KR20110138215A

KR20110138215A - 고온 안정성 산소 담체 함유 약학 조성물의 제조 방법 및 그의 용도

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Publication number: KR20110138215A
Application number: KR1020117020242A
Authority: KR
Inventors: 빙 로우 웡; 수이 이 쿽
Original assignee: 빙 로우 웡; 수이 이 쿽
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-12-26
Also published as: HK1166258A1; US7989593B1; PT2411025E; HK1160604A1; SG182237A1; CA2752943A1; EP2411025A1; ZA201208726B; SA111320476B1; JP2012526859A; TWI377947B; TW201141493A; CN103169954A; AU2011221433B2; CN102405051B; CA2752943C; KR101185437B1; DK2411025T3; EP2411025B1; WO2011149602A1

Abstract

신장 손상 및 혈관수축을 야기하지 않으면서 포유동물에 사용하기에 적합한 높은 효율의 산소 전달을 갖는 고온-안정성이고 고도로 정제된 가교결합된(선택적으로 ≥70% β-β 결합된) 사량체성 헤모글로빈을 제공한다. 상기 헤모글로빈의 이량체 형태를 변질시키고 전혈로부터의 적혈구 상에서 정제 공정을 수행한다. 즉석 세포용해 장치에서 조절된 저장성 용해는 백혈구의 용해를 방지한다. 백혈구로부터의 핵산 및 인지질 불순물은 검출되지 않는다. 반응성 설프하이드릴 그룹의 설프하이드릴 시약에 의한 차단을 산소 공급된 환경에서 수행한다. 관류 컬럼 크로마토그래피는 상이한 혈장 단백질 불순물들을 제거한다. N-아세틸 시스테인을 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 첨가하여 낮은 수준의 메트-헤모글로빈을 유지시킨다. 상기 안정화된 헤모글로빈을 알루미늄 겉포장을 갖는 주입 주머니 중에서 보존하여 산소 침입으로부터 불활성 메트-헤모글로빈의 형성을 방지한다. 상기 생성물은 조직 산소 공급 및 암 치료에 사용된다.

Description

고온 안정성 산소 담체 함유 약학 조성물의 제조 방법 및 그의 용도{A METHOD FOR THE PREPARATION OF A HIGH-TEMPERATURE STABLE OXYGEN-CARRIER-CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THE USE THEREOF}

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2010년 5월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 61/348,764 호 및 2011년 1월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제 13/013,847 호의 우선권을 청구하며, 이들 출원의 내용은 본 발명에 참조로서 병합된다.

기술 분야

본 발명은 고온 안정성 산소-담체 함유 약학 조성물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 및 다른 동물의 암 치료, 산소-결핍 장애 및 기관 보존을 위한 고온 안정성 산소 담체 함유 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

헤모글로빈은 대부분의 척추동물에서 혈관계와 조직 간의 가스 교환을 위해서 중요한 역할을 한다. 이것은 호흡계로부터 혈액 순환을 통해 체세포로 산소를 운반하고, 또한 폐 대사 산물인 이산화탄소를 체세포로부터 떨어져 호흡계(여기에서 상기 이산화탄소가 내뱉어진다)로 운반하는 책임이 있다. 헤모글로빈은 이러한 산소 운반 특징을 가지므로, 상기 헤모글로빈이 생체 외에서 안정화되고 생체 내에서 사용될 수 있다면, 이를 효능 있는 산소 공급자로서 사용할 수 있다.

천연 헤모글로빈은 적혈구 내에서 존재할 때 일반적으로 안정한 사량체이다. 그러나, 천연 헤모글로빈이 적혈구로부터 제거되면, 상기는 혈장 중에서 불안정해지고 2 개의 α-β 이량체로 분할된다. 이들 이량체는 각각 분자량이 대략 32 kDa이다. 이들 이량체는 신장을 통해 여과되고 배설될 때 상당한 신장 손상을 일으킬 수도 있다. 상기 사량체 결합의 붕괴는 작용성 헤모글로빈의 순환 지속성에도 부정적인 영향을 미친다.

상기 사량체의 붕괴를 방지하기 위해, 헤모글로빈 가공에 있어서 최근의 개발은 상기 사량체 내의 분자 내 결합뿐만 아니라 상기 사량체 간의 분자 간 결합을 생성시켜, 중합체성 헤모글로빈을 형성시키는 다양한 가교결합 기법들을 통합시켰다. 종래 기술은 중합체성 헤모글로빈이 상기 헤모글로빈의 순환 반감기를 증가시키기 위해 바람직한 형태임을 교시한다. 그러나, 본 발명자들에 의해 측정된 바와 같이, 중합체성 헤모글로빈은 혈액 순환 시 메트-헤모글로빈으로 보다 쉽게 전환된다. 메트-헤모글로빈은 산소와 결합할 수 없고, 따라서 조직에 산소를 공급할 수 없다. 그러므로, 중합체성 헤모글로빈의 형성을 야기하는 종래 기술에 의해 교시된 가교결합은 문제가 된다. 당해 분야에서는 중합체성 헤모글로빈의 동시적인 형성 없이 안정한 사량체를 생성시키는 분자 내 가교결합을 허용하는 기법이 필요하다.

헤모글로빈을 안정화시키기 위한 종래 기술의 시도가 갖는 추가의 문제점은 받아들이기 어려울 정도로 높은 퍼센트의 이량체 단위를 포함하는 사량체성 헤모글로빈의 생성을 포함하며; 상기 이량체의 존재는 상기 헤모글로빈 조성물을 포유동물에 투여하기에 만족스럽지 못하게 한다. 상기 헤모글로빈의 이량체 형태는 포유동물의 신체에 심한 신장 손상을 유발할 수 있으며; 이러한 신장 손상은 사망을 일으킬 정도로 상당히 심각할 수 있다. 따라서 당해 분야에서는 최종 생성물 중에 불필요한 이량체 형태가 낮게 존재하는 안정한 사량체성 헤모글로빈을 생성시킬 필요가 있다.

안정한 헤모글로빈을 생성시키기 위한 종래 기술의 시도가 갖는 추가의 문제점은 포유동물에게서 알러지 결과를 초래할 수 있는 면역글로불린 G와 같은 단백질 불순물의 존재를 포함한다. 따라서, 당해 분야에서는 단백질 불순물이 없는 안정한 사량체성 헤모글로빈을 생성시킬 수 있는 방법이 필요하다.

종래 기술의 헤모글로빈 제제가 갖는 다른 문제점은 포유동물의 수혈에 따른 혈관수축을 포함한다. 상기 혈관수축은 헤모글로빈 분자의 반응성 설프하이드릴 그룹에 결합하는 내피세포 유래 평활근 이완 인자 때문인 것으로 나타났다. 그러므로, 당해 분야에서는 수혈에 따른 혈관수축을 유발하지 않는 안정화된 사량체성 헤모글로빈을 생성시킬 필요가 있다.

상기 문제점들 이외에, 당해 분야에서는 인지질이 없고 산업적인 규모로 생산할 수 있는 안정화된 사량체성 헤모글로빈이 필요하다.

본 발명은 심한 신장 손상, 혈관 유해 영향, 또는 다른 심한 부작용(사망 포함)을 유발하지 않으면서 포유동물에 사용하기에 적합한 고온 안정성의 정제되고 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 고온 안정성의 정제되고 가교결합된 사량체성 헤모글로빈과, 생체 내 및 생체 외 조직의 산소 공급을 위한 상기 헤모글로빈의 용도를 포함한다.

상기 방법은 적어도 적혈구 및 혈장을 포함한 포유동물 전혈의 출발 물질을 포함한다. 적혈구를 상기 포유동물 전혈로부터 분리한 다음 여과하여, 여과된 적혈구 분획을 수득한다. 상기 여과된 적혈구 분획을 세척하여 혈장 단백질 불순물을 제거한다. 상기 세척된 적혈구를 즉석 세포 용해 장치에서 50 내지 1000 리터/시간의 유량으로 백혈구의 용해 없이 적혈구를 용해하기에 충분한 시간 동안 조절된 저장성 용해에 의해 파괴한다. 여과를 수행하여 상기 용해물로부터 폐 농축물의 적어도 일부를 제거한다. 상기 용해물로부터 제 1 헤모글로빈 용액을 추출한다.

제 1 한외여과 공정을, 사량체성 헤모글로빈보다 더 큰 분자량을 갖는 불순물을 제거하고, 상기 제 1 헤모글로빈 용액으로부터 임의의 바이러스 및 잔류 폐 농축물을 추가로 제거하여 제 2 헤모글로빈 용액을 수득하도록 구성된 한외여과 필터를 사용해 수행한다. 관류(flowthrough) 컬럼 크로마토그래피를 제 2 헤모글로빈 용액 상에서 수행하여 단백질 불순물, 이량체성 헤모글로빈 및 인지질을 제거하여 인지질 무 함유 저 이량체 헤모글로빈 용액을 형성시킨다. 제 2 한외여과 공정을, 불순물을 제거하도록 구성된 필터를 사용해 상기 인지질 무 함유 저 이량체 헤모글로빈 용액 상에서 수행하여 농축 정제된 인지질 무 함유 저 이량체 헤모글로빈 용액을 생성시킨다.

헤모글로빈 분자의 설프하이드릴 그룹을 충분히 산소 공급된 환경에서 설프하이드릴 시약에 의해 상기 농축 정제된 인지질 무 함유 저 이량체 헤모글로빈 용액 중에서 차단시킨다. 상기 생성된 헤모글로빈 분자들은 각각, 상기 헤모글로빈 분자들이 시스테인 부위에서 내피세포 유래 평활근 이완 인자와 결합할 수 없도록 티올-보호 그룹을 포함하는 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는다.

상기 티올-보호된 헤모글로빈의 적어도 α-α 및/또는 β-β 서브유닛들은, 생성되는 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 분자량이 60 내지 70 kDa가 되도록 비스-3,5-다이브로모살리시 퓨마레이트에 의해 가교결합되어 중합체성 헤모글로빈의 형성 없이 고온 안정성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 형성한다. 적합한 생리학적 완충제를 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈과 교환한다. 임의의 잔류 비-가교결합된 사량체성 헤모글로빈 및 임의의 잔류 화학물질들을 접선류 한외여과(tangential-flow ultrafiltration)를 사용함으로써 제거한다. N-아세틸 시스테인을 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 0.2 내지 0.4%의 농도로 첨가하여 메트-헤모글로빈의 수준을 5% 아래로 유지시킨다. 이어서, 상기 인지질 무 함유, 저 이량체, 티올-보호된 고온 안정성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 약학적으로 허용 가능한 담체에 첨가하며; 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적 완충제 또는 물일 수 있다.

상기 과정에 이어서, 생성된 헤모글로빈을 기밀식 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐-아세테이트, 에틸렌-비닐 알콜(PE, EVA, EVOH) 주입 패키지에 선택적으로 패키징한다. 상기 패키징은 불활성 메트-헤모글로빈을 형성시키는 산소 오염을 방지한다.

상기 방법에 의해 생성된 고온 안정성 가교결합된 헤모글로빈은 다양한 암, 예를 들어 백혈병, 결장직장암, 폐암, 유방암, 비인두암 및 식도암의 치료에 사용된다. 상기 암 세포 파괴 기전은 종양 세포에서의 산소 공급을 개선시키고, 이에 의해 방사선 및 화학요법제에 대한 감도를 향상시키는 것이다. 상기 고온 안정성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 또한 이식 중 기관 조직의 보존을 위해, 또는 생체 내 산소 공급이 결여된 상황에서, 예를 들어 산소 결핍된 심장에서 심장의 보존을 위해 사용한다.

도 1은 상이한 헤모글로빈들의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 2는 본 발명 방법의 개요를 도시하는 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 방법에서 사용된 즉석 세포용해 장치를 개략적으로 도시한다.
도 4는 산소 공급 및 산소 제거된 환경에서 헤모글로빈과 설프하이드릴 시약과의 반응을 나타내는 그래프이다.
도 5는 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 대한 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 도시한다.
도 6은 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS) 분석을 도시한다.
도 7은 (a) 정제된 헤모글로빈 용액 및 (b) 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 대한 원편광 이색성(CD) 분광법 분석을 나타낸다.
도 8은 시험관 내 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 화학요법 증감 효과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 사용하는 정상 조직 중 산소공급의 개선을 도시한다.
도 10은 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 사용하는 매우 저 산소성인 종양 영역의 산소공급의 개선을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 안정화된 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 의한 처리 후 중증 출혈성 쇼크의 래트 모델에서 평균 동맥압 변화를 나타낸다.
도 12는 관류 컬럼 크로마토그래피에 대한 용출 프로파일이며; 상기 헤모글로빈 용액은 상기 관류 분획 중에 있다.
도 13은 산업적 규모의 실행을 위한 한외 여과와 병행되는 관류 CM 컬럼 크로마토그래피 시스템을 개략적으로 도시한다.
도 14는 산소 공급된 환경에서의 설프하이드릴 반응과 산소 제거된 환경에서의 반응 간의 비교이다.
도 15는 종래 기술의 헤모글로빈과 비교한, 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 열 안정성을 입증하는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 주입 주머니의 개략적인 묘사이다.
도 17은 시험관 내 메트-헤모글로빈의 형성을 시험하기 위해 사용한 장치의 개략적인 묘사이다.
도 18은 도 17의 장치에서 중합체성 헤모글로빈과 본 발명의 헤모글로빈에 대한 메트-헤모글로빈 형성률을 도시한다.

헤모글로빈은 포유동물 및 다른 동물들의 혈액의 적혈구 중 철-함유 산소-운반 단백질이다. 헤모글로빈은 단백질의 3차 및 4차 구조 모두의 특징을 나타낸다. 헤모글로빈 중 아미노산의 대부분은 짧은 비-나선형 구획들에 의해 연결된 알파 나선을 형성한다. 수소 결합은 상기 헤모글로빈 내부의 나선형 절편들을 안정화시켜 상기 분자 내에 인력을 유발하여 각각의 폴리펩타이드 쇄를 특정한 형상으로 폴딩되게 한다. 헤모글로빈 분자는 4 개의 공 모양 단백질 서브유닛들의 조립체이다. 각각의 서브유닛은 매몰된 헴 그룹과 "마이오글로빈 폴드" 배열로 연결된 일련의 α-나선 구조 구획들로 배열된 폴리펩타이드 쇄로 구성된다.

상기 헴 그룹은 포르피린으로서 공지된, 헤테로사이클릭 고리 중에 유지된 철 원자로 이루어진다. 상기 철 원자는 하나의 평면에 놓인 고리의 중심에서 모두 4 개의 질소 원자와 동등하게 결합한다. 이어서 산소가 상기 포르피린 고리의 면에 수직인 철 중심에 결합할 수 있다. 따라서 단일 헤모글로빈 분자는 4 개의 산소 분자와 결합하는 능력을 갖는다.

성인 인간에서, 상기 헤모글로빈의 가장 통상적인 유형은 α2β2로서 표시되는 2 개의 α 및 2 개의 β 비-공유 결합된 서브유닛들(각각 141 및 146 개의 아미노산 잔기들로 만들어진다)로 이루어진 헤모글로빈 A라 지칭되는 사량체이다. 상기 α 및 β 서브유닛의 크기 및 구조는 서로 매우 유사하다. 상기 서브유닛들은 각각 약 65 kDa의 상기 사량체의 총 분자량에 대해 약 16 kDa의 분자량을 갖는다. 상기 4 개의 폴리펩타이드 쇄들은 염 가교, 수소 결합, 및 소수성 상호작용에 의해 서로 결합된다. 소 헤모글로빈의 구조는 인간 헤모글로빈과 유사하다(α 쇄에서 90.14% 동일함; β 쇄에서 84.35% 동일함). 차이는 소 헤모글로빈 중의 2 개의 설프하이드릴 그룹은 β Cys 93에 위치하는 반면, 인간 헤모글로빈 중의 상기 설프하이드릴은 각각 α Cys 104, β Cys 93 및 β Cys 112에 위치한다. 도 1은 소, 인간, 개, 돼지 및 말 헤모글로빈의 아미노산 서열 정렬(각각 B, H, C, P 및 E로 표지됨)을 나타낸다. 다양한 출처로부터의 다른 아미노산들은 어둡게 나타낸다. 도 1은 인간 헤모글로빈이, 아미노산 서열들을 비교할 때, 소, 개, 돼지 및 말 헤모글로빈과 높은 유사성을 공유함을 가리킨다.

적혈구 내부의 천연 헤모글로빈에서, α 쇄와 그의 상응하는 β 쇄와의 회합은 매우 강하며 생리학적 조건 하에서 해리되지 않는다. 그러나, 하나의 αβ 이량체와 또 다른 αβ 이량체와의 회합은 적혈구 밖에서 상당히 약하다. 상기 결합은 각각 대략 32 kDa의 2 개의 αβ 이량체들로 분할하는 경향이 있다. 이들 원치 않는 이량체들은 신장에 의해 여과되고 배설되기에 충분히 작으며, 결과적으로 잠재적인 신장 손상 및 실질적으로 감소된 혈관 내 체류 시간을 발생시킨다.

따라서, 효능 및 안정성 모두를 위해서는 적혈구 밖에서 사용되는 임의의 헤모글로빈을 안정화시킬 필요가 있다. 상기 안정화된 헤모글로빈의 제조 방법을 하기에 개략적으로 기술하며; 본 발명 방법의 개요를 도 2의 흐름도에 나타낸다.

처음에, 전혈 공급원을 적혈구로부터의 헤모글로빈의 공급원으로서 선택한다. 비 제한적으로 인간, 소, 돼지, 말 및 개 전혈을 포함한 포유동물 전혈을 선택한다. 상기 적혈구를 혈장으로부터 분리하고, 여과하고 세척하여 혈장 단백질 불순물을 제거한다.

상기 헤모글로빈을 적혈구로부터 방출시키기 위해서, 상기 세포막을 용해시킨다. 적혈구를 용해시키기 위해서 다양한 기법을 사용할 수 있지만, 본 발명은 산업적인 규모의 생산에 적합한 부피로 정밀하게 조절될 수 있는 방식으로 저장성 조건 하에서의 용해를 사용한다. 이를 위해, 도 3에 나타낸 바와 같은 즉석 세포용해 장치를 사용하여 상기 적혈구를 용해시킨다. 저장성 용해는 헤모글로빈 및 폐 농축물을 포함하는 용해물의 용액을 생성시킨다. 산업적인 규모의 생산이 가능하기 위해서는, 상기 용해를 백혈구나 다른 세포의 용해 없이 오직 적혈구만을 용해시키도록 조심스럽게 조절한다. 하나의 실시태양에서, 상기 즉석 세포용해 장치의 크기를 상기 적혈구가 상기 장치를 대략 30 초 안에 통과하도록 선택하며, 상기 즉석 세포용해 장치는 정적 믹서를 포함한다. 탈이온수 및 증류수를 저장성 용액으로서 사용한다. 물론 상이한 염수 농도를 갖는 다른 저장성 용액들의 사용이 적혈구 세포 용해에 대해 상이한 기간을 생성시킬 수도 있는 것으로 이해된다. 상기 조절된 용해 과정은 백혈구나 세포 물질이 아닌, 상기 적혈구만을 파괴하기 때문에, 상기 과정은 백혈구 및 다른 세포 물질로부터의 독성 단백질, 인지질 또는 DNA의 방출을 최소화한다. 저장성 용액을 30 초 후에, 즉 상기 적혈구 함유 용액이 상기 즉석 세포용해 장치의 정적 믹서 부분을 통과한 후에 바로 첨가한다. 상기 생성된 헤모글로빈은 다른 용해 기법을 사용하여 생성되는 헤모글로빈보다 더 높은 순도 및 더 낮은 수준의 오염물질, 예를 들어 원치않는 DNA 및 인지질을 갖는다. 백혈구로부터의 원치않는 핵산 및 인지질 불순물은 각각 폴리머라제 쇄 반응(검출 한계 = 64 pg) 및 HPLC(검출 한계 = 1 ㎍/㎖)에 의해 상기 헤모글로빈 용액에서 검출되지 않는다.

2 개의 한외여과 공정, 즉 관류 컬럼 크로마토그래피 전의 헤모글로빈보다 더 큰 분자량을 갖는 불순물을 제거하는 공정, 및 관류 컬럼 크로마토그래피 후의 헤모글로빈보다 작은 분자량을 갖는 불순물을 제거하는 공정을 수행한다. 상기 후자의 한외여과 공정은 상기 헤모글로빈을 농축시킨다. 일부 실시태양에서, 100 kDa 필터를 제 1 한외여과에 사용하고, 반면에 30 kDa 필터를 제 2 한외여과에 사용한다.

관류 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 상기 정제된 헤모글로빈 용액 중의 단백질 불순물, 예를 들어 면역글로불린-G, 알부민 및 탄산 탈수 효소를 제거한다. 일부 실시태양에서, 컬럼 크로마토그래피를 DEAE 컬럼, CM 컬럼, 하이드록시아파타이트 컬럼 등과 같은 상업적으로 입수할 수 있는 이온 교환 컬럼들 중 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 수행한다. 상기 컬럼 크로마토그래피에 대한 pH는 전형적으로는 6 내지 8.5이다. 하나의 실시태양에서, 관류 CM 컬럼 크로마토그래피 단계를 pH 8.0에서 단백질 불순물의 제거에 사용한다. 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 수행하여 상기 컬럼 크로마토그래피로부터 용출 후 상기 샘플 중에 남아있는 단백질 불순물 및 인지질을 검출한다. 이러한 독특한 관류 컬럼 크로마토그래피 분리는 산업적인 규모의 생산을 가능하게 하는 연속적인 분리 설계를 가능하게 한다. 상기 ELISA 결과는 상기 불순물의 양이 상기 용출된 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 중에 실질적으로 낮음을 보인다(면역글로불린-G: 44.3 ng/㎖; 알부민: 20.37 ng/㎖; 탄산 탈수 효소: 81.2 ㎍/㎖). 상이한 pH 값들을 갖는 상이한 종류의 컬럼을 사용한 상기 단백질 불순물 제거 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

상이한 이온-교환 컬럼들을 사용한 상이한 단백질 불순물들의 제거

컬럼 ( pH 조건)	제거율 (%)
컬럼 ( pH 조건)	탄산 탈수 효소	알부민	면역글로불린-G
DEAE (pH 7.5 에서)	---	68	29.8
DEAE (pH 7.8 에서)	---	60	50.9
CM (pH 6.2 에서)	---	32	21.8
CM (pH 8.0 에서)	5.6	53.2	66.4
하이드록시아파타이트 (pH 7.5 에서)	4.5	23.5	22.8

상기 내피세포 유래 평활근 이완 인자가 상기 헤모글로빈의 시스테인 부위에 결합하여 바람직하지 못한 혈관수축을 유발하는 것을 방지하기 위해서, 상기 헤모글로빈에 대해 산소 공급된 조건 하에서 설프하이드릴 시약과의 반응을 수행한다. 이는 산소 제거된 조건 하에서 헤모글로빈과 설프하이드릴 시약 간의 반응을 강조하는 종래 기술의 교시와 정 반대이다. 본 발명은 상기 설프하이드릴 시약이 산소 공급된 조건 하에서 헤모글로빈의 반응성 설프하이드릴 그룹과 더 빠르고 완전히 반응함을 설명한다. 상기 설프하이드릴 시약과 헤모글로빈의 설프하이드릴 그룹과의 반응은 요오다이드를 생성시킨다. 따라서, 상기 알킬화 반응의 완료를 요오다이드 방출의 측정에 의해 모니터할 수 있다. 시간-과정 실험 동안, 상기 알킬화 반응은 도 4 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 산소 제거된 환경에 비해 산소 공급된 환경에서 더 빠르고 더 효율적으로 수행된다. 완료에 도달하는데 필요한 반응 시간은 산소 제거된 환경에 비해 산소 공급된 환경에서 5 시간 이하로 감소한다. 보다 짧은 반응 시간은 산업적인 규모의 공정에서 매우 중요하다. 상기는 또한 최종 생성물에 악영향을 가져오는 바람직하지 않은 불순물에 의해 야기되는 반응들을 감소시킨다.

상기 설프하이드릴 반응 공정에 이어서, 상기 헤모글로빈에 비스-3,5-다이브로모살리시 퓨마레이트(DBSF)에 의한 α-α 및/또는 β-β 가교결합을 가한다. 중합체성 헤모글로빈의 형성을 방지하기 위해서, 상기 반응을 산소 제거된 환경에서, 생성되는 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 헤모글로빈이 60 내지 70 kDa의 분자량을 갖는 사량체성 헤모글로빈이도록(이는 중합체성 헤모글로빈이 존재하지 않음을 입증한다) 1:2.5 내지 1:4.0의 헤모글로빈 대 DBSF의 몰 비로 조심스럽게 조절한다. 상기 DBSF 반응의 수율은 높아, >99%이고, 최종 생성물 중의 이량체 농도는 낮으며; 본 발명과 관련하여, 낮은 이량체 함량은 5% 미만, 및 보다 바람직하게는 2% 미만을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 상기 가교결합을 상기 β-β 가교결합된 헤모글로빈이 전체 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 50%를 초과하도록 선택한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 가교결합을 상기 β-β 가교결합된 헤모글로빈이 상기 전체의 60% 이상이 되도록 선택한다. 더욱이, 상기 β-β 가교결합된 헤모글로빈이 상기 전체 사량체성 헤모글로빈의 70%를 초과하도록 하는 조건들을 선택할 수 있다. β-β 가교결합된 헤모글로빈이 α-α 가교결합된 사량체성 헤모글로빈보다 더 낮은 산소 친화성을 가질 수도 있다는 일부의 증거가 존재한다. 따라서, 산소 운반의 효율을 향상시키기 위해서는 보다 높은 퍼센트의 β-β 가교결합된 헤모글로빈이 α-α 가교결합된 헤모글로빈보다 바람직한 상황이 있을 수 있다. 더욱이, β-β 가교결합된 헤모글로빈이 보다 적은 α-β 이량체를 생성시킬 수도 있으며, 이는 신장 독성의 감소를 도울 것이다.

N-아세틸 시스테인을 상기 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 0.2 내지 0.4%의 농도로 첨가하여 메트-헤모글로빈의 수준을 5% 아래로 유지시킨다.

상기 헤모글로빈의 최종 용도에 따라, 본 발명의 정제되고 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 산소 제거된 환경에서 기밀식 패키지로 선택적으로 패키징한다. 본 발명에 사용된 패키징은 2년 넘게 안정한 상기 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 생성시킨다. 대조적으로, 본 발명의 헤모글로빈은 산소 공급된 조건 하에서 수일 내에 급속히 불활성 메트-헤모글로빈으로 전환된다. 종래 기술의 헤모글로빈 용액은 PVC 또는 스테리콘(Stericon) 혈액 주머니에 패키징되었으며, 상기 주머니는 높은 산소 투과성을 가지며, 따라서 상기 생성물의 수명을 단축시킨다.

본 발명의 다수의 실시태양에서, 상기 산소-담체-함유 가교결합된 헤모글로빈-함유 약학 조성물을 정맥 내 주사에 의해 전달한다. 따라서, 상기 패키징 디자인 및 물질 선택은 정맥 내 주사 용도에 대한 것이다. EVA/EVOH 물질의 다층 패키지를 사용하여 상기 기체 투과성을 최소화하고 불활성 메트-헤모글로빈의 형성을 피한다. 본 발명의 정제되고 가교결합된 헤모글로빈에 사용하기 위해 디자인된 100 ㎖ 주입 주머니는 실온에서 대기압당 24 시간당 100 in² 당 0.006 내지 0.132 ㎤의 산소 투과성을 갖는 두께 0.4 ㎜의 5 층 EVA/EVOH 적층 물질로 제조된다. 상기 물질은 VI 등급 플라스틱(USP<88>에 정의된 바와 같음)이며, 이는 생체 내 생물학적 반응성 시험 및 물리-화학적 시험을 충족시키고 정맥 내 주사용 주입 주머니의 제작에 적합하다. 이러한 1 차적인 주머니는 상기 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액을, 상기 용액의 불안정성을 유발하고 결국 상기 용액의 치료학적 성질에 영향을 미치는 장기적인 산소 노출로부터 보호하는데 특히 유용하다.

혈액 제품의 2차적인 보호에 대해서, 잠재적인 공기 누출에 대해 보호하고 생성물을 산소 제거된 상태로 유지시키기 위해 알루미늄 겉포장을 사용하는 것이 공지되었다. 그러나, 상기 알루미늄 겉포장에는 그의 기밀성을 손상시키고 생성물을 불안정하게 하는 핀 홀의 가능성이 존재한다. 따라서, 본 발명은 2차적인 패키징으로서 산소공급을 방지하고 광 노출을 또한 방지하는 알루미늄 겉포장 파우치를 사용한다. 상기 겉포장 파우치의 조성은 0.012 ㎜의 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 0.007 ㎜의 알루미늄(AL), 0.015 ㎜의 나일론(NY) 및 0.1 ㎜의 폴리에틸렌(PE)을 포함한다. 상기 겉포장 필름은 0.14 ㎜의 두께 및 실온에서 대기압당 24시간당 100 in²당 0.006 ㎤의 산소 투과율을 갖는다. 상기 2차적인 패키징은 상기 헤모글로빈에 대한 안정성 시간을 늘려, 제품의 저장 수명을 연장시킨다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS), 및 원편광 이색성(CD) 분광법을 사용하여 상기 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 분석하고 특성화한다. 소 혈액 공급원에 대해서, 도 5는 HPLC 분석에 의한 분자량 분포에 의한 생성물의 조성을 나타낸다. HPLC 분석 방법을 사용하여 각각 사량체 및 이량체의 양을 검출한다. HPLC 분석에 대한 이동 상은 염화 마그네슘(0.75 M)을 함유하며, 상기는 이량체, 가교결합되지 않은 사량체, 및 안정화된 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체를 분리시킬 수 있다. 이량체로의 헤모글로빈 해리를 촉진하기 위해서는, 염화 마그네슘이 동일한 이온 강도에서 염화 나트륨보다 대략 30 배 더 유효하다.

ESI-MS는 매우 큰 분자들의 분석을 허용한다. 상기는 단백질을 이온화하고, 이어서 상기 이온화된 단백질을 질량/전하 비를 근거로 분리시킴으로써, 고 분자량 화합물을 분석하는 이온화 기법이다. 따라서, 상기 분자량 및 상기 단백질 상호작용을 정확하게 측정할 수 있다. 도 6에서, ESI-MS 분석 결과는 안정화된 사량체의 크기가 65 kDa임을 가리킨다. 190 내지 240 ㎚의 원 UV CD 스펙트럼은 상기 헤모글로빈의 글로빈 부분의 2차 구조를 밝힌다. 도 7에서, 상기 정제되고 가교결합된 헤모글로빈의 스펙트럼의 일관성은 상기 헤모글로빈 쇄들이 DBSF에 의해 가교결합된 후에조차도 적합하게 폴딩됨을 밝힌다. 상기 CD 결과는 상기 가교결합된 헤모글로빈이 대략 42%의 알파-나선, 38%의 베타-시트, 2.5%의 베타-회전 및 16%의 랜덤 코일을 가짐을 보인다. 상기는 DBSF와 가교결합하여 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 형성하는 단계가 헤모글로빈의 2차 구조에 영향을 미치지 않음을 추가로 입증한다.

본 발명의 방법에 의해 생성된 정제되고 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 60 내지 70 kDa의 분자량을 가지며 하나 이상의 시스테인 부분을 갖고, 여기에서 상기 시스테인 부분은 상기 헤모글로빈이 상기 시스테인 부위에서 내피세포 유래 평활근 이완 인자와 결합할 수 없도록 티올-보호 그룹을 포함한다. 더욱이, 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 비-발열성이며, 내독소가 없고(<0.05 EU/㎖), 간질이 없다(<1%).

본 발명의 방법을 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 대규모 산업적인 생산에 적용할 수 있다. 또한, 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 약학 담체(예를 들어 물, 생리학적 완충제, 캡슐 중)와 함께 포유동물에 사용하기에 적합하다.

본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 조직 산소공급을 위해, 암 치료를 위해, 산소-결핍 장애, 예를 들어 출혈성 쇼크의 치료를 위해, 및 낮은 산소 함량 환경(예를 들어 심장 이식) 하에서 심장 보존에 사용된다. 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 투여량을 대략 0.3 내지 1.3 g/㎏의 농도 범위에서 선택한다.

암 치료에 사용하기 위해서, 본 발명의 산소-담체-함유 약학 조성물은 조직 산소공급제로서 작용하여 종양 조직 중의 산소 공급을 개선시키고, 이에 의해 화학요법-감도(예를 들어 화학요법에 대한 감도) 및 방사선 감도를 향상시킨다.

도 8은 시험관 내에서 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 포함하는 조성물 적용 후의 암 종양 세포의 향상된 화학요법-감도를 설명한다. 5 개의 상이한 암 세포 주 (A) Jurkat(백혈병), (B) HKESC1(식도암), (C) COLO205(결장암), (D) A549/Cisp(폐암) 및 (E) MCF-7/ADM(유방암)을 다양한 화학요법제 단독으로, 또는 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈과 병용 치료한다. 종양 세포 성장의 억제를 ATP 종양 화학요법 감도 분석(ATP-TCA)(Jurkat, COLO205, A549/Cisp, 및 MCF-7/ADM 세포 주들의 경우), 또는 MTT 세포 증식 분석(HKESC1 세포 주의 경우)에 의해 측정한다. 상기 결과는 상기 화학요법 감도가 화학요법에 고도로 내성인 2 개의 세포 주, A549/Cisp 및 MCF-7/ADM을 포함한 모든 암 세포 주들에서 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 첨가에 의해 대단히 향상됨을 보인다. 도 8의 결과는 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 첨가에 의한 상기 향상된 화학요법 감도의 결과로서, 백혈병 세포, 식도암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 및 유방암 세포들에 대한 치료 효능이 크게 증가함을 보인다.

또한, 정상 조직(도 9) 및 매우 저 산소성인 종양 조직(도 10)(인간 비 인두 암종(CNE2))에서 산소공급을 개선하는 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 능력을 본 발명에서 입증한다. 인간 CNE2 이종이식편의 조직 흔적에 따른 전형적인 산소 프로파일을 도 10에 나타낸다. 상기 종양 덩어리 내 산소 분압을 마이크로포지셔닝 시스템(DTI Limited)과 커플링된 광섬유 산소 센서(Oxford Optronix Limited)에 의해 직접 모니터한다. 1.2 g/㎏의 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 정맥 내 주입 후, 중간 pO2 값은 3 시간 동안 0.2 mmHg에서 3.9 mmHg로, 6 시간 동안 10.6 mmHg로 각각 상승한다. 가장 저 산소성인 부위에서조차, 본 발명의 산소 담체-함유 약학 조성물은 산소 분압을 현저하게 증가시켰다. 다른 유사한 상업적인 제품들이나 또는 어떠한 기존의 기술들도 본 발명에서 제조된 산소-담체-함유 약학 조성물에 비해 상기 조성물만큼 높은 효능을 나타내지 않는다.

산소-결핍 장애의 치료 및 심장 보존에 사용하기 위해서, 본 발명의 산소-담체-함유 약학 조성물은 표적 기관에 산소를 제공하는 혈액 대용품으로서 작용한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 심장 보존을 위한 심정지 용액으로서 사용된다.

0.5 g/㎏의 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈으로 치료한 후의 중증 출혈성 쇼크의 래트 모델(실시예 12b 참조)에서 평균 동맥압 변화를 도 11에 나타낸다. 중증 출혈성 쇼크의 래트 모델에서, 상기 평균 동맥압은 상기 안정화 가교결합된 사량체성 헤모글로빈으로 치료 후 다시 안전하고 안정한 수준으로 돌아오고 기준선 아래에서 유지된다. 본 발명의 헤모글로빈에 의한 치료에 이어서, 상기 평균 동맥압이 정상으로 돌아오는 반응 시간은 양성 대조군으로서 작용하는 래트 전혈의 투여에 이은 경우보다 훨씬 더 짧다. 상기 결과는 본 발명의 헤모글로빈 주입 후의 혈관-활성 사건이 안정한 혈류역학 상태를 유지시키기에 유리함을 가리킨다. 종래의 헤모글로빈-기재 산소 담체들은 많은 혈관수축 사건들을 유발시켰다. 예를 들어, 헤모퓨어(Hemopure)(등록상표) 제품(Biopure Co., USA)은 문헌[Katz et al., 2010]에 개시된 바와 같은 기준선(96 ±10 mmHg)에 비해 더 높은 평균 동맥압(124±9 mmHg)을 생성시켰다.

본 발명의 주입용 헤모글로빈의 사용은 마우스(18%에서 75%까지) 및 비글 개(46%에서 97%까지)의 쇼크 모델에서 생존율을 증가시킨다. 중증 출혈성 쇼크 동물 모델의 생존율은 상이한 양의 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 주입함으로써 현저하게 증가한다(실시예 12 참조). 따라서, 본 발명의 헤모글로빈은 출혈성 쇼크의 치료제로서 사용된다.

실시예

하기의 실시예들을, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않으면서 본 발명의 특정 실시태양들을 개시할 목적으로 제공한다.

실시예 1

전체 공정

본 발명의 방법에 대한 도식적인 흐름도를 도 2에 예시한다. 소 전혈을 응고 방지제로서 3.8%(w/v) 삼나트륨 시트레이트 용액을 함유하는, 동봉된 멸균 용기/주머니에 채집한다. 이어서 혈액을 삼나트륨 시트레이트 용액과 즉시 잘 혼합하여 혈액 응고를 억제한다. 적혈구(RBC)를 성분채집술 기전에 의해 혈장 및 다른 더 작은 혈구들로부터 단리하고 채집한다. "세포 세척기"를 감마 멸균된 일회용 원심분리 사발과 함께 상기 과정에 사용한다. RBC를 동 부피의 0.9%(w/v 염화 나트륨) 염수로 세척한다.

세척된 RBC를, 상기 RBC 세포막에 저장성 쇼크를 행함으로써 용해시켜 헤모글로빈 내용물을 방출시킨다. 도 3에 도시된 RBC 용해 장치용 특수 즉석 세포용해 기구를 상기 목적에 사용한다. RBC 용해에 이어서, 헤모글로빈 분자를, 100 kDa 멤브레인을 사용하여 접선류 한외여과에 의해 다른 단백질들로부터 단리한다. 상기 여액 중 헤모글로빈을 관류 컬럼 크로마토그래피를 위해 채집하고 30 kDa 멤브레인에 의해 12 내지 14 g/dL로 추가 농축시킨다. 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 단백질 불순물을 제거한다.

상기 농축된 헤모글로빈 용액을 먼저 천연 산소공급된 조건 하에서 설프하이드릴 시약에 의해 개질시키고(알킬화 반응), 이어서 상기 성분들을 DBSF와 반응시켜 안정한 α-α 및/또는 β-β 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 분자를 형성시킨다.

실시예 2

시간 & 조절된 저장성 용해 및 여과

소 전혈을 저온 조건 하에서 새로 채집하고 운반한다. 상기 적혈구를 세포 세척기를 통해서, 및 후속적으로 0.65 ㎛ 여과로 상기 혈장으로부터 분리시킨다. 상기 적혈구(RBC) 여액을 0.9% 염수로 세척한 후에, 상기 여액을 저장성 용해에 의해 파괴시킨다. 상기 저장성 용해는 도 3에 도시된 즉석 세포용해 장치를 사용하여 수행한다. 상기 즉석 세포용해 장치는 세포 용해를 지원하는 정적 믹서를 포함한다. 조절된 헤모글로빈 농도(12 내지 14 g/dL)를 갖는 RBC 현탁액을 4 분량의 정제 수와 혼합하여 RBC 세포막에 저장성 쇼크를 발생시킨다. 상기 저장성 쇼크의 기간을, 백혈구 및 혈소판의 바람직하지 못한 용해를 피하도록 조절한다. 상기 저장성 용액을 대략 30초 동안 상기 즉석 세포용해 기구의 정적 믹서 부분에 통과시킨다. 상기 쇼크를, 30 초 후에 상기 용해물을 상기가 상기 정적 믹서를 나갈 때 1/10 부피의 고장성 완충제와 혼합함으로써 종결시켰다. 상기 사용된 고장성 용액은 0.1M 인산염 완충제, 7.4% NaCl, pH 7.4이다. 도 3의 즉석 세포용해 기구는 시간당 50 내지 1000 리터, 바람직하게는 연속적인 방식으로 시간당 300 리터 이상의 용해물을 처리할 수 있다.

상기 RBC 용해에 이어서, 상기 적혈구의 용해물을 0.22 ㎛ 필터에 의해 여과하여 헤모글로빈 용액을 수득한다. 백혈구로부터의 핵산 및 인지질 불순물은 각각 폴리머라제 쇄 반응(검출 한계 = 64 pg) 및 HPLC(검출 한계 = 1 ㎍/㎖) 방법에 의해 상기 헤모글로빈 용액 중에서 검출되지 않는다. 제 1의 100 kDa 한외여과를 수행하여 헤모글로빈보다 더 큰 분자량을 갖는 불순물을 제거한다. 관류 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 상기 헤모글로빈 용액을 추가로 정제한다. 이어서 제 2의 30 kDa 한외여과를 수행하여 헤모글로빈보다 작은 분자량을 갖는 불순물을 제거하고 농축시킨다.

실시예 3

간질 무 함유 헤모글로빈 용액에 대한 바이러스 검사

본 발명으로부터의 생성물의 안전성을 입증하기 위해서, (1) 0.65 ㎛ 정용 여과 단계 및 (2) 100 kDa 한외여과 단계의 바이러스 제거 능력을 바이러스 검증 연구에 의해 입증한다. 이를, 상기 2 개 공정의 규모 축소된 버전의 상이한 모델 바이러스들(뇌심근염 바이러스, 가성광견병 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 및 소 파르보바이러스)에 의한 신중한 첨가(spiking)에 의해 수행한다. 이 연구에서, 4 가지 유형의 바이러스(하기 표 2 참조)를 사용하였다. 이들 바이러스는 그들의 생물물리학적 및 구조적 특징들이 다양하며 물리적 및 화학적 작용제 또는 치료에 대해 내성의 변화를 나타낸다.

표적 바이러스	모델 바이러스	분류	게놈	구조	크기 [ nm ]	안정성*
C형 간염 바이러스 (HCV)	소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)	플라비비리다에	ssRNA	외피 있음	40-60	낮음
-	뇌심근염 바이러스 (EMCV)	피코르나바이러스	ssRNA	외피 없음	25-30	중간
파르보바이러스 B19	소 파르보바이러스 (BPV)	파르보비리다에	ssDNA	외피 없음	18-26	매우 높음
B형 간염 바이러스 (HBV)	가성 광견병 바이러스 (PRV)	헤르페스비리다에	dsDNA	외피 있음	120-200	낮거나 중간

상기 바이러스 검증 설계를 하기 표 3에 간략히 나타낸다.

정용 여과	한외 여과
세포 세척 ↓ 바이러스 첨가 ↓ 정용 여과 ↓ 바이러스 검사	바이러스 첨가 ↓ 한외 여과 ↓ 바이러스 검사

(1) 0.65 ㎛ 정용 여과 및 (2) 100 kDa 한외 여과에서 상기 4 개 바이러스의 로그 감소 결과들에 대한 요약을 하기 표 4에 나타낸다. 4 개의 바이러스, BVDV, BPV, EMCV 및 PRV 모두 0.65 ㎛ 정용 여과 및 100 kDa 한외 여과에 의해 유효하게 제거되었다.

바이러스	BVDV		BPV		EMCV		PRV
실시	1	2	1	2	1	2	1	2
0.65 ㎛ 정용 여과	2.69	3.20	3.73	3.53	3.25	≥ 3.90	2.67	2.63
100 kDa 한외 여과	≥ 4.68	≥ 4.38	5.87	5.92	3.60	3.43	≥ 6.05	3.27
누적 최대	≥ 7.88		9.65		≥ 7.50		≥ 8.72
누적 최소	≥ 7.07		9.40		6.68		5.90
주석: ≥ 측정된 잔류 감염성 없음

실시예 4

관류 컬럼 크로마토그래피

CM 컬럼(GE healthcare로부터 상업적으로 입수할 수 있음)을 사용하여 임의의 단백질 불순물들을 추가로 제거한다. 출발 완충제는 20 mM 나트륨 아세테이트(pH 8.0)이고 용출 완충제는 20 mM 나트륨 아세테이트, 2M NaCl(pH 8.0)이다. 상기 CM 컬럼을 출발 완충제로 평형화한 후에, 상기 단백질 샘플을 상기 컬럼에 로딩한다. 결합되지 않은 단백질 불순물을 적어도 5 컬럼 부피의 출발 완충제로 세척한다. 25% 용출 완충제(0 내지 0.5M NaCl)를 8 컬럼 부피로 사용하여 용출을 수행한다. 상기 용출 프로파일을 도 12에 나타내며; 상기 헤모글로빈 용액은 관류 분획 중에 있다.

상기 관류 분획의 순도를 ELISA에 의해 분석한다. 결과를 하기 표 5에 나타낸다.

	단백질 불순물
	면역글로불린-G	탄산 탈수 효소	알부민
CM 컬럼 전	1320 ng/mL	860.3 ㎍/mL	435.2 ng/mL
관류 (헤모글로빈 함유)	44.3 ng/mL	81.2 ㎍/mL	20.4 ng/mL

상기 헤모글로빈 용액이 pH 8에서 상기 CM 컬럼 크로마토그래피로부터의 관류 중에 있으므로(용출물 중에 있지 않음), 이는 연속적인 산업 규모의 실행에 양호한 접근법이다. 제 1 한외 여과 설비를 상기 관류 CM 컬럼 크로마토그래피 시스템에 직접 연결하며, 상기 관류 배관을 산업적인 규모의 실행을 위해 상기 제 2 한외 여과 설비에 연결할 수 있다. 개략적인 산업 공정 형태를 도 13에 나타낸다.

실시예 5

설프하이드릴 반응 및 가교결합

(5a) 설프하이드릴 반응

본 발명에서, 헤모글로빈과 설프하이드릴 간의 반응을 종래 기술의 교시와 대조적으로 산소 공급된 환경에서 수행하며, 상기 종래 기술에서는 상기 반응이 전형적으로는 질소와 같은 불활성 분위기에서 일어난다. 알킬화 설프하이드릴 시약을 가하여 상기 헤모글로빈의 유리 설프하이드릴 그룹들을 알킬화한다. 이 실시태양에서, 상기 헤모글로빈 대 설프하이드릴 시약의 몰 비는 1:2 내지 1:4이다. 상기 반응은 헤모글로빈 설프하이드릴 그룹과 반응하는 내피세포 유래 평활근 이완 인자의 결합을 제거할 수 있다. 내피세포 유래 평활근 이완 인자는 헤모글로빈의 반응성 설프하이드릴 그룹과 결합하는 것으로 입증되었으며, 이는 보다 초기 세대의 헤모글로빈 기재 산소 담체의 주입 후 관찰되는 혈압 증가의 원인일 수 있다. 상기 설프하이드릴 반응의 완료를 생성물 또는 잔류 설프하이드릴 시약의 방출을 측정함으로써 모니터할 수 있다(265 ㎚에서, UV 분광분석법에 의해). 도 14는 산소 공급된 환경에서의 반응과 산소 제거된 환경에서의 반응 간의 비교이다. 도 14는 상기 잔류 설프하이드릴 시약이 시간 과정 실험 동안 산소 공급된 환경에서 3 시간째에 수평 상태로 됨을 보인다. 대조적으로, 산소 제거된 환경에서 다량의 반응하지 않은 설프하이드릴 시약이 남아있다. 산소 공급된 환경에서 상기 설프하이드릴 반응의 수율은 4 시간의 반응 후에 높다(92.7%).

(5b) 안정성 사량체를 형성하는 가교결합 반응

상기 α-α 및/또는 β-β 가교결합 반응을 산소 제거된 환경에서 수행한다. 비스-3,5-다이브로모살리시 퓨마레이트(DBSF)를 상기 헤모글로빈 용액에 가하여 사량체 내에 α-α 가교결합 및/또는 β-β 가교결합을 포함하는 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 형성시킨다. 선택적으로, 일부 α-β 가교결합이 상기 사량체 내에 포함된다.

본 실시태양에서, 헤모글로빈과 DBSF의 몰 비는 1:2.5 내지 1:4.0이다. 상기 DBSF 안정화 과정은 헤모글로빈의 사량체 형태(65 kDa)를 안정화하고 신장을 통해 배설되는 이량체(32 kDa)로의 해리를 방지한다. 상기 가교결합 공정에서, 오직 사량체성 헤모글로빈만이 형성되며; 중합체성 헤모글로빈은 형성되지 않는다. 상기 공정을 질소의 불활성 분위기 하에서 수행하여 상기 헤모글로빈의 산화를 방지하여 생리학적으로 불활성인 제 2 철 메트-헤모글로빈을 형성시킨다. DBSF 반응의 완료를, HPLC를 사용하여 잔류 DBSF를 측정함으로써 모니터한다. 상기 DBSF 반응의 수율은 높아, >99%이다.

하나의 실시태양에서, 상기 가교결합 반응을 실온(15 내지 25 ℃)에서 산소 제거된 환경(용해된 산소 < 0.1 ㎎/L)에서 수행한다. DBSF를 상기 헤모글로빈 용액에 가하여 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 형성시키며; 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 하기 나타낸 바와 같이 특성화한다. 상기 특성화는 단지 하나의 실시태양만을 근거로 함에 유의한다. 상기 사량체 내 가교결합의 다양한 비율 및 유형들을, 사용되는 DBSF의 양, 상기 반응의 시간 및 온도, 및 다른 공정 조건들에 의해 조절할 수 있다.

상기 헤모글로빈과 DBSF의 몰 비를 1:5.0으로 변화시킬 때, 팔량체(130 kDa)의 퍼센트가 18%까지 급격하게 증가한다.

(5b-1) 15% SDS-PAGE를 사용하는 가교결합된 헤모글로빈에 대한 전기영동 분석

가교결합된 헤모글로빈 용액을 동 부피의 환원 샘플 완충제(62 mM 트리스-HCl(pH 6.8), 10%(v/v) 글리세롤, 5%(v/v) 머캅토에탄올 및 2.3%(w/v) SDS)와 혼합하고, 95 ℃에서 10 분간 가열하였다. 상기 샘플 혼합물을 4% 적층 젤과 함께 15% 아크릴아미드 평석 젤을 사용하여 용해시켰다. 전기영동을 60 mA의 정전류를 사용하여 실행하였다. 전기영동 후, 상기 SDS-PAGE 젤을 0.1%(w/v) 쿠마씨 블루 R350, 20%(v/v) 메탄올, 및 10%(v/v) 아세트산으로 염색하였다. 블랙 라이트 유닛(BLU)에 나타난 단백질 밴드들의 강도를 바이오-래드 콴터티 원 소프트웨어(Bio-Rad Quantity One Software)를 사용하여 정량분석하였다.

(5b-2) 15% SDS-PAGE로부터 절제된 단백질 밴드들의 트립신 절단

단백질 밴드들을 상기 SDS-PAGE로부터 절제하고, 입방체(1 x 1 ㎜)로 절단하고, 10% 메탄올/10% 아세트산으로 오물을 제거(destaining)하였다. 상기 오물 제거된 젤을 25 mM NH₄CO₃ 중의 10 mM DTT로 환원시키고 암실에서 45 분간 25 mM NH₄CO₃ 중의 55 mM 요오도아세트아미드로 알킬화하고, 이어서 37 ℃에서 밤새 25 mM NH₄CO₃ 중의 20 ng/㎕의 개질된 트립신으로 젤-내 절단하였다. 트립신 절단 후에, 상기 트립신-절단된 펩타이드를 50%(v/v) 아세토나이트릴 및 1%(v/v) 트라이플루오로아세트산(TFA) 내로의 확산에 의해 추출하였다.

(5b-3) 기질-지원된 레이저 해리/이온화 - 트립신-절단된 단백질 밴드의 이동 시보 질량 분광법(MALDI-TOF MS) 분석

상기 젤 입방체로부터 추출된 트립신 절단된 펩타이드를 앵커칩(Anchorchip) 플레이트[1 ㎕의 기질 용액(50% 아세토나이트릴/0.1% TFA 중에 포화된, 2 ㎎/㎖ HCCA)로 예비-스폿팅되었다] 상에 스폿팅하고, 공기 건조되게 하였다. 건조 후, 상기 샘플 스폿을 10mM 모노포스페이트 완충제로 세척하고 EtOH:아세톤:0.1% TFA(6:3:1 비)의 용액을 사용하여 재결정화하였다. MALDI-TOF MS 분석을 800 내지 3500 Da의 m/z 범위에 걸쳐 리플랙트론(reflectron) 방식으로 작동되는 브루커 오토플렉스(Bruker Autoflex) III(Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany)로 수행하고, 매개변수들을 하기와 같이 설정하였다: 펩타이드 질량 측정(peptide mass fingerprint, PMF)의 경우 이온 공급원 25 kV, 및 PMF의 경우 반사기 26.3 kV. 외부 눈금화를 브루커 펩타이드 믹스 캘리브레이션 스탠다드(Bruker Peptide Mix Calibration Standard)를 사용하여 수행하였다. 4 이상의 S/N 비를 갖는 피크들은 플렉스-어낼리시스(Flex-Analysis)(Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany)에 의해 자동 표지되었다. 상기 MS 데이터를 MASCOT 2.2.04 및 바이오툴스(Biotools) 2.1 소프트웨어(Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany)를 통해 추가로 분석하였으며, 이들 데이터를 NCBI 논리던턴트(nonreduntant)(NCBInr) 데이터베이스에 대해 탐색하였다. 하기의 매개변수들을 데이터베이스 탐색에 사용하였다: 모노아이소토픽 질량 정밀도 < 250 ppm, 모 전하 +1, 상실된 클리비지 1, 고정 변경으로서 시스테인의 카브아미도메틸화, 가변 변경으로서 메티오닌의 산화. PMF에 근거한 67(p = 0.05) 초과의 단백질 점수를 갖는 결과들은 포지티브 확인으로서 간주하였다. 신뢰할만한 확인에 대한 다른 기준은 상기 단백질 짝이 15% 이상의 서열 커버리지를 갖고 4 개 이상의 펩타이드가 맞아야 하는 것이었다.

(a) 15% SDS-PAGE 및 (b) MALDI-TOF MS로부터의 분석 결과 조합 후, 상기 가교결합된 헤모글로빈의 조성이 결정된다. 상기 결과로부터, 가교결합된 헤모글로빈의 ≥70%가 β-β 결합되어 있다.

실시예 6

제형화 후 생성물 중 낮은 수준의 불활성 메트 -헤모글로빈의 유지

다른 산소 담체 약학 제품 또는 미국 특허 제 7494974 B2 호 및 미국 특허 제 7504377 B2 호에 개시된 방법들에 따라 형성된 생성물과 비교 시, 본 발명의 생성물은 낮은 수준의 불활성 메트-헤모글로빈 분자를 함유한다. 이 실시태양에서, N-아세틸 시스테인 등의 산화방지제를 0.2%로 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 첨가한다. 상기 산화방지제의 첨가 없이는, 불활성 메트-헤모글로빈이 높은 수준(12 내지 20%)으로 발견된다. 본 발명으로부터의 생성물은 낮은 수준(<5%)의 불활성 메트-헤모글로빈을 가지며 이는 고온 안정성이어서 치료에 사용될 때보다 큰 효능을 생성시킨다.

본 발명으로부터의 생성물의 안정성을 입증하기 위해서, 열 안정성 시험을 80 ℃에서 수행한다. 결과를 도 15에 도시한다. 미국 특허 제 7494974 호 및 미국 특허 제 7504377 호에 따라 제조된 생성물은 높은 메트-헤모글로빈 함량(22 내지 28%)을 갖는다. 그러나, 본 발명의 생성물은 낮은 수준의 메트-헤모글로빈(<5%)을 나타낸다.

실시예 7

패키징 & 제품 안정성

본 발명의 생성물은 산소 제거된 조건 하에서 안정하므로, 상기 생성물의 패키징은 기체 투과성을 최소화하는데 중요하다. 정맥 내 용도를 위해서, 주문 디자인된 100 ㎖ 주입 주머니를 실온에서 대기압당 24 시간당 100 in² 당 0.006 내지 0.132 ㎤의 산소 투과성을 갖는 두께 0.4 ㎜의 5 층 EBA/EVOH 적층 물질로부터 제조한다. 상기 특수 물질은 VI 등급 플라스틱(USP<88>에 정의된 바와 같음)이며, 이는 생체 내 생물학적 반응성 시험 및 물리-화학적 시험을 충족시키고 정맥 주사용 용기의 제작에 적합하다(다른 패키징 형태들을 또한 목적하는 용도에 따라 상기 물질로부터 제조할 수 있음에 주목한다). 광 노출 및 산소 확산을 최소화함에 있어서 추가적인 차단층을 제공하는 2 차 패키징 알루미늄 겉포장 파우치를 또한 상기 1차 패키징 주입 주머니에 적용시킨다. 상기 파우치의 조성은 0.012 ㎜의 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 0.007 ㎜의 알루미늄(AL), 0.015 ㎜의 나일론(NY) 및 0.1 ㎜의 폴리에틸렌(PE)으로 이루어진다. 상기 겉포장 필름은 0.14 ㎜의 두께 및 실온에서 대기압당 24시간당 100 in²당 0.006 ㎤의 산소 투과율을 갖는다. 상기 주입 주머니의 개략적인 묘사를 도 16에 도시한다. 본 발명으로부터의 각각의 주입 주머니에 대한 전체 산소 투과율은 실온에서 대기압당 24시간당 0.0025 ㎤이다.

안정성 연구를 40 ℃ 및 75% 상대 습도에서 상기 패키징 물질에 대해 수행한다. 결과를 하기 표 6에 나타낸다. 상기 결과는 상기 패키징 물질이 연장된 기간에 걸쳐 낮은 수준의 메트-헤모글로빈을 유지함을 입증한다.

안정성 연구 조건: 온도 40 +/- 2 ℃, 상대 습도 75 +/- 5%

패키징 물질	시점 (개월)	시험 항목
		전체 Hb	메트-Hb	산소-Hb	내독소
		(g/dL)	(%)	(%)	(EU/㎖)
주입 주머니 & 알루미늄 겉포장	0	6.3	3.1	7.3	<0.02
	1	6.3	1.0	6.8	<0.02
	2	6.4	0.8	6.4	<0.02
	3	6.3	0.8	6.6	<0.02
	6	6.3	0.6	5.2	<0.02

실시예 8

독성 연구

본 발명의 정제된 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 잠재적인 독성을 평가하기 위해서 실험을 수행한다. 10 마리의 수컷 스프래그-다우리 래트를 3 개의 그룹, 즉 대조용 그룹 3 마리, 저 용량 그룹 3 마리, 및 고 용량 그룹 4 마리로 할당한다. 식염수(대조용), 저 용량(5.52 g/㎏)의 정제된 가교결합된 사량체성 헤모글로빈, 고 용량(6.90 g/㎏)의 정제된 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 각각 연속적인 정맥 내 주입을 통해 경정맥을 통해 3 ㎖/㎏/시간의 주입 속도로 상기 래트들에게 투여한다. 약물 처리 스케줄을 하기 표 7에 나타낸다. 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 33.3 시간까지 상기 래트들에게 주입한다. 상기 동물들을 9일의 기간 동안 면밀히 관찰한다.

연구 그룹	대조군 (n=3)	저 용량 (n=3)	고 용량 (n=4)
-7 일 내지 -6 일째	둥물들을 수술함 및 이어서 24 시간 동안 NS 주입
-5 일 내지 -1 일째	헤파린을 매일 주사함
0 일째	랜덤화 및 새 환경 순응화, 24 시간 동안 NS 주입
1 일째	대사 분석 (물 및 뇨) 채집. NS 주입	대사 분석 (물 및 뇨) 채집. 26.7 시간 Hb 주입 및 이어서 21.3 시간 NS 주입	대사 분석 (물 및 뇨) 채집. 33.3 시간 Hb 주입 및 이어서 14.7 시간 NS 주입
2 일째	대사 분석(물 및 뇨) 채집
3 일째	대사 분석(물 및 뇨) 채집
4 일째	NS 주입 중지
5 일째	재킷 제거 및 튜브 밀봉, 동물들을 통상적인 우리로 복귀시킴
8 일째	동물들을 뇨 채집를 위해 대사 우리로 이동시킴, 소비한 물 기록
9 일째	대사 분석(물 및 뇨) 채집 나머지 동물들 안락사시킴 채혈(혈청 및 혈장 모두) 주요 기관들 포르말린 중에 보존
*NS: 식염수, Hb: 가교결합된 사량체성 헤모글로빈

혈액 샘플들을 9일째에 임상 병리 평가를 위해서 모든 연구 동물들에 대해 채집한다. 뇨를 소변 분석을 위해 0 일째 내지 3 일째 및 9 일째에 채집한다. 최종 부검을 9일째에 수행한다. 평가된 매개변수들은 임상 관찰, 체중, 체중 변화, 물 소비, 임상 병리(케마톨로지, 임상 화학 및 소변검사), 기관 중량, 기관 대 체중 비, 기관 대 뇌 중량비, 총체적인 병리학 및 조직병리학을 포함한다. 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 의한 처리는 사망률이나 불리한 임상적 발견들을 생성시키지 않으며, 래트의 체중 변화 및 물 소비에 대해 현저한 영향을 미치지 않는다.

상기 처리와 관련된 임상 화학 및 혈액학적 매개변수들에 대해 명백한 변화는 관찰되지 않는다. 소변 검사는 클로라이드 및 칼륨의 농도가 2 일째에 대조군의 경우보다 처리 그룹에서 더 낮음을 보인다. 소변 중 혈액 오염, 보다 높은 단백질 농도 및 보다 많은 적혈구가 2 내지 3 일째에 대조군에서보다 처리 그룹에서 발견된다. 상기 관찰들은 모두 곧 정상으로 회복된다. 폐 대 체중 비 간의 현저한 차이는 관찰되지 않는다. 상기 연구 중, 뜻밖의 사망 및 명백한 독성 임상 징후는 관찰되지 않는다. 추가로, 총체적인 병리학적 및 조직학적 분석은 폐, 심장, 간, 비장 및 신장을 포함한 모든 기관들의 중한 이상(major abnormalities)을 드러내지 않는다(상기와 같은 이상은 주입의 독성 부작용에 기인한다).

실시예 9

심장 보존

가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 비글 개에서 심폐 바이패스 중 심장 보존의 모델에서 심정지 용액으로서 사용할 수 있다. 18 마리의 비글 개를 3 개의 그룹, 즉 모의, 세인트 토마스 용액(STS), 및 0.1%의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 그룹으로 랜덤하게 분할한다. 심폐 바이패스를, 배출을 위해 상행 대동맥, 상대정맥 및 하대정맥, 및 좌심실의 삽관술과 함께 표준 방식으로 확립시킨다. 상기 모의 그룹을 제외하고, 0.1 g/dL의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈이 없거나(STS 그룹) 또는 있는(0.1% Hb 그룹) STS를 대동맥 클램핑 후에 대동맥 기부에 주입하여 심장 정지를 성취하고 이를 120 분간 유지시킨다. 심박출량, 폐동맥압, 폐동맥 쐐기압, 평균 동맥압, 중심 정맥압 및 심박수를 포함한 심장 기능, 및 혈액 가스를 재관류 중에 측정하고 기준선과 비교한다. 크레아틴 키나제 MB, 락테이트 데하이드로게나제 및 트로포닌-1을 포함한 심장 효소의 방출을 또한 심장 손상의 대리 마커로서 측정한다. 헤마톡실린 및 에오신 오염 및 심장 수분 함량 검출을 수행하여 재관류 후 120 분째에 심근의 형태학적 및 병리학적 변화를 측정한다.

상기 기본 조건 하에서, 상기 심장 기능, 산소 소비 및 심장 효소 방출의 측정은 상기 3 개의 그룹들에서 유사하다. 재관류 중에, 심박수, 심박출량 및 중심 정맥압은 상기 모의 그룹에 비해 상기 STS 그룹에서 크게 감소한다. 그러나, 상기 심박수, 심박출량, 중심 정맥압 및 심장 산소 소비는 0.1% Hb 그룹에서 크게 보존되며, 이는 상기 모의 그룹의 경우들과 유사하다. STS 중의 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 상기 STS 그룹과 비교 시 락테이트 데하이드로게나제, 크레아틴 키나제 MB 및 트로포닌-1의 출현을 또한 크게 감소시킨다. 더욱이, 세포 팽윤, 지방 변화 및 유리질 변화가 상기 STS 그룹에 비해 상기 0.1% Hb 그룹에서 현저하게 줄어든다. 폐 동맥압, 폐 동맥 쐐기압, 평균 동맥압 및 심장 수분 함량을 포함한 다른 척도들은 상기 3 개의 그룹들 사이에서 현저한 차이가 없다. 상기 연구에서 상기 0.1% Hb 그룹의 모든 척도들은 상기 모의 그룹에 비해 현저한 차이가 없다. 심폐 바이패스 동안 STS 중 0.1 g/dL의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈은 STS(현행 표준 심정지 용액)의 경우보다 더 양호한 심장 보호 효과를 나타내며, 결과가 또한 상기 모의 그룹에 필적할만하다.

실시예 10

조직 산소공급, 정상 및 암성 조직에 대한 연구

(10a) 정상 조직에서 산소 공급의 개선

가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 의한 정상 조직 산소 공급에 대한 일부의 연구를 수행한다(도 9에 나타낸 바와 같다). 비교 상의 약동학 및 약역학 연구를 버팔로 래트에서 수행한다. 수컷 동계 교배 버팔로 래트에게 정맥 내 주사를 통해 개별적으로 0.2 g/㎏의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액 또는 아세테이트 링거 완충액(대조군)을 투여한다. 혈장 헤모글로빈의 농도-시간 프로파일을 1, 6, 24, 48 시간째에 헤모큐(Hemocue)^TM 광도계에 의해 측정하고 기준선 판독값과 비교한다. 상기 방법은, 헤모글로빈 농도가 g/dL로서 직접 판독되는 헤모글로빈의 광도계 측정을 기본으로 한다. 상기 버팔로 래트의 뒷다리 근육의 산소 분압(pO2)을 옥시랩(Oxylab)^TM 조직 산소공급 및 온도 모니터(Oxford Optronix Limited)에 의해 직접 측정한다. 래트들을 30 내지 50 ㎎/㎏의 펜토바르비톤 용액의 복강 내 주사에 의해 마취시킨 다음 상기 근육에 산소 센서를 삽입한다. 모든 pO2 판독값들을 실시간 방식으로 데이타트랙스(Datatrax)2 데이터 포착 시스템(World Precision Instrument)에 의해 기록한다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 0.2 g/㎏의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액의 주사는 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액의 약동학(혈장 헤모글로빈 농도)과 약역학(근육 조직으로의 산소의 전달) 간의 상관성을 입증한다. 중요하게는, 상기 혈장 헤모글로빈 수준에 비해 더 오랜 기간 동안 산소 공급의 현저한 증가가 관찰된다. 혈장 헤모글로빈 농도를 그래프 (A)에 나타내고, 근육으로의 산소 전달은 그래프 (B)에 나타낸다.

(10b) 매우 저 산소성인 종양 영역에서의 산소 공급의 개선

매우 저산소성인 종양 영역에서의 산소 공급의 개선을 인간 비인두 암종(CNE2) 이종이식편 모델에 의해 평가한다. 상기 CNE2 세포주를 홍콩 대학의 암 유전학 실험실로부터 수득한다. 대략적으로 1 x 10⁶ 개의 암 세포를 4- 내지 6-주된 동계 교배된 BALB/c AnN-nu(누드) 마우스에게 피하 주사한다. 상기 종양 이종이식편이 8 내지 10 ㎜의 직경에 도달하면, 상기 종양 덩어리 내의 산소 분압을 상기 옥시랩^TM 조직 산소 공급 및 온도 모니터(Oxford Optronix Limited)에 의해 직접 모니터한다. 산소 분압을 완전히 컴퓨터화된 PTS30 마이크로-포지셔닝 시스템(Discovery Technology International)을 사용하여 조직 흔적을 따라 측정한다. 모든 pO2 판독값들을 실시간 방식으로 데이타트랙스2 데이터 포착 시스템(World Precision Instrument)에 의해 기록한다. 상기 pO2 판독이 안정화되면, 1.2 g/㎏의 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액을 상기 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사하고 조직 산소 공급을 측정한다. 결과는 가장 저 산소성인 종양 영역에서의 산소 공급의 현저한 증가를 입증한다. 1.2 g/㎏의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 정맥 내 주사 후에, 중간 pO2 값은 각각 0.2 mmHg에서 3.9 mmHg(3 시간 동안) 및 10.6 mmHg(6 시간 동안)으로 상승한다(도 10에 도시됨).

실시예 11

암 치료 연구( 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 화학요법-증감 효과)

본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 화학요법 증감 효과를 상이한 암 세포 주들에서 평가한다. 백혈병 세포 주(Jurkat), 결장암 세포 주(COLO205), 시스플라틴-내성 폐암 세포 주(A549/Cisp) 및 아드리아마이신-내성 유방암 세포 주(MCF-7/ADM)를 중국 의과학 암 연구소 아카데미(Chinese Academy of Medical Sciences Cancer Institute)로부터 수득한다. 8000 개의 Jurkat 세포, 4000 개의 COLO205 세포, 3000 개의 A549/Cisp 세포 및 3000 개의 MCF-7/ADM 세포를 96-웰 플레이트 상에 개별적으로 3 회 중복해서 시딩한다. 부착 후에, 세포들을 37 ℃에서 다양한 화학요법제들의 단독, 또는 0.5 ㎎/㎖의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액과 함께 배양한다. Jurkat 세포를 빈크리스틴 설페이트 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍/㎖로 처리하고; COLO205 세포를 5-플루오로유라실 0.78, 1.56, 3.13, 6.25 및 12.5 ㎍/㎖로 처리하고; A549/Cisp 세포를 시스플라틴 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25 및 12.5 ㎍/㎖로 처리하고; MCF-7/ADM 세포를 아드리아마이신 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25 및 12.5 ㎍/㎖로 처리한다. 처리 후에, 암 세포 성장의 억제를 ATP 종양 화학요법 감도 분석(ATP-TCA)에 의해 측정한다.

식도암 세포 주 HKESC-1을 홍콩 대학의 암 유전학 실험실로부터 수득한다. 2000 개의 암 세포를 96-웰 플레이트 상에 시딩한다. 부착 후에, 세포들을 37 ℃에서 0.08, 0.4, 2, 10 및 50 ㎍/㎖의 시스플라틴 단독, 또는 3 ㎎/㎖의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액과 함께 배양한다. 배양 후에, 세포독성을 MTT 세포 증식 분석에 의해 평가한다. 결과는 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 첨가가 화학요법에 고도로 내성인 A549/Cisp 및 MCF-7/ADM 세포를 포함한 다양한 암 세포 주들에서 화학요법 감도를 현저하게 향상시킴을 보인다(도 8에 도시됨).

실시예 12

급성 중증 출혈성 쇼크의 치료

(12a) 비글 개에서 급성 중증 출혈성 쇼크의 치료

본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 비글 개에서 급성 중증 출혈성 쇼크의 모델에서 소생제로서 사용한다. 60 마리의 비글 개를 각 그룹에 15 마리씩, 소생제에 따라 4 개의 그룹들로 랜덤하게 분할한다.

그룹 1: 덱스트란(음성 대조군)

그룹 2: 동물 자가혈액(양성 대조군)

그룹 3: 저 용량 처리(0.35 g 가교결합된 사량체성 헤모글로빈/체중 ㎏)

그룹 4: 중간 용량 처리(1.05 가교결합된 사량체성 헤모글로빈/체중 ㎏)

급성 중증 출혈성 쇼크를, 50 ㎖/체중 ㎏의 부피로 동물 전혈을 회수함으로써 확립시킨다. 출혈성 쇼크 확립 후 10 분째에, 덱스트란(50 ㎖/㎏), 동물 자가 혈액(50 ㎖/㎏), 상이한 용량의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈(5 ㎖/㎏, 15 ㎖/㎏)을 상기 동물들에게 주입한다. 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 주입 속도를 10 ㎖/㎏/시간으로 설정하고, 그 후에, 모든 실험 동물들을 7일간 관찰한다. 상기 연구 기간 중에 생존, 체중, 심전도 기록법(electro-cardiography, ECG), 혈압, 심박수, 호흡수, 체온, 혈장 헤모글로빈 농도, 혈액학, 동맥 혈액 가스, 소변검사, 임상 화학, 응고, 신체 상태 및 부작용들을 포함한 매개변수들의 집단을 관찰하고 분석한다. 상기 모두 중에서, 생존이 1차적인 종점이다. 7일의 처리 후에, 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 처리 그룹은 상기 정상 그룹 및 자가 혈액 그룹에 비해 훨씬 더 높은 생존율을 갖는다(하기 표 8에 나타난 바와 같음).

출혈성 쇼크 모델에서 개 연구

그룹	7일 후 생존 수 (n = 15)	7일 후 생존율 (%)
덱스트란 음성 대조군	7	46
개의 자가 혈액	12	80
저 용량 처리	14	97
중간 용량 처리	15	100

(12b) 래트에서 급성 중증 출혈성 쇼크의 치료

본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 래트에서 급성 중증 출혈성 쇼크의 모델에서 소생제로서 또한 사용한다. 80 마리의 스프래그-다우리 래트를 각 그룹에 16 마리씩, 소생제에 따라 5 개의 그룹들로 랜덤하게 분할한다.

그룹 1: 락테이트 링거 용액(음성 대조군)

그룹 2: 동물 자가 혈액(양성 대조군)

그룹 3: 저 용량 처리(0.1 g 가교결합된 사량체성 헤모글로빈/체중 ㎏)

그룹 4: 중간 용량 처리(0.3 가교결합된 사량체성 헤모글로빈/체중 ㎏)

그룹 5: 고 용량 치료(0.5 가교결합된 사량체성 헤모글로빈/체중 ㎏)

급성 중증 출혈성 쇼크를, 35 ㎖/체중 ㎏으로서 평가되는 동물 전혈 50%를 회수함으로써 확립시킨다. 출혈성 쇼크 확립 후 10 분째에, 락테이트 링거 용액, 동물 자가 혈액, 상이한 용량의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈(0.1 g Hb/㎏, 0.3 g Hb/㎏, 0.5 g Hb/㎏)을 상기 동물들에게 주입한다. 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 주입 속도를 5 ㎖/시간으로 설정하고, 그 후에, 모든 실험 동물들을 24 시간 동안 관찰한다. 상기 연구 기간 중에 생존, 혈류역학, 심근 역학, 심박출량, 심장 기능, 혈액 가스, 조직 산소 전달 & 소비, 조직 관류 & 산소 분압(간, 신장 및 뇌), 간 & 신장 기능, 혈류학(혈액 점도), 미토콘드리아 호흡 조절 속도(간, 신장 및 뇌)를 포함한 매개변수들의 집단을 관찰하고 분석한다. 상기 모두 중에서, 생존이 1차적인 종점이다. 24 시간의 관찰 후에, 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 처리 그룹은 상기 정상 그룹 및 자가 혈액 그룹에 비해 훨씬 더 높은 생존율을 갖는다(하기 표 9에 나타난 바와 같음).

그룹	24 시간 후 생존 수 (n = 16)	24 시간 후 생존율 (%)
음성 대조군	3	18.75
저 용량 치료 (0.1 g Hb/㎏)	6	37.5
중간 용량 치료 (0.3 g Hb/㎏)	8	50
고 용량 치료 (0.5 g Hb/㎏)	12	75
래트의 자가 혈액	10	62.5
*Hb: 가교결합된 사량체성 헤모글로빈

실시예 13: 시험관 내 메트 -헤모글로빈 형성 연구

종래 기술은 고 분자량 중합된 헤모글로빈 용액이 보다 긴 순환 지속성을 생성시키므로 바람직하다고 주장하였다. 따라서, 본 발명의 안정화 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 시험관 내에서 고 분자량 중합된 헤모글로빈과 비교하여 순환 조건을 시뮬레이션하는 조건에서 안정성을 분석한다. 상기 시험 회로를 도 17에 도시한다. 상기 메트-헤모글로빈 형성 우회 회로에서, A는 샘플 수용조이고, B는 샘플 유출구이고, C는 펌프이고, D는 리퀴-셀(Liqui-Cel) 접촉기이고, E는 샘플 채집 지점이고, F는 샘플 유입구이다. 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액의 시간 과정 메트-헤모글로빈 형성을 상업적으로 입수할 수 있는 제품(Oxyglobin)(등록상표)(대략적으로 68%의 중합체성 분획(≥128,000 MW)을 함유한다)과 비교한다. 상기 실험 전에, 모든 샘플들을 5 g/dL로 희석하고 50 ㎖의 희석된 샘플을 상기 샘플 유입구로부터 상기 샘플 수용조 내로 도입한다. 상기 액체 펌프 속도를 30 ㎖/분으로 설정하고, 상기 샘플이 상기 회로를 충전하게 한다. 상기 실험 전체를 통해서, 상기 샘플 수용조의 온도를 37 ℃에서 유지시킨다. 상기 메트-헤모글로빈 수준을 측정하기 위해서, 0.2 ㎖의 시험 샘플을 상기 공-산소 측정(IL-682, Instrumentation Laboratory)을 위한 샘플 채집 지점으로부터 채집한다. 이어서 압축된 공기를 2.0 ㎖/분의 유량으로 상기 리퀴-셀 멤브레인 접촉기에 통과시켜 상기 샘플의 산소 공급을 시작한다. 0.2 ㎖의 샘플을 30 분 간격으로 채집한다. 5 시간 동안 처리 후에, 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈 용액 및 상기 상업적으로 입수할 수 있는 제품(Oxyglobin)(등록상표)의 메트-헤모글로빈 분율은 각각 8.7% 및 16.4%까지 증가한다. 이는 상기 중합체성 헤모글로빈에 대한 불활성 메트-헤모글로빈 형성률이 본 발명의 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 경우보다 실실적으로 더 크다는 것을 입증한다(도 18).

상기 발명을 다양한 실시태양들에 관하여 개시하였지만, 상기와 같은 실시태양들은 제한이 아니다. 다수의 변화 및 변경은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 이해될 것이다. 상기와 같은 변화 및 변경을 하기 청구의 범위 내에 포함되는 것으로 간주한다.

<110> WONG, Bing Lou KWOK, Sui Yi <120> A METHOD FOR THE PREPARATION OF HIGH-TEMPERATURE STABLE OXYGEN-CARRIER-CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THE USE <130> 11PC254 <150> US 61/348,764 <151> 2010-05-27 <150> US 13/013,847 <151> 2011-01-26 <150> US 13/083,639 <151> 2011-04-11 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Bovine <400> 1 Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Gly Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys 1 5 10 15 Val Gly Gly His Ala Ala Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met 20 25 30 Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 35 40 45 Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Ala Lys Val Ala Ala 50 55 60 Ala Leu Thr Lys Ala Val Glu His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu 65 70 75 80 Ser Glu Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val 85 90 95 Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Val Thr Leu Ala Ser His 100 105 110 Leu Pro Ser Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 55 60 Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala 100 105 110 His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 3 <211> 141 <212> PRT <213> Canine <400> 3 Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Ile Lys Ser Thr Trp Asp Lys 1 5 10 15 Ile Gly Gly His Ala Gly Asp Tyr Gly Gly Glu Ala Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Phe Gln Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 35 40 45 Ser Pro Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Ala Asp 50 55 60 Ala Leu Thr Thr Ala Val Ala His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu 65 70 75 80 Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala Tyr Lys Leu Arg Val Asp Pro Val 85 90 95 Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Cys His 100 105 110 His Pro Thr Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Phe Ala Ala Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Porcine <400> 4 Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Ala Asp Val Lys Ala Ala Tyr Gly Lys 1 5 10 15 Val Gly Ala His Ala Gly Glu Ala Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met 20 25 30 Phe Leu Gly Phe Thr Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 35 40 45 Ser His Gly Ser Asp Glu Val Lys Ala His Gly Glu Lys Val Ala Asp 50 55 60 Ala Leu Thr Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Met Pro Gly Ala Leu 65 70 75 80 Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val 85 90 95 Asp Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Ser Thr Leu Ala Val His 100 105 110 Leu Pro Asp Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Asp Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Leu Ala Asp Val Ser Thr Val Leu Asp Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 5 <211> 142 <212> PRT <213> Equine <400> 5 Met Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser 1 5 10 15 Lys Val Gly Gly His Ala Gly Glu Phe Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Leu Gly Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Gly 50 55 60 Asp Ala Leu Thr Leu Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala 65 70 75 80 Leu Ser Asn Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Ser Thr Leu Ala Val 100 105 110 His Leu Pro Asn Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Ser Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 6 <211> 145 <212> PRT <213> Bovine <400> 6 Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys 1 5 10 15 Val Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val 20 25 30 Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser 35 40 45 Thr Ala Asp Ala Val Met Asn Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys 50 55 60 Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Met Lys His Leu Asp Asp Leu 65 70 75 80 Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His 85 90 95 Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val 100 105 110 Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp 115 120 125 Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Arg Tyr 130 135 140 His 145 <210> 7 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120 125 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145 <210> 8 <211> 147 <212> PRT <213> Porcine <400> 8 Met Val His Leu Ser Ala Glu Glu Lys Glu Ala Val Leu Gly Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Asn Ala Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Gln Ser Phe Ser Asp Gly Leu Lys His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Lys Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Gln 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Ile Val 100 105 110 Val Val Leu Ala Arg Arg Leu Gly His Asp Phe Asn Pro Asn Val Gln 115 120 125 Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145 <210> 9 <211> 147 <212> PRT <213> Equine <400> 9 Met Val Gln Leu Ser Gly Glu Glu Lys Ala Ala Val Leu Ala Leu Trp 1 5 10 15 Asp Lys Val Asn Glu Glu Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Asn Pro Gly Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu His Ser Phe Gly Glu Gly Val His His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Val Val Leu Ala Arg His Phe Gly Lys Asp Phe Thr Pro Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Ser Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145

Claims

고도로 정제되고 고온 안정성인 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법으로서, 상기 산소-담체-함유 약학 조성물이 헤모글로빈을 포함하고, 상기 방법이
a) 적어도 적혈구 및 혈장을 포함하는 포유동물 전혈을 제공하고;
b) 상기 포유동물 전혈 중의 혈장으로부터 적혈구를 분리하고;
c) 상기 혈장으로부터 분리된 적혈구를 여과하여, 여과된 적혈구 분획을 수득하고;
d) 상기 여과된 적혈구 세포 분획을 세척하여 혈장 단백질 불순물을 제거하고, 이에 의해 세척된 적혈구를 생성시키고;
e) 상기 세척된 적혈구를 즉석 세포용해 장치에서 50 내지 1000 리터/시간의 유량으로 백혈구의 용해 없이 적혈구를 용해하기에 충분한 시간 동안 조절된 저장성 용해에 의해 파괴하여, 파괴된 적혈구의 용해물을 포함하는 용액을 생성시키고;
f) 여과를 수행하여 상기 용해물로부터 폐 농축물의 적어도 일부를 제거하고;
g) 상기 용해물로부터 제 1 헤모글로빈 용액을 추출하고;
h) 사량체성 헤모글로빈보다 더 높은 분자량을 갖는 불순물을 제거하도록 구성된 한외 여과 필터를 사용해 제 1 한외 여과 공정을 수행하고, 상기 제 1 헤모글로빈 용액으로부터 임의의 바이러스 및 잔류 폐 농축물을 추가로 제거하여 제 2 헤모글로빈 용액을 수득하고;
i) 상기 제 2 헤모글로빈 용액 상에서 관류(flowthrough) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 인지질, 단백질 불순물 및 이량체성 헤모글로빈을 제거하고 인지질 무 함유, 저 단백질 불순물 및 저 이량체 헤모글로빈 용액을 형성시키고;
j) 상기 인지질 무 함유, 저 단백질 불순물 및 저 이량체 헤모글로빈 용액 상에서 불순물을 제거하도록 구성된 필터를 사용해 제 2 한외 여과 공정을 수행하여, 농축 정제된 인지질 무 함유, 저 단백질 불순물 및 저 이량체 헤모글로빈 용액을 생성시키고;
k) 상기 농축 정제된 인지질 무 함유, 저 단백질 불순물 및 저 이량체 헤모글로빈 용액 중의 헤모글로빈 분자들의 설프하이드릴 그룹들을 충분히 산소 공급된 환경에서, 상기 헤모글로빈 분자들이 시스테인 부위에서 내피세포 유래 평활근 이완 인자와 결합할 수 없게, 상기 헤모글로빈 분자들이 각각 티올-보호 그룹을 포함하는 하나 이상의 시스테인 부분을 갖도록 설프하이드릴 시약에 의해 차단하고;
l) 상기 티올-보호된 헤모글로빈을, 생성되는 가교결합된 사량체성 헤모글로빈의 분자량이 60 내지 70 kDa이 되고, 비 중합체성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈으로 필수적으로 이루어지도록 비스-3,5-다이브로모살리시 퓨마레이트에 의해 가교결합시켜, 중합체성 헤모글로빈의 형성 없이 고온 안정성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 형성시키고;
m) 적합한 생리학적 완충제를 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈과 교환하고;
n) 임의의 잔류 비-가교결합된 사량체성 헤모글로빈 및 임의의 잔류 화학물질들을 세척에 의해 제거하고;
o) N-아세틸 시스테인을 상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈에 0.2 내지 0.4%의 농도로 첨가하여 메트-헤모글로빈의 수준을 5% 아래로 유지시키고;
p) 중합체성 헤모글로빈이 없는, 상기 저 이량체, 인지질 무 함유, 티올-보호된, 80 ℃ 이하의 온도에서 고온 안정성인 가교결합된 사량체성 헤모글로빈을 약학적으로 허용 가능한 담체에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 즉석 세포용해 장치가 정적 믹서를 포함하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 가교결합된 사량체성 헤모글로빈이 소, 돼지, 개 또는 말 헤모글로빈으로부터 유래하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 컬럼 크로마토그래피가 하나 이상의 양이온-교환 컬럼 및 음이온-교환 컬럼을 포함하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 이온 교환 컬럼이 하나 이상의 DEAE 컬럼, CM 컬럼 및/또는 하이드록시아파타이트 컬럼인 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 비스-3,5-다이브로모살리시 퓨마레이트에 의한 헤모글로빈 가교결합이 적어도 α-α 및/또는 β-β 가교결합을 포함하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 β-β 가교결합이 전체 가교결합의 50%를 초과하도록, 상기 가교결합 조건을 선택하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 β-β 가교결합이 전체 가교결합의 60%를 초과하도록, 상기 가교결합 조건을 선택하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 β-β 가교결합이 전체 가교결합의 70%를 초과하도록, 상기 가교결합 조건을 선택하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 담체가 생리학적 완충제 또는 물인 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 제조된 조성물을 주변 조건에서 24 시간당 0.0025 ㎤ 미만의 산소 투과성을 갖는 다층의 가요성 주입 패키지로 패키징하는 것을 더 포함하는 산소-담체-함유 약학 조성물의 제조 방법.
헤모글로빈을 포함하고, 상기 헤모글로빈이 제 1 항의 방법에 의해 형성된 비중합체성 가교결합된 사량체성 헤모글로빈으로 필수적으로 이루어지는, 고도로 정제되고 고온 안정성인 산소 담체-함유 약학 조성물.
제 12 항의 조성물을 생체 내 또는 생체 외에서 조직에 제공하는 것을 포함하는, 상기 조직에 산소를 공급하는 방법.