CN109762042B

CN109762042B - 一种治疗癌症的药物、其合成方法和应用

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Publication number: CN109762042B
Application number: CN201811610894.0A
Authority: CN
Inventors: 孔彦平; 刘锦红
Original assignee: Hebei Aike Meiji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Aike Meiji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109762042A

Abstract

本发明公开了一种治疗癌症的药物、其合成方法及应用，该药物主要由DNA片段和紫杉醇组成；该药物的合成方法为首先DNA片段被硫代磷酸修饰，而后与正己胺的碳端共价结合，再与修饰的紫杉醇结合生成化合物4708SP‑1；该药物应用于治疗癌症的原发病灶和/或转移的癌症如晚期肝癌。本发明药物中的DNA片段可以不经包装直接被癌细胞摄取而很少进入正常细胞，简化了合成步骤，减少了药物对正常组织的损伤，用于治疗晚期癌症如晚期肝癌。

Description

一种治疗癌症的药物、其合成方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体地说涉及一种治疗癌症的药物、其合成方法和应用。

背景技术

在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，是一类治疗难度比较高的慢性疾病，已经成为我国城乡居民的第一位死因。

目前癌症的治疗方法有外科手术、化疗、放疗等，但都存在一定的缺陷。例如，外科手术虽然是早期癌症的最好治疗方法，但癌症的早期诊断较困难，很多患者诊断出癌症时已进入癌症的中晚期，外科手术已失效；化疗是用抑制细胞增殖的细胞毒性药物将癌细胞杀死达到治疗癌症的目的，但是一方面目前化疗药物还不全面，缺乏治疗某些癌症的化疗药物，另一方面化疗药物会影响正常细胞的增殖，对人体正常组织有很大的副作用；放疗是利用放射线如放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类x射线杀死癌细胞，对某些癌症如头颈部肿瘤效果明显，但对其他癌症的治疗效果不明显，且对人体的正常组织产生很大的副作用。

近年来人们对癌症治疗的研究逐渐转移到基因治疗上来，基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。但通常DNA不能直接被细胞摄取而需要包载蛋白或脂质体等，合成的难度较大。

紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。然而其严重的骨髓抑制，心脏，肝，肾脏及其他毒副作用严重地影响了该药物在临床上的应用，并造成病人的痛苦。本发明将一段DNA做载体连于紫杉醇成功合成新的化合物。这一技术使得紫杉醇能进入癌细胞，而限制其进入正常细胞，使紫杉醇的毒副作用明显减小。已证明其比紫衫醇有更宽的治疗窗口，其有效剂量和产生毒性的剂量明显拉大，能够在未来的临床治疗上明显减少毒副作用。有望成为理想的抗癌药物。

发明内容

本发明的目的，是要针对现有癌症治疗技术中存在的上述问题，提供一种治疗癌症的药物、其合成方法和应用，以期能够将不经包装可直接被癌细胞摄取而很少进入正常细胞的DNA片段和化疗药物紫杉醇结合生成一种新的药物，使其能直接被癌细胞靶向摄取而限制正常细胞对紫衫醇的摄取，达到治疗癌症的目的，同时不对人体正常组织造成损伤。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：

一种治疗癌症的药物，该药物主要由DNA片段和紫杉醇组成，所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CATTCTCTGATGACAAGTTCATTTTCCATAAGGATCTGTGCCAAGCTCAG-3’。

本发明还提供了上述一种治疗癌症的药物的一种合成方法，该合成方法的合成路线为：

（1）DNA片段的核苷酸序列上的某一磷酸二酯键被硫代磷酸修饰为硫代磷酸二酯键生成化合物1，化合物1与正己胺的碳端共价结合为化合物2；反应式为

（2）紫杉醇与丁二酸酐发生醇解反应生成化合物3，N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将化合物3的羧基活化生成化合物4；反应式为

（3）化合物4与化合物2的氨基共价结合生成化合物4708SP-1，反应式为

化合物4708SP-1即为所述一种治疗癌症的药物。

本发明的还提供了前述一种治疗癌症的药物的另外一种合成方法，该合成方法的合成路线为：

（1）紫杉醇与丁二酸酐发生醇解反应生成化合物3，N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将化合物3的羧基活化生成化合物4；反应式为

（2）DNA片段的核苷酸序列上的某一磷酸二酯键被硫代磷酸修饰为硫代磷酸二酯键生成化合物1，化合物1与正己胺的碳端共价结合为化合物2；反应式为

化合物4708SP-1即为所述一种治疗癌症的药物。

本发明还提供了上述的一种治疗癌症的药物的应用，它应用于治疗癌症的原发病灶或有转移的癌症，所述一种治疗癌症的药物组成中的DNA片段应用于不经包装直接将紫杉醇靶向导入癌细胞。

作为限定，所述癌症为原发性肝癌和/或晚期癌症。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：

(１)本发明药物中的DNA片段可以特异性靶向癌细胞，以该DNA片段为载体可将携带的治疗药物靶向导入癌细胞，而限制正常细胞对紫衫醇的摄取，从而减少了治疗过程中药物对正常组织的损伤；

(２)本发明药物中的DNA片段可以不经包载蛋白和脂质体等而直接被癌细胞摄取，简化了合成步骤，降低了生物毒性；

(３)本发明药物中的紫杉醇是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，是治疗晚期癌症的重要药物。紫杉醇适用于大多数癌症患者，相对于其他药物有更广泛的适用性。

总之，本发明将紫杉醇修饰连接于DNA片段，该DNA片段能直接被癌细胞靶向摄取因此可将紫杉醇靶向导入癌细胞，使得紫杉醇有效抑制癌细胞增殖并且不损伤人体正常组织，达到治疗癌症的目的，适用于治疗原发性肝癌和/或晚期癌症。

附图说明

图1为本发明实施例2中癌细胞与正常细胞摄取DNA的对比图；

图2 为化合物4708SP-1和紫杉醇对肝癌细胞的毒性对比实验结果图。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

本发明中所有原料购买于西格玛奥德里奇贸易有限公司（Sigma-Aldrich）。

实施例1　一种治疗癌症的药物（化合物4708SP-1）

本实施例为化合物4708SP-1，其主要由DNA片段和紫杉醇组成，该DNA片段可不经包装直接被癌细胞靶向摄取而很少进入正常细胞，该DNA片段含50个碱基，其核苷酸序列为：

5’-CATTCTCTGATGACAAGTTCATTTTCCATAAGGATCTGTGCCAAGCTCAG-3’

上述的核苷酸序列为人工合成的序列或筛选自人细胞基因组DNA。

本实施例中紫杉醇的化学名为5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2'R，3'S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。

本实施例的用法用量为：静脉注射，经导管动脉注射用量为100~500mg/m²。

实施2　DNA片段的筛选过程

AFP 基因在肝癌有高表达，因此本发明中的DNA片段筛选与AFP基因。其基因的不同序列经标记荧光素后检测其被癌细胞和正常细胞摄取的靶向性。具体方法如下：

实验中所用荧光原位杂交试剂盒（FISH）购自美国Mirus公司，操作方法完全按照试剂盒说明书进行。所筛选的DNA片段经PCR扩增后，由酚氯仿纯化并调整至1g/L。将荧光素Rhodamine加入该DNA片段中，37℃培养1 h；然后用G50凝胶柱纯化。将用荧光标记好的DNA片段加入细胞培养液中，37℃，培养16h，然后用PBS冲洗，并用4%福尔马林固定。再用同样方法进行DAPI双重标记，进行细胞照相（细胞照相是用Leica公司的TCS SP荧光相机）。结果如图1所示，癌细胞（Huh7，MDA-MB231）大量摄取DNA片段，照片中可见大量红色荧光标记的DNA片段与癌细胞重合；而正常细胞（THLE，HMEC）则不摄取DNA片段，照片中癌细胞内无红色荧光标记的DNA片段（无红色）；该实验结果表明所筛选的DNA有很好的靶向性。

实施例3 治疗癌症的药物（化合物4708SP-1）的合成方法

本实施例对实施例１所提供的一种治疗癌症的药物提供了两种合成方法，具体如下：

一.第一种合成方法

第一种合成方法的合成路线为：

3）化合物4与化合物2的氨基共价结合生成化合物4708SP-1，反应式为

二.第二种合成方法

第二种合成方法的合成路线为：

实施例4　化合物4708SP-1和紫杉醇对肝癌细胞的毒性对比实验

将Huh-7肝癌细胞以6×10⁴cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，37℃、5％CO₂、饱和湿度下，用完全培养基培养细胞24h后换培养液，实验组每孔加入化合物4708SP-1，终浓度分别为0 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、20 nM、40 nM，对照组每孔加入紫杉醇，浓度分别为0nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、20 nM、40 nM，在加入药物后分别继续培养24 h，48 h，72 h观察肝癌细胞生长情况。

实验结果如图1所示，化合物4708SP-1和紫杉醇均有抑制肝癌细胞增长的作用，随着化合物4708SP-1或紫杉醇加入的浓度增大，培养相同时间后肝癌细胞的数量越少，有明显的量效作用。图中Taxol为紫衫醇，Taxol-oligo为化合物4708SP-1。

实施例5　化合物4708SP-1对正常肝细胞和肝癌细胞的毒性对比实验

将Huh-7肝癌细胞、L-O2人正常肝细胞和以6×10⁴cell/mL的密度分别接种于24孔细胞培养板，37℃、5％CO₂、饱和湿度下，用完全培养基培养细胞24h后换培养液，实验组每孔加入化合物4708SP-1，对照组每孔加入紫杉醇，在加入药物后分别继续培养24 h，48 h，72 h观察肝癌细胞生长情况。

结果如表1所示，IC50表示化合物4708SP-1(Taxol-oligo)和紫衫醇Taxol的半抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度。

化合物4708SP-1（Taxol-oligo）对癌细胞的半抑制浓度为20nM，紫衫醇Taxol对癌细胞的半抑制浓度为3nM。化合物4708SP-1（Taxol-oligo）对正常细胞的半抑制浓度为160nM，紫衫醇Taxol对正常细胞的半抑制浓度为40nM。可见，化合物4708SP-1（Taxol-oligo）对癌细胞和正常细胞的半抑制浓度均远大于紫衫醇Taxol对癌细胞和正常细胞的半抑制浓度，因此其治疗有效剂量远高于产生毒副作用的剂量，在动物实验和临床上具有较大的治疗窗口，从而明显减少毒副作用。

表1 化合物4708SP-1（Taxol-oligo）和紫杉醇Taxol的半抑制浓度（IC50）

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 孔彦平

<120> 一种治疗癌症的药物、其合成方法和应用

<141> 2018-09-21

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

cattctctga tgacaagttc attttccata aggatctgtg ccaagctcag 50

Claims

1.一种治疗癌症的药物，其特征在于：它主要由DNA片段和紫杉醇组成，所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CATTCTCTGATGACAAGTTCATTTTCCATAAGGATCTGTGCCAAGCTCAG-3’；

所述治疗癌症的药物的合成方法为：

（2）紫杉醇与丁二酸酐发生醇解反应生成化合物3, N, N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将化合物3的羧基活化生成化合物4；反应式为

化合物4708SP-1即为所述的一种治疗癌症的药物。

2.如权利要求1所述的药物在制备治疗癌症的原发病灶或有转移的癌症的药物中的用途，其特征在于：所述DNA片段应用于不经包装直接将紫杉醇靶向导入癌细胞。

3.如权利要求2所述的药物在制备治疗癌症的原发病灶或有转移的癌症的药物中的用途，其特征在于：所述用途为治疗原发性肝癌。

4.如权利要求2所述的药物在制备治疗癌症的原发病灶或有转移的癌症的药物中的用途，其特征在于：所述用途为治疗晚期肝癌。