CN102532268B - 具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用 - Google Patents
具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗乳腺癌活性的寡肽，其序列为His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。所述寡肽在较低浓度下能选择性抑制体外乳腺癌细胞的生长，而对正常乳腺细胞的生长无影响。体内试验也表明，该寡肽对癌细胞的生长和增殖有很强的抑制作用，并呈现明显的剂效关系。因其安全、高效、理想的抗癌效果，该寡肽可用于制备抗癌药物，并具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及寡肽及其应用，尤其涉及一种具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用，属生物医学领域。
背景技术
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌5年生存率约50%-60%，近50%患者治疗后复发转移，晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18-30个月。乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、内分泌治疗等传统的治疗手段。但手术治疗风险高，对人体创伤大，使患者免疫力降低，对疾病抵抗力下降，术后易产生一系列手术并发症且仅为局部治疗手段，只适用于早期患者，对中、晚期患者来说，即使能手术效果也不理想，难以根治。由于乳腺癌的复发和转移特性，放射治疗对肿瘤的局部控制效应不如外科手术，且对照射区的正常组织也有杀伤作用，同时亦可导致乏力、恶心、食欲不振等全身不良反应；放射线本身亦可造成医源性损伤，如放射性脊髓炎、放射性肺炎、放射性脑坏死等。虽然肿瘤的化疗近年来发展很快，但对大多数实体瘤而言，根除性化疗的前途仍不容乐观。另外，化疗药物在抑制肿瘤细胞生长或杀伤癌细胞的同时，对机体内正常繁殖的各类细胞同样也有不同程度的毒性作用，尤其是骨髓造血细胞和胃粘膜上皮细胞受到的损害最重。另外，化疗药物的严重毒副反应，以及多药耐药等，仍然是十分棘手的问题。由于乳腺癌是一种与内分泌密切相关的肿瘤，内分泌治疗已成为乳腺癌各阶段的重要治疗手段，但也会产生一定的副作用。
多肽、蛋白质类药物具有活性高、疗效稳定、毒副作用小、用量少等优点，对癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压和某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效和广泛的应用前景，因此备受国内外专家的关注。自1953 年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素以后，50 年代的研究主要集中在脑垂体所分泌的各种多肽激素并取得了很大的进展。到60年代，研究的重点转移到一类典型的神经细胞所分泌的活性肽( 神经肽) ，即由下丘脑所形成的激素释放因子和释放激素抑制因子。70 年代，脑啡肽及脑中其他阿片样肽的相继发现，使神经肽的研究又进入了高潮，在研究脑活性肽( 脑肽) 的同时，胃肠激素的研究也十分活跃，成为发展较快的一个研究领域。近年来，随着生物技术的不断发展，利用生物技术合成并研究了多种多肽类药物，已经成为了药物研究的热点问题。随着医疗科学的不断发展，多肽类药物已成为21 世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药。
自然界中存在着大量的生物活性多肽，它们在生物活动中起着非常重要的调节作用，涉及分子识别、信号识别、细胞分化及个体发育等诸多领域。人们发现存在于生物体的多肽有数万种，并且发现所有的细胞均能合成多肽。同时，几乎所有的细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长与生殖等各个领域。应用这些活性肽可作为药物、疫苗、导向药物、诊断试剂及药物先导化合物等。因此，开展生物活性肽研究具有广泛的理论和应用价值。
存在于体内的信号分子有相当数量是肽和蛋白质，许多疾病的发生、发展均与这些物质的失衡有关。因此，源于生物体本身的蛋白质、多肽类药物日益受到重视，它们被称为内源性活性肽或蛋白质。由于生物活性肽在体内含量极少而效应极强，分布广泛，因而为多种药物研发提供了天然先导化合物。自然界存在的多肽，除了有些是蛋白质降解产生的活性肽段外，生物体内已知的活性多肽主要是下丘脑、垂体、胃肠道等产生的多种具有特殊生理作用的激素。
生物活性肽早期主要从天然动、植物、昆虫等生物体内分离扩取，周期长，成本高。80年代末及90年代初出现的生物（基因）组合肽库及化学组合肽库，给肽类药物以及制药工业到来了革命性进展。目前主要从生物肽库（噬菌体、细菌、酶菌及哺乳动物细胞表面展示肽库）内筛选生物活性多肽。
生物组合肽库及化学组合肽库的构建和筛选涉及化学、计算机分子设计、分子生物学、药学等多学科，是这些学科的重要生长点，并将成为将基因组、蛋白质组、疾病分子生物学及结构生物学等最新成果推向应用的强有力手段。生物肽库是通过四个碱基的随即组合，合成各种随机序列的DNA片段，将这些随机序列DNA片段克隆至原核或真核细胞表达载体，与细菌、噬菌体或真核细胞的表面蛋白或鞭毛蛋白融合表达，使这些表达的随机序列多肽展示在细胞表面。近10年国内外多生物多肽进行大量基础和应用研究，并已将多种多肽药物和诊断试剂应用临床。
多肽合成的方法学在不断的发展和创新，肽的化学合成至今一直是肽研究的一个重要方面。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。自从1963年Merrifidld发展成功了固相多肽合成方法以来，此方法合成步骤简单，同时能够得到高纯度肽类物质，克服了传统液相合成费时和烦琐，又解决了操作步骤多带来的损失，也为多肽自动合成奠定了基础，经过不断的改进和完善，到今天固相合成法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。
固相合成多肽的主要步骤是：通过简单的脱去氨基保护，连接一个氨基酸，再脱去氨基保护，再接下一个氨基酸的简单重复，就可以很容易的得到所需要的肽段。待所要的肽段合成完毕后，就可以采用化学试剂将多肽从树脂上洗脱下来，同时使用合适的试剂将多肽的侧链保护基团也切割除掉，这样就得到了与完整的生物体内的多肽完全一样的产物。
该方法比液相合成法有极大优势，比如每一步连接方式简单；氨基末端保护方式相同，除去该保护基团方法简单；羧基末端由于一直连接在树脂载体上，不需要保护；每步的中间产品不需要纯化，只需要简单的洗涤树脂；化学偶联效率高。因此，现在越来越多的使用该方法合成多肽。而且由于这种接肽的方法是使用重复简单的方式方法，可以很容易的采用自动控制的仪器完成，因此设计和使用这种仪器已经变得越来越简单，能更快更好的掌握这种方法来合成多肽进行研究。
多肽合成方法不断丰富和完善，合成的效率大大提高，必将进一步促进活性肽的结构和功能关系的研究，开拓多肽生物学研究的新领域。
多肽作为药物有其独特的优点：（1）分子量小，无免疫原性、比较安全；（2）结构相对简单，功能较明确、特异、副作用小；（3）分子较小，易于合成，生产成本低：（4）多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样化（如口服、喷雾、透皮吸收等）；（5）合成的多肽纯度较高，不存在热源问题。
正因如此，国内外对多肽药物的研究特别重视。多肽类药物的化学本质具有生物活性的小分子物质，它们参与人体许多重要的生理过程，比如造血、抑制肿瘤细胞活性、免疫等，因此这类药物往往作用机理明确，效果明显，具有很高的临床应用价值。
多肽药物依据不同用途或靶向目标，可分为9 大类，主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其他药用小肽、诊断用多肽等。
发明内容
基于肽类药物的基本特性以及乳腺癌临床治疗中的需要，本发明的目的是提供一种具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用。
本发明通过提取国际主要抗菌肽数据库中登录的抗菌肽序列，分析其一级结构与活性的对应关系，同时设计人工短肽序列。分析已知活性的寡肽序列与设计的寡肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正，并利用本领域常规的液相或固相合成法人工合成高纯度的全序列，经质谱鉴定、抗癌活性筛选，最终确定具有抗乳腺癌功能的寡肽。
本发明筛选得到的具有抗乳腺癌活性的寡肽其序列为His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。该寡肽氨基酸数目小于10个，不需任何修饰连接，为线性寡肽，且人工合成方便；功能实验显示，该寡肽能显著抑制乳腺癌细胞株的生长，并能有效抑制小鼠体内肿瘤的增殖，提示其在乳腺癌临床治疗中具有重要的开发和应用价值，因此可用于制备抗乳腺癌药物。
本发明与现有技术相比具有如下效果：
本发明合成了一个具有很强抑制乳腺癌活性的寡肽。目前虽有文献报道抗乳腺癌肽类，但大多数从海洋生物、植物及生物体中分离得到。本发明合成的寡肽由天然氨基酸组成，分子量较小，便于人工合成，易于产业化，且抑制乳腺癌活性强，对正常细胞无影响，是一种安全、高效、理想的抗癌药物。
附图说明
图1.P1221号寡肽对人正常乳腺细胞株MCF-10A生长的抑制作用检测。
图2.P1221号寡肽对人乳腺癌细胞株MCF-7生长的抑制作用检测。
图3.P1221号寡肽对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231生长的抑制作用检测。
具体实施方式
实施例1：
寡肽的设计与合成
1、提取国际主要抗菌肽数据库（http://aps.unmc.edu/AP/main.php；http://penbase.immunaqua.com/；http://www.bbcm.univ.trieste.it/；http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/）中登录的抗菌肽的序列，分析其一级结构与活性的关系的对应关系，同时设计人工短肽序列。
、利用蛋白质分析数据库http://www.expasy.org/，分析已知活性的寡肽序列与设计的寡肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
、寡肽序列送至生物公司合成或利用自动寡肽合成仪合成全序列。HPLC检测纯度要大于96％，同时通过质谱检测确定寡肽合成质量。样品以冻干状态保存。
、合成后的寡肽进行抗乳腺癌功能检测筛选。
、通过功能检测，最终获得具有抗乳腺癌功能的寡肽序列，实验序列号为P1221，其氨基酸序列为His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。
实施例2：
寡肽的鉴定
P1221号寡肽经5.7mol/L HCl水解16小时，进行氨基酸分析，知其含His、Asn、Tyr、Gly、Phe、Val、Pro、Ser、Leu等9种氨基酸，其摩尔比为 His：Asn：Tyr：Gly：Phe：Val：Pro：Ser：Leu＝1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1。经氨基酸序列分析，序列为 His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。经电喷雾质谱测定得到一个峰，其分子量为1033.15。
实施例3：
利用MTT法检测P1221号寡肽体外抑癌活性
2.1材料与试剂
1）P1221号寡肽，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
）人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231，人正常乳腺细胞MCF-10A，均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
）RPMI 1640培养基，DMEM培养基，新生小牛血清，均为美国GIBCO公司产品。
）二甲基亚砜（DMSO），四甲基偶氮唑（MTT）和胰蛋白酶为Sigma公司产品。
2.2实验
1）用稀释液（无菌PBS，或无菌水，或相应的细胞培养基）将P1221号寡肽稀释至1mM的初始浓度，过滤除菌，分装后-20℃冻存。
）细胞培养：癌细胞于含10％小牛血清的RPMI 1640培养液中（含100U/mL青霉素和链霉素）培养，细胞每2-3天传代1次；正常细胞于DMEM培养基中培养，4-5天传代一次。细胞生长呈80％左右融合状态时，采用胰酶消化的方法消化分离细胞，用相应的培养基制备单细胞悬液并调整合适的细胞浓度，分瓶传代，置于37℃，体积分数为5％CO2的湿化环境中培养，实验时用对数生长期细胞。
）细胞已贴壁后，弃去孔中原培养基，实验组分别加入含有梯度稀释（在初始浓度基础上以10倍体积稀释）肽的100μL培养基，终浓度分别为0.1mM，0.01mM，0.001mM。阴性对照组加入含有同等浓度稀释液的同体积培养基，CO2恒温培养箱中培养48h。
）显微镜下观察细胞生长状态，然后每孔加入20μl（5mg/mL）MTT溶液，培养4h。
）小心吸尽孔中液体，每孔加入150μl DMSO，置于水平摇床上轻摇10min，以便紫色结晶充分溶解于DMSO中。
）使用Model680酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值，记录并分析数据。
显微镜观察可见癌细胞生长速率降低，细胞边缘出现小泡及细胞凋亡现象的发生，而正常细胞的生长并无明显异常。MTT实验统计结果（见附图1-3）显示，P1221号寡肽在0.001mM-0.1mM浓度下均能不同程度的抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的生长，且浓度越高，其抑制效果越明显。而同等浓度下P1221号寡肽对人正常乳腺细胞并无生长抑制作用。说明P1221号寡肽具有对乳腺癌细胞具有选择性杀伤能力，而对正常细胞并无毒副作用，这使其可以用于制备癌症治疗的临床药物，或者作为联合化疗的临床药物使用，因而具有较好的应用前景。
实施例4：
检测P1221号寡肽体内抑癌活性
2.1材料与试剂
1）P1221号寡肽，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
）紫杉醇（上海瑞齐生物科技有限公司）。
）人乳腺癌细胞株MCF-7。
）昆明种小白鼠。
2.2实验
100只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分五组，每组20只，雌雄各半或全部为雄鼠。将已接种乳腺癌细胞MCF-7的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，P1221号寡肽和作为阳性对照的紫杉醇为治疗组，连续注射7天后，于停药3天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，按以下公式计算抑瘤率。
结果显示，与紫杉醇的抑癌作用类似，P1221号寡肽在以剂量15、7.5和2.5mg/kg进行静脉注射时，对小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用，且剂效关系明显。
组别剂量（mg/kg）抑瘤率（%）
生理盐水 25 0
紫杉醇 20 71
P1221 2.5 49
P1221 7.5 61
P1221 15 89
序列表
<110> 胡海波
<120> 一种具有抗乳腺癌活性的寡肽
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<400> 1
His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu
1 5 9
Claims (2)
1.一种具有抗乳腺癌活性的寡肽，其特征在于：其序列为His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。
2.权利要求1所述寡肽在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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