CN102405051A - 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用 - Google Patents

一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102405051A
CN102405051A CN2011800012855A CN201180001285A CN102405051A CN 102405051 A CN102405051 A CN 102405051A CN 2011800012855 A CN2011800012855 A CN 2011800012855A CN 201180001285 A CN201180001285 A CN 201180001285A CN 102405051 A CN102405051 A CN 102405051A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hemoglobin
oxygen
cross
carrier
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800012855A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102405051B (zh
Inventor
黄炳镠
郭瑞仪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Feng an International Limited
Original Assignee
黄炳镠
郭瑞仪
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44314337&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102405051(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US13/013,847 external-priority patent/US8742073B2/en
Application filed by 黄炳镠, 郭瑞仪 filed Critical 黄炳镠
Priority to CN201310054976.2A priority Critical patent/CN103169954B/zh
Publication of CN102405051A publication Critical patent/CN102405051A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102405051B publication Critical patent/CN102405051B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Abstract

本发明提供了一种高温稳定的和高度纯化的交联的(任选地≥70％β-β交联)的四聚体血红蛋白，其具有高效的氧输送功能，所述四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。将二聚体形式的血红蛋白变性并对来自全血的红细胞进行纯化。在快速细胞裂解设备中进行可控低渗裂解以防止白细胞的裂解。在裂解液中没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。在氧合环境中通过巯基试剂封闭活性巯基。流通柱色谱去除不同的血浆蛋白杂质。将N-乙酰半胱氨酸加入至交联的四聚体血红蛋白以保持低水平的高铁血红蛋白。稳定的血红蛋白保存在带有铝外包装的输液袋中以防止氧侵入形成无活性的高铁血红蛋白。该产品用于组织氧合和癌症治疗。

Description

一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年5月27日提交的美国临时专利申请号61/348,764和于2011年1月26日提交的美国专利申请系列号13/013,847以及于2011年4月11日提交的美国部分继续专利申请系列号13/083,639的优先权，这些申请的公开内容通过引用并入。
技术领域
本发明涉及一种制备高温稳定的含氧载体的药物组合物的方法和由该方法制备的组合物。本发明还涉及所述高温稳定的含氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-deprivation disorder)以及器官保存中的用途。
背景技术
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。
天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了在循环系统中功能性血红蛋白存在的持久性。
为了防止四聚体的分解，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。
现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括：产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物身体的严重肾损伤；此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有少量不需要的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。
现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括：蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的不含蛋白杂质的四聚体血红蛋白的工艺的需求。
现有技术血红蛋白制剂的其他问题包括：在哺乳动物中输液后产生血管收缩。已经表明此血管收缩是由于内皮衍生舒张因子与血红蛋白分子的活性巯基结合所引起的。因此，本领域中存在着对形成稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白在输液后不会导致血管收缩。
除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定化的四聚体血红蛋白的需求，而所述四聚体血红蛋白须不含磷脂并且能够以工业规模生产。
发明内容
本发明提供了一种制备高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法，所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响或其他严重的不良反应(包括死亡)。本发明还包括高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白和所述血红蛋白用于氧合体内和离体组织的用途。
该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，紧接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来裂解所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。
使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂和低含量的二聚体的血红蛋白溶液。使用配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液。
在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂和低二聚体血红蛋白溶液中血红蛋白分子的巯基。得到的每个血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。
通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(bis-3，5-dibromosalicy fumarate)交联巯基保护的血红蛋白的至少α-α和/或β-β亚单位从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa。用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白。通过使用切向流超滤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质。向所述交联四聚体血红蛋白加入0.2-0.4％的浓度的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5％以下。然后将所述无磷脂、低二聚体、巯基保护的高温稳定的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体；所述药学可接受的载体可以是生理缓冲液或水。
紧接着此步骤，得到的血红蛋白任选地包装在气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EVOH)输液包装中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。
通过上述方法制备的高温稳定的交联血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善肿瘤细胞中的氧合，从而提高对放射线和化疗剂的敏感性。该高温稳定的交联四聚体血红蛋白也用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保存心脏。
附图说明
图1描绘了不同物种血红蛋白的氨基酸序列比对，包括牛，人，狗，猪和马。
图2描绘了本发明的方法的流程图。
图3示意性描绘了本发明的方法中使用的快速细胞裂解设备(instantcytolysis apparatus)。
图4是显示在氧合和缺氧环境中血红蛋白与巯基试剂的反应的图。
图5描绘了对于交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析。
图6描绘了对交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。
图7显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)交联四聚体血红蛋白的圆二色性(CD)光谱分析。
图8显示了交联四聚体血红蛋白的体外化学增敏作用。
图9描绘了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了正常组织中的氧合。
图10显示了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了极度低氧的肿瘤区域中的氧合。
图11显示了在用本发明的稳定化的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化。
图12是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中。
图13示意性描绘了用于工业规模生产的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。
图14是氧合环境中的巯基反应和缺氧环境中的反应之间的比较。
图15证明与现有技术血红蛋白相比本发明的交联四聚体血红蛋白的热稳定性更高。
图16是用于本发明的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图。
图17是用来测试体外高铁血红蛋白形成的设备的示意图。
图18描绘了在图17的设备中聚合血红蛋白和本发明的血红蛋白形成高铁血红蛋白的速率。
具体实施方式
血红蛋白是哺乳动物和其他动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白。血红蛋白显示蛋白的三级和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋段，产生其分子内的吸引力，将各个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子是四个球状蛋白亚单位的组合体。每个亚单位由排列成一组α-螺旋结构段的多肽链构成，所述α-螺旋结构段以具有包埋的血红素基团的“肌红蛋白折叠”排列方式连接。
血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与位于一个平面中的环中心中所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。
在成人中，最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体，其由称为α2β2的两个α和两个β非共价结合的亚单位组成，每个亚单位分别由141和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14％；β链中的同一性为84.35％)。不同之处在于牛血红蛋白中的两个巯基位于βCys 93处，而人血红蛋白中的巯基分别位于αCys 104、βCys93和βCys 112处。图1显示分别标记为B、H、C、P和E的牛、人、犬、猪和马血红蛋白的氨基酸序列比对。各种来源的氨基酸的不同之处用阴影表示。图1表明当比较其氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马血红蛋白具有高度的相似性。
在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个αβ二聚体与另一个αβ二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个αβ二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而被肾脏过滤和分泌，结果造成潜在的肾损伤和并导致其在血管内的存留时间的实质性减少。
因此，从功效和安全性两方面来看，稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法；本发明的方法的概况呈现在图2的流程图中。
首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括，但不限于，人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤，和洗涤以去除血浆蛋白杂质。
为了从红细胞释放血红蛋白，需裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞，但本发明利用精确可控的低渗裂解技术，且能够满足工业规模制备的需要。为此，用来裂解红细胞的快速细胞裂解设备可见图3。低渗裂解形成裂解产物溶液，其包含血红蛋白和废截留物。为了能够进行工业规模制备，小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在约30秒内穿越该设备并且所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。去离子水和蒸馏水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时限不同。由于可控的裂解步骤仅破坏红细胞，不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA从白细胞的释放或细胞性物质的释放最小化。在30秒后即，在含有红细胞的溶液已经穿越快速细胞裂解设备的静态混合器部分后立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限＝64pg)和HPLC(检出限＝1μg/mL)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。
进行两个超滤过程；一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质，另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，100kDa滤器用于第一超滤过程，而30kDa滤器用于第二超滤过程。
流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱，所述离子交换柱诸如DEAE柱，CM柱，羟磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8.5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH 8.0下去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现连续的分离方案，从而能够实现工业规模的制备。ELISA结果显示在洗脱的交联四聚体血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G：44.3ng/mL；白蛋白：20.37ng/mL；碳酸酐酶：81.2μg/mL)。使用不同类型的柱采用不同的pH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表1中。
表1：使用不同的离子交换柱去除不同的蛋白杂质
为了防止内皮衍生舒张因子与血红蛋白的半胱氨酸位点的结合导致不合乎需要的血管收缩，使血红蛋白在氧合条件下与巯基试剂进行反应。这与现有技术的教导正相反，现有技术强调血红蛋白和巯基试剂之间的反应在缺氧条件下进行。本发明证明巯基试剂在氧合条件下与血红蛋白的活性巯基较快地且完全地反应。巯基试剂与血红蛋白的巯基的反应产生碘化物。因此，烷基化反应的完成可以通过测量碘化物释放来监测。在时程试验期间，与缺氧环境相比，在氧合环境中烷基化反应更快和更有效地进行，如图4和图14中所示。与缺氧环境相比，在氧合环境中达到完成反应所需的反应时间减少至5小时以下。较短的反应时间对于工业规模过程是非常重要的。其还减少了由不需要的杂质引起的反应，该杂质导致终产物的不良反应。
在巯基反应过程后，血红蛋白经由富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)进行α-α和/或β-β交联。为了防止聚合血红蛋白的形成，在缺氧环境中小心地控制反应，血红蛋白与DBSF的摩尔比控制在1∶2.5-1∶4.0之间，使得得到的α-α和/或β-β交联的血红蛋白是分子量为60-70kDa的四聚体血红蛋白，证明不存在聚合血红蛋白。DBSF反应的收率高，＞99％且终产物中的二聚体浓度低；在本发明的上下文中，低二聚体含量是指小于5％和，更优选地，小于2％二聚体。在一个实施方案中，选择交联使得β-β交联的血红蛋白大于总交联四聚体血红蛋白的50％。在另一个实施方案中，选择交联使得β-β交联的血红蛋白为总交联四聚体血红蛋白的60％或更高。此外，可以选择条件使得β-β交联的血红蛋白大于总四聚体血红蛋白的70％。存在一些证据，β-β交联的血红蛋白的氧亲和力比α-α交联四聚体血红蛋白低。因此，可能存在这样的情形，即为增加氧运输的效率，较高百分比的β-β交联的血红蛋白优选于α-α交联的血红蛋白。此外，β-β交联的血红蛋白可能产生较少的α-β二聚体，较少的α-β二聚体将有助于减少肾毒性。
N-乙酰半胱氨酸以0.2-0.4％的浓度加入至α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白从而将高铁血红蛋白的水平保持在5％以下。
取决于血红蛋白的最终应用，本发明的纯化的交联四聚体血红蛋白任选地在缺氧环境中包装在气密包装中。本发明中使用的包装使α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白稳定持续两年以上。相反，本发明的血红蛋白在氧合条件下在数天内迅速地转变成无活性的高铁血红蛋白。现有技术血红蛋白溶液已经包装在具有高透氧性的PVC或Stericon血袋中，由此缩短了产品的寿命。
在本发明的许多实施方案中，包含氧载体的含交联血红蛋白的药物组合物通过静脉注射递送。因此，包装设计和材料选择针对静脉注射应用。EVA/EVOH材料的多层包装用来使透气性最小化并且避免形成无活性的高铁血红蛋白。设计与本发明的纯化的交联血红蛋白一起使用的100mL输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，其透氧性为在室温下每个大气压每24小时每100平方英寸0.006-0.132cm3(0.006-0.132cm3/100平方英寸/24小时/大气压)。此材料是VI类塑料(由USP<88>定义)，其满足体内生物学反应测试和物理化学测试并且适合于制造静脉注射用输液袋。此初级包装袋可特别地用于保护α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白溶液免于长期暴露氧，长期暴露氧导致其不稳定并且最终影响其治疗性能。
对于血液产品的二次保护，已经知道使用铝外包装以防止潜在的漏气并且将产品保持在缺氧状态。然而，在铝外包装中有存在针孔的可能性，使其气密性受损并且使产品变得不稳定。因此，本发明使用铝外包装袋作为二次包装，其防止氧合并且还防止暴露于光。外包装袋的组成包括0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，0.007mm铝(AL)，0.015mm尼龙(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧传递速率为在室温下0.006cm3/100平方英寸/24小时/大气压。此二次包装延长了血红蛋白的稳定时间，从而延长了产品保存期限。
高效液相色谱(HPLC)法、电喷雾电离质谱(ESI-MS)法和圆二色性(CD)光谱法用来分析和表征α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白。对于牛血来源，图5通过HPLC分析分子量分布来显示产物的组成。HPLC分析法用来分别检测四聚体和二聚体的量。HPLC分析的流动相包含氯化镁(0.75M)，其可以分离二聚体、未交联的四聚体和稳定的α-α和/或β-β交联的四聚体。为了促进血红蛋白离解成二聚体，在相同的离子强度下氯化镁的有效性为氯化钠的约30倍多。
ESI-MS允许分析非常大的分子。其是一种电离技术，该技术通过电离蛋白质，然后基于质量/电荷比分离电离的蛋白质来分析高分子量化合物。因此，可以准确地确定分子量和蛋白相互作用。在图6中，ESI-MS分析结果表明稳定的四聚体的尺寸为65kDa。190-240nm的远紫外CD光谱揭示了血红蛋白的珠蛋白部分的二级结构。在图7中，纯化的和交联的血红蛋白的光谱的一致性揭示血红蛋白链即使在通过DBSF交联以后被正确地折叠。CD结果显示交联血红蛋白具有大约42％α-螺旋，38％β-折叠，2.5％β-转角和16％无规卷曲。其进一步确定使用DBSF以形成交联四聚体血红蛋白的交联步骤不影响血红蛋白的二级结构。
由本发明的方法制备的纯化的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa，并且具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团，使得该血红蛋白不能在半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。此外，交联四聚体血红蛋白无热原、无内毒素(＜0.05EU/mL)且无基质(＜1％)。
本发明的方法适用于交联四聚体血红蛋白的大规模工业制备。另外，交联四聚体血红蛋白与药用载体(例如，水、生理缓冲液、在胶囊中)的组合适合于哺乳动物应用。
本发明的交联四聚体血红蛋白用于组织氧合，用于癌症治疗，用于治疗缺氧病症诸如失血性休克，和用于低氧含量环境下的心脏保存(例如，心脏移植物)。交联四聚体血红蛋白的剂量在约0.3-1.3g/kg的浓度范围内选择。
对于在癌症治疗中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为组织氧合剂起作用，以改善肿瘤组织中的氧合，从而提高化学敏感性(例如，对化疗的敏感性)和放射敏感性。
图8证明在体外应用包含交联四聚体血红蛋白的组合物后癌症肿瘤细胞的提高的化学敏感性。5种不同的癌细胞系(A)Jurkat(白血病)，(B)HKESC1(食管癌)，(C)COLO205(结肠癌)，(D)A549/Cisp(肺癌)和(E)MCF-7/ADM(乳腺癌)用多种化疗剂单独，或与本发明的交联四聚体血红蛋白联合治疗。肿瘤细胞生长的抑制通过ATP肿瘤化学敏感性测定(ATP-TCA)(用于Jurkat、COLO205、A549/Cisp和MCF-7/ADM细胞系)或MTT细胞增殖测定(用于HKESC1细胞系)来确定。结果显示通过在所有癌细胞系中添加本发明的交联四聚体血红蛋白极大地提高了化学敏感性，这些癌细胞系包括两个细胞系，A549/Cisp和MCF-7/ADM，它们对化疗高度耐药。图8中的结果显示作为添加交联四聚体血红蛋白提高化学敏感性的结果，对白血病细胞、食管癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞的治疗功效大大增加。
另外，在本发明中证明了本发明的交联四聚体血红蛋白改善正常组织中(图9)和极度低氧的肿瘤组织(图10)(人鼻咽癌(CNE2))中的氧合的能力。沿人CNE2异种移植物的组织轨迹的代表性氧状况显示在图10中。肿瘤块内的氧分压通过与微定位系统(DTI Limited)耦联的光纤氧传感器(Oxford OptronixLimited)直接监测。静脉注射1.2g/kg交联四聚体血红蛋白后，中位数pO2值分别在3小时内从0.2mmHg升高至3.9mmHg，在6小时内升高至10.6mmHg。即使在最低氧的区域中，本发明的包含氧载体的药物组合物显著地增加氧分压。与本发明中制备的包含氧载体的药物组合物相比，没有其他类似的市售产品或任何现有的技术显示这样高的功效。
对于在治疗缺氧病症和在心脏保存中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为将氧提供至靶器官的血液代用品起作用。在一些实施方案中，该组合物用作用于心脏保存的心脏停搏液。
在用0.5g/kg的本发明的交联四聚体血红蛋白治疗后严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化(参见实施例12b)显示在图11中。在严重失血性休克的大鼠模型中，在用稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至安全和稳定的水平，并且保持在基线以下。在用本发明的血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至正常的反应时间甚至比充当阳性对照的施用大鼠全血后的平均动脉压恢复至正常的反应时间还短。上述结果表明在输注本发明的血红蛋白后的血管活性事件有益于维持稳定和血液动力学状态。以前的基于血红蛋白的氧载体多引起血管收缩。例如，如由Katz等，2010所公开，
Figure BDA0000087876060000121
产品(Biopure Co.，USA)导致与基线(96±10mmHg)相比较高的平均动脉压(124+9mmHg)。
本发明的血红蛋白用于输液的应用增加了鼠(从18％增加至75％)和小猎犬(从46％增加至97％)的休克模型的存活率。通过输注不同量的交联四聚体血红蛋白(参见实施例12)显著地增加严重失血性休克动物模型的存活率。因此本发明的血红蛋白可用于失血性休克的治疗。
实施例
以下的实施例描述本发明的具体实施方案，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
总过程
本发明的方法的示意性流程图显示在图2中。牛全血采集在封闭的无菌容器/袋中，该容器/袋含有作为抗凝剂的3.8％(w/v)枸橼酸钠溶液。然后将血液与枸橼酸钠溶液立即充分混合以抑制血凝块。通过单采机制(apheresismechanism)将红细胞(RBC)从血浆和其他较小的血细胞分离并收集。为此步骤“细胞洗涤机”与γ灭菌的一次性离心机转筒(centrifuge bowl)一起使用。用等体积的0.9％(w/v氯化钠)盐水洗涤RBC。
对红细胞的细胞膜进行低渗冲击，来裂解洗涤过的红细胞以释放血红蛋白内容物。图3绘制了一种用于此目的的RBC专用快速细胞裂解设备。在RBC裂解后，使用100kDa膜通过切向流超滤将血红蛋白分子与其他蛋白分离。收集滤液中的血红蛋白用于流通柱色谱，并且通过30kDa膜进一步浓缩至12-14g/dL。进行柱色谱法以去除蛋白杂质。
浓缩的血红蛋白溶液首先通过巯基试剂(烷基化反应)在天然氧合条件下改性，然后将各组分与DBSF反应以形成稳定的α-α和/或β-β交联的四聚体血红蛋白分子。
实施例2
时间&可控的低渗裂解和过滤
采集新鲜牛全血并在冷却条件下运输。经细胞洗涤机将红细胞与血浆分离，随后用0.65μm过滤。在用0.9％盐水洗涤红细胞(RBC)滤液后，通过低渗裂解破裂滤液。通过使用图3中绘制的快速细胞裂解设备来进行低渗裂解。该快速细胞裂解设备包括静态混合器以辅助细胞裂解。含有可控浓度的血红蛋白(控制在12-14g/dL的范围内)的RBC悬浮液与4体积的纯净水混合从而低渗冲击RBC细胞膜。控制低渗冲击的时间以避免不希望的对白细胞和血小板的裂解。低渗溶液经过该快速细胞裂解设备的静态混合器部分持续约30秒。在30秒后当裂解产物离开静态混合器时通过将裂解产物与1/10体积的高渗缓冲液混合而终止冲击。使用的高渗溶液为0.1M磷酸盐缓冲液，7.4％NaCl，pH 7.4。图3的快速细胞裂解设备可以连续地处理50-1000升裂解产物/小时，和优选地至少300升/小时。
在RBC裂解后，红细胞的裂解产物通过0.22μm滤器过滤以获得血红蛋白溶液。聚合酶链式反应法(检出限＝64pg)和HPLC(检出限＝1μg/mL)方法在该血红蛋白溶液中都没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。进行第一次100kDa超滤以去除分子量大于血红蛋白的杂质。紧接着进行流通柱色谱以进一步纯化该血红蛋白溶液。然后进行第二次30kDa超滤以去除分子量比血红蛋白小的杂质，并用于浓缩。
实施例3
对无基质血红蛋白溶液的病毒清除研究
为了证明本发明所述的产品的安全性，我们通过病毒验证研究证明(1)0.65μm渗滤步骤和(2)100kDa超滤步骤的病毒清除能力。我们用按比例缩小的小规模反应体系来实施这两种方法，人为地向反应体系中添加不同模型的病毒，如脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus)和牛细小病毒(bovine parvovirus)。在此研究中使用四种类型的病毒，可见下表2。这些病毒的生物物理学和结构特征不同，并且对物理和化学药剂或治疗的抗性方面具有差异。
表2
Figure BDA0000087876060000141
病毒验证方案简要地显示在下表3中。
表3
Figure BDA0000087876060000142
下面的表4总结了在(1)0.65μm渗滤和(2)100kDa超滤中4种病毒的对数(log)减少的结果。通过0.65μm渗滤和100kDa超滤可有效地去除所有4种病毒，BVDV、BPV、EMCV和PRV。
表4
Figure BDA0000087876060000151
注释：
≥没有测定到残留的感染性
实施例4
流通柱色谱
CM柱(商购自GE healthcare)用来进一步去除任何蛋白杂质。起始缓冲液为20mM乙酸钠(pH 8.0)，且洗脱缓冲液为20mM乙酸钠、2M NaCl(pH8.0)。用起始缓冲液平衡CM柱后，蛋白样品加样至柱中。用至少5个柱体积的起始缓冲液洗涤未结合的蛋白杂质。使用处于8个柱体积中的25％洗脱缓冲液(0-0.5M NaCl)进行洗脱。洗脱状况显示在图12中；血红蛋白溶液处于流过级分中。
流过级分的纯度通过ELISA分析。结果显示在下面的表5中。
表5
Figure BDA0000087876060000161
由于血红蛋白溶液在pH8下处于来自CM柱色谱的流过级分中(不在洗出液中)，因此这是一种用于连续的工业规模操作的好方法。第一超滤装置直接连接至流通CM柱色谱系统，并且流通管可以连接至用于工业规模操作的第二超滤装置。示意性的工业工艺配置显示在图13中。
实施例5
巯基反应和交联
(5a)巯基反应
在本发明中，与现有技术的教导相反，在氧合环境中进行血红蛋白和巯基之间的反应，在现有技术中反应典型地在惰性气氛诸如氮气中发生。加入烷基化巯基试剂以烷基化血红蛋白的游离巯基。在此实施方案中，血红蛋白与巯基试剂的摩尔比为1∶2-1∶4。此反应可以消除与血红蛋白巯基反应的内皮衍生舒张因子的结合。内皮衍生舒张因子已经证明结合于血红蛋白的活性巯基，其可以解释在输注前几代的基于血红蛋白的氧载体后观察到的血压升高。巯基反应的完成可以通过测量产物的释放或残留的巯基试剂来监测(通过UV光谱仪，在265nm处)。图14是在氧合环境中的反应和在缺氧环境中的反应之间的比较。图14显示在时程试验期间在氧合环境中在3小时结束时的残留巯基试剂趋平。相反，在缺氧环境中仍然存在大量未反应的巯基试剂。在氧合环境中在4小时反应后巯基反应的收率很高(92.7％)。
(5b)交联反应形成稳定的四聚体
在缺氧环境中进行α-α和/或β-β交联反应。富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)加入至血红蛋白溶液以形成交联四聚体血红蛋白，所述交联四聚体血红蛋白在四聚体内包含α-α交联和/或β-β交联。任选地，一些α-β交联包含在四聚体内。
在此实施方案中，血红蛋白和DBSF的摩尔比为1∶2.5-1∶4.0。DBSF稳定步骤稳定四聚体形式的血红蛋白(65kDa)并且防止离解成二聚体(32kDa)，该二聚体通过肾脏排泄。在此交联过程中，仅形成四聚体血红蛋白；不形成聚合血红蛋白。在氮气的惰性气氛中进行此过程以防止血红蛋白氧化形成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白在生理学上是无活性的。DBSF反应的完成度通过使用HPLC测量残留的DBSF来监测。DBSF反应的收率高，＞99％。
在一个实施方案中，在室温(15-25℃)下在缺氧环境中进行交联反应(溶解氧＜0.1mg/L)。DBSF加入至血红蛋白溶液以形成交联四聚体血红蛋白；此交联四聚体血红蛋白如下表征。需注意此表征仅基于一个实施方案。四聚体内的交联的多种比例和类型可以通过使用的DBSF的量、反应的时间和温度以及其他工艺条件来控制。
当血红蛋白和DBSF的摩尔比改变为1∶5.0时，八聚体(130kDa)的百分比急剧地增加至18％。
(5b-1)使用15％SDS-PAGE对交联血红蛋白的电泳分析
交联血红蛋白溶液与等体积的还原样品缓冲液(62mM Tris-HCl(pH 6.8)，10％(v/v)甘油，5％(v/v)巯基乙醇和2.3％(w/v)SDS)混合，并在95℃加热10min。样品混合物使用具有4％浓缩胶的15％丙烯酰胺平板凝胶进行解析。使用60mA的恒定电流运行电泳。电泳后，SDS-PAGE凝胶用0.1％(w/v)考马斯兰R350、20％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸染色。在黑光装置(BlackLight Unit)(BLU)中显示的蛋白条带的强度使用Bio-Rad Quantity One软件进行定量。
(5b-2)从15％SDS-PAGE切下的蛋白条带的胰蛋白酶消化
从SDS-PAGE凝胶上切下蛋白条带，切成方块(1X 1mm)，用10％甲醇/10％乙酸脱色。脱色的凝胶用25mM NH4CO3，10mM DTT还原，并用25mMNH4CO3，55mM碘乙酰胺(idoacetamide)在暗处烷基化45min，然后用25mMNH4CO3，20ng/μL修饰胰蛋白酶在37℃下凝胶内消化过夜。经胰蛋白酶消化后，胰蛋白酶消化的肽在50％(v/v)乙腈和1％(v/v)三氟乙酸(TFA)中进行萃取。
(5b-3)胰蛋白酶消化的蛋白条带的基质辅助雷射脱附游离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析
将从凝胶方块中提取的经胰蛋白酶消化的肽点样至Anchorchip板上，并使其风干，所述Anchorchip板用1μL基质溶液(在50％乙腈/0.1％TFA中饱和的2mg/mL HCCA)预点样。干燥后，试样斑用10mM一磷酸盐缓冲液洗涤，并使用EtOH∶丙酮∶0.1％TFA(6∶3∶1的比率)的溶液重结晶。使用BrukerAutoflex III(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)以反射模式在800-3500Da的m/z范围内进行MALDI-TOF MS分析，其参数设置如下：用于肽质量指纹图谱(PMF)的离子源和反射器分别为25kV和26.3kV。使用Bruker肽混合校准标准品(Bruker Peptide Mix Calibration Standard)进行外部校准。S/N比超过4的峰通过Flex-分析(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)自动标记。MS数据进一步通过MASCOT 2.2.04和Biotools 2.1软件(Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany)分析，并且在NCBI非冗余(NCBInr)数据库中针对哺乳动物蛋白对这些数据进行搜索。下列的参数用于数据库搜索：单同位素质量准确度(monoisotopic mass accuracy)＜250ppm，母体电荷(parent charge)为+1，漏切位点(missed cleavages)为1，半胱氨酸的脲甲基化(carbamidomethylation)为固定修饰，蛋氨酸的氧化为可变修饰。基于PMF，蛋白评分超过67(p＝0.05)的结果是阳性鉴定结果。确认鉴定结果的其他标准是蛋白匹配应该具有至少15％的序列覆盖率(sequence coverage)并且匹配至少4个肽。
将来自(a)15％SDS-PAGE和(b)MALDI-TOF MS的分析结果结合后，确定交联血红蛋白的组成。从这些结果看出，≥70％的交联血红蛋白是β-β交联的。
实施例6
在配制后的产品中保持低水平的无活性高铁血红蛋白
与其他氧载体药物产品或根据美国专利7494974B2和美国专利7504377B2中公开的方法制备的产品相比，本发明的产品含有低水平的无活性高铁血红蛋白分子。在此实施方案中，抗氧化剂诸如N-乙酰半胱氨酸以0.2％加入至交联四聚体血红蛋白。在不加入抗氧化剂时，无活性高铁血红蛋白以高水平(12-20％)存在。本发明的产品具有低水平的无活性高铁血红蛋白(＜5％)并且其是高温稳定的，使得当用于治疗时具有较高的功效。
为了证明本发明的产品的稳定性，在80℃下进行热稳定性测试。结果绘制在图15中。根据美国专利7494974和美国专利7504377制备的产品显示高高铁血红蛋白含量(22-28％)。然而，本发明的产品显示低水平的高铁血红蛋白(＜5％)。
实施例7
包装&产品稳定性
因为本发明的产品在缺氧条件下是稳定的，因此用于该产品的包装使透气性最小化是重要的。对于静脉应用，定制设计的100mL输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，其透氧性为在室温下0.006-0.132cm3/100平方英寸/24小时/大气压。此特殊材料是VI类塑料(由USP<88>定义)，其满足体内生物学反应测试和物理化学测试并且适合于制造静脉注射用容器(需注意也可以由此材料制成其他形式的包装，取决于所需的应用)。二次包装的铝外包装袋也应用于该初级包装输液袋，其为使光暴露和氧扩散最小化提供额外的屏障。该袋由以下成分组成：0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，0.007mm铝(AL)，0.015mm尼龙(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧传递速率为在室温下0.006cm3/100平方英寸/24小时/大气压。输液袋的示意图绘制在图16中。来自本发明的每个输液袋的总透氧性为在室温下0.0025cm3/24小时/大气压。
在40℃和75％相对湿度下对上述包装材料进行稳定性研究。结果绘制在下表6中。结果证明该包装材料在延长的时期内保持低水平的高铁血红蛋白。
表6
实施例8
毒性研究
进行试验评价本发明的纯化交联四聚体血红蛋白的潜在毒性。10只雄性Sprague-Dawley大鼠分配为3组，3只在对照组中，3只在低剂量组中且4只在高剂量组中。生理盐水(对照)、低剂量的纯化的交联四聚体血红蛋白(5.52g/kg)、高剂量的纯化的交联四聚体血红蛋白(6.90g/kg)分别经颈静脉以3mL/kg/hr的输液速率连续静脉输注至大鼠。药物治疗时间表显示在下表7中。交联四聚体血红蛋白输注至大鼠持续至多达33.3小时。密切观察动物持续9天。
表7
*NS：生理盐水，Hb：交联四聚体血红蛋白
在第9天时从所有研究动物中收集血样用于临床病理学评价。在第0天至第3天和第9天收集尿液用于尿液分析。在第9天时进行最后的尸检。评价的参数包括临床观察、体重、体重变化、饮水量、临床病理学(血液学、临床化学和尿液分析)、器官重量、器官/体重比、器官/脑重量比、大体病理学和组织病理学。用本发明的交联四聚体血红蛋白治疗不引起死亡或不良的临床表现，并且对大鼠的体重变化和饮水量没有显著的影响。
对与治疗相关的临床化学和血液学参数没有观察到明显的改变。尿液检查显示在第2天时治疗组中氯化物和钾的浓度低于对照组。在第2天至第3天，与对照组相比，在治疗组中发现肉眼血尿、尿液中有较高的蛋白浓度和较多的红细胞。所有这些观察均很快地恢复至正常。在肺/体重比之间没有观察到显著的差异。在研究期间，没有观察到意外死亡和明显的毒性的临床体征。另外，大体病理学和组织学分析表明所有器官包括肺、心、肝、脾和肾没有主要异常(major abnormalities)(此类异常归因于输液的毒副作用)。
实施例9
心脏保存
交联四聚体血红蛋白可以用作比格犬心肺转流术期间心脏保存模型中的心脏停搏液。18只比格犬随机地分成3组：假手术组、St.Thomas溶液(STS)组和0.1％交联四聚体血红蛋白组。以标准的方式建立心肺转流术，对升主动脉、上腔静脉和下腔静脉和左心室插管用于排血。除了假手术组以外，在主动脉钳夹以实现心脏停搏维持120分钟后，将不含有0.1g/dL交联四聚体血红蛋白的STS(STS组)或含有0.1g/dL交联四聚体血红蛋白的STS(0.1％Hb组)输注至主动脉根中。在再灌注期间测量心功能包括心输出量、肺动脉压、肺动脉楔压、平均动脉压、中心静脉压和心率以及血气，并与基线比较。还测量心脏酶类包括肌酸激酶MB、乳酸脱氢酶和肌钙蛋白-1的释放作为心脏损伤的替代指标。进行苏木精-伊红染色和心脏含水量检测以确定再灌注120分钟后心肌的形态学和病理学改变。
心功能、氧耗量和心脏酶类释放的基线测量值在所述三组之间是类似的。在再灌注期间，与假手术组相比，在STS组中心率、心输出量和中心静脉压显著降低。然而，在0.1％Hb组中心率、心输出量、中心静脉压和心脏氧耗量得到极大地保留，类似于假手术组。与STS组相比，于STS中加入交联四聚体血红蛋白也极大地减少乳酸脱氢酶、肌酸激酶MB和肌钙蛋白-I的出现。而且，与STS组相比，0.1％Hb组中细胞肿胀、脂肪变性(fatty change)和玻璃样变(hyaline change)显著减轻。其他的测量值包括肺动脉压、肺动脉楔压、平均动脉压和心脏含水量在3个组之间没有显著差异。本研究中0.1％Hb组的所有测量值与假手术组相比没有显著差异。在心肺转流术期间与STS(目前标准的心脏停搏液)相比，处于STS中的0.1g/dL交联四聚体血红蛋白显示较好的心脏保护作用，并且结果也与假手术组相当。
实施例10
对组织，包括正常组织和癌性组织的氧合的研究
(10a)正常组织中氧合的改善
进行一些交联四聚体血红蛋白对正常组织氧合的研究(如图9中所示)。在水牛鼠(buffalo rat)中进行比较药物动力学和药效学研究。雄性近交水牛鼠通过静脉注射各自施用0.2g/kg交联四聚体血红蛋白溶液或林格氏乙酸盐缓冲液(ringer’s acetate buffer)(对照组)。通过HemocueTM光度计在1、6、24、48小时测定血浆血红蛋白的浓度-时间分布状况并与基线读数比较。该方法基于血红蛋白的光度计测量值，其中血红蛋白的浓度以g/dL直接读数。水牛鼠后腿肌肉的氧分压(pO2)通过OxylabTM组织氧合和温度监测仪(Oxford OptronixLimited)直接测量。大鼠通过腹腔内注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液进行麻醉，紧接着将氧传感器插入至肌肉中。所有pO2读数通过Datatrax2数据采集系统(World Precision Instrument)以实时的方式记录。
如图9中所见，注射0.2g/kg交联四聚体血红蛋白溶液证明了本发明的交联四聚体血红蛋白溶液的药物动力学(血浆血红蛋白浓度)和药效学(氧输送至肌肉组织)特性之间的相关性。重要的是，与血浆血红蛋白水平相比观察到氧合的明显增加持续较长的时间段。血浆血红蛋白浓度见图(A)，氧至肌肉的输送见图(B)。
(10b)极度低氧的肿瘤区域中氧合的改善
通过人鼻咽癌(CNE2)异种移植物模型评价极度低氧的肿瘤区域中氧合的改善。CNE2细胞系获自香港大学癌症遗传学实验室(Laboratory of CancerGenetics)。约1x106癌细胞经皮下注射至4-至6-周龄近交BALB/c AnN-nu(裸鼠)小鼠中。当肿瘤异种移植物达到8-10mm的直径时，通过OxylabTM组织氧合和温度监测仪(Oxford Optronix Limited)直接监测肿瘤块内的氧分压。使用完全计算机化的PTS30微型定位系统(Discovery Technology International)沿组织轨迹测量氧分压。所有pO2读数通过Datatrax2数据采集系统(WorldPrecision Instrument)以实时的方式记录。当pO2读数稳定时，通过小鼠的尾静脉静脉注射1.2g/kg本发明的交联四聚体血红蛋白溶液，并测量组织氧合。结果证明在大多数低氧的肿瘤区域中氧合均明显增加。在静脉注射1.2g/kg交联四聚体血红蛋白后，中位数pO2值分别从0.2mmHg升高至3.9mmHg(在3小时内)和10.6mmHg(在6小时内)(显示在图10中)。
实施例11
癌症治疗研究(交联四聚体血红蛋白的化学增敏效应)
用不同的癌细胞系评价本发明的交联四聚体血红蛋白的化学增敏效应。白血病细胞系(Jurkat)，结肠癌细胞系(COLO205)，顺铂耐药的肺癌细胞系(A549/Cisp)和阿霉素耐药的乳腺癌细胞系(MCF-7/ADM)获自中国医学科学院癌症研究所。将8000个Jurkat细胞、4000个COLO205细胞、3000个A549/Cisp细胞和3000个MCF-7/ADM细胞接种至96孔板，每种细胞3个复孔。细胞贴壁后，在37℃下与单独的各种化疗剂分别温育，或与各种化疗剂连同0.5mg/mL交联四聚体血红蛋白溶液一起温育。Jurkat细胞用0.31、0.63、1.25、2.5、5和10μg/mL的硫酸长春新碱处理；COLO205细胞用0.78、1.56、3.13、6.25和12.5μg/mL的5-氟尿嘧啶处理；A549/Cisp细胞用0.39、0.78、1.56、3.13、6.25和12.5μg/mL的顺铂处理，MCF-7/ADM细胞用0.39、0.78、1.56、3.13、6.25和12.5μg/mL的阿霉素处理。处理后，癌细胞生长的抑制通过ATP肿瘤化学敏感性测定(ATP-TCA)确定。
食管癌细胞系HKESC-1获自香港大学癌症遗传学实验室。将2000个癌细胞接种至96孔板。细胞贴壁后，分别与0.08、0.4、2、10和50μg/mL的顺铂单独温育，或与顺铂连同3mg/mL交联四聚体血红蛋白溶液一起温育。温育后，细胞毒性通过MTT细胞增殖法检测。结果显示添加本发明的交联四聚体血红蛋白显著地增强了各种癌细胞系的化学敏感性，包括对化疗高度耐药的A549/Cisp和MCF-7/ADM细胞(显示在图8中)。
实施例12
急性严重失血性休克的治疗
(12a)比格犬急性失血性休克的治疗
本发明的交联四聚体血红蛋白在比格犬的急性严重失血性休克模型中用作复苏剂。60只比格犬根据复苏剂随机地分成4组，每组15只犬。
1组：葡聚糖(阴性对照)
2组：动物自体血(阳性对照)
3组：低剂量治疗(0.35g交联四聚体血红蛋白/kg体重)
4组：中等剂量治疗(1.05g交联四聚体血红蛋白/kg体重)
以50mL/kg体重的体积抽取动物全血造成急性严重失血性休克。造成失血性休克10分钟后，将葡聚糖(50mL/kg)、动物自体血(50mL/kg)、不同剂量的交联四聚体血红蛋白(5mL/kg，15mL/kg)输注至动物体内。交联四聚体血红蛋白的输液速率设置为10mL/kg/h，之后，所有试验动物观察7天。在研究期间观察和分析一组参数，包括存活、体重、心电图(ECG)、血压、心率、呼吸速率、体温、血浆血红蛋白浓度、血液学、动脉血气、尿液分析、临床化学、凝血、身体状况和不良事件。其中，存活是主要终点指标。治疗7天后，交联四聚体血红蛋白治疗组与正常组和自体血组相比具有高得多的存活率(如下表8中所示)。
表8
犬失血性休克模型中的研究
Figure BDA0000087876060000261
(12b)大鼠急性严重失血性休克的治疗
本发明的交联四聚体血红蛋白也在大鼠的急性严重失血性休克模型中用作复苏剂。80只Sprague-Dawley大鼠根据复苏剂随机地分成5组，每组16只大鼠。
1组：乳酸盐林格溶液(阴性对照)
2组：动物自体血(阳性对照)
3组：低剂量治疗(0.1g交联四聚体血红蛋白/kg体重)
4组：中等剂量治疗(0.3g交联四聚体血红蛋白/kg体重)
5组：高剂量治疗(0.5g交联四聚体血红蛋白/kg体重)
通过抽取50％的动物全血，估计为35mL/kg体重，造成急性严重失血性休克。造成失血性休克10分钟后，将乳酸盐林格溶液、动物自体血、不同剂量的交联四聚体血红蛋白(0.1g Hb/kg，0.3g Hb/kg，0.5g Hb/kg)输注至动物体内。交联四聚体血红蛋白的输液速率设置为5mL/h，之后，所有试验动物观察24小时。在研究期间观察和分析一组参数，包括存活、血流动力学、心肌力学、心输出量、心功能、血气、组织氧输送和氧耗量、组织灌注和氧分压(肝、肾和脑)、肝功能和肾功能、血液流变学(血液粘度)、线粒体呼吸控制速率(肝、肾和脑)。其中，存活是主要终点指标。观察24小时后，本发明的交联四聚体血红蛋白治疗组与正常组和自体血组相比具有高得多的存活率(显示在下表9中)。
表9
Figure BDA0000087876060000271
*Hb：交联四聚体血红蛋白
实施例13：体外高铁血红蛋白形成研究
现有技术已经指出高分子量聚合血红蛋白溶液是优选的，因为其能较长时间地存在于在循环系统中。因此，对本发明的稳定的交联四聚体血红蛋白与高分子量聚合血红蛋白在体外进行比较以分析在模拟循环条件下的稳定性。测试通路描绘在图17中。在形成高铁血红蛋白的旁路回路中，A为样品储器，B为样品出口，C为泵，D为Liqui-CelTM接触器，E为样品收集点，且F为样品入口。比较本发明的交联四聚体血红蛋白溶液与市售产品
Figure BDA0000087876060000272
的高铁血红蛋白形成的时间过程，该市售产品含有约68％的聚合体级分(≥128,000MW)。在试验前，所有样品稀释至5g/dL，并将50mL稀释的样品从样品入口引入至样品储器中。液泵速率设置为30mL/min，并使样品充满回路。在整个试验期间，样品储器的温度保持在37℃。为了测量高铁血红蛋白水平，从样品收集点收集0.2mL测试样品用血氧分析仪(co-oximetry)(IL-682，InstrumentationLaboratory)进行检测。然后压缩空气以2.0mL/min的流速通过liqui-celTM膜接触器从而开始样品的氧合。以30分钟的间隔收集0.2mL样品。处理5小时后，本发明的交联四聚体血红蛋白溶液和市售产品
Figure BDA0000087876060000281
的高铁血红蛋白级分分别增加至8.7％和16.4％。这证明聚合血红蛋白的无活性高铁血红蛋白形成速率大大高于本发明的交联四聚体血红蛋白(图18)。
尽管已经就多个实施方案描述了本发明，但这些实施方案并非限制性的。本领域普通技术人员将理解大量的变动和修饰。这样的变动和修饰被认为包括在下列权利要求的范围内。

Claims (13)

1.一种制备高度纯化的和高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述方法包括：
a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；
b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；
c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；
d)洗涤所述滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质，得到洗涤过的红细胞；
e)在快速细胞裂解设备中，通过可控的低渗裂解以50-1000升/小时的流速来破裂所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间，从而形成包含红细胞裂解产物的溶液；
f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少部分废截留物；
g)从所述裂解产物提取第一血红蛋白溶液；
h)使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质，以从第一血红蛋白溶液中进一步去除任何病毒和残留废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液；
i)对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除磷脂、蛋白杂质和二聚体血红蛋白并形成无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液；
j)使用被配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液；
k)在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液中血红蛋白分子的巯基使得各血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子；
l)通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯交联所述巯基保护的血红蛋白，从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa，并且基本上由未聚合的交联四聚体血红蛋白组成；
m)用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白；
n)通过洗涤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质；
o)向所述交联四聚体血红蛋白加入浓度为0.2-0.4％的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5％以下；和
p)将所述低二聚体、无磷脂、巯基保护的在高达80℃的温度下高温稳定的不含聚合血红蛋白的交联四聚体血红蛋白加入药学可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。
3.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述交联四聚体血红蛋白衍生自牛、猪、犬或马血红蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述柱色谱包含一个或多个阳离子交换柱和阴离子交换柱。
5.根据权利要求4所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述离子交换柱为一个或多个DEAE柱、CM柱和/或羟磷灰石柱。
6.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯的血红蛋白交联包括至少α-α和/或β-β交联。
7.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的50％。
8.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的60％。
9.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的70％。
10.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述药学可接受的载体为生理缓冲液或水。
11.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，所述方法还包括将已制备的组合物包装在多层柔性输液包装中，所述输液包装在日常环境条件下的透氧性为每24小时小于0.0025cm3。
12.一种高度纯化和高温稳定的包含氧载体的药物组合物，所述药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由通过权利要求1所述的方法形成的未聚合的交联四聚体血红蛋白组成。
13.一种氧合组织的方法，所述方法包括在体内或离体条件下向所述组织提供权利要求12所述的组合物。
CN2011800012855A 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用 Active CN102405051B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310054976.2A CN103169954B (zh) 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34876410P 2010-05-27 2010-05-27
US61/348,764 2010-05-27
US13/013,847 2011-01-26
US13/013,847 US8742073B2 (en) 2010-05-27 2011-01-26 Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof
US13/083,639 2011-04-11
US13/083,639 US7989593B1 (en) 2010-05-27 2011-04-11 Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof
PCT/US2011/032594 WO2011149602A1 (en) 2010-05-27 2011-04-15 High-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310054976.2A Division CN103169954B (zh) 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102405051A true CN102405051A (zh) 2012-04-04
CN102405051B CN102405051B (zh) 2013-01-23

Family

ID=44314337

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800012855A Active CN102405051B (zh) 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用
CN201310054976.2A Expired - Fee Related CN103169954B (zh) 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310054976.2A Expired - Fee Related CN103169954B (zh) 2010-05-27 2011-04-15 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用

Country Status (21)

Country Link
US (1) US7989593B1 (zh)
EP (1) EP2411025B1 (zh)
JP (1) JP5261806B2 (zh)
KR (1) KR101185437B1 (zh)
CN (2) CN102405051B (zh)
AR (1) AR081222A1 (zh)
AU (1) AU2011221433B2 (zh)
CA (1) CA2752943C (zh)
CY (1) CY1115986T1 (zh)
DK (1) DK2411025T3 (zh)
ES (1) ES2527608T3 (zh)
HK (2) HK1160604A1 (zh)
NZ (1) NZ594915A (zh)
PL (1) PL2411025T3 (zh)
PT (1) PT2411025E (zh)
RU (1) RU2475252C1 (zh)
SA (1) SA111320476B1 (zh)
SG (1) SG182237A1 (zh)
TW (1) TWI377947B (zh)
WO (1) WO2011149602A1 (zh)
ZA (1) ZA201208726B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103251998A (zh) * 2012-11-08 2013-08-21 黄炳镠 用于血红蛋白氧载体（hboc）溶液的精确输注递送系统
CN104717966A (zh) * 2012-10-12 2015-06-17 视界全球控股有限公司 用于癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物
CN106421805A (zh) * 2016-09-14 2017-02-22 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种右旋糖酐交联血红蛋白氧载体及其制备方法与应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8048856B1 (en) * 2010-06-23 2011-11-01 Billion King, Ltd. Treatment methods using a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition
US8084581B1 (en) 2011-04-29 2011-12-27 Bing Lou Wong Method for removing unmodified hemoglobin from cross-linked hemoglobin solutions including polymeric hemoglobin with a high temperature short time heat treatment apparatus
US20130052232A1 (en) * 2011-08-31 2013-02-28 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking
US9066933B2 (en) 2011-09-06 2015-06-30 Billion King International Ltd. Oral delivery for hemoglobin based oxygen carriers
US10385116B2 (en) 2013-01-07 2019-08-20 Omniox, Inc. Polymeric forms of H-NOX proteins
EA032164B1 (ru) * 2013-05-13 2019-04-30 Вижн Глобал Холдингс Лтд. Содержащая модифицированное лекарственное вещество на основе гемоглобина фармацевтическая композиция для таргетной терапии рака и диагностической визуализации
US9814759B2 (en) 2014-07-02 2017-11-14 Cheer Global Ltd. Pharmaceutical composition comprising recombinant hemoglobin protein or subunit-based therapeutic agent for cancer targeting treatment
BR112017019862A2 (pt) * 2015-03-17 2018-05-29 Omniox Inc modulação de imunidade de tumor através de liberaçâo de o2 mediada por proteína
US9763889B2 (en) 2015-06-29 2017-09-19 Billion King International Ltd. Oral delivery system for hemoglobin based oxygen carriers
US10052290B2 (en) 2016-02-04 2018-08-21 Billion King International Ltd. Enteric-coated hemoglobin multiparticulate for oral delivery of hemoglobin based oxygen carriers
WO2020080978A2 (ru) * 2018-10-19 2020-04-23 Рахимджан Ахметджанович РОЗИЕВ Cпособ получения кровезаменителя для применения в ветеринарии
BR112022003751A2 (pt) * 2019-08-29 2022-05-31 Billion King Int Ltd Análogos de hemoglobina reticulada com tiosuccinila e métodos de uso e preparação dos mesmos
CN113621055B (zh) * 2021-08-23 2023-05-02 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用
CA3231611A1 (en) * 2021-09-17 2023-03-23 Nenad SESTAN Methods, systems and compositions for restoration and preservation of intact organs in a mammal

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5250665A (en) * 1991-05-31 1993-10-05 The University Of Toronto Innovations Foundation Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation
US5618919A (en) * 1986-11-10 1997-04-08 Biopure Corportion Ultra pure hemoglobin solutions and blood-substitutes
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
US7041800B1 (en) * 1995-03-23 2006-05-09 Biopure Corporation Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap
US20100035797A1 (en) * 2006-10-23 2010-02-11 IKOR Inc., a South Dakota Corporation Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4529719A (en) 1983-05-04 1985-07-16 Tye Ross W Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin
FR2548671B1 (fr) 1983-07-07 1986-05-02 Merieux Inst Procede de preparation de globine a partir d'hemoglobine et globine obtenue par ce procede
US4831012A (en) 1984-03-23 1989-05-16 Baxter International Inc. Purified hemoglobin solutions and method for making same
US4600531A (en) 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
US4598064A (en) 1984-06-27 1986-07-01 University Of Iowa Research Foundation Alpha-alpha cross-linked hemoglobins
USRE34271E (en) 1984-06-27 1993-06-01 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
JPH0750329B2 (ja) 1986-06-23 1995-05-31 富士写真フイルム株式会社 画像形成材料
US5753616A (en) 1986-11-10 1998-05-19 Biopure Corporation Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute
US5955581A (en) 1986-11-10 1999-09-21 Biopure Corporation Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute
US5084558A (en) 1987-10-13 1992-01-28 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
US5189146A (en) 1987-05-05 1993-02-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence Pasteurizable, freeze-driable hemoglobin-based blood substitute
US5439882A (en) 1989-12-29 1995-08-08 Texas Tech University Health Sciences Center Blood substitute
US5344393A (en) 1992-02-28 1994-09-06 Alliance Pharmaceutical Corp. Use of synthetic oxygen carriers to facilitate oxygen delivery
US6187744B1 (en) 1992-03-11 2001-02-13 Michael W. Rooney Methods and compositions for regulating the intravascular flow and oxygenating activity of hemoglobin in a human or animal subject
US5399671A (en) * 1992-11-18 1995-03-21 Kluger; Ronald Specifically crosslinked hemoglobin with free functionality
US5840851A (en) 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
US5725839A (en) 1993-08-16 1998-03-10 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules for ERI or MRI
US5804561A (en) 1993-08-16 1998-09-08 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5840701A (en) 1993-08-16 1998-11-24 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
TW381022B (en) 1993-08-16 2000-02-01 Hsia Jen Chang Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute
US5741893A (en) 1993-08-16 1998-04-21 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5767089A (en) 1993-08-16 1998-06-16 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5824781A (en) 1993-08-16 1998-10-20 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5807831A (en) 1993-08-16 1998-09-15 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5817632A (en) 1993-08-16 1998-10-06 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5631219A (en) 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
EP0804734B1 (en) 1994-05-13 2005-05-04 Miltenyi Biotec GmbH Sterile and pyrogen-free columns coupled to protein for binding and removal of substances from blood
SE9500724D0 (sv) 1994-06-23 1995-02-24 Pharmacia Ab Filtrering
US6610832B1 (en) 1995-03-23 2003-08-26 Biopure Corporation Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap
ES2179188T3 (es) * 1995-03-23 2003-01-16 Biopure Corp Sustituto de la sangre a base de hemoglobina polimerizada estable.
US5895810A (en) 1995-03-23 1999-04-20 Biopure Corporation Stable polymerized hemoglobin and use thereof
US5865784A (en) 1995-06-07 1999-02-02 Alliance Pharmaceutical Corp. Method of hemodilution facilitated by monitoring oxygenation status
US5691453A (en) 1995-06-07 1997-11-25 Biopure Corporation Separation of polymerized hemoglobin from unpolymerized hemoglobin on hydroxyapatite using HPLC
WO1998034955A1 (en) * 1997-02-06 1998-08-13 Duke University Medical Center No-modified hemoglobins and uses therefor
CA2236794A1 (en) 1995-11-30 1997-06-05 Bruce A. Kerwin Method for control of functionality during cross-linking of hemoglobins
EP0892830B1 (de) 1996-03-21 2003-08-13 Kobusch-Sengewald GmbH &amp; Co.KG Mehrlagenfolie, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JP2000509374A (ja) 1996-04-19 2000-07-25 アルファ セラピュティック コーポレイション 凍結乾燥した血液タンパク質のウイルス不活性化方法
RU2080865C1 (ru) * 1996-07-08 1997-06-10 Станислав Людвигович Люблинский Способ получения гемоглобина
EP1011710B1 (en) 1997-02-28 2005-08-17 The Regents of the University of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
US5814601A (en) 1997-02-28 1998-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
AU745209B2 (en) 1998-01-06 2002-03-14 Cerus Corporation Methods for quenching pathogen inactivators in biological materials
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6894150B1 (en) 1999-10-01 2005-05-17 Ross Walden Tye Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
US6747132B2 (en) 2000-11-29 2004-06-08 Apex Biosciences, Inc. Methods for the synthesis of a modified hemoglobin solution
US6518010B2 (en) 2001-02-28 2003-02-11 Biopure Corporation Use of defibrinated blood for manufacture of a hemoglobin-based oxygen carrier
MXPA03009555A (es) 2001-04-18 2004-12-06 Northfield Lab Sistema de recipiente flexible para almacenamiento de soluciones de hemoglobina estabilizadas.
JP4260417B2 (ja) 2001-05-23 2009-04-30 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 溶液を輸送し脱酸素するためのシステム及び方法
US7038016B2 (en) 2001-08-21 2006-05-02 Apex Bioscience, Inc. Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution
US20030153491A1 (en) 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20050164915A1 (en) 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
AU2003299700B2 (en) 2002-12-23 2009-03-26 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Modified hemoglobin and methods of making same
EP1592437A4 (en) 2003-01-29 2007-12-26 Northfield Lab POLYMERIZED HEMOGLOBIN SOLUTIONS WITH REDUCED TETRAMER QUANTITY AND MANUFACTURING METHOD
US7135554B1 (en) * 2004-01-27 2006-11-14 Biopure Corporation Method of forming a polymerized hemoglobin solution from stabilized hemoglobin
JP5346468B2 (ja) 2004-10-29 2013-11-20 シーラス コーポレイション 赤血球不活性化プロセスのための改善されたクエンチング方法
WO2007065265A1 (en) 2005-12-08 2007-06-14 Ronald Kluger Cross-linking reagents for hemoglobin and hemoglobin products cross-linked therewith
US7759306B2 (en) 2006-05-16 2010-07-20 Simoni Jan S Methods of treating acute blood loss
US7795401B2 (en) 2006-09-06 2010-09-14 National Chung Cheng University Modified hemoglobin with allosteric effector conjugated
CN101168565A (zh) * 2006-10-23 2008-04-30 爱科有限公司 一氧化氮阻断的交联四聚体血红蛋白
US7494974B2 (en) 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
US7932356B1 (en) 2010-06-23 2011-04-26 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618919A (en) * 1986-11-10 1997-04-08 Biopure Corportion Ultra pure hemoglobin solutions and blood-substitutes
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
US5250665A (en) * 1991-05-31 1993-10-05 The University Of Toronto Innovations Foundation Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation
US7041800B1 (en) * 1995-03-23 2006-05-09 Biopure Corporation Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap
US20100035797A1 (en) * 2006-10-23 2010-02-11 IKOR Inc., a South Dakota Corporation Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU,XL ET AL: "Disuccinimidyl suberate cross-linked hemoglobin as a novel red blood cell substitute", 《SCIENCE IN CHINA SERIES C-LIFE SCIENCES》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104717966A (zh) * 2012-10-12 2015-06-17 视界全球控股有限公司 用于癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物
CN104717966B (zh) * 2012-10-12 2018-08-24 视界全球控股有限公司 用于癌症靶向治疗和预防癌症复发的含有基于血红蛋白的氧载体的药物组合物
CN103251998A (zh) * 2012-11-08 2013-08-21 黄炳镠 用于血红蛋白氧载体（hboc）溶液的精确输注递送系统
CN103251998B (zh) * 2012-11-08 2015-09-02 亿京国际有限公司 用于血红蛋白氧载体(hboc)溶液的精确输注递送系统
CN106421805A (zh) * 2016-09-14 2017-02-22 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种右旋糖酐交联血红蛋白氧载体及其制备方法与应用
CN106421805B (zh) * 2016-09-14 2019-06-04 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种右旋糖酐交联血红蛋白氧载体及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
AR081222A1 (es) 2012-07-04
SA111320476B1 (ar) 2013-07-28
CA2752943A1 (en) 2011-11-27
WO2011149602A8 (en) 2012-05-24
SG182237A1 (en) 2012-08-30
DK2411025T3 (en) 2015-02-16
EP2411025A1 (en) 2012-02-01
HK1166258A1 (en) 2012-10-26
ZA201208726B (en) 2013-09-25
WO2011149602A1 (en) 2011-12-01
CA2752943C (en) 2013-10-08
JP2012526859A (ja) 2012-11-01
NZ594915A (en) 2013-06-28
CN103169954A (zh) 2013-06-26
KR20110138215A (ko) 2011-12-26
US7989593B1 (en) 2011-08-02
KR101185437B1 (ko) 2012-10-02
PT2411025E (pt) 2015-02-04
JP5261806B2 (ja) 2013-08-14
AU2011221433B2 (en) 2012-03-29
CN103169954B (zh) 2016-01-20
AU2011221433A1 (en) 2011-12-15
TW201141493A (en) 2011-12-01
EP2411025A4 (en) 2012-11-14
RU2475252C1 (ru) 2013-02-20
CN102405051B (zh) 2013-01-23
TWI377947B (en) 2012-12-01
CY1115986T1 (el) 2017-01-25
PL2411025T3 (pl) 2015-04-30
EP2411025B1 (en) 2014-11-05
HK1160604A1 (zh) 2012-08-10
ES2527608T3 (es) 2015-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102405051B (zh) 一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用
CN102510753B (zh) 一种制备热稳定的包含氧载体的组合物的方法
KR101121102B1 (ko) 열 안정성 산소 운반체 함유 약학 조성물의 제조 방법
JP6148673B2 (ja) β‐β架橋を容易にする熱安定性酸素担体含有組成物の調製方法
CN103687609B (zh) 用于不同治疗应用的含热稳定氧载体的药物组合物
JP2010507679A (ja) 酸化窒素ブロック型架橋四量体ヘモグロビン
KR20140031915A (ko) 고온 단기 열처리 기구로 변형되지 않은 헤모글로빈을 중합 헤모글로빈을 포함하는 상호결합된 헤모글로빈 용액으로부터 제거하는 방법
US8742073B2 (en) Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof
US20130219829A1 (en) Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1166258

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: FENGAN INTERNATIONAL CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: HUANG BING

Effective date: 20130305

Free format text: FORMER OWNER: GUO RUIYI

Effective date: 20130305

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; TO: HONG KONG, CHINA

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20130305

Address after: Room 23, building 2301, Fu Hui business centre, 27 Li Fu Street, Sheung Wan, Hongkong, China

Patentee after: Feng an International Limited

Address before: American California

Patentee before: Huang Bingliao

Patentee before: Guo Ruiyi

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1166258

Country of ref document: HK