CN104717966A

CN104717966A - 用于癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物

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Publication number: CN104717966A
Application number: CN201380053346.1A
Authority: CN
Inventors: 黄炳镠; 卫凤文; 郭瑞仪; 刘思行
Original assignee: Visual Field Whole World Pty Ltd
Current assignee: Visual Field Whole World Pty Ltd
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-10-11
Also published as: AR093023A1; IL237763A; ZA201501949B; HK1206281A1; JP6113850B2; UY35082A; AP2015008315A0; WO2014059199A1; CN104717966B; SG10201607846PA; TW201414489A; CA2884521A1; US20140303085A1; CL2015000897A1; BR112015007475A2; US9056098B2; CA2884521C; PH12015500562A1; MX367562B; US20140106004A1

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有基于血红蛋白的氧载体以治疗癌症、预防癌性肿瘤的复发和转移。所述组合物可以被单独使用或与至少一种化学治疗剂组合使用，所述化学治疗剂诸如5FU、硼替佐米(Bortezomib)、多柔比星(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)或其任何组合。所述组合物中的所述基于血红蛋白的氧载体能够靶向癌细胞上表达的表面受体并且促进基于血红蛋白的氧载体和所述化学治疗剂这两者经由受体介导的机制被所述癌细胞摄取。所述基于血红蛋白的氧载体抑制诸如HIF1α、VEGF、ET1、VHL等的缺氧反应元件表达。本发明的药物组合物还可用于诱导位于癌性肿瘤的缺氧微环境中的一种类型的被称作癌症干细胞的自我更新和肿瘤起始细胞发生细胞凋亡或细胞死亡。

Description

用于癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物

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相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月12日提交的美国临时专利申请序列号61/712,853和2012年12月13日提交的美国非临时专利申请序列号13/731,013的优先权，并且这两篇专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及一种用于在人类和其它动物中进行癌症靶向治疗和预防肿瘤复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物。具体来说，本发明涉及一种包括基于血红蛋白的氧载体的组合物，所述组合物被单独施用或与至少一种化学治疗剂组合施用以治疗癌症、靶向癌细胞/癌症干细胞/含有这些细胞中的任一种的组织以及预防肿瘤复发。

背景技术

血红蛋白在大多数的脊椎动物中对血管系统与组织之间的气体交换发挥了重要的作用。它负责经由血液循环将来自呼吸系统的氧运送到达体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳运送离开体细胞到达呼吸系统，在所述呼吸系统中将二氧化碳呼出。由于血红蛋白具有这种转运氧的特征，因此如果可以在离体使它稳定并且用于体内，那么它可以被用作强效的供氧剂。

天然存在的血红蛋白是一种四聚体，一般在存在于血红细胞内时保持稳定。然而，当从血红细胞中取出天然存在的血红蛋白时，它在血浆中变得不稳定并且分裂成两个α-β二聚体。这些二聚体中的每一个的分子量均是约32kDa。这些二聚体在被肾脏滤过并且被排泄时可能会引起显著的肾脏损伤。四聚体键的断裂还会负面地影响循环中功能性血红蛋白的可持续性。

为了解决所述问题，在血红蛋白处理方面的最新发展已结合各种交联技术以在四聚体内形成分子内键以及在四聚体之间形成分子间键而形成聚合血红蛋白。

缺氧在癌症中是常见的。缺氧可以通过使肿瘤细胞丧失氧而产生电离辐射和化学疗法抗性(氧对这些药剂的细胞毒性活性来说是必要的)。缺氧还可能经由包括蛋白质组和基因组的变化在内的一种或多种间接的机制来降低肿瘤对放射疗法和化学疗法的敏感性。因此，需要改进的癌症治疗组合物，特别是提高细胞毒性剂的功效的改进的癌症治疗组合物。

虽然肿瘤转移导致约90％的癌症死亡，但允许癌细胞从身体一部分扩散到另一部分的确切机制尚未得到充分了解。因此，预防癌症复发的改进的癌症治疗组合物是重要的。

多项最新的研究已证实癌症干细胞(CSC)在癌症和肿瘤发展中起重要作用。Wang和Dick(2005)通过早先提出的随机模型和癌症干细胞模型重新探究了肿瘤中存在的白血病干细胞的自我更新和肿瘤细胞增殖潜能。根据随机模型，一般存在一类在功能上均质的肿瘤细胞，并且遗传变化可能会导致所有这些肿瘤细胞向恶性肿瘤进展。相比之下，癌症干细胞模型提出，一群具有持续引发肿瘤生长的独特能力并且能够再生功能上异质的细胞类别的层次的稀有细胞可能具有与肿瘤中的大部分细胞相比不同的致瘤通路。在癌症干细胞模型中所提出的肿瘤起始细胞可以逐步地被鉴定和从其余细胞中纯化。这些细胞被称作癌症干细胞(CSC)。如同白血病干细胞，诸如乳腺癌之类的其它癌症似乎也受这群稀有的肿瘤起始细胞的驱动。已在乳腺癌中鉴定出两种细胞表型，其中一种占少数的表型能够形成乳腺肿瘤，而另一种表型则不能。在脑癌中，发现两种类型的细胞：CD133⁺细胞在体内具有分化、自我更新以及肿瘤起始能力，而CD133^-细胞不能。已发现越来越多的证据证明这些癌症干细胞可能处在所有肿瘤系统的顶点，并且因此成为癌症治疗的新靶标。一篇综述文章(Mohyeldin等,2010)表明癌症干细胞微环境(stem cell niche)具有低得多的氧张力。缺氧微环境被发现位于远离肿瘤脉管系统处并且含有以不同的HIF(缺氧诱导因子)诱导模式、特别是HIF-2α差异地响应于缺氧的癌症干细胞。它成为调节癌症干细胞自我更新、增殖以及存活的信号转导通路中的新靶标，并且对这些信号转导通路进行抑制将会削弱它们的肿瘤起始潜能。

因此，在本领域中需要能够在癌症干细胞中提供高氧张力的组合物。这种组合物可以用于产生氧化应激或冲击，所述氧化应激或冲击引起癌症干细胞的DNA损伤和随后的DNA损伤诱导的癌症干细胞凋亡。

发明内容

本发明涉及一种用于在人类和其它动物中进行癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物。本发明的第一个方面在于提供一种基于血红蛋白的氧载体，所述氧载体被配置成靶向癌细胞、癌症干细胞(CSC)和/或癌症祖细胞、和/或人体或动物体内含有这些细胞中的任一种的组织，从而触发受体介导的机制并且引导组合的化学治疗剂共同定位于所述癌细胞、CSC的细胞质和/或含有这些细胞中的任一种的组织中，以提高基于血红蛋白的氧载体和所述化学治疗剂这两者的功效。还发现所述定位的基于血红蛋白的氧载体会使所述癌细胞和CSC增敏，从而使得所述癌细胞和CSC对所述化学治疗剂变得更加敏感。本发明的第二个方面在于提供一种使用本发明的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物治疗癌症和预防癌症复发的方法，所述方法是通过向有需要的患有各种肿瘤、癌症或与肿瘤或癌症相关的疾病的受试者施用所述组合物来实现的。

本发明中所用的所述基于血红蛋白的氧载体可以是热稳定的交联四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白、聚乙二醇化血红蛋白或重组/修饰的血红蛋白，所述氧载体与至少一种化学治疗剂组合使用以治疗各种癌症，如白血病、头部和颈部癌症、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌以及脑癌。还发现所述基于血红蛋白的氧载体本身具有经由改善肿瘤在缺氧条件下的氧合破坏癌细胞的能力，从而提高对放射和化学治疗剂的敏感性。

此外，本发明的基于血红蛋白的氧载体也可以被单独使用以减少癌性肿瘤复发以及使肿瘤细胞的转移减到最低程度。所述血红蛋白在因肿瘤切除手术而引起的缺血之前以及在肿瘤切除后重新建立血液供应(再灌注)期间施用。所述基于血红蛋白的氧载体还可以被用于提高癌组织的氧合作用，然后与化学治疗剂一起随后减小肿瘤的尺寸。因此，本发明的含有基于血红蛋白的氧载体的组合物可以单独施用或与至少一种化学治疗剂组合施用以治疗癌性肿瘤或预防癌性肿瘤复发。

本发明的方法还包括使用不同的化学治疗药物和/或放射疗法与本发明的基于血红蛋白的氧载体的组合以对癌症治疗和预防肿瘤复发提供协同作用。

本发明的第三个方面涉及本发明的组合物，所述组合物向肿瘤提供氧化应激或冲击以杀死一群稀有的被称为癌症干细胞的自我更新和肿瘤起始细胞。用于向肿瘤提供高氧张力的本发明的组合物包含基于血红蛋白的氧载体，所述氧载体包括交联的四聚体血红蛋白、或聚合的血红蛋白，其中它们这两者均被制备成含有不可检出量的二聚体和低百分比的高铁血红蛋白。所述组合物中的所述基于血红蛋白的氧载体被配置用于穿透到肿瘤的癌组织中，在所述肿瘤中，发现所述癌症干细胞在所述肿瘤内选择性增殖。所述基于血红蛋白的氧载体可以被单独使用或与包括硼替佐米、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星、顺铂或其任何组合在内的至少一种化学治疗剂组合使用以使肿瘤进行氧合以及向所述癌症干细胞提供氧化应激或冲击，以诱导所述癌症干细胞发生细胞凋亡或死亡，这产生治疗癌症或癌性肿瘤和防止癌症或癌性肿瘤复发的作用。本发明的基于血红蛋白的氧载体还经过修饰以避免解离成二聚体，以使得它在循环中变得更稳定并且具有更长的半衰期。不同于天然存在的血红蛋白，这种更长的半衰期特性促进其穿透到包括癌细胞、癌症干细胞这两者和/或癌症祖细胞在内的靶细胞中。类似于对癌细胞的作用，本发明的组合物中的所述基于血红蛋白的氧载体也使癌症干细胞对化学治疗剂或放射疗法增敏。换句话说，本发明的组合物是一种有效的辅助疗法，可以在化学疗法和/或放射疗法之前或与化学疗法和/或放射疗法组合施用。在本文所述的本发明的任何方面，所述基于血红蛋白的氧载体可以在手术切除癌组织或肿瘤之前、期间或之后以9.5g/dL-10.5g/dL的浓度向有需要的受试者施用以实现以下目的：靶向癌组织或肿瘤中的细胞、触发受体介导的机制、穿透并且定位到癌组织或肿瘤细胞中、诱导癌组织或肿瘤细胞发生细胞凋亡、使细胞对并行或随后施用的化学治疗剂或放射疗法增敏。

附图说明

图1是一组处在相同的放大倍数的显微图像，这些图像示出了(A)荧光标记的热稳定的基于血红蛋白的氧载体和(B)荧光标记的聚合血红蛋白被摄取到肝癌细胞内。

图2是两组处在相同的放大倍数的显微图像，这些图像示出了荧光标记的热稳定的基于血红蛋白的氧载体经由网格蛋白(Clathrin)介导的通路(上图)，而不经由小窝蛋白(Caveolin)-1介导的通路(下图)被摄取到肝癌细胞内。

图3示出了在用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞中不同蛋白质的表达。

图4示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞(HepG2和Huh7)中缺氧诱导因子1(HIF1α)基因的表达。

图5示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞(HepG2和Huh7)中血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达。

图6示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞(HepG2和Huh7)中内皮素-1(ET1)基因的表达。

图7示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞(HepG2和Huh7)中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。

图8示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞(HepG2和Huh7)中希佩尔-林道蛋白(von Hippel-Lindau，VHL)基因的表达。

图9示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞中热休克蛋白90(HSP90)基因的表达。

图10是图示了所提出的牵涉到热稳定的基于血红蛋白的氧载体对肿瘤复发的抑制作用中的机制和信号转导级联的示意图。

图11示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞中热休克蛋白7C(HSP7C)基因的表达。

图12示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞中高迁移率族蛋白3(high-mobility group box 3，HMGB3)基因的表达。

图13示出了在常氧条件下相比于在缺氧条件下用不同浓度的热稳定的基于血红蛋白的氧载体处理之后肝癌细胞中复制因子1C(RFC1)基因的表达。

图14示出了正常组织中的氧合作用的改善。注射0.2g/kg具有热稳定性的四聚体血红蛋白溶液使得(A)血浆血红蛋白浓度和(B)向肌肉的氧输送显著增加。

图15示出了缺氧性肿瘤组织中的氧合作用的改善。注射0.2g/kg热稳定的四聚体血红蛋白溶液使得向头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物的氧输送显著增加。

图16示出了(A)鼻咽癌(NPC)和(B)肝肿瘤的啮齿动物模型中的部分肿瘤缩小。

图17示出了汇总了在肝脏切除术期间手术和血红蛋白产品施用程序的示意图。

图18示出了在肝切除术和缺血/再灌注程序后在IR损伤组的大鼠中所诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移以及使用本发明的热稳定的四聚体血红蛋白针对它的保护作用的代表性实例。

图19示出了在肝脏切除术和IR损伤程序后的四周时对实验组和对照组进行的组织学检查。

图20A示出了在肝切除术和IR程序后IR损伤组(对照组)的大鼠以及接受本发明的热稳定的四聚体血红蛋白处理的大鼠(Hb治疗组)中所发现的复发的肝脏肿瘤的体积(cm³)。

图20B示出了在肝切除术和IR程序后IR损伤大鼠(对照组)以及接受本发明的热稳定的四聚体血红蛋白处理的大鼠(Hb组)的肝脏复发率(左侧)和平均复发肿瘤尺寸(右侧)。

图21示出了在肝切除术和缺血/再灌注程序后IR损伤组的大鼠(对照组：C10和C13)以及接受本发明的热稳定的四聚体血红蛋白处理的大鼠(Hb治疗组：Y9、Y10以及Y11)中所诱导的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移的代表性实例。

图22示出了从首次施用本发明血红蛋白产品或RA缓冲液(对照组)起在整个肝脏手术和再灌注期间的肝脏氧分压(mmHg)的代表性实例。

图23示出了在肝脏手术后28天时接受本发明血红蛋白产品处理或未接受本发明血红蛋白产品处理的情况下大鼠的外周血液中循环内皮祖细胞(EPC)的水平之间的比较。

图24示出了热稳定的基于血红蛋白的氧载体在鼻咽癌异种移植物内的时间定位。

图25示出了在Hep-2喉癌模型中基于血红蛋白的氧载体单独或基于血红蛋白的氧载体与放射的组合的肿瘤生长抑制作用；下图示出了从不同的治疗组获得的肿瘤异种移植物的代表性图像。相比于对照组，*p<0.05，**p<0.01。

图26示出了在C666-1鼻咽癌模型中基于血红蛋白的氧载体与放射的组合的肿瘤生长抑制作用；下图示出了从不同的治疗组获得的肿瘤异种移植物的代表性图像。相比于对照组，**p<0.01，相比于对照，#p<0.05单独的放射治疗组。

图27示出了基于血红蛋白的氧载体在脑癌细胞中提高替莫唑胺(temozolomide，TMZ)诱导的细胞毒性。

图28是示出了癌症干细胞形成的乳腺球(mammosphere)的形态变化的显微图像：(A)第0天、(B)第3天、(C)第6天、(D)第9天-第20天、(E)对照组(来自乳腺上皮细胞的中空乳腺球)。

图29是示出了从不同代收集的未分选的乳腺球和分选过的MCF7CD44⁺/CD24^-细胞中不同的标志物Oct-4和Sox-2的表达水平的蛋白质印迹。

图30是不同代的MCF7细胞关于醛脱氢酶(ALDH)活性的点图：(A)对照组(与二乙氨基苯甲醛(DEAB)一起孵育的分选过的MCF7细胞)；(B)处于第0代的分选过的MCF7细胞；(C)处于第3代的分选过的MCF7细胞；(D)处于第5代的分选过的MCF7细胞。

图31是在流式细胞术分析中处于缺氧条件下并且以CD24(PE-A)和CD44(APC-A)抗体标记的MCF7细胞的点图。象限1(Q1)是CD44^高并且CD24^低的细胞。

图32是示出了在与DMSO(对照组)和90nM紫杉醇(Taxol)处理一起孵育16小时和4天后未分选的和CD24/CD44分选过的MCF7细胞的形态变化的显微图像。

定义

术语“癌症干细胞”指的是赘生性克隆内能够在体内引发并且维持肿瘤生长的生物学上独特的细胞(即癌症起始细胞)。

本文所用的“Hb”指的是交联的四聚体血红蛋白，所述血红蛋白是热稳定的且含有不可检出量的二聚体和低百分比的高铁血红蛋白。所述热稳定的交联四聚体血红蛋白具有60kDa-70kDa的分子量，所述血红蛋白在合成期间经过热处理并且添加有0.05％-0.4％的N-乙酰半胱氨酸。所产生的热稳定的交联四聚体血红蛋白具有不可检出量的二聚体和少于5％的高铁血红蛋白。热稳定的交联四聚体血红蛋白还不含血管收缩性杂质和蛋白质杂质、无热原、无内毒素、无磷脂并且无基质。四聚体血红蛋白分子内的交联可以在α/α亚基、α/β亚基或α-β亚基之间。

本文所定义的“修饰的血红蛋白”或“重组血红蛋白”指的是与至少一种化合物以化学方式缀合或经过至少一种化合物表面修饰的任何天然的血红蛋白或纯化的血红蛋白。所述化合物可以包括聚(乙)二醇(PEG)。本发明中所使用的修饰的血红蛋白的一个实例是聚乙二醇化的血红蛋白。

具体实施方式

血红蛋白是哺乳动物和其它动物血液的血红细胞中的一种含铁的氧转运蛋白。血红蛋白表现出蛋白质的三级结构和四级结构这两者的特征。血红蛋白中大部分的氨基酸形成由短的非螺旋状的链段连接的α螺旋。氢键使血红蛋白内部的螺旋段稳定，从而在其分子内产生吸引力而使每一条多肽链均折叠成特定的形状。血红蛋白分子是由四个球状蛋白亚基组装而成。每一个亚基由被排列成一组α-螺旋结构链段的多肽链构成，这些链段以“肌红蛋白折叠”排列方式与包埋的血红素基团连接。

血红素基团由被包含在被称为卟啉的杂环中的铁原子组成。该铁原子同样地与处在环中心的处于一个平面内的所有四个氮原子结合。然后，氧能够和与卟啉环的平面垂直的铁中心结合。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。

在成人中，最常见类型的血红蛋白是被称作血红蛋白A的四聚体，由非共价结合的两个α亚基和两个β亚基(被命名为α2β2的)组成，这些亚基各自分别由141个氨基酸残基和146个氨基酸残基构成。α亚基和β亚基的尺寸和结构彼此非常相似。每个亚基具有约16kDa的分子量，四聚体的总分子量是约65kDa。四条多肽链是通过盐桥、氢键以及疏水性相互作用而彼此结合。牛血红蛋白的结构类似于人血红蛋白(α链具有90.14％同一性；β链具有84.35％同一性)。区别在于牛血红蛋白中的两个巯基位于βCys 93处，而人血红蛋白中的巯基分别位于αCys 104、βCys 93以及βCys 112处。

在血红细胞内部天然存在的血红蛋白中，α链与它的相应β链的缔合是非常强的并且在生理条件下不会解离。然而，在血红细胞外部一个αβ二聚体与另一个αβ二聚体的缔合是相当弱的。该键有分裂成两个αβ二聚体的倾向，这两个αβ二聚体中的每一个均是约32kDa。这些不合需要的二聚体是小到足以被肾脏滤过并且被排泄，结果导致潜在的肾脏损伤以及血管内停留时间显著缩短。因此，稳定化的交联四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白和/或重组/修饰的血红蛋白是用于氧输送的药物组合物中的重要分子。血红蛋白的来源可以来自于但不限于人、牛、猪、马以及犬科动物的全血。

本发明的药物组合物含有热稳定的基于血红蛋白的氧载体，所述氧载体被配置成与肿瘤细胞上的受体连接以促进优先于正常的非缺氧性健康组织选择性靶向缺氧性肿瘤细胞并且可以被用于治疗癌症，这是因为它可以优先地被摄取到癌细胞中。在图1A中，使用活细胞成像以显示出热稳定的四聚体血红蛋白(Hb)如何具有对抗肝癌的功效。通过在室温下在使用N₂吹扫的封闭系统中使Hb与异硫氰酸荧光素(FITC)(用pH 9.3的NaHCO₃缓冲)之间进行缀合1小时来制备荧光缀合的Hb。使用蛋白质纯化柱(密理博公司(Millipore))进行后续的纯化以去除未缀合的Hb和游离的FITC。立即使用新鲜缀合的Hb-FITC探针来进行活细胞摄取研究。在进行活细胞采集之前，使肝癌细胞HepG2以及转移性肝癌细胞Huh7暴露于0.0125g/dL的Hb-FITC，持续15分钟。观测到在暴露15分钟后，Hb-FITC被摄取到这两种类型的肝癌细胞中(图1A)。在暴露1小时后，对Hb-FITC的摄取达到峰值(图1A)。在缺氧条件下，观测到单层肝癌细胞向上卷成三维结构，并且检测到与正常细胞相比，Hb-FITC更优先地被这些癌细胞所摄取。在图1B中示出了聚合的血红蛋白被摄取到肝癌细胞中。

细胞摄取血红蛋白分子的能力是经由蛋白质衣被囊泡内吞作用来实现的。可以被内化的两种常见的蛋白质衣被是网格蛋白和小窝蛋白1。构建红色荧光蛋白标记的网格蛋白(RFP-网格蛋白)和小窝蛋白1(mCherry-小窝蛋白1)质粒，并且使这些质粒独立地表达于摄取有缀合FITC的Hb的HepG2或Huh7细胞中。延时成像研究(图2)揭示Hb-FITC与RFP-网格蛋白共定位，但不与mCherry-小窝蛋白1共定位，这表明血红蛋白分子经由网格蛋白介导的内吞作用进入肝癌细胞中。

本发明通过在两种肝癌模型即HepG2和Huh7中，并且在常氧条件和缺氧条件这两种条件下研究各种药物的IC₅₀证实了血红蛋白单独以及与辅助疗法一起在非转移性的肝癌细胞和转移性的肝癌细胞中的功效(结果示于表1中)。在常氧条件下，在HepG2细胞中顺铂、多柔比星、硼替佐米以及5-氟尿嘧啶(5FU)的IC₅₀分别是130μM、10μM、0.5μM以及4mM，并且在Huh7细胞中顺铂、多柔比星、硼替佐米以及5FU的IC₅₀分别是70μM、5μM、55μM以及3.5mM。在缺氧条件下，在HepG2细胞中顺铂、多柔比星、硼替佐米以及5FU的IC₅₀分别是170μM、30μM、0.7μM以及4mM，并且在Huh7细胞中顺铂、多柔比星、硼替佐米以及5FU的IC₅₀分别是100μM、6μM、60μM以及4mM。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定结果表明在常氧条件下，与在常氧条件下的HepG2细胞相比，Huh7细胞对顺铂和多柔比星更敏感，但对硼替佐米的抗性是HepG2细胞的110倍(硼替佐米是一种针对蛋白酶体亚基PSMB1、PSMB5以及PSMB6的靶向药物)。与在缺氧条件下的HepG2细胞相比，在缺氧条件下的Huh7细胞变得对顺铂和多柔比星更敏感，并且对硼替佐米同样具有高度的抗性(86倍)。这些结果揭示不管是在常氧条件下或是在缺氧条件下，转移性肝癌细胞(Huh7)对硼替佐米的抗性一般都大于非转移性肝癌细胞(HepG2)。

表1

MTT结果还揭示Hb单独将不会引起任何细胞死亡。然而，在将5FU和硼替佐米以它们对应的IC₅₀连同0.2g/dL的Hb一起施用时，观测到对5FU和硼替佐米的显著的化学增敏。在常氧条件下，在经过5FU和Hb处理的HepG2细胞中检测到增加了33％(总共83％)的细胞死亡，而在经过硼替佐米和Hb处理的Huh7细胞中观测到增加了20％(总共50％)的细胞死亡。在缺氧条件下，在经过硼替佐米和Hb处理的HepG2细胞中检测到增加了42％(总共92％)的细胞死亡，而在经过5FU和Hb处理的HepG2细胞中观测到细胞死亡增加了35％(总共85％)。在相同的缺氧条件下，在经过5FU和Hb处理的Huh7细胞中观测到增加了20％(总共72％)的细胞死亡。5FU是一种抑制胸苷酸合酶的嘧啶类似物。硼替佐米是最初被用于治疗骨髓瘤患者的第一种治疗性蛋白酶体抑制剂。据报道，它会引起肝癌细胞发生细胞凋亡(Koschny等,Hepatology,2007)。综上所述，观测到血红蛋白分子与5FU和硼替佐米对非转移性癌症和转移性癌症这两者均具有显著的协同作用。

缺氧是肿瘤的一种常见的生理特征。肿瘤内缺氧在肝癌中也是常见的。已知缺氧条件会激活信号转导级联，所述信号转导级联引起缺氧诱导因子1(HIF1α)转录因子的稳定化以及具有缺氧反应元件(HRE)的HIF1α效应基因(超过60种基因)的激活。这些HIF1α下游效应子牵涉到细胞的存活、适应、无氧代谢、免疫反应、细胞因子的产生、血管形成以及一般组织稳态。

在图3中，证实Hb影响HepG2和转移性Huh7肝癌模型中的HIF1α蛋白质表达。Hb在常氧和缺氧这两种情况下均使HIF1α下调，这表明单独由Hb使HIF1α减少(与未处理的对照组相比，减少40％)使得HIF1α与它的下游效应子的结合受到影响并且对这些效应基因产生转录抑制作用。在使用Hb处理后，在HIF1α的上游调节因子(图4)、热休克蛋白90(HSP90)(图9)以及希佩尔-林道蛋白(VHL)(图8)中可以检测到类似的下调模式。

在用Hb和5FU(95％抑制)或Hb和硼替佐米(80％抑制)对肝癌细胞进行处理时，检测到HIF1α的转录物水平和蛋白质水平这两者显著减少，所述转录物水平和蛋白质水平由对应的定量qPCR和蛋白质印迹研究来例证。这些数据表明Hb单独、Hb与5FU或硼替佐米的组合处理可以消除缺氧诱导的HIF1αmRNA和蛋白质稳定化。因此，在Huh7细胞中观测到血管内皮生长因子(VEGF)(图5)和内皮素-1(ET1)(图6)表达的下调，这表明Hb和5FU或Hb和硼替佐米的组合可以抑制肝转移模型中的血管生成和血管张力，其中对血管生成的抑制作用在本质上与转移的产生相关。已观测到这些组合处理在Huh7中减少诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达(图7)，这表明在肝转移模型中脉管系统和血管生成的程度也可能受到损害。总之，我们的研究结果表明将Hb与5FU或硼替佐米一起组合施用可以通过抑制HIF1α来协同地抑制VEGF、ET1以及iNOS表达的缺氧诱导。所提出的牵涉到Hb对肿瘤复发和它的信号转导级联的抑制作用的机制图示于图10中。供氧、含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白质(PDH)、HIF以及内皮祖细胞(EPC)的关系被明确地示出。

包含被配置成靶向DNA损伤感受细胞调节器的基于血红蛋白的氧载体的药物组合物还被发现通过新颖的调节通路来起作用。在本发明中，作为DNA损伤感受器的固有部分的蛋白质中的两种，即复制因子1C(RFC1)(图13)和HSP7C(热休克蛋白7C)(图11)在经过Hb处理的肝癌细胞中上调，并且在与硼替佐米一起组合处理的情况下显著上调(RFC1上调至3-10倍，并且HSP7C上调至25-45倍)。这些新颖的Hb靶蛋白表明Hb是一种潜在的活性氧簇(ROS)诱导物，并且它对于转移性肝癌细胞Huh7感受并且响应于ROS介导的DNA损伤来说显然是重要的。DNA损伤反应蛋白在与Hb和硼替佐米的反应中的显著上调可以引起后续的氧化应激诱导的细胞凋亡。

对于在癌症治疗中的使用，本发明的含有氧载体的药物组合物用作组织氧合剂以改善肿瘤组织中的氧合作用，从而提高化学敏感性和放射敏感性。

此外，热稳定的四聚体血红蛋白改善正常组织(图14)和极度缺氧的肿瘤(图15)中的氧合作用的能力在本发明中被证实。通过光纤氧传感器(Oxford Optronix有限公司)联同微定位系统(DTI有限公司)直接监测肿瘤块内的氧分压(pO₂)。在静脉内注射0.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白后，中值pO₂值在15分钟内从基线上升到相对平均氧分压的约两倍并且持续至6小时。此外，在输注后的24小时至48小时的平均氧水平仍维持高于基线值25％至30％的水平。没有市售产品或现有技术显示出与在本发明中所制备的含有氧载体的药物组合物的同样高的功效。

对于肿瘤组织的氧合作用，人头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物(FaDu)的代表性氧曲线示于图15中。在静脉内注射0.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白后，在3小时和6小时时分别观测到平均pO₂显著增加了超过6.5倍和5倍(图15)。

对于在癌症治疗中的应用，本发明的含有氧载体的药物组合物用作组织氧合剂以改善肿瘤组织中的氧合作用，从而提高化学敏感性和放射敏感性。在将X射线照射联同热稳定的四聚体血红蛋白一起使用的情况下，肿瘤生长延迟。在图16A中，代表性的曲线示出了在啮齿动物鼻咽癌模型中肿瘤显著缩小。使用单独的X射线(2Gy)或与热稳定的四聚体血红蛋白的组合(2Gy+Hb)对带有CNE2异种移植物的裸小鼠进行处理。在X射线照射之前的约3至6小时将1.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白静脉内注射到小鼠体内，并且引起鼻咽癌异种移植物的部分缩小。

在一个实施方案中，在注射该组合物联同化学治疗剂之后，观测到显著的肝脏肿瘤缩小。在图16B中，代表性的图表示出了在大鼠原位肝癌模型中肿瘤显著缩小。用单独的3mg/kg顺铂或与0.4g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白的组合(顺铂+Hb)对带有肝脏肿瘤原位移植物(CRL1601细胞系)的布法罗大鼠(Buffalo rat)进行处理。在注射顺铂之前施用热稳定的四聚体血红蛋白引起肝脏肿瘤的部分缩小。

实施例

提供以下实施例以描述本发明的具体实施方案而不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

用于肝癌细胞系的培养和试剂

使用HepG2和Huh7细胞系。在37℃将这些细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素(penicillin)以及100μg/ml的链霉素(streptomycin)的DMEM(英杰公司(Invitrogen))中。对于常氧条件，将细胞与环境O₂浓度和5％的CO₂一起孵育；对于缺氧条件，将细胞与0.1％-0.5％的O₂(Quorum FC-7自动CO₂/O₂/N₂气体混合器)和5％的CO₂一起孵育。

实施例2

活细胞延时显微镜法

将HepG2或Huh7细胞接种到玻璃底微孔培养皿(MatTek公司)上。使用Zeiss Observer.Z1广角显微镜以限定的缩放(63×、20×)采集活细胞，所述显微镜装备有大气压/温度受控的腔室和用于多位置采集的机动台。在使用0.1％O₂和5％CO₂(预混合)吹扫的封闭的活细胞成像系统中进行孵育。使转染有pcDNA3、pRFP-小窝蛋白1或pRFP-网格蛋白的细胞暴露于HB-FITC，持续15分钟，之后进行图像采集，每3分钟一次，持续2小时的时间段。使用MetaMorph软件(美谷分子仪器公司(Molecular Device))使图像解卷积并且压缩成延时影片。

实施例3

细胞毒性测定

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)增殖测定来测量细胞活力。简单地说，将HepG2或Huh7细胞接种于96孔平底微量培养板(6000个细胞/孔)中并且在100μL的生长培养基中在37℃和5％CO₂下培养24小时。然后将每孔中的细胞培养基更换成100μL不含药物的细胞生长培养基、单独含有Hb的细胞生长培养基或含有Hb连同另外的IC₅₀浓度的化学治疗剂的细胞生长培养基。将Hb孵育24小时，将20μL的MTT标记试剂(5mg/mL的PBS溶液)添加至每孔中，在37℃下再持续4小时。轻轻地去除生长培养基，然后将200μL的DMSO作为增溶剂添加到每个孔中以将甲臜晶体完全溶解。通过Multiskan EX(热电公司(Thermo Electron Corporation))测量570nm波长下的吸光度，并且每个数据点表示三个重复孔的平均值±SD。

实施例4

RNA分离和定量实时PCR

使用Trizol试剂(英杰公司)分离总RNA并且使用寡核苷酸-dT引物和Superscript II逆转录酶(英杰公司)对5μg的总RNA进行逆转录。使用第一链cDNA的十分之一，通过SYBR绿色PCR预混液试剂盒(SYBR GreenPCR Master Mix kit，应用生物系统公司(Applied Biosystems))以特异性引物(下文所示)对HIF1α、VHL、HSP90、VEGF、iNOS、ET1、HSP7c、RFC1、HMGB3以及GAPDH的转录物水平进行定量测量。在延伸步骤期间，通过7900HT快速实时PCR系统(应用生物系统公司)对荧光信号进行实时测量。阈值循环(Ct)被定义为在荧光信号达到基线的标准偏差的10倍时所经历的循环分数(从第2次循环至第10次循环)。通过2^-ΔΔCt法确定靶基因相对于GAPDH对照基因的比率变化。

HIF1α：

SEQ NO.1：正向引物：5-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3(420-440)

SEQ NO.2：反向引物：5-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3(21-44)

SEQ NO.3：正向引物：CAGAGCAGGAAAAGGAGTCA(2414-2433)

SEQ NO.4：反向引物：AGTAGCTGCATGATCGTCTG(2645-2625)

SEQ NO.5：正向引物：5'-AATGGAATGGAGCAAAAGACAATT-3'(2694-2720)

SEQ NO.6：反向引物：5'-ATTGATTGCCCCAGCAGTCTAC-3'(2764-2743)

VEGF：

SEQ NO.7：正向引物：GCTACTGCCATCCAATCGAG(1187-1206)

SEQ NO.8：反向引物：CTCTCCTATGTGCTGGCCTT(1395-1376)

SEQ NO.9：正向引物：5'-CTCTCTCCCTCATCGGTGACA-3'(3146-3167)

SEQ NO.10：反向引物：5'-GGAGGGCAGAGCTGAGTGTTAG-3'(3202-3223)

SEQ NO.11：正向引物：ACTGCCATCCAATCGAGACC(1190-1209)

SEQ NO.12：反向引物：GATGGCTGAAGATGTACTCGATCT(1265-1241)

INOS：

SEQ NO.13：正向引物：5'-ACAACAAATTCAGGTACGCTGTG-3'(2111-2137)

SEQ NO.14：反向引物：5'-TCTGATCAATGTCATGAGCAAAGG-3(2194-2171)

SEQ NO.15：正向引物：GTTCTCAAGGCACAGGTCTC(121-140)

SEQ NO.16：反向引物：GCAGGTCACTTATGTCACTTATC(225-247)

ET1：

SEQ NO.17：正向引物：TGCCAAGCAGGAAAAGAACT(701-720)

SEQ NO.18：反向引物：TTTGACGCTGTTTCTCATGG(895-876)

HSP90：

SEQ NO.19：正向引物：TTCAGACAGAGCCAAGGTGC(640-659)

SEQ NO.20：反向引物：CAATGACATCAACTGGGCAAT(807-787)

SEQ NO.21：正向引物：GGCAGTCAAGCACTTTTCTGTAG(1032-1054)

SEQ NO.22：反向引物：GTCAACCACACCACGGATAAA(1230-1210)

VHL：

SEQ NO.23：正向引物：ATTAGCATGGCGGCACACAT(2806-2825)

SEQ NO.24：反向引物：TGGAGTGCAGTGGCATACTCAT(2921-2900)

实施例5

蛋白质印迹分析

收获细胞并且测定蛋白质浓度。将蛋白质(30μg)在10％SDS-PAGE上分离，转移到硝化纤维素膜(PVDF，伯乐公司(BioRad))上。使用肌动蛋白作为上样对照。通过凝胶成像系统(gel documentation system，紫外线产品有限公司(Ultra-Violet Product Ltd))对相对蛋白质表达水平进行定量。

实施例6

氧合作用的改善

(6a)正常组织中的氧合作用的改善

进行了一些关于热稳定的四聚体血红蛋白对正常组织的氧合作用的研究(示于图14中)。在布法罗大鼠中进行比较药物代谢动力学和药效动力学研究。对雄性近交系布法罗大鼠每只使用0.2g/kg热稳定的四聚体血红蛋白溶液或林格氏乙酸盐缓冲液(ringer's acetate buffer)(对照组)。在1小时、6小时、24小时、48小时之时通过Hemocue^TM光度计对血浆血红蛋白的浓度-时间曲线进行测定并且与基线读数相比较。这些方法是基于对血红蛋白进行的光度测量，其中血红蛋白的浓度直接以g/dL读出。在布法罗大鼠的后肢肌肉中通过Oxylab^TM组织氧合和温度监测器(Oxford Optronix有限公司)直接测量氧分压(pO₂)。通过腹膜内注射30-50mg/kg的戊巴比妥(pentobarbitone)溶液使大鼠麻醉，继而将氧传感器插入到肌肉中。通过Datatrax2数据采集系统(世界精密仪器公司(World Precision Instrument))以实时方式记录所有pO₂读数。结果证实在静脉内注射0.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白之后，平均pO₂值在15分钟内从基线上升到相对平均氧分压的约两倍并且持续6小时。此外，在注射后的24小时至48小时，平均氧水平仍维持在高于基线值的25％至30％的水平(图14B)。

(6b)极度缺氧的肿瘤区域中的氧合作用的显著改善

通过人头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植模型对极度缺氧的肿瘤区域中氧合作用的改善进行评价。下咽鳞状细胞癌(FaDu细胞系)是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的。将约1×10⁶个癌细胞皮下注射到四至六周大的近交系BALB/c AnN-nu(裸)小鼠体内。当肿瘤异种移植物达到8-10mm的直径时，通过Oxylab^TM组织氧合和温度监测器(Oxford Optronix有限公司)直接监测肿瘤块内的氧分压(pO₂)。通过Datatrax2数据采集系统(世界精密仪器公司)以实时方式记录所有pO₂读数。当使pO₂读数稳定时，经由小鼠的尾静脉以静脉内方式注射0.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白溶液并且对组织氧合作用进行测量。结果证实在静脉内注射0.2g/kg的所述热稳定的四聚体血红蛋白之后，在3小时和6小时内分别观测到平均pO₂显著增加了超过6.5倍和5倍(图15)。

实施例7

癌症治疗研究：在鼻咽癌中肿瘤显著缩小

在施用热稳定的四聚体血红蛋白溶液与X射线照射的组合之后观测到肿瘤显著缩小(图16A)。使用人鼻咽癌异种移植模型。将约1×10⁶个癌细胞(CNE2细胞系)皮下注射到四至六周大的近交系BALB/c AnN-nu(裸)小鼠体内。当肿瘤异种移植物达到8-10mm的直径时，将荷瘤小鼠随机分到如下三个组中：

组1：林格氏乙酸盐缓冲液(对照组)

组2：林格氏乙酸盐缓冲液+X射线照射(2Gy)

组3：热稳定的四聚体血红蛋白+X射线照射(2Gy+Hb)

使用单独的X射线照射(组2)或与热稳定的四聚体血红蛋白的组合(组3)对带有CNE2异种移植物的裸小鼠进行照射。为了进行X射线照射(组2和组3)，通过腹膜内注射50mg/kg戊巴比妥溶液使小鼠麻醉。通过线性加速器系统(瓦里安医疗系统公司(Varian Medical Systems))向荷瘤小鼠的异种移植物递送2戈瑞的X射线。对于组3，在X射线处理之前经由尾静脉将1.2g/kg热稳定的四聚体血红蛋白静脉内注射到小鼠体内。从处理的第一天开始，每隔一天对肿瘤的尺寸和重量进行记录。使用公式1/2×LW²计算肿瘤重量，其中L和W表示在每次测量时通过数显卡尺(日本东京的三丰公司(Mitutoyo Co,Tokyo,Japan))所测量的肿瘤块的长度和宽度。组1是无处理对照组。结果(示于图16中)证实在接受热稳定的四聚体血红蛋白溶液联同X射线照射处理的小鼠中观测到CNE2异种移植物显著缩小(组3，图16A)。

实施例8

癌症治疗研究：肝脏肿瘤显著缩小

此外，在施用热稳定的四聚体血红蛋白溶液与顺铂的组合之后观测到肿瘤显著缩小(图16B)。使用大鼠原位肝癌模型。将约2×10⁶个经过荧光素酶基因(CRL1601-Luc)标记的大鼠肝脏肿瘤细胞注射到布法罗大鼠的肝脏的左叶中。通过Xenogen体内成像系统对肿瘤生长进行监测。在注射后的两周至三周时，收集肿瘤组织，将所述肿瘤组织解剖成小块并且原位植入到第二组大鼠的左肝叶中。将带有肝脏肿瘤的大鼠随机分到如下三个组中：

组1：林格氏乙酸盐缓冲液(对照组)

组2：林格氏乙酸盐缓冲液+顺铂(顺铂)

组3：热稳定的四聚体血红蛋白+顺铂(顺铂+Hb)

用单独的3mg/kg顺铂(组2)或联同热稳定的四聚体血红蛋白一起(组3)对被植入有肝脏肿瘤组织的大鼠进行处理。对于组2和组3，通过腹膜内注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液使大鼠麻醉并且经由门静脉左支施用顺铂。对于组3，在顺铂处理之前静脉内注射0.4g/kg热稳定的四聚体血红蛋白。组1是无处理对照组。重要的是，在处理后3周时观测到肝脏肿瘤显著缩小(图16B)。

实施例9

预防手术后肝脏肿瘤复发和转移的方法

肝脏肿瘤的手术切除术是肝癌的第一线治疗。然而，癌症的手术后复发和转移仍为这些患者的预后不良的主要属性。举例来说，先前的研究报道肝切除术与50％的5年存活率有关，但也与70％的复发率有关。对肝细胞癌(HCC)患者进行的随访研究还揭示在约15％的HCC患者中检测到从原发HCC的肝外转移，其中肺是肝外转移频率最高的部位。已表明在肝脏手术期间引入的手术应激，特别是缺血/再灌注(IR)损伤是肿瘤进展的主要原因。常规上，外科医生通常使用肝血管控制以防止在肝切除术期间出现大出血。举例来说，已经利用通过夹紧肝门三体(portal triad)实现的入肝血流阻断(普林格法(Pringle maneuver))以使失血减到最低程度以及减小对围手术期输血的需要。最近的一项日本研究显示25％的外科医生在常规基础上应用普林格法。然而，普林格法会在残肝中诱发不同程度的缺血性损伤并且与癌症的复发和转移有关。

IR损伤和肿瘤进展的联系还由先前的动物研究所支持。首先，IR损伤和肝切除术对肝癌的复发和转移的影响在一项最近的研究中使用原位肝癌模型加以证实。肝IR损伤和肝切除术导致肝脏肿瘤的显著复发和转移。在结肠直肠肝转移小鼠模型中获得了类似的结果，在所述小鼠模型中，IR损伤的引入加速了结肠直肠肝转移的长出。

先前，若干种保护性策略已被研究用于减少在切除术期间的IR损伤。举例来说，建议在长时间夹紧之前施加短时间的缺血(这被称为缺血预处理(IP))以触发肝细胞防御机制并且已被用于减少在肝脏切除术期间的IR损伤。他人应用间歇性夹紧(IC)程序，该程序允许进行入肝血流阻断，继而再灌注的循环。这两种方法均被表明在防止接受大型肝脏手术的非肝硬化患者的手术后肝脏损伤方面具有有效性。然而，在肿瘤背景下，动物研究还证实IP未能保护肝脏对抗由IR损伤诱发的肿瘤生长加速。此外，一些研究小组试图使用诸如α-生育酚和抗坏血酸之类的抗氧化剂来保护肝脏免遭IR损伤，从而预防肝脏转移。然而，这两种抗氧化剂均未能制约由IR刺激的肝内肿瘤生长。

在机制上，不同方面的证据表明缺氧出于多种原因而与肿瘤的复发和转移有关：(1)研究证实缺氧性肿瘤对放射疗法和化学疗法更具抗性，经历治疗之后存活的肿瘤细胞易于复发；临床证据还表明带有更多的缺氧性肿瘤区域的患者具有更高的转移率；(2)在缺氧条件下，癌细胞经由缺氧诱导因子-1(HIF-1)通路的激活而变得更具侵袭性。这进而触发牵涉到促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)和诸如c-Met和CXCR4之类的受体的补体反应，从而提高细胞向特定的远处器官的运动和归巢；(3)最近的研究还证实循环癌细胞(CTC)在缺氧条件下变得更具侵袭性。在癌症患者的外周血液中检测到循环肿瘤细胞被证实是有远处转移的患者体内疾病侵袭的指征，而缺氧能够使得那些细胞呈现出更具侵袭性的表型和减小的细胞凋亡潜能。具体来说，更具放射抗性的癌症干细胞群体在氧水平降低的情况下富含于脑肿瘤中。

因此，鉴于上述观测结果和研究，使用本发明的交联四聚体血红蛋白来预防在肝切除术后出现的手术后肝脏肿瘤复发和转移。建立大鼠原位肝癌模型。使用肝细胞癌细胞系(McA-RH7777细胞)在布法罗大鼠(雄性，300-350g)中建立原位肝癌模型。图17示出了汇总了手术和血红蛋白产品施用程序的示意图。将McA-RH7777细胞(约1×10⁶个细胞/100μL)注射到布法罗大鼠的肝包膜中以诱发实体肿瘤生长。两周以后(当肿瘤体积达到约10×10mm时)，将肿瘤组织收集并且切割成1-2mm³立方体并且植入到一组新的布法罗大鼠的左肝叶中。在原位肝脏肿瘤植入后的两周时，使大鼠经受肝脏切除术(带有肝脏肿瘤的左叶)和部分肝脏IR损伤(在右叶上缺血30分钟)。

使用两组被植入有肿瘤组织的大鼠对肿瘤的复发和转移进行比较。在组1中，在缺血之前1小时使用戊巴比妥使大鼠麻醉并且静脉内施用0.2g/kg的10g/dL浓度的本发明的热稳定的四聚体血红蛋白。通过使用无损伤止血夹(bulldog clamp)夹紧肝门静脉和肝动脉的右支将缺血引入到肝脏的右叶中。随后，在左肝叶中进行结扎术，继而对带有肝脏肿瘤的左肝叶进行切除术。在缺血后30分钟时，经由下腔静脉再注射0.2g/kg的热稳定的四聚体血红蛋白，继而再灌注。在组2中，使用相同的程序注射林格氏乙酸盐缓冲液作为媒介物对照组。在肝切除术程序后的4周时将所有大鼠处死。

为了研究肿瘤的生长和转移，在缺血/再灌注和肝切除术程序后的4周时对布法罗大鼠的肝脏和肺进行采样以进行形态学检查。收集组织，进行石蜡膜包埋并且切片，继而进行苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin，H&E)染色。通过组织学检查确认局部的复发/转移(肝内)和远处转移(肺)。表2汇总了在大鼠原位肝癌模型中在肝脏切除术和IR损伤后的四周时肿瘤的复发/转移的比较。

表2

为了研究非聚合的热稳定的四聚体血红蛋白针对肝脏肿瘤复发和转移的保护作用，在肝切除术和IR程序后的4周时将所有大鼠处死。收集肺和肝脏组织；在这两个组中比较肝肿瘤的复发/转移和肺中的远处转移。结果证实血红蛋白处理降低了这两个器官中复发和转移的出现率。

图18示出了在肝切除术和缺血/再灌注程序后在IR损伤组的大鼠中所诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移以及使用本发明的热稳定的四聚体血红蛋白针对它的保护作用的代表性实例。在图18A中，在IR损伤组中观测到广泛的肝内肝癌复发/转移。在同一只大鼠中还存在远处肺转移(以实线箭头指示)。在图18B中，在IR损伤组中的另一个病例中观测到肝内肝癌复发/转移(以虚线箭头指示)。在同一个病例中观测到广泛的肺转移(以实线箭头指示)。相比之下，图18C示出了在接受本发明的热稳定的四聚体血红蛋白处理的大鼠中防止肝内肝癌复发/转移和远处肺转移的保护作用的代表性实例。

图19示出了在肝脏切除术和IR损伤程序后的四周时对这两组进行的组织学检查。对IR损伤组和血红蛋白治疗组这两组中的肝脏和肺组织进行组织学检查(H&E染色)以确认肿瘤结节的特征。示出了IR损伤组中的肝内复发(T1和T2)和肺转移(M)的代表性的视野(顶部)。显示出治疗组中正常的肝脏结构(N1)和在血红蛋白处理后在肝脏中所检测到的肿瘤结节(T3)的组织学检查被纳入以进行比较(底部)。此外，在治疗组中无转移的肺组织(N2)被示出以进行比较。

为了进一步确认热稳定的四聚体血红蛋白针对肿瘤复发和转移的保护作用，研究在缺血/再灌注和肝切除术程序后肿瘤的复发率和复发肿瘤的尺寸。再次，如图17中所述，在缺血之前以及在肝脏切除术程序后再灌注时，使用约0.2-0.4g/kg的本发明的热稳定的四聚体血红蛋白或作为阴性对照的林格氏乙酸盐(RA)缓冲液对如上文所述通过注射McA-RH7777细胞所制备的植入有肿瘤组织的大鼠进行静脉内处理。对总共26只大鼠进行测试，其中13只大鼠接受主题血红蛋白处理并且13只大鼠是仅接受RA缓冲液处理的阴性对照大鼠。在肝切除术和IR程序后的4周时将所有大鼠处死，对测试大鼠的肝脏和肺的肿瘤复发/转移进行检查，并且测量复发肿瘤的相对尺寸。

图20A示出了测试大鼠中的肝脏肿瘤复发和单个的复发肿瘤的体积。在13只未处理的对照大鼠中有9只存在肝脏肿瘤复发/转移，而在13只接受处理的大鼠中仅有4只遭受肿瘤复发/转移。同样明显的是，在观测到肿瘤复发的情况下，接受主题血红蛋白处理的大鼠的复发肿瘤的尺寸显著小于未处理的大鼠的复发肿瘤。结果证实在本发明主题处理情况下肿瘤复发率大幅降低并且复发的肿瘤尺寸显著减小，如图20B中所汇总。

图21图示了在肝切除术和IR程序后的4周时所收集的接受本发明热稳定的主题四聚体血红蛋白处理的大鼠和IR损伤(阴性对照)组的大鼠的肝脏和肺组织的代表性实例。如在未处理的阴性对照组的代表性实例，即大鼠C10和C13中所看到，观测到广泛的肝内肝癌复发/转移和远处肺转移(圆圈)。另一方面，通过本发明的主题血红蛋白的处理防止了肝内肝癌复发/转移和远处肺转移，如在大鼠Y9、Y10以及Y11中所看到。

实施例10

使用热稳定的四聚体血红蛋白进行的处理减少缺血

如在实施例6中所证实，向缺氧性肿瘤中静脉内注射热稳定的主题四聚体血红蛋白显著地改善了其中的氧合作用。因此，对主题血红蛋白产品在肿瘤切除术和IR程序期间的氧合作用进行研究。使用通过注射McA-RH7777细胞所制备的植入有肝脏肿瘤组织的大鼠并且使这些大鼠接受手术和0.2-0.4g/kg的主题血红蛋白产品或RA缓冲液施用程序，如图17中所概述。从首次向肝肿瘤施用主题血红蛋白产品/RA缓冲液之时起以及在整个IR程序、肝肿瘤切除术期间和再灌注之后测量肝脏的氧分压。结果(图22)证实在引入缺血之后观测到在主题血红蛋白处理的情况下氧合作用提高。此外，如在图22中所看到，在再灌注之后，已接受主题血红蛋白处理的肝脏的氧分压是未接受处理的肝脏的氧分压的约3倍。已确认的是，在缺血之前以及在肿瘤切除术后再灌注时用主题血红蛋白进行处理与未处理相比显著地改善了肝脏组织的氧合作用。鉴于在本领域中所提出的缺氧性肿瘤与肿瘤复发/转移的可能性增大之间具有很强的相关性、如在这一实施例中所证实的在肿瘤切除术程序期间本发明的血红蛋白产品及其使用的明显氧合作用，本发明的血红蛋白产品对于减少肿瘤复发和转移的有用性得到明显确认。

实施例11

使用热稳定的四聚体血红蛋白进行的处理降低循环内皮祖细胞水平

不同项的研究已证实了癌症干细胞(CSC)和/或祖细胞群体在肝癌进展中的意义。重要的是，先前的研究证实在包括接受肝切除术的那些患者在内的HCC患者中发现显著更高水平的循环内皮祖细胞(EPC)。

因此，通过诸如CD133、CD34以及VEGFR2之类的表面分子的表达对循环EPC的水平进行评价。对在使用或未使用主题血红蛋白产品进行处理的情况下在肝脏切除手术和IR程序后循环内皮祖细胞的水平进行研究。使植入有肝肿瘤的两组大鼠分别在缺血之前以及在肝脏切除术后再灌注时接受主题血红蛋白或RA缓冲液(对照组)的处理，如图17中所示。然后在肝脏切除术和IR程序后的0、3、7、14、21以及28天时测量两组大鼠的循环EPC的数目。结果(图23)证实虽然在手术后的第0天-第3天期间治疗组和未治疗组的EPC水平是相当的，但血红蛋白治疗组的EPC水平明显低于RA缓冲液治疗组的EPC水平。结果证实主题血红蛋白的保护作用可以使肿瘤的复发/转移减少并且减到最低程度。

实施例12

热稳定的四聚体血红蛋白在肿瘤块内的定位

为了使热稳定的四聚体血红蛋白在肿瘤块内的定位可视化，根据制造商的说明书，使用Alexa750SAIVI^TM抗体标记系统对本发明的血红蛋白进行标记。简单地说，将荧光标记的本发明的血红蛋白(fl-Hb)与未标记的对应物以约1:80的比率混合。将混合物静脉内注射到带有鼻咽癌异种移植物(C666-1)的裸小鼠体内。对于每只裸小鼠，fl-Hb的量是约0.2mg以确保有足够的荧光信号由Maestro2成像系统所捕获。在不同的时间点使裸小鼠麻醉，之后使其暴露于Maestro2荧光成像系统以进行分析。图24示出了在肿瘤异种移植物内聚集的Hb的代表性图像(以箭头指示)。

实施例13

热稳定的四聚体血红蛋白在喉癌中的放射增敏作用

为了评价热稳定的四聚体血红蛋白在头部和颈部癌症中的放射增敏作用，在放射之前施用一次本发明的基于血红蛋白的氧载体，并且结果证实了在Hep-2喉癌模型中的肿瘤生长抑制作用。在实验结束时高剂量Hb(2.2g/kg)与放射的组合的组的肿瘤体积是90.0mm³，这显著小于对照组的肿瘤体积(336.1mm³)(P<0.01)。单独放射组的肿瘤体积是143.1mm³，并且施用高剂量Hb的组合q值是1.17，这指示这一组合的协同作用(q>1.15，协同作用)。图25示出了先施用本发明的基于血红蛋白的氧载体，而后进行放射的肿瘤生长抑制作用。

实施例14

热稳定的四聚体血红蛋白在鼻咽癌中的放射增敏作用

为了评价热稳定的四聚体血红蛋白在鼻咽癌中的放射增敏作用，在放射之前施用一次本发明的基于血红蛋白的氧载体，并且结果证实了在C666-1鼻咽癌模型中的肿瘤生长抑制作用。在实验结束时高剂量Hb(2.2g/kg)与放射组合的组的肿瘤体积是110.3mm³，这显著小于对照组的肿瘤体积(481.1mm³)(P<0.01)，并且也显著小于单独放射组的肿瘤体积(160mm³)(P<0.05)。Hb高剂量的组合q值是1.24，这指示这一组合的协同作用(q>1.15，协同作用)。图26示出了先施用本发明的基于血红蛋白的氧载体，而后进行放射的肿瘤生长抑制作用。

实施例15

热稳定的四聚体血红蛋白在脑癌中的化学增敏作用

多形性成胶质细胞瘤(GBM)是成人的原发性脑肿瘤的常见类型并且是人类最具侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一，它的特征在于迅速生长、具有侵袭性以及早期复发。GBM患者的预后是极为不利的，中值存活期是约1年。虽然烷化剂替莫唑胺(TMZ)可以显著延长存活期，但是大多数的患者由于原发性(de novo)或获得性TMZ抗性而产生肿瘤复发。

因此，对Hb在多形性成胶质细胞瘤中对替莫唑胺诱导的细胞毒性的增敏作用进行研究。在缺氧(1％氧气)下使用不同浓度(0.015至0.03g/dL)的单独的Hb、单独的TMZ或它们的组合处理对替莫唑胺具有敏感性(D54-S)和具有抗性(D54-R)的GBM细胞72小时，继而进行细胞活力测定。

结果证实在体外，在D54-S和D54-R GBM细胞这两者中，Hb增强了TMZ诱导的细胞毒性。图27A示出了在不同的处理条件后D54-S和D54-R细胞的代表性的96孔培养板。图27B示出了Hb对TMZ诱导的细胞毒性的剂量依赖性增强作用。

实施例16

通过流式细胞术分离癌症干细胞

将乳腺癌细胞系MCF7细胞用CD24抗体和CD44抗体标记并且通过流式细胞术，使用PE和APC同种型进行分析，所述PE和APC同种型分别由488nm(蓝色激光)和633nm(红光激光)所激发，并且通过585nm和660nm带通滤波器测量对应的发射。流式细胞术结果证实高表达CD44，但不表达CD24的可商购获得的MCF7细胞的百分比在总群体中仅占约0.5％。

为了获得所需的癌症干细胞，将MCF7细胞在无涂层的皮氏培养皿(petri dish)上在MammoCult^TM中悬浮培养至少7-9天，之后形成类球体。所述培养基含有用于人类乳腺球的MammoCult基础培养基和MammoCult增殖补充剂这两者。还在使用之前将所述培养基补充以0.48μg/mL的新鲜溶解的氢化可的松(hydrocortisone)和4μg/mL的肝素。将皮氏培养皿中的培养基每1-2天更换一次并且所述频率可以根据培养基的颜色来决定。在显微镜下观测细胞的形态。图28示出了在光学显微镜下在相衬视野中观测到的细胞形态。与源自于乳腺上皮细胞的中空乳腺球(E，对照)相比，在将流式分选的MCF7细胞倒到皮氏培养皿上之后生长的约第9天至第20天时观测到实心乳腺球。通过将癌症干细胞传代约9代来进一步确认自我更新能力，并且在第0代后的后续每一代均可以耗时约9-14天以发展成为实心的乳腺球。从一代到另一代，在无菌环境中通过化学(例如胰蛋白酶消化)或机械手段(例如使用细胞刮刀使细胞团块脱离皮氏培养皿，继而通过移液管上下吹吸)来将实心乳腺球分离成单细胞。收集每一代的单细胞以进行进一步蛋白质分析来确认癌症干细胞的特征和自我更新能力。图29示出了在不同代收集的溶解的细胞的蛋白质印迹。在图29A中，样品1是指来自乳腺球的未分选的细胞，并且样品2是指处于第1代的来自乳腺球的CD44+/CD24-分选过的细胞。在图29B中，样品1是指来自乳腺球的未分选的细胞，并且样品2、3以及4分别是指处于第1代、第2代以及第3代的来自乳腺球的CD44+/CD22-分选过的细胞。根据蛋白质印迹，证实来自乳腺球的未分选的以及分选过的细胞这两者均表达干细胞标志物Oct-4(39kDa)和Sox-2(40kDa)。然而，在未分选的细胞与分选过的细胞之间这些标志物的表达水平是不同的。显然，在处于同一代时，CD44+/CD24-分选过的细胞中Oct-4的表达水平高于未分选的细胞。由于在每一代中应用细胞分选来选择CD44+/CD24-细胞，就这些干细胞标志物的表达水平而言的癌症干细胞的自我更新能力从一代到另一代变得更高。

为了进一步研究癌症干细胞的肿瘤起始能力，通过使用ALDH-抗体对从处于不同代的乳腺球所收集的细胞进行标记并且使用流式细胞术对标记的细胞进行分析来研究醛脱氢酶(ALDH)活性。图30A是对对照(与二乙氨基苯甲醛(DEAB，一种ALDH抑制剂)一起孵育的细胞)进行分析的结果；图30B是在第0代所收集的细胞的结果，其中它显示细胞群体中有1％具有ALDH活性；图30C是在第3代所收集的细胞的结果，其中它显示细胞群体中有约8.7％具有ALDH活性；在第5代所收集的细胞群体中有约10％-13％具有ALDH活性(图30D)。在这一分析中，证实从乳腺球分离的细胞具有肿瘤起始和自我更新能力，同时在选择压力下从一代到另一代在癌细胞的细胞群体中变得越来越占优势。这也与先前对癌症干细胞的研究相符。

实施例17

基于血红蛋白的氧载体对癌症干细胞的作用

为了测试基于血红蛋白的氧载体对肿瘤中的癌症干细胞的作用，将MCF7细胞在缺氧条件(5％CO₂和1.1％O₂)下孵育9-20天，之后传到细胞分选仪中，在该细胞分选仪中使用两种滤波器：PE-A用于CD24标志物，而APC-A用于CD44标志物。分选出CD44呈阳性并且CD24呈阴性的细胞所处的象限1(图31)以进行进一步分析。

为了测试癌症干细胞对单独的化学治疗剂或对基于血红蛋白的氧载体和化学治疗剂的组合疗法的敏感性，向从例如第7代和第8代的较晚代获得的乳腺球分离的MCF7细胞施用不同组的化学治疗剂和/或本发明的基于血红蛋白的氧载体。在测试癌症干细胞的敏感性之前，CD44+/CD24-对化学治疗剂的药物抗性示于图32中。将未分选的MCF7细胞和CD44+/CD24-分选过的细胞与DMSO(作为对照)和90nM的紫杉醇一起孵育16小时和4天。在每个时间间隔(16小时和4天)获取每一组样品的相衬图像(图32)并且通过MTT测定(如实施例3中所述)对在紫杉醇处理4天后分选过的细胞进行进一步测试以确认这些细胞对化学治疗剂的药物抗性。根据细胞形态，未分选的细胞和CD44+/CD24-分选过的细胞这两者的乳腺球形成看来受到90nM的紫杉醇抑制。然而，在使用紫杉醇处理4天后对分选过的细胞进行的MTT测定显示出约96％的存活率，这意味着CD44+/CD24-分选过的细胞对单独的紫杉醇具有高抗性。

通过在使用化学品的不同组合将乳腺球处理至少24小时，之后对乳腺球进行胰蛋白酶消化后对来自两代(P7和P8)的单细胞进行的MTT测定的结果来进一步确认CSC对化学治疗剂的高抗性。将乳腺球培养在缺氧条件(5％CO₂、1.1％O₂)下以模拟肿瘤的生理环境。MTT测定中所使用的化学品的不同组合包括单独的Hb(0.2g/dL)、单独的硼替佐米(“Bort”，0.5μM)、单独的5-氟尿嘧啶(“5FU”，5μM)、或上述化学品的任何组合。在组合药物(即Hb+至少一种化学治疗剂)的情况下，将经过胰蛋白酶消化的细胞与0.2g/dL的Hb一起孵育24小时，继而添加一种或多种预期的化学治疗剂并且再孵育24小时。通过光谱仪测量吸光度并且吸光度的归一化值提供于下表3中。在归一化值中，“1”表示100％的存活率；0.75表示75％的存活率，诸如此类。

在仅施用0.2g/dL的Hb的情况下，来自两代的细胞的存活率是约61％-65％的存活率。在单独施用0.5μM的硼替佐米的情况下，来自两代的细胞具有约78％-91％的存活率。在单独施用5μM的5FU的情况下，来自两代的细胞具有约72％-87％的存活率。在施用0.2g/dL的Hb+0.5μM的硼替佐米的情况下，来自两代的细胞的存活率是约38％-49％。在施用0.2g/dL的Hb+5μM的5FU的情况下，来自两代的细胞的存活率是约52％-72％。在施用0.5μM的硼替佐米和5μM的5FU的情况下，来自两代的细胞的存活率是约60％-64％。在施用0.2g/dL的Hb+0.5μM的硼替佐米和5μM的5FU的情况下，来自两代的细胞的存活率是约33％-39％。通过对单独施用一种化学治疗剂与施用基于血红蛋白的氧载体和同一药剂的组合的情况进行比较，在硼替佐米的情况下，存活率降低了几乎一半；在5FU的情况下，存活率降低了约17％至20％。虽然在硼替佐米和5FU的组合的情况下细胞的存活率是约60％-64％，但它仍相对高于接受基于血红蛋白的氧载体和硼替佐米处理的细胞的存活率。有趣地注意到，基于单独血红蛋白的氧载体杀死CSC的百分比与使用硼替佐米和5FU的组合杀死CSC的百分比可以几乎相同。最终，在这一测试中最有效的杀死CSC的组合是基于血红蛋白的氧载体加上硼替佐米和5FU，这是因为存活率仅是约33％-39％，这远低于如本文所述的任何其它组合。然而，应当指出的是，与本发明的基于血红蛋白的氧载体组合施用的化学治疗剂不限于硼替佐米或5FU。已被证明在治疗癌症/肿瘤方面不太有效的任何其它常规的化学治疗剂或诸如放射疗法之类的任何其它疗法也可以与本发明的基于血红蛋白的氧载体组合使用而具有提高的杀死CSC的功效。

如果需要的话，本文所论述的不同功能可以按不同的顺序和/或彼此同时执行。此外，如果需要的话，上述功能中的一种或多种可以是任选的或可以组合的。

作为上述研究的结果，得出的结论是，使用本发明的热稳定的四聚体血红蛋白进行的治疗对肝肿瘤的复发和其它器官中的转移这两者具有预防作用。

虽然已关于不同的实施方案对上述发明进行描述，但这些实施方案不具限制性。多种变化方案和改动方案将为本领域的普通技术人员所了解。这些变化方案和改动方案被认为是包括在以下权利要求书的范围内。

虽然在独立权利要求中阐述了本发明的各个方面，但本发明的其它方面包括来自所描述的实施方案和/或从属权利要求的特征与独立权利要求的特征的其它组合，并且不仅仅包括权利要求书中所明确阐述的组合。

在本文中还应当指出的是，虽然上文描述了本发明的示例性实施方案，但这些说明不应当被视为具有限制意义。相反，存在若干种变化方案和改动方案，这些变化方案和改动方案可以被作出而不背离如所附权利要求书中所限定的本发明的范围。

Claims

1.一种基于血红蛋白的氧载体药物组合物，所述药物组合物被配置成靶向癌组织或肿瘤块内癌细胞的表面上所表达的受体，以使得所述基于血红蛋白的氧载体药物组合物触发受体介导的机制以促进所述基于血红蛋白的氧载体被摄取和定位到所述癌组织或肿瘤块内的所述癌细胞中，从而诱导所述癌组织或肿瘤的包括自我更新和肿瘤起始细胞在内的细胞发生细胞凋亡以预防癌症复发，向所述癌组织或肿瘤提供氧化应激或冲击，以及使所述癌组织或肿瘤对并行或随后施用的化学治疗剂或放射疗法增敏。

2.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含化学治疗剂，所述化学治疗剂与所述基于血红蛋白的氧载体以化学方式缀合以协同地靶向所述癌组织或肿瘤以及包括所述自我更新和肿瘤起始细胞在内的所述癌性肿瘤细胞。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、硼替佐米、多柔比星、顺铂、或其任何组合。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述基于血红蛋白的氧载体选自热稳定的交联四聚体血红蛋白、聚合的血红蛋白、或修饰的血红蛋白分子，所述热稳定的交联四聚体血红蛋白、聚合的血红蛋白、或修饰的血红蛋白分子具有不可检出量的二聚体浓度和低浓度的高铁血红蛋白。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述受体介导的机制是网格蛋白介导的内吞作用。

6.如权利要求1所述的药物组合物，向有需要的受试者在破坏血液供应之前和/或在从所述受试者体内手术切除肿瘤中在重新建立血液供应期间施用所述药物组合物。

7.如权利要求6所述的药物组合物，以约0.2g/kg受试者体重-1.2g/kg受试者体重的范围施用所述药物组合物。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌组织或肿瘤包括肝脏癌组织或肿瘤、乳腺癌组织或肿瘤、脑癌组织或肿瘤、结肠癌组织或肿瘤、肺癌组织或肿瘤、头部和颈部癌组织或肿瘤、鼻咽癌组织或肿瘤、以及白血病。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌组织或肿瘤是缺氧的。

10.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述交联的四聚体血红蛋白具有60-70kDa的分子量并且经过热处理和添加有0.05％-0.4％浓度的N-乙酰半胱氨酸。

11.如权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物不含血管收缩性杂质和蛋白质杂质、无热原、无内毒素、无磷脂、无基质并且具有低于5％的高铁血红蛋白水平。

12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述基于血红蛋白的氧载体经过修饰而具有更长的半衰期以穿透到所述癌组织或肿瘤块中以及对所述癌组织或肿瘤提供氧化应激或冲击，从而诱导所述癌组织或肿瘤的包括所述自我更新和肿瘤起始细胞在内的细胞发生细胞凋亡。

13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述自我更新和肿瘤起始细胞是癌症干细胞和/或祖细胞。

14.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述基于血红蛋白的氧载体被单独施用或与至少一种化学治疗剂和/或放射疗法组合施用，并且其中所述基于血红蛋白的氧载体被作为辅助疗法施用。

15.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述修饰的血红蛋白分子是聚乙二醇化的血红蛋白分子。

16.基于血红蛋白的氧载体用于制备用于治疗癌组织以及预防癌性肿瘤复发的药物组合物的用途，其中向有需要的受试者单独施用所述组合物或与至少一种化学治疗剂组合施用所述组合物。

17.如权利要求16所述的用途，其中在切除癌组织或肿瘤期间或之后向所述受试者施用所述组合物。

18.如权利要求16所述的用途，其中所述癌组织或肿瘤是肝脏癌组织或肿瘤、鼻咽组织或肿瘤、脑组织或肿瘤、结肠组织或肿瘤、肺组织或肿瘤、头部和颈部组织或肿瘤、乳腺组织或肿瘤以及白血病。

19.如权利要求16所述的用途，其中所述癌组织或肿瘤是缺氧的。

20.如权利要求16所述的用途，其中所述基于血红蛋白的氧载体是具有60-70kDa的分子量的交联四聚体血红蛋白，并且在热处理以及添加0.05％-0.4％浓度的N-乙酰半胱氨酸之后是热稳定的。

21.如权利要求20所述的用途，其中在所述热处理以及与所添加的N-乙酰半胱氨酸反应之后所述组合物不含血管收缩性杂质和蛋白质杂质、无热原、无内毒素、无磷脂、无基质并且具有低于5％的高铁血红蛋白水平。

22.如权利要求16所述的用途，其中通过以约0.2-1.2g/kg体重的范围并且以小于10毫升/小时/kg体重的速率输注施用所述组合物。

23.如权利要求16所述的用途，其中所述至少一种化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、硼替佐米、多柔比星、顺铂、或其任何组合。

24.如权利要求16所述的用途，其中所述基于血红蛋白的氧载体与至少一种化学治疗剂的所述组合被配置成协同地靶向所述癌组织或肿瘤中表达有受体的细胞，以触发受体介导的机制，从而使所述癌组织或肿瘤中的所述细胞增敏，以使得更多的基于血红蛋白的氧载体和化学治疗剂被所述细胞选择性地摄取并且定位到所述细胞的细胞质中，同时所述细胞对所述化学治疗剂变得更加敏感。

25.如权利要求16所述的用途，其中所述基于血红蛋白的氧载体被作为辅助疗法与所述至少一种化学治疗剂一起施用以向所述癌组织或肿瘤块提供氧化应激或冲击以及使所述癌组织或肿瘤对所述化学治疗剂增敏，从而诱导所述癌组织或肿瘤中包括自我更新和肿瘤起始细胞在内的细胞发生细胞凋亡。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述自我更新和肿瘤起始细胞是癌症干细胞和/或癌症祖细胞。

27.如权利要求16所述的用途，其中所述癌组织或肿瘤包括肝脏癌组织或肿瘤、乳腺癌组织或肿瘤、脑癌组织或肿瘤、结肠癌组织或肿瘤、肺癌组织或肿瘤、头部和颈部癌组织或肿瘤、鼻咽癌组织或肿瘤以及白血病。

28.如权利要求24所述的用途，其中所述受体介导的机制是网格蛋白介导的内吞作用。