceitáveis para o paciente partindo de um ponto de vista farmacológico/toxicológico e para o químico farmacêutico produtor partindo de um ponto de vista físico/químico considerando a composição, a formulação, a estabilidade, a aceitação do paciente e disponibilidade biológica. “Carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um meio que não interfere com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativos(s) e não é tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado.

[0036] “Imunidade protetora” ou “resposta imunológica protetora” significa que o indivíduo monta uma resposta imunológica ativa para um componente imunogênico de um antígeno tal como os antígenos de câncer de mama descritos e exemplificados aqui, de forma que após a exposição subsequente ao antígeno, o sistema imunológico do indivíduo é capaz de se direcionar e de destruir células que expressam o antígeno, diminuindo assim a incidência de morbidez e mortalidade proveniente da recorrência de câncer no indivíduo. A imunidade protetora no contexto da presente invenção é preferencialmente, mas não exclusivamente, conferida por linfócitos T.

[0037] “Imunidade pré-existente” é definida como as um nível de dímero específico ao peptídeo de pelo menos 0,3%. O nível de dímero específico ao peptídeo pode ser medido utilizando ensaios padronizados, tal como o ensaio de dímeros de imunoglobulina HLA-A2 descrito neste pedido de patente.

[0038] Entende-se que o termo “aproximadamente” como utilizado aqui quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade, uma duração temporal e similar, abrange variações de ±20% ou ±10%, mais preferencialmente de ±5%, ainda mais preferencialmente de ±1% e ainda mais preferencialmente de ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para a realização dos métodos divulgados.

[0039] “Peptídeo” refere-se a qualquer peptídeo que compreende dois ou mais aminoácidos ligados um a cada outro através de ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres peptídicos. Polipeptídeo refere-se tanto a cadeias curtas, comumente referidas como peptídeos, oligopeptídeos ou oligômeros quanto a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Os polipeptídeos podem conter aminoácidos sem ser os 20 aminoácidos codificados por genes. Os polipeptídeos incluem sequências de aminoácidos modificadas através de processos naturais, tal como processamento pós-tradução ou através de técnicas de modificação química que são bem conhecidas na arte. Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura de pesquisa extensa. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar em um polipeptídeo, incluindo a estrutura peptídica, as cadeias laterais de aminoácidos e os terminais amino ou carboxila. Será considerado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variáveis em vários sítios em um certo polipeptídeo. Ainda, certo polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Os polipeptídeos podem ser ramificados como um resultado de ubiquitinação e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipeptídeos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos pós-tradução naturais ou podem ser produzidos através de métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de um grupamento heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou um derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou um derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de ancoragem de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatização, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência em proteínas tal como arginilação e ubiquitinação.

[0040] “Reforço” refere-se a uma dose de um agente imunogênico administrada a um paciente para aumentar, prolongar ou manter a imunidade protetora e para superar a regulação para menos de respostas de células T medidas por células T reguladoras.

[0041] “Livre de câncer de mama” ou “livre de doença” ou NED (No Evidence of Disease (Sem Evidência de Doença) significa que o paciente está em remissão clínica induzida pelo tratamento com o padrão atual de terapias de tratamento. Por “remissão” ou “remissão clínica”, que são utilizadas de sinonimicamente, entende-se que os sinais clínicos, os sinais radiológicos e os sintomas de câncer de mama diminuíram significativamente ou desapareceram totalmente com base em diagnósticos clínicos, embora células cancerosas ainda possam existir no corpo. Assim, é considerado que remissão abrange remissão parcial e completa. A presença de células cancerosas residuais pode ser enumerada através de ensaios tal como CTC (Células Tumorais Circulantes) e pode ser prognóstica de recorrência.

[0042] “Reincidência” ou “recorrência” ou “ressurgimento” são utilizados de forma intercambiável aqui e referem-se ao diagnóstico radiográfico de retorno ou sinais e sintomas de retorno de câncer de mama após um período de melhora ou remissão.

[0043] O câncer de mama é uma grande preocupação com a saúde para mulheres em todo o mundo. As vacinas para câncer de mama que foram tentadas até agora tinham eficácia limitada, particularmente em relação à prevenção de reincidência em pacientes que estão em remissão após um curso padronizado de terapia. Como discutido neste pedido de patente, foi determinado que a administração de um peptídeo do oncogene HER2/neu, GP2 (SEQ ID NO: 2), pode induzir uma resposta imunológica in vivo potente que é conhecida como estando correlacionada com uma taxa reduzida de recorrência de câncer de mama em pacientes livres de doença.

[0044] O peptídeo GP2 está associado com MHC HLA-A2 e pode assim induzir imunidade protetora em pacientes que possuem o haplotipo HLA-A2. O haplotipo HLA-A2 foi implicado como um fator prognóstico negativo em câncer de ovário (Gamzatova et.al., Gynecol Oncol (2006) 103:145-50) e de próstata (Hueman et.al., Clin Cancer Res (2005) 11:7470-79; De Petris et.al., Med Oncol (2004) 21:49-52) e esta descoberta provavelmente se estende também para o câncer de mama. Assim, pacientes HLA-A2+ parecem representar um risco maior de desenvolver recorrência de câncer após a remissão. Todavia, foi demonstrado de forma inesperada que uma composição para vacina que compreende GP2 + GM-CSF induzia de forma eficiente uma resposta imunológica in vivo potente em pacientes HLA-A2+ que é conhecida como estando correlacionada a um risco menor de recorrência de câncer de mama e uma sobrevivência livre de doença mais longa quando comparados com pacientes de controle HLA-A2-. Além disso, foi observado de forma supreendente que pacientes tratados com GP2 (o epítopo subdominante) e GM-CSF exibiam respostas de DTH mais fortes quando comparados com composições para vacina que compreendem E75 (o epítopo imunodominante) e GM- CSF. De forma notável, estes resultados não foram obtidos através da combinação de GP2 com outro epítopo, tal como E75 para gerar uma vacina com vários epítopos, mas ao invés disto foram obtidos com uma vacina com um único epítopo (isto é, GP2). Em adição, com base nos dados preliminares, parece que GP2 também pode induzir imunidade protetora em pacientes que possuem o haplotipo HLA-A3.

[0045] Devido ao fato de que GP2 é derivado da proteína HER2/neu, seria esperado que pacientes superexpressando HER2/neu exibiriam uma melhor resposta para uma vacina baseada em GP2 que aqueles com expressão de HER2/neu baixa à intermediária. Por exemplo, outra terapia baseada em HER2/neu, trastuzumab (Herceptin® Genentech Inc., South San Francisco, CA), é indicada apenas parapacientes com câncer de mama metastásico positivos em relação a nódulos (NP) que superexpressam HER2/neu (IHC 3+ ou FISH >2,0) e mostra atividade muito limitada em pacientes com expressão de HER2/neu baixa à intermediária. Todavia, foi observado de forma inesperada que pacientes que possuem níveis de expressão de HER2/neu baixos a intermediários sofriam respostas imunológicas potentes para GP2, similares em magnitude às respostas induzidas por GP2 em pacientes superexpressando HER2/neu.

[0046] Consequentemente, uma modalidade da presente invenção apresenta composições para vacina para indução de imunidade protetora contra reincidência ou recorrência de câncer de mama. Outra modalidade fornece métodos para indução e para manutenção de imunidade protetora contra câncer de mama e mais particularmente contra câncer de mama recorrente. Em alguns aspectos, os métodos compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade eficiente de uma composição que compreende um carreador farmaceuticamente ativo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e opcionalmente um imunoadjuvante, tal como GM-CSF. Variações de SEQ ID NO: 2, incluindo aquelas com cadeias laterais modificadas de aminoácidos que são descritas pela Publicação de Patente U.S. N° 20050169934, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade, são adequadas para uso nas composições para vacina e nos métodos deste pedido de patente.

[0047] Em adição, um polimorfismo que ocorre naturalmente no códon 655 (substituição de isoleucina por valina) foi identificado, fornecendo um peptídeo GP2 polimórfico que possui a sequência IVSAVVGIL (SEQ ID NO: 4) (Papewalis et.al., Nucleic Acid Res. (1991) 19:5452). Este peptídeo GP2 polimórfico também é adequado para uso nas composições para vacina e nos métodos deste pedido de patente. Similarmente, vários grupos investigaram substituições de aminoácidos isoladas, duplas e triplas introduzidas em vários sítios no peptídeo GP2, incluindo os resíduos de ancoragem (posições 2 e 9) e observaram que certas substituições de aminoácidos levam à maior ligação de GP2 com HLA-A2 (Tanaka et.al., Int J Cancer (2001) 94:540-44; Kuhns et.al., J Biol Chem (1999) 274:36422-427; Sharma et.al., J Biol Chem (2001) 276:21443-449, cada uma destas referências é incorporada aqui como referência em sua totalidade). Assim, um perito na arte entenderia que certas substituições, particularmente nos resíduos de ancoragem, poderiam ser feitas no GP2 sem afetar negativamente sua capacidade de induzir uma resposta imunológica protetora. Em uma modalidade, o peptídeo GP2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 exceto por uma substituição em um resíduo que aumenta a afinidade do peptídeo GP2 pela molécula de HLA-A2. Preferencialmente, a substituição ocorre em um ou em ambos os resíduos de ancoragem de GP2 (posições 2 e 9). Mais preferencialmente, a substituição compreende uma substituição de isoleucina por leucina na posição 2 e/ou uma substituição de leucina por valina na posição nove. Em outra modalidade, o peptídeo GP2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 exceto por uma substituição em um resíduo que não afeta a afinidade do peptídeo GP2 pela molécula de HLA-A2 quando comparada com a afinidade de um peptídeo GP2 do tipo selvagem que compreende SEQ ID NO: 2 pela molécula de HLA-A2. Os ensaios para testar a afinidade de ligação entre GP2 e HLA-A2 são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, o ensaio de montagem na superfície de células T2 divulgado em Sharma et.al., J Biol Chem (2001) 276:21443-449.

[0048] Em um aspecto, o peptídeo GP2 possui não mais que 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo GP2 possui não mais que 9 resíduos de aminoácidos. Preferencialmente, o peptídeo GP2 com não mais que 9 aminoácidos é a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ IDNO:4 ou uma versão mutante da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2 e/ou 9.

[0049] O indivíduo pode ser qualquer animal e preferencialmente é um mamífero tal como um ser humano, um camundongo, um rato, um hamster, um porquinho-da-Índia, um coelho, um gato, um cachorro, um macaco, um bovino, um equino, um suíno e similares. Os seres humanos são mais preferidos. Em aspectos altamente preferidos, os seres humanos são positivos em relação ao haplotipo HLA-A2. Em outros aspectos preferidos, os seres humanos são positivos em relação à expressão de HER2/neu humana, incluindo preferencialmente os seres humanos com tumores com expressão de HER2/neu baixa e/ou intermediária, bem como os seres humanos que superexpressam HER2/neu.

[0050] Adicionalmente, o presente grupo demonstrou anteriormente uma sinergia possível entre CTLs ex vivo estimulados por trastuzumab e peptídeo GP2. O pré-tratamento de células de câncer de mama com trastuzumab seguido pela incubação com CTLs induzidos pelo peptídeo GP2 resultava em maior citotoxicidade em três linhagens de células tumorais comparado com o tratamento com trastuzumab ou CTLs específicos para GP2 isoladamente (Mittendorf EA et.al., Annals of Surgical Oncology (2006) 13(8):1085-1098). Em vista dos resultados dos experimentos com GP2 divulgados neste pedido de patente, estas descobertas indicam que a vacinação com GP2 concorrente durante a terapia com trastuzumab pode ser uma imunoterapia de combinação eficiente.

[0051] As composições para vacina podem ser formuladas na forma de preparações secas por congelamento ou líquidas de acordo com quaisquer meios adequados na arte. Os exemplos não limitantes de preparações na forma líquida incluem soluções, suspensões, xaropes, pastas fluidas e emulsões. Os carreadores líquidos adequados incluem qualquer solvente orgânico ou inorgânico adequado, por exemplo, água, álcool, solução salina, solução salina tamponada, solução salina fisiológica, solução de dextrose, soluções de propileno glicol em água e similares, preferencialmente na forma esterilizada.

[0052] As composições para vacina podem ser formuladas em formas neutras ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres dos polipeptídeos ativos) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados partindo de grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e similares.

[0053] As composições para vacina são preferencialmente formuladas para inoculação ou injeção no indivíduo. Para injeção, as composições para vacina da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas tal como água ou álcool ou em tampões fisiologicamente compatíveis tal como a solução de Hanks, a solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, preservantes, estabilizantes e/ou de dispersão. As formulações para injeção também podem ser preparadas na forma de preparações na forma sólida que são planejadas que sejam convertidas, logo antes do uso, em preparações na forma líquida adequadas para injeção, por exemplo, através de constituição com um veículo adequado, tal como água esterilizada, solução salina ou álcool, antes do uso.

[0054] As composições para vacina também podem ser formuladas em veículos de liberação controlada ou preparações em depósito. Tais formulações de atuação prolongada podem ser administradas através de inoculação ou de implantação (por exemplo, de forma subcutânea ou de forma intramuscular) ou através de injeção. Assim, por exemplo, as composições para vacina podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, na forma de uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica ou na forma de derivados moderadamente solúveis, por exemplo, na forma de um sal moderadamente solúvel. Lipossomos e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de fornecimento adequados para uso como carreadores.

[0055] As composições para vacina podem compreender agentes que aumentam a eficácia protetora da vacina, tais como adjuvantes. Os adjuvantes incluem qualquer composto ou quaisquer compostos que atuam aumentando uma resposta imunológica protetora para o antígeno do peptídeo GP2, reduzindo assim a quantidade de antígeno necessária na vacina, e/ou a frequência de administração necessária para gerar uma resposta imunológica protetora. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo, emulsificantes, muramil dipeptídeos, avridina, adjuvantes aquosos tais como hidróxido de alumínio, adjuvantes baseados em quitosana e qualquer uma das várias saponinas, óleos e outras substâncias conhecidas na arte, tais como Amphigen, LPS, extratos de parede celular bacteriana, DNA bacteriano, sequências CpG, oligonucleotídeos sintéticos e combinações dos mesmos (Schijns et.al. (2000) Curr. Opin. I mmunol. 12:456), extrato de parede celular de Mycobacterialphlei (M. phlei) (MCWE) (Patente U.S. N° 4.744.984), DNA de M. phlei (M-DNA) e complexo de M-DNA-parede celular de M. phlei (MCC). Os compostos que podem servir como emulsificantes incluem agentes emulsificantes naturais e sintéticos, bem como compostos aniônicos, catiônicos e não iônicos. Entre os compostos sintéticos, os agentes emulsificantes aniônicos incluem, por exemplo, os sais de potássio, sódio e amônio do ácido láurico e oléico, os sais de cálcio, magnésio e alumínio de ácidos graxos e sulfonatos orgânicos tal como lauril sulfato de sódio. Os agentes catiônicos sintéticos incluem, por exemplo, brometo de cetiltretilamônio, enquanto que os agentes não iônicos sintéticos são exemplificados por glicerilésteres (por exemplo, monostearato de glicerila), ésteres e éteres de polioxietileno glicol e os ésteres de ácidos graxos de sorbitana (por exemplo, monopalmitato de sorbitana) e seus derivados de polioxietileno (por exemplo, monopalmitato de polioxietileno sorbitana). Os agentes emulsificantes naturais incluem goma acácia, gelatina, lecitina e colesterol.

[0056] Outros adjuvantes adequados podem ser formados com um componente oleoso, tal como um óleo isolado, uma mistura de óleos, uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão de óleo-em-água. O óleo pode ser um óleo mineral, um óleo vegetal ou um óleo animal. Os óleos minerais são hidrocarbonetos líquidos obtidos de petrolato através de uma técnica de destilação e também são referidos na arte como parafina líquida, petrolato líquido ou óleo mineral branco. Os óleos animais adequados incluem, por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleo de halibute, óleo de savelha, óleo bruto de laranja e óleo de fígado de tubarão, dos quais todos estão disponíveis comercialmente. Os óleos vegetais adequados, incluem, por exemplo, óleo de canola, óleo de amêndoa, óleo de semente de algodão, óleo de milho, azeite de oliva, óleo de amendoim, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de soja e similares. O Adjuvante Completo de Freund (FCA) e o Adjuvante Incompleto de Freund (FIA) são dois adjuvantes comuns que são ordinariamente utilizados nas preparações para vacina e são também adequados para uso na presente invenção. Tanto FCA quanto FIA emulsões de água-em-óleo mineral; entretanto, FCA contém ainda um Mycobacterium sp morto.

[0057] As citocinas imunomoduladoras também podem ser utilizadas nas composições para vacina para aumentar a eficácia da vacina, por exemplo, como um adjuvante. Os exemplos não limitantes de tais citocinas incluem interferon alfa (IFN-α), interleucina-2 (IL-2) e fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ou combinações dos mesmos. GM-CSF é altamente preferido.

[0058] As composições para vacina que compreendem antígenos do peptídeo GP2 e que compreendem ainda adjuvantes podem ser preparadas utilizando técnicas bem conhecidas pelos peritos na arte incluindo, mas não limitadas a, mistura, sonicação e microfluidação. O adjuvante pode compreender de aproximadamente 10% até aproximadamente 50% (v/v) da composição para vacina, mais preferencialmente aproximadamente 20% até aproximadamente 40% (v/v) e mais preferencialmente aproximadamente 20% até aproximadamente 30% (v/v) ou qualquer número inteiro dentro destas faixas. Aproximadamente 25% (v/v) são altamente preferidos.

[0059] A administração das composições para vacina pode ser através de infusão ou de injeção (por exemplo, de forma intravenosa, de forma intramuscular, de forma intracutânea, de forma subcutânea, de forma intratecal, de forma intraduodenal, de forma intraperitoneal e similares). As composições para vacina também podem ser administradas de forma intranasal, de forma vaginal, de forma retal, de forma oral ou de forma transdermal. Adicionalmente, as composições para vacina podem ser administradas através de sistemas de fornecimento “isentos de agulha”. Preferencialmente, as composições são administradas através de injeção intradérmica. A administração pode ser na orientação de um médico ou de uma auxiliar do médico.

[0060] As injeções podem ser divididas em várias injeções, com tais inoculações divididas administradas preferencialmente de forma substancialmente concorrente. Quando administradas na forma de uma inoculação dividida, a dose do agente imunogênico é preferencialmente, mais não necessariamente, dividida igualmente em cada injeção separada. Se um adjuvante estiver presente na composição para vacina, a dose do adjuvante é preferencialmente, mais não necessariamente, dividida igualmente em cada injeção separada. As injeções separadas para a inoculação dividida são preferencialmente administradas substancialmente próximas uma de cada outra no corpo do paciente. Em alguns aspectos preferidos, as injeções são administradas pelo menos aproximadamente 1 cm de distância de cada outra no corpo. Em alguns aspectos preferidos, as injeções são administradas pelo menos aproximadamente 2,5 cm de distância de cada outra no corpo. Em aspectos altamente preferidos, as injeções são administradas pelo menos aproximadamente 5 cm de distância de cada outra no corpo. Em alguns aspectos, as injeções são administradas pelo menos aproximadamente 10 cm de distância de cada outra no corpo. Em alguns aspectos, as injeções são administradas mais de 10 cm de distância de cada outra no corpo, por exemplo, pelo menos aproximadamente 12,5, 15, 17,5, 20 ou mais cm de distância de cada outra no corpo. As injeções de imunização primária e as injeções de reforço podem ser administradas na forma de uma inoculação dividida como descrito e exemplificado aqui.

[0061] Vários sistemas de fornecimento farmacêutico alternativos podem ser empregados. Os exemplos não limitantes de tais sistemas incluem lipossomos e emulsões. Certos solventes orgânicos tal como dimetilsulfóxido também podem ser empregados. Adicionalmente, as composições para vacina podem ser fornecidas utilizando um sistema de liberação controlada, tal como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos contendo o agente terapêutico. Os vários materais de liberação controlada disponíveis são bem conhecidos pelos peritos na arte. Cápsulas de liberação controlada podem, dependendo de sua natureza química, liberar as composições para vacina ao longo de uma faixa de vários dias até várias semanas até vários meses.

[0062] Para prevenir a recorrência de câncer de mama em um paciente que está em remissão de câncer de mama, uma quantidade terapeuticamente eficiente da composição para vacina é administrada ao indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficiente fornecerá um aumento clinicamente significativo no número de linfócitos T citotóxicos específicos para GP2 (CD8+) no paciente, bem como um aumento clinicamente significativo na resposta de linfócitos T citotóxicos para o antígeno, que é medido através de quaisquer meios adequados na arte. Em adição, devido ao espalhamento do epítopo, uma quantidade terapeuticamente eficiente da composição para vacina com GP2 fornecerá um aumento no número de linfócitos T citotóxicos específicos a E75 (CD8+) no paciente, que é medido através de quaisquer meios adequados na arte. No paciente de modo geral, uma quantidade terapeuticamente eficiente da composição para vacina destruirá a doença microscópica residual e reduzirá ou eliminará significativamente o risco de recorrência de câncer de mama no paciente.

[0063] A quantidade eficiente da composição para vacina pode ser dependente de qualquer número de variáveis, incluindo sem limitação, a espécie, a raça, o tamanho, a altura, o peso, a idade, a saúde geral do paciente, o tipo de formulação, o modo ou a maneira ou a administração ou a presença ou a ausência de fatores de risco que aumentam significativamente a probabilidade de que o câncer de mama poderá sofrer recorrência no paciente. Tais fatores de risco incluem, mas não estão limitados ao tipo de cirurgia, ao estado dos linfonodos e ao número positivo, ao tamanho do tumor, ao grau histológico do tumor, à presença/ausência de receptores de hormônios (receptores de estrogênio e de progesterona), expressão de HER2/neu, invasão linfovascular e predisposição genética (BRCA 1 e 2). Em alguns aspectos preferidos, a quantidade eficiente é dependente do fato do paciente ser positivo em relação aos linfonodos ou negativos em relação aos linfonodos e se o paciente for positivo em relação aos linfonodos, do número e da extensão dos nódulos positivos. Em todos os casos, a quantidade eficiente apropriada pode ser determinada de forma rotineira pelos peritos na arte utilizando técnicas de otimização de rotina e o julgamento qualificado e informado do médico praticante et.al. fatores evidentes para os peritos na arte. Preferencialmente, uma dose terapeuticamente eficiente das composições para vacina descritas aqui fornecerá o benefício preventivo terapêutico sem causar toxicidade substancial ao indivíduo.

[0064] A toxicidade e a eficácia terapêutica das composições para vacina podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficiente em 50% da população). A proporção de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresas na forma da proporção LD50/ED50. As composições para vacina que exibem altos índices terapêuticos são preferidas. Os dados obtidos partindo de ensaios de cultura de células e de estudos com animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso nos pacientes. A dosagem de tais composições para vacina fica preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada.

[0065] A informação sobre a toxicidade pode ser utilizada para determinar de forma mais acurada doses úteis em um indivíduo especificado tal como um ser humano. O médico que realiza o tratamento pode terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade ou às disfunções de órgãos e pode ajustar o tratamento quando necessário se a resposta clínica não for adequada, para melhorar a resposta. A magnitude de uma dose administrada na prevenção de câncer de mama recorrente variará com a gravidade do estado de saúde do paciente, o risco relativo de recorrência ou a rota de administração, entre et.al. fatores. A gravidade do estado de saúde do paciente pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, através de métodos de avaliação de prognóstico padronizados.

[0066] As composições para vacina podem ser administradas a um paciente em qualquer programação apropriada para induzir e/ou para manter a imunidade protetora contra reincidência de câncer de mama e mais especificamente para induzir e/ou para manter uma resposta de linfócitos T citotóxicos para GP2 e/ou E75 (devido ao espalhamento de epítopos). Por exemplo, os pacientes podem receber a administração de uma composição para vacina como uma imunização primária como descrito e exemplificado aqui, seguida pela administração de um reforço para sustentar e/ou manter a imunidade protetora.

[0067] Em alguns aspectos, os pacientes podem receber a administração das composições para vacina 1, 2 ou mais vezes por mês. Uma vez por mês durante seis meses consecutivos é preferida para estabelecer a resposta imunológica protetora, particularmente em relação à programação de imunização primária. Em alguns aspectos, os reforços podem ser administrados em intervalos regulares tal como a cada 6 ou mais meses após completar a programação de imunização primária. A administração do reforço ocorre preferencialmente a cada 6 meses. Os reforços também podem ser administrados em uma base de quando for necessário.

[0068] A programação de administração da vacina, incluindo a imunização primária e a administração de reforço, pode continuar até quando for necessário para o paciente, por exemplo, ao longo do curso de vários anos, até ao longo de toda a vida do paciente. Em alguns aspectos, a programação de vacina inclui uma administração mais frequente no início do regime de vacinação e inclui uma administração menos frequente (por exemplo, reforços) ao longo do tempo para manter a imunidade protetora.

[0069] A vacina pode ser administrada em doses menores no início do regime de vacinação, com doses maiores administradas ao longo do tempo. As vacinas também podem ser administradas em doses maiores no início do regime de vacinação, com doses menores administradas ao longo do tempo. A frequência de vacinação primária e de administração de reforço e de dose de GP2 administrada pode ser adaptada e/ou ajustada para satisfazer as necessidades particulares de pacientes individuais, como é determinado através do médico que está fazendo a administração de acordo com quaisquer meios adequados na arte.

[0070] Em alguns aspectos, as composições para vacina, incluindo composições para administração como um reforço, compreendem de aproximadamente 0,1 mg até aproximadamente 10 mg de peptídeo GP2. Em alguns aspectos preferidos, as composições compreendem aproximadamente 0,1 mg de GP2. Em alguns aspectos preferidos, as composições compreendem aproximadamente 1 mg de GP2. Em alguns aspectos mais preferidos, as composições compreendem aproximadamente 0,5 mg de GP2.

[0071] Em alguns aspectos preferidos, as composições para vacina que compreendem GP2, incluindo composições para administração como um reforço, compreendem ainda GM-CSF. Tais composições compreendem preferencialmente de aproximadamente 0,01 mg até aproximadamente 0,5 mg de GM-CSF. Em alguns aspectos preferidos, as composições compreendem aproximadamente 0,125 mg de GM- CSF. Em alguns aspectos preferidos, as composições compreendem aproximadamente 0,25 mg de GM-CSF.

[0072] Em alguns aspectos particularmente preferidos, as composições para vacina compreendem aproximadamente 0,5 mg até 1 mg de peptídeo GP2 e de 0,125 até 0,250 mg de GM-CSF em um volume total de 1 mL e são administradas mensalmente na forma de uma inoculação dividida de 0,5 mL cada, administradas através de injeções aproximadamente 5 cm de distância no corpo do paciente e administradas concorrentemente ou misturadas. A programação de administração é preferencialmente mensalmente durante seis meses. Após um período de aproximadamente 48 horas, o sítio de injeção pode ser avaliado em relação à reação local de eritema e enduração. Se as reações em ambos os sítios forem confluentes e a área de enduração total medir >100 mm (ou o paciente sofrer qualquer toxicidade sistêmica com grau > 2), então a dose de GM-CSF pode ser reduzida, por exemplo, na metade, embora seja pretendido que a dose do peptídeo permaneça a mesma. Se o paciente apresentar uma reação forte em doses subsequentes, então pode ocorrer uma redução adicional de GM- CSF, por exemplo, uma redução na metade. Se o paciente não apresentar uma reação forte, então o paciente pode continuar com a dose maior de GM-CSF. Em alguns aspectos, a programação de administração e da dosagem do reforço é determinada similarmente, com reforços sendo iniciados com a administração de composições para vacina que compreendem 1 mg de GP2 e 0,25 mg de GM-CSF, administradas aproximadamente a cada seis meses após a conclusão da programação de vacinação para imunização primária.

[0073] Os exemplos a seguir são fornecidos para descrever a invenção em maiores detalhes. É pretendido que sejam ilustrativos e não limitantes da invenção.

EXEMPLO 1: Teste de Fase I de GP2 + GM-CSF Características do Paciente e Protocolo Clínico:

[0074] Este é o primeiro teste clínico de fase I do peptídeo GP2 derivado de HER2/neu com o imunoadjuvante GM-CSF nos pacientes livres de doença com câncer de mama. O teste foi aprovado pela Institutional Review Board e conduzido no Walter Reed Army Medical Center sob uma nova aplicação para investigação de fármacos (BB-IND #11730). Todos os pacientes tinham câncer de mama negativo em relação a nódulos confirmado histologicamente que expressava todos os níveis de HER2/neu através de imunohistoquímica padronizada (IHC 1-3+). Os pacientes tinham completado um curso padronizado de cirurgia, quimioterapia e terapia de radiação (quando necessário) antes do registro e os pacientes em quimioprevenção hormonal continuaram em seu regime específico. Após a verificação em relação aos critérios de qualificação e do aconselhamento e do consentimento apropriados, os pacientes HLA-A2+ qualificados foram registrados no estudo. Antes da vacinação, os pacientes passaram por um teste de pelo com um conjunto de antígenos de memória (teste de Mantoux). Os pacientes foram considerados imunocompetentes se reagissem (>5 mm) a >2 antígenos.

[0075] Foram registrados e vacinados 18 pacientes com câncer de mama livres de doenças negativos em relação a nódulos com todos os níveis de expressão de HER2/neu (IHC 1-3+). Nenhum paciente se retirou deste estudo ou foi perdido até o acompanhamento. A faixa demográfica, os fatores prognósticos e os perfis de tratamento dos pacientes são apresentados na tabela 1. Tabela 1. Faixa demográfica, fatores prognósticos e perfis de tratamento dos pacientes para o Estudo de Fase I.

Vacinação e Protocolo Clínico

[0076] Vacina. O peptídeo GP2 (HER2/neu, 654-662) foi produzido comercialmente de acordo com normas de procedimento federais para boas práticas de produção (GMP) pela NeoMPS Inc. (San Diego, CA). A pureza do peptídeo (>95%) foi verificada através de cromatografia líquida de alto desempenho e espectrometria de massa e o conteúdo de aminoácidos foi determinado através da análise de aminoácidos. O teste de esterilidade, endotoxinas (teste de lisado de amebócitos de límulo) e de segurança geral foi realizado pelo fabricante. O peptídeo liofilizado foi reconstituído em solução salina esterilizada nas concentrações a seguir: 100 μg/0,5 mL, 500 μg/0,5 mL e 1 mg/0,5 mL. O peptídeo GP2 foi misturado com GM-CSF (Berlex, Seattle, WA) a 250 μg/0,5 mL e a inoculação de 1,0 mL foi dividida e fornecida de forma intradérmica em dois sítios 5 cm de distância na mesma extremidade.

[0077] Série de Vacinação. O estudo foi planejado e realizado na forma de um teste de segurança de aumento de dose para determinar a segurança, a imunogenicidade e a melhor dose ótima do peptídeo GP2 em combinação com o adjuvante GM-CSF. A melhor dose ótima foi definida como a dose mínima da vacina e de adjuvante que fornece a melhor resposta imunológica in vivo e ex vivo.

[0078] Três pacientes foram designados para cada dos primeiros três grupos de dose recebendo seis inoculações mensais de GP2 e 250 μg de GM-CSF. Os grupos de dose são listados como GP2- peptideo(μg):GM-CSF(μg):# de inoculações e incluem: 100:250:6, 500:250:6 e 1000:250:6. GM-CSF foi reduzido em 50% se os pacientes desenvolvessem uma reação local medindo >100 mm ou toxicidades sistêmicas de grau >2. No último grupo de pacientes, o GM-CSF foi reduzido para 125 μg de forma que estes nove pacientes receberam 500:125:6.

[0079] Este teste de aumento de dose utilizava um aumento de dose do peptídeo GP2 (100 μg, 500 μg e 1000 μg) com 250 μg de GM-CSF e 6 inoculações mensais para os primeiros três grupos de dose (abreviados: GP2-peptideo(μg):GM-CSF(μg):# inoculações - 100:250:6, 500:250:6 e 1000:250:6). O GM-CSF foi reduzido em 50% se os pacientes desenvolvessem uma reação local medindo >100 mm ou toxicidades sistêmicas de grau >2. Oito dos primeiros 9 pacientes (89%) requereram reduções na dose de GM-CSF devido às reações locais fortes. Por causa das reduções no número de doses requeridas, a dose inicial de GM-CSF foi reduzida de 250 μg para 125 μg por inoculação para o quarto e para o grupo final de 9 pacientes (500:125:6). Apenas 2 dos 9 pacientes (22%) no grupo de dose final requereram uma redução adicional na dose de GM-CSF. Não foram requeridas reduções nas doses do peptídeo para a série de vacinação. A figura 1 mostra as reações locais médias versus a dose média de GM-CSF para cada grupo de dose. As reações locais no grupo de dose final flutuavam menos ao longo de toda a série de vacinação utilizando uma dose inicial de GM-CSF de 125 μg por inoculação.

[0080] Toxicidade. Os pacientes foram observados uma hora após a vacinação em relação à hipersensibilidade imediata e voltaram 48-72 horas depois para terem seus sítios de injeção medidos e serem questionados em relação às toxicidades. As toxicidades foram classificadas através dos NCI Co mmon Terminology Criteria for Adverse Events, v3,0 (CTCAE). O avanço do grupo de uma dose para o seguinte ocorria somente na ausência de toxicidades limitantes da dose, definidas como reação de hipersensibilidade ou dois pacientes dentro um grupo de dose desenvolvendo toxicidade de grau > 3.

[0081] Isolamento e Culturas de Células Mononucleares de Sangue PEriférico (PBMC). O sangue foi tirado antes de cada vacinação e em um (pós-vacina) e seis meses (longo prazo) após completar a série de vacinação. 50 mL de sangue foram tirados e as PBMCs foram isoladas. As PBMCs foram lavadas e ressuspensas em meio de cultura e utilizadas como uma fonte de linfócitos.

[0082] Ensaio de Dímeros de Imunoglobulina HLA-A2. A presença de células T CD8+ específicas para GP2 em PBMCs recém-isoladas de pacientes foi avaliada diretamente ex vivo através do ensaio de dímeros na linha de base, antes de cada vacinação sucessiva e em 1, 6 e 12 meses após completar a série de vacinação (Woll mm et.al., J Clin I mmunol (2004) 24:449-461). Sucintamente, o dímero de HLA- A2:Imunoglobulina (Ig) (PharMingen, San Diego, CA) foi carregado com o peptídeo GP2, E75 ou de controle (E37, proteína que se liga ao folato (25-33) RIAWARTEL) através da incubação de 1 μg de dímero com um excesso (5 μg) de peptídeo e 0,5 μg de β2-microglobulina (Sigma, St. Louis, MO) a 37°C durante a noite então armazenado a 4°C até ser utilizado. As PBMCs foram lavadas e ressuspensas em PharMingen Stain Buffer (PharMingen) e adicionadas a 5x105 células/100μL/tubo em tubos de poliestireno de fundo arredondado de 5 mL (Becton Dickinson, Mountain View, CA) e coradas com os dímeros e os anticorpos carregados. Em cada paciente o nível de células CD8+ específicas para GP2 e para E75 foi determinado em resposta a cada vacinação sucessiva e os níveis médios pós-inoculação foram comparados com os níveis pré-inoculação.

[0083] Hipersensibilidade do Tipo Retardada (DTH). As reações de DTH para o peptídeo GP2 foram realizadas antes e depois da série de vacinação. As injeções intradérmicas, nas costas ou na extremidade (lado oposto da vacinação), utilizando 100 μg de GP2 (sem GM-CSF) em 0,5 mL de solução salina foram comparadas a um inóculo de controle com volume igual de solução salina. As reações de DTH foram medidas em duas dimensões em 48-72 horas utilizando o método de caneta esferográfica sensível e relatadas na forma da média ortogonal. Sokol JE, Measurement of delayed skin test responses. N Engl J Med (1975) 293:501-501.

[0084] Análise Estatística. Os valores de p para os fatores clinicopatológicos foram calculados utilizando Wilcoxon, o teste exato de Fisher ou x2 quando apropriado. Os valores de p para a comparação de DTH pré- e pós-vacinação e os ensaios de dímeros foram calculados utilizando o teste t de Student, pareado ou não pareado, quando apropriado. As diferenças eram consideradas significativas uando p<0,05.

Resultados

[0085] As composições que compreendem GP2 e GM-CSF são tanto seguras quanto altamente imunogênicas. As respostas imunológicas, tanto ex vivo quanto in vivo, parecem ser influenciadas pela presença ou pela ausência de imunidade específica para GP2 no início da série de inoculação e pela dose de GM-CSF utilizada. Em adição, a vacinação com GP2 resulta eficientemente no espalhamento de epítopos intraantigênicos.

[0086] A toxicidade foi limitada a reações locais brandas (que são desejadas e servem como uma medida substituta da imunogenicidade) e respostas sistêmicas brandas, das quais muitas são efeitos colaterais conhecidos de GM-CSF. Não havia toxicidades limitantes da dose e as reduções de dose em GM-CSF eram suficientes para limitar as reações locais encontradas com as inoculações em série até <grau 2. De forma geral a combinação de vacina era bem tolerada.

[0087] Como discutido em maiores detalhes a seguir, a imunogenicidade ex vivo da vacina foi demonstrada, mas primariamente evidente quando uma análise de subgrupos dos pacientes sem imunidade pré-existente é realizada. Os pacientes sem imunidade pré- existente, como definido anteriormente como nível de dímero específico para o peptídeo <0,3%, atingiam a maior indução de uma resposta de CTL para a vacinação com GP2. Esta resposta era uniforme sem considerar a dose do peptídeo GP2. Os pacientes com imunidade pré- existente demonstraram uma menor resposta de CTL o que sugere um nível de tolerância às vacinações com o peptídeo ou uma resposta imunológica endógena previamente otimizada.

[0088] A imunogenicidade in vivo da vacina GP2+GM-CSF foi demonstrada através de um aumento na reação de DTH em resposta ao peptídeo GP2 (sem GM-CSF) antes e depois da série de vacinação. Esta diferença em resposta atingia significância estatística de forma cumulativa e dentro de cada grupo de dose. De observação, os pacientes sem imunidade pré-existente tendiam em direção a maiores reações de DTH. Ainda, os pacientes que receberam os 250 μg de dose de GM-CSF tendiam em direção a uma maior resposta de DTH, mas esta descoberta foi frustrada por uma maior porcentagem de pacientes com imunidade pré-existente no grupo de dose menor de GM-CSF. Portanto, é incerto se a diferença observada nos pacientes com 250 μg de GM-CSF é devida à dose do adjuvante ou à ausência de tolerância. Juntas, estas respostas de DTH indicariam que a imunidade in vivo é mantida e aumentada em todos os grupos em resposta à vacinação.

[0089] Grupos de Doses. Este teste de aumento de doses utilizava uma dose crescente de peptídeo GP2 (100 μg, 500 μg e 1000 μg) com 250 μg de GM-CSF e 6 inoculações mensais para os primeiros três grupos de dose (abreviados: GP2-peptideo(μg):GM-CSF(μg):# inoculações - 100:250:6, 500:250:6 e 1000:250:6). O GM-CSF foi reduzido em 50% se os pacientes desenvolvessem uma reação local medindo >100 mm ou toxicidades sistêmicas de grau >2. Oito dos primeiros 9 pacientes (89%) requereram reduções na dose de GM-CSF devido às reações locais fortes. Por causa das reduções no número de doses requeridas, a dose inicial de GM-CSF foi reduzida de 250 μg para 125 μg por inoculação para o quarto e para o grupo final de 9 pacientes (500:125:6). Apenas 2 dos 9 pacientes (22%) no grupo de dose final requereram uma redução adicional na dose de GM-CSF. Não foram requeridas reduções nas doses do peptídeo para a série de vacinação. A figura 1 mostra as reações locais médias versus a dose média de GM- CSF para cada grupo de dose. As reações locais no grupo de dose final flutuavam menos ao longo de toda a série de vacinação utilizando uma dose inicial de GM-CSF de 125 μg por inoculação.

[0090] Grupo de Dosagem Combinada. Não havia toxicidades de graus 3-5 entre os 18 pacientes que receberam um total de 108 doses de GP2+GM-CSF. Entre todos os pacientes, as toxicidades locais máximas que ocorreram durante a série inteira eram de grau 1 (38,9%) ou de grau 2 (61,1%). As toxicidades sistêmicas máximas durante a série eram de grau 0 (5,6%), de grau 1 (61,1%) e de grau 2 (33,3%). As reações locais mais comuns incluíam eritema e enduração (100% de pacientes), prurido (25%) e inflamação (23%). As reações sistêmicas mais comuns eram fadiga de grau 1 (40%) e artralgia/mialgia de grau 1 (15%). As taxas de toxicidades licais e sistêmicas combinadas gerais são mostradas na figura 2a.

[0091] A vacina de GP2+GM-CSF era capaz de induzir uma resposta imunológica tanto ex vivo quanto in vivo. A resposta imunológica ex vivo foi avaliada através do ensaio de dímeros de HLA- A2:Ig para detectar a porcentagem de células T CD8+ circulantes específicas para GP2. Os CTLs específicos para GP2 são relatados na forma da procentagem da média + erro padrão da população de CD8+ circulante total. Os pontos de tempo analisados incluem pré-vacina (pré=0,5+0,1%), um mês após completar todas as inoculações (pós=0,6+0,1%), valor máximo durante a série (máx=1,4+0,2%) e 6 meses após completar todas as inoculações (longo prazo=0,9+0,2%). Embora um aumento estatisticamente significativo tenha ocorrido nos pacientes quando era comparado o nível pré versus máximo de vacina (p=0,0003), nenhum aumento significativo foi observado quando eram comparados os níveis pré versus pós ou em longo praxo de dímeros de vacina (p=0,7 e p=0,2, respectivamente) (figura 2b).

[0092] A eficiência da in vivo da vacina foi analisada através de respostas de DTH pré e pós-série de vacina utilizando GP2 (sem GM- CSF) bem como um controle de volume de solução salina. Um aumento estatisticamente significativo foi observado em respostas de DTH para GP2 pré versus pós-vacina (2,5+1,4 mm versus 35,1+7,0 mm, p=0,0002) (figura 2c).

[0093] Para elucidar melhor a resposta imunológica para a vacina de GP2, foram realizadas análises de dois subconjuntos diferentes: resposta baseada na presença de imunidade pré-existente específica para GP2 e resposta baseada na dose de GM-CSF. Estas são fornecidas a seguir.

[0094] Imunidade Pré-Existente versus Não Pré-Existente. Como definido anteriormente, a imunidade pré-existente é um nível de dímero específico para o peptídeo >0,3% (Peoples GE et.al., J Clin Oncol (2005) 23:7536-7545). Dez pacientes (56%) tinham níveis de dímeros coerentes com a imunidade pré-existente para GP2 e 8 pacientes (44%) não tinham imunidade pré-existente. Havia uma diferença estatística entre os dois grupos pré-vacina GP2-níveis de dímeros (0,8+0,1% versus 0,06+0,02%, p=0,0007).

[0095] Os pacientes sem imunidade pré-existente tinham reações locais ligeiramente mais altas com toxicidades locais ligeiramente maiores comparados com o grupo com imunidade pré-existente; entretanto, isto não era estatisticamente significativo (Figura 3a).

[0096] Respostas imunológicas ex vivo e in vivo foram observadas em ambos os grupos, mas eram mais fortes no grupo de pacientes sem imunidade pré-existente. Os níveis de dímeros de GP2 do grupo sem imunidade pré-existente eram pré versus máx (0,06±0,02% versus 1,4±0,4%; p=0,009), pré versus pós (0,06±0,02% versus 0,5±0,2%; p=0,07) e pré versus longo prazo (0,06+0,02% versus 0,9+0,4%; p=0,06). Nos 10 pacientes com imunidade pré-existente, a resposta de CTL à vacinação era pré versus máx (0,8±0,1% versus 1,5±0,2%; p=0,02), pré versus pós (0,8±0,1% versus 0,6±0,2%; p=0,2) e pré versus longo prazo (0,8±0,1 versus 0,9±0,2; p=0,7) (figura 3b).

[0097] Quando as respostas imunológicas in vivo nos grupos eram comparadas ambos os grupos tinham aumentos estatisticamente significativos em suas respostas de DTH pré versus pós (sem imunidade pré-existente = 3,3±2,1 mm versus 43,9±14,6 mm; p=0,02; e imunidade pré-existente = 2,0±2,0 mm versus 28,0±4,6 mm; p=0,0001).

[0098] Os pacientes sem imunidade pré-existente tinham respostas de DTH maiores comparadas com a pós-resposta de DTH do grupo com imunidade pré-existente, mas esta diferença não era estatisticamente significativa (43,9+14,6 mm versus 28,0+4,6 mm, respectivamente; p=0,3) (figura 3c).

[0099] 250 μg versus 125 μg de GM-CSF. Foi também realizada uma análise dos pacientes de acordo com as duas doses iniciais de GM- CSF. As toxicidades tanto locais quanto sistêmicas eram menores no grupo de dose final de 125 μg de GM-CSF, embora não estatisticamente significativas (figura 4a).

[00100] A resposta de CTL à vacinação nos grupos de dose de 250 μg (n=9) era pré versus máx (0,3±0,1% versus 1,1±0,2%; p=0,004), pré versus pós (0,3±0,1% versus 0,5±0,2%; p=0,07) e pré versus longo prazo (0,3±0,1% versus 0,4±0,09%; p=0,2). A resposta de CTL no grupo de dose de 125 μg (n=9) era pré versus máx (0,8±0,2% versus 1,8±0,3%; p=0,04), pré versus pós (0,8±0,2% versus 0,6±0,2%; p=0,5) e pré versus longo prazo (0,8±0,2% versus 1,4±0,3%; p=0,5) (ffigura 4b). Ambos os grupos de 250 μg e 125 μg de GM-CSF tinham aumentos significativos na resposta pré à máxima para o dímero e o grupo de 250 μg tendia em direção à significância. Esta análise pode ser confundida pelo fato de que 33% (3/9) dos pacientes do grupo de 250 μg tinham imunidade pré-existente, enquanto que 77,8% (7/9) pacientes do grupo de 125 μg tinham imunidade pré-existente.

[00101] Para as respostas imunológicas in vivo, todos os pacientes, independente da dose de GM-CSF, tinham um aumento estatisticamente significativo na resposta de DTH comparando medidas pré versus pós-vacina (125 μg = 3,8+2,5 mm para 24,4+5,5 mm; p=0,009 e 250 μg = 1,3+1,3 mm para 45,7+12,2 mm; p=0,008). Os pacientes que receberam 250 μg de GM-CSF tinham uma tendência em direção a maiores respostas de DTH pós-vacina, embora não estatisticamente significativas (45,7+12,2 mm versus 24,4+5,5 mm; p=0,1) (figura 4c).

[00102] Condição de Expressão de HER2. Os dados de resposta imunológica in vivo para pacientes agrupados de acordo com o nível de expressão de HER2 (IHC 1+, IHC 2+ ou IHC 3+) foram analisados, como mostrado na tabela 2 abaixo. Todos os três grupos produziram reações de DTH substanciais pós-vacina. De forma surpreendente, os pacientes que possuem expressão de HER2/neu baixa à intermediária produziram respostas imunológicas in vivo similares em magnitude às respostas de DTH pós-vacina observadas nos pacientes IHC 3+. Os pacientes com expressão de HER2/neu baixa à intermediária também exibiam uma tendência em direação a diferenças mais estatisticamente significativas entre respostas de DTH pré e pós-vacina quando comparados com os pacientes IHC 3+. Especificamente, os pacientes IHC 2+ tinham um aumento estatisticamente significativo na resposta de DTH comparando medidas pré versus pós-vacina (2,3±2,3 mm para 32,5±6,6 mm; p=0,02). Pacientes com IHC 1+ e IHC 3+ tinham uma tendência em direação a respostas de DTH pós-vacina mais potentes, com os pacientes IHC 1+ mais próximos à significância estatística que os pacientes IHC 3+ (IHC 1+ = 2,1±2,1 mm para 33,0±12,8 mm; p=0,06 e IHC 3+ = 3,9±3,9 mm para 44,0±17,9 mm; p=0,1). Quando os dados de DTH de pacientes com expressão baixa à intermediária foram combinados (“LE”) e comparados com os dados de DTH dos pacientes IHC 3+ (“OE”), foi observado de forma inesperada que os pacientes LE tinham um aumento estatisticamente significativo na resposta de DTH comparando medidas pré versus pós-vacina (2,0±1,4 mm para 31,7±7,1 mm; p=0,002) quando comparados com os pacientes OE (3,9±3,9 mm para 44,0±17,9 mm; p=0,1). Tabela 2. Respostas de DTH Baseadas no Nível de

[00103] Espall aamntOo de Epítopos. Finalmente, foi rea izada a avaliação em relação à evidência de espalhamento de epítopos intra- antigênicos em resposta à vacinação com GP2+GM-CSF. Foi realizada a medida te CTLs tanto específicos para GP2 quanto específicos para E75 antes, durante e depois da vacinação. Foi observado que a porcentagem de CTLs específicos para E75 aumentava significativamente quando eram comparados os níveis pré versus máximo (0,8±0,2% versus 2,0±0,2%; p=0,0001) e aumentavam, mas não significativamente, pré versus pós-vacina (0,8±0,2% versus 1,2±0,2%; p=0,1) e pré versus longo prazo (0,8+0,2% versus 1,0+0,2%; p=0,6) em resposta à vacinação com o peptídeo GP2 (figura 5). Digno de observação, estes níveis de CTLs específicos para E75 são similares em magnitude à vacinação primária com E75 com a única diferença sendo uma tendência em direação a respostas mais altas de dímero máximo para E75 comparado com GP2 (2,0+0,2% versus 1,4+0,2%; p=0,07).

[00104] A observação de reações de DTH e locais mais robustas junto com maiores respostas de CTL entre os pacientes começando com doses de GM-CSF mais altas sugere que a dose de imunoadjuvante desempenha uma função na imunogenicidade e possivelmente na eficácia das vacinas com peptídeo HER2/neu. Como relatado anteriormente, doses maiores de E75+GM-CSF levam a reações de DTH mais robustas e tendem em direção a menos recorrências com maior sobrevivência nos pacientes que sofreram recorrência (Peoples GE et. al., Clin Cancer Res (2008) 14(3):797-803). Outro estudo recente com E75 mostrou que a administração de E75 e GM-CSF em seis inoculações mensais em pacientes com câncer de mama livres de doença no grupo de dose ótima (ODG) de 1000 μg de E75 e 250 μg de GM-CSF (1000:250:6) resulta em uma resposta de DTH pós-vacinação média de 21,5 mm. Holmes et.al. Cancer (2008) 113:1666-75. As respostas de DTH pós-vacinação do grupo com dose subótima (SDG) eram significativamente menores que as do OBD. De forma interessante, os pacientes no ODG tinham menos casos de recorrência de doença apesar de terem doença mais agressiva, indicando que a resposta de DTH fornece um marcador útil para o resultado clíico e, em particular, para a medida da pré-disposição para recorrência de doença, com uma DTH menor estando correlacionada com uma predisposição maior para recorrência de doença ou um tempo de sobrevivência livre de doença mais curto e vice versa.

[00105] De forma surpreendente, muito embora GP2 tenha uma afinidade de ligação relativamente fraca por HLA-A2 e seja o epítopo subdominante, os pacientes tratados com GP2 e GM-CSF exibiam respostas de DTH notavelmente maiores quando comparados com aquelas induzidas com o epítopo imunodominante, E75 (mais GM-CSF). Neste teste com GP2, foram observadas respostas de DTH maiores nos pacientes sem imunidade pré-existente (43,9 mm) bem como nos pacientes recebendo a dose de GM-CSF mais alta (45,7 mm). Especificamente, a resposta de DTH pós-vacinação média para todos os pacientes com GP2 + GM-CSF era de 35,1 mm, enquanto que a resposta de DTH pós-vacinação média para pacientes com E75 + GM- CSF era de 11,3 mm (SDG) e 21,5 mm (ODG). Os pacientes tratados com GP2 e 250 μg de GM-CSF tinham uma DTH pós-vacinação média maior que duas vezes o tamanho dos pacientes com E75 OBD tratados similarmente (1000:250:6) (45,7 mm versus 21,5 mm). De forma surpreendente, em comparação com testes anteriores com o peptídeo imunodominante E75, a reação de DTH média para GP2 era aproximadamente duas vezes o tamanho daquela induzida por E75 com a metade da dose do peptído em média. Não apenas estas descobertas ilustram adicionalmente a imunogenicidade de GP2 e enfatizam sua relevância clínica, mas os dados de DTH in vivo também sugerem fortemente que GP2, apesar de ser o epítopo subdominante, deve ser mais eficiente na redução de recorrência de câncer de mama que E75.

EXEMPLO 2: Teste de Fase II de GP2 + GM-CSF Métodos

[00106] Pacientes com câncer de mama de alto risco livre de doença que completaram a terapia padronizada com o adjuvante foram registrados em vários sítios e selecionados aleatoriamente para receberem seis inoculações mensais de 500 μg de GP2 com 125 μg de GM-CSF (Grupo do peptídeo; PG) ou 125 μg de GM-CSF isoladamente (grupo do adjuvante; AG). A toxicidade foi avaliada após cada inoculação. A resposta imunológica foi monitorada através de reações de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) medidas e um ensaio de dímero de HLA-A2:Imunoglobulina para detectar linfócitos T CD8+ específicos para GP2. Os paacientes foram monitorados clinicamente, radiograficamente e patologicamente em relação à recorrência.

Resultados

[00107] Até agora, 50 (27 PG, 23 AG) dos 200 pacientes planejados completaram a série primária. Os PG e AG possuem características de faixa demográfica/prognósticas similares (tabela 3). Tabela 3. Características de faixa demográfica e prognósticas de pacientes para o Estudo de Fase II

[00108] Os perfis de toxicidade nos PG e AG eram quase idênticos com nenhuma toxicidade local de grau 4-5 e nenhuma toxicidade sistêmica de grau 3-5 em qualquer um dos braços. A reação de DTH média para GP2 aumentou significativamente desde o nível pré- vacinação após completar a série primária (pós-vacinação) no grupo PG (1,0+0,8 cm para 18,0 +3,1 cm; p<0,0001) e até uma extensão menor no grupo AG (0,0+1,0 cm para 0,5+3,3 cm; p<0,01) (figura 6). A DTH pós-vacinação era significativamente maior no PG comparado com o AG (18,0 +3,1 cm vs 0,5+3,3 cm, p=0,002) (figura 6). Todos os pacientes de PG (27/27) exibiam imunidade significativa (SI) através de DTH (reação maior que 1 cm) pós-vacinação comparados com 45,5% (10/22) de pacientes de AG. Dos 10 pacientes de AG com SI pós-vacinação, 50% (5/10) tinham SI pré-vacinação comparados com apenas 16,6% (2/12) sem SI pós-vacinação (p=0,38). A % de linfócitos CD8+ específicos para GP2 aumentou significativamente partindo da linha de base em 6 meses após completar a série primária no PG (0,65+0,15 até 1,82+ 0,23, p=0,002) e não se alterou significativamente no AG (1,08 + 0,16 to 1,41 + 0,49, p=0,45).

[00109] Devido ao fato de que há um estudo em vários sítios em andamento, com pacientes registrados em uma base de rotação, os dados de recorrência ainda não são completos. Entretanto, os dados preliminares mostram que os pacientes do PG sofreram uma redução de aproximadamente 50% na taxa de recorrência quando comparados com os pacientes do AG de controle, similar às taxas de recorrência observadas em 24 meses nos pacientes tratados com E75 + GM-CSF (Peoples GE et.al., Clin Cancer Res (2008) 14(3):797-803). Mais especificamente, em um acompanhamento da mediana de 17,9 meses, a taxa de recorrência no PG é de 7,4% (2/27) comparada com a de 13% (3/23) no AG (p=0,65). Mais dados sobre a taxa de recorrência se tornarão disponíveis à medida que mais pacientes passam pelo acompanhamento em 24 meses e além e à medida que mais pacientes se registram no estudo.

[00110] Todas as patentes, os pedidos de patentes e as referências publicadas,citados aqui, são incorporados aqui como referência em sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às modalidades preferidas da mesma, será entendido pelos peritos na arte que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas aqui sem se afastar do âmbito da invenção abrangido pelas reivindicações em anexo.

Claims (3)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, uma quantidade eficiente de um peptídeo GP2 que consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, e o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, em que além do peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, a composição não contém nenhum outro peptídeo derivado de HER2/neu, tal como um peptídeo E75 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade eficaz do peptídeo GP2 é entre 0,1 e 1 mg/mL e uma dose do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos é entre 0,1 e 0,5 mg/mL.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que que a quantidade eficaz do peptídeo GP2 é de 0,5 mg/mL e a dose do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos é de 0,125 mg/mL.

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