CN101168565A - 一氧化氮阻断的交联四聚体血红蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明包括含有羧酰胺甲基化的交联血红蛋白的组合物，其中所述血红蛋白的半胱氨酸部分包含巯基保护基团，所述血红蛋白与一氧化氮结合的能力降低。所述血红蛋白优选是脱氧、无内毒素与无基质的。本发明也包括制备方法、制备工艺与使用方法，包括补充哺乳动物的血液容积与治疗哺乳动物的可从氧递送物质获益的疾病。

Description

一氧化氮阻断的交联四聚体血红蛋白

本申请要求2006年10月23日提交，第一作者是Ross Tye的美国临时申请系列号60/853,968的优先权。

技术领域

本发明涉及一氧化氮阻断的交联四聚体血红蛋白，更具体地说涉及酰胺基甲基化(carboxamidomethylated)的交联四聚体血红蛋白，其与一氧化氮(NO)的反应性低，交联以稳定该四聚体的体内应用。也公开了其制备方法与作为血液容积膨胀剂和氧气转运疗剂的应用。

背景技术

紧急情况中用血的局限性之一是需要测定血型与交叉配血以尽可能降低输血反应的风险。测定血型与交叉匹配需要至少10分钟，完全的测定血型与交叉配血可能要花费达1小时的时间。此外，估计每500,000份血液中有一份有HIV传染的风险，估计每3,000份血液中有一份有丙型肝炎传染的风险。血液供应与血液后勤的安全是发展中国家的关键问题，在这些国家中感染性疾病传播以及过期供应的风险较高。在发展中国家中，最大达25％的血液因存在感染性疾病而遭弃去。因此，急需发现能避免疾病传播并提供快速反应以提高存活几率的血液替代品或人工血液组合物。

人工血液在临床情况中应用的两个方面是容积膨胀与氧疗法。容积膨胀剂是惰性的，只增加血液容积，从而使得心脏能有效地泵出血流。氧疗法能模拟人血的氧气转运能力。根据转运机理可将氧疗法分为两类：基于全氟化碳的治疗，其通过氧的简单溶解起作用；和基于血红蛋白的治疗，其通过促进捕获和释放来转运氧的血红蛋白。在基于血红蛋白的产品中，从红细胞(RBC)分离的纯血红蛋白(Hb)可能因许多原因而不适用，包括不稳定性、诱导肾毒性与从红细胞分离时不合适的氧转运和递送特征。

基于血红蛋白的氧疗法在动物与人研究中显示能施加各种程度的血管活性作用(Winslow等，Adv Drug Del Rev，2000，40：131-42；Stowell等，Transfusion，2001，41：287-99；Spahn等，News Physiol Sci，2001，16：38-41；Spahn等，Anesth Analg，1994，78：1000-21；Kasper等，Anesth Analg，1996；83：921-7；Kasper等，Anesth Analg，1998，87：284-91；Levy等，J ThoracCardiovasc Surg，2002，124：35-42)。此血管活性可能是因这些产品在结合胞内NO(Kasper等，Anesth Analg，1996，83：921-7；Dietz等，Anesth Analg，1997，85：265-273；Schechter等，N Engl J Med，2003，348：1483-5)、内皮释放(Gulati等，Crit.Care Med，1996，24：137-47)或外周α-肾上腺素能受体敏化(Gulati等，J Lab Clin Med，1994，124：125-33)中的作用所致。或者，血管收缩作用增加可归因于以高于RBC的浓度给予这些产品后氧释放速率继发性的增加，结果导致血管收缩(Winslow等，J Intern Med，2003，253：508-17；McCarthy等，Biophys Chem，2001，92：103-17；Intaglietta等，Cardiovasc Res，1996，32：632-43；Vandegriff等，Transfusion，2003，43：509-16)。

已知无基质的Hb溶液能诱导血压升高。已证实一些交联的Hb溶液能在给予的15分钟内以剂量依赖性方式将平均动脉血压升高25-30％，该作用可持续长达5小时。

血管收缩可归因于血红蛋白疗法清除了NO(Katsuyama等，Artif CellsBlood Substit Immobil Biotechnol，1994，22：1-7；Schultz等，J Lab Clin Med，1993，122：301-308，这些文献全文纳入本文作为参考)。磷脂和内毒素污染了血红蛋白也可导致血管收缩。虽然Hb纯化期间剩余的磷脂和内毒素污染作用可导致血流动力学作用(Macdonald等，Biomater Artif Cells Artif Organs，1990，18：263-282)，但这种污染不大可能是解释一些这种产品的有效血管活性作用的主要原因(Gulati等，Life Sci，1995，56：1433-1442)。

NO是通过激活鸟苷酸环化酶并产生cGMP或通过直接激活钙依赖性钾通道来发挥作用的平滑肌松弛剂。游离Hb增加导致NO结合能力增加。NO结合能力增加可导致对血管活性物质或缺乏血管活性调节物质起反应的瞬时与持续的(反复给予)血流动力学变化。在一些情况中，缺乏一氧化氮可导致血压升高与高血压(如果血压升高持续的话)。已证实NO可与Hb的反应性巯基结合，并可以与血红素基团转运氧相类似的方式转运到或转运出各组织(Jia等，Nature，1996，80：221-226)。

一氧化氮联同前毛细血管括约肌运动是任何组织的小动脉输注的调节剂。一氧化氮在动脉壁的内皮合成与释放，并在该处与红细胞中的血红蛋白结合。当某组织接受高水平的氧时，一氧化氮不释放，动脉壁收缩使得血管直径变小，从而降低了输注速率并导致心脏输出改变。当需氧增加时，内皮释放一氧化氮从而导致血管舒张。一氧化氮对动脉输注的控制在NO从内皮释放后扩散的距离上起作用。一氧化氮也是介导某些炎性反应所需。例如，内皮产生的一氧化氮能抑制血小板聚集。因此，当一氧化氮与无细胞的血红蛋白结合时，血小板聚集增加。当血小板聚集时，它们释放有效的血管收缩性化合物，例如凝血噁烷A₂和5-羟色胺。这些化合物可与血红蛋白清除导致的一氧化氮水平降低协同作用从而造成显著的血管收缩作用。除了抑制血小板聚集，一氧化氮也抑制嗜中性白细胞与细胞壁的黏附，进而导致细胞壁受损。由于一氧化氮能与红细胞内部的血红蛋白结合，估计一氧化氮也能与游离Hb(无基质的交联四聚体Hb)结合。

在许多制剂中，游离Hb与稳定的血红蛋白输注看来与血管收缩有关，从而导致极端的高血压。这些产品中的血红蛋白部分可扩散入血管壁的内皮衬里并作为维持血管壁正常紧张性所需的NO的结合与除去的变换器。这可导致血管壁的平滑肌细胞的血管收缩作用。游离的Hb溶液可渗入周围的组织。施加基于不同分子大小的血红蛋白疗法后发生的血管收缩程度也与所用产品的分子大小具有相反的关系，即输注较大的氧运载体可导致程度较低的血管收缩与高血压(Sakai等，Am J Physiol，2000，279：H908-15)。较小的Hb分子可能最具渗透性，并且可能显示较高水平的血管收缩与高血压(Faivre-Fiorina等，Am J Physiol Heart Circ Physiol，1999，276：H766-70)。在家兔模型中，从耳静脉输入游离Hb导致脑血管结构局部缺血和死亡。因此，在给药期间尽可能降低给予大部分游离Hb对动脉系统的影响是重要的。可先给予患者血管活性剂，例如异搏定、atenocard、柠檬酸西地那非等，再输注游离Hb。这是为了保证输注期间动脉系统的改变最小。一氧化氮与异搏定是优选的血管活性药物。缓慢钙通道阻断剂(或5型环状鸟苷单磷酸(cGMP)-特异性磷酸二酯酶(PDE5)的选择性抑制剂，例如柠檬酸西地那非)也有助于预防严重的血管收缩。然而，就紧急需要大量血液且是至关重要的外伤患者而言，不可能用较慢的输注速率。

改进血红蛋白疗法的NO清除特性的一种机理是阻断这些分子上的NO结合位点。血红蛋白上半胱氨酸部分的未受保护的巯基可与NO结合。保护血红蛋白分子中的巯基可防止NO在该巯基位点与血红蛋白结合，从而防止了导致高血压反应的血管的急性血管活性反应。当施加此类疗法时，防止NO与血红蛋白结合也能防止正常血小板聚集和嗜中性白细胞迁移的干扰。

因此，基于血红蛋白的氧递送疗法所需的一些特征是：无毒，不会诱导有害的免疫原性反应，满意的携氧与递送能力，合适的循环持续性以使组织发生有效的氧合作用，储存寿命长，在室温保存的能力，无病毒或其它病原体以防止疾病传播，无需测定血型与易于为第一出动人员(first responder)，例如随行医务人员，前线军医等使用。这些特征能对失血作出快速安全的应答，对组织代谢需要给予即刻支持，因此提高了存活率。

本文公开的本发明提供了制备脱氧、无内毒素、无基质、巯基阻断、交联的四聚体血红蛋白的组合物、特征与方法，所述血红蛋白与一氧化氮(NO)的反应性低并通过交联稳定了四聚体结构。具体地说，提供了羧酰胺甲基化的交联四聚体血红蛋白作为本发明稳定的NO阻断四聚体Hb及其制备方法。公开了制备本发明稳定的NO阻断四聚体Hb的工艺和方法以及将其用作血液容积膨胀剂与氧递送治疗剂的方法。

发明内容

本发明涉及含铁的蛋白质化合物，其分子量分布范围是约60,000-约500,000道尔顿，具有至少一个半胱氨酸部分，其中该半胱氨酸部分包含巯基保护基团，从而降低了该蛋白质化合物在该半胱氨酸位点与一氧化氮结合的能力。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧气。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物不能在半胱氨酸位点与一氧化氮结合。

本发明的另一方面涉及包含含铁蛋白质化合物的组合物，该蛋白质化合物的分子量分布范围是约60,000-约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中该半胱氨酸部分包含巯基保护基团从而降低了该蛋白质化合物在该半胱氨酸位点与一氧化氮结合的能力。

本发明还有另一方面涉及包含含铁蛋白质化合物的组合物，该蛋白质化合物的分子量分布范围是约60,000-约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中该半胱氨酸部分包含巯基保护基团从而降低了该蛋白质化合物在该半胱氨酸位点与一氧化氮结合的能力，并且其中所述化合物是交联的四聚体血红蛋白。

本发明的另一方面涉及制备四聚体血红蛋白的方法，其中该血红蛋白的半胱氨酸基团上连接有巯基保护基团，所述方法包括：(a)从含有红细胞的制品中除去内毒素和其它脂多糖；(b)裂解这些红细胞；(c)除去裂解的红细胞中的基质来分离血红蛋白；(d)任选从血红蛋白中除去氧；(e)向血红蛋白溶液中加入能为血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和(f)分离在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。

在本发明上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括：(a)任选从在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白中除去氧；交联在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白，从而得到本发明稳定的NO阻断四聚体Hb，它是交联的。

本发明的另一方面提供了制备半胱氨酸上连接有巯基保护基团的四聚体血红蛋白的方法，所述方法包括：(a)从含有红细胞的制品中除去内毒素；(b)裂解所述红细胞；(c)除去所述裂解的红细胞中的基质来分离血红蛋白；(d)任选使所述血红蛋白脱氧；(e)向血红蛋白溶液中加入能为所述血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和(f)分离在其半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。

本发明的另一方面提供了制备交联四聚体血红蛋白的方法，所述方法包括：任选从制备四聚体血红蛋白的方法制得的产品中除去氧；和交联所述产品。

本发明还有另一方面涉及制备NO阻断的四聚体血红蛋白的方法，所述血红蛋白在半胱氨酸上连接有巯基保护基团，所述方法包括：(a)向血红蛋白溶液中加入能为血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和(b)分离在其半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。在一些实施方案中，还可交联所述血红蛋白。

本发明的另一方面涉及补充哺乳动物的血液容积的方法，所述方法包括给予该哺乳动物含有含铁的蛋白质化合物的组合物，该蛋白质化合物的分子量是约60,000-约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中该半胱氨酸部分包含巯基保护基团从而降低了该蛋白质化合物在该半胱氨酸位点与一氧化氮结合的能力。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物是交联的。

本发明的另一方面提供了治疗患病哺乳动物的方法，所述方法包括给予含有含铁的蛋白质化合物的组合物，该蛋白质化合物的分子量是约60,000-约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中该半胱氨酸部分包含巯基保护基团从而降低了该蛋白质化合物在该半胱氨酸位点与一氧化氮结合的能力。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物是交联的。

本发明的另一方面提供了输注某器官的方法，所述方法包括给予有效量的本发明稳定的NO阻断四聚体血红蛋白，该方法还可在体内或离体实施。

在一些实施方案中，与天然、无细胞的血红蛋白相比，该含铁的蛋白质化合物提高了氧卸载能力。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物提高了氧递送能力。在一些实施方案中，该交联的四聚体血红蛋白与一氧化氮的结合能力显著降低。在一些实施方案中，该交联的四聚体血红蛋白不能与一氧化氮结合。在一些优选的实施方案中，该交联的四聚体血红蛋白以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。

在本发明的一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物是巯基受保护的血红蛋白。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物是交联的四聚体血红蛋白。在一些实施方案中，该含铁的蛋白质化合物与3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联。在一些实施方案中，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应来修饰血红蛋白。在一些实施方案中，该血红蛋白是哺乳动物的血红蛋白。在一些实施方案中，该血红蛋白是人血红蛋白。在一些实施方案中，该血红蛋白是牛(即，牛(牛属)或野牛(野牛属))或猪血红蛋白。在一些优选的实施方案中，该血红蛋白是非热源性、无内毒素、无氧与无基质、无酶以及诱导负面免疫原性反应的能力低。

在一些优选的实施方案中，从在其半胱氨酸上连接或未连接巯基保护基团的血红蛋白中除去氧。在一些实施方案中，通过接触器膜技术(contactormembrane technology)除去氧。

在本发明的另一方面，本发明含铁的蛋白质化合物是巯基阻断的不含基质的血红蛋白，它可安全地长期储存。此巯基阻断的不含基质的血红蛋白可以是能经受包装、转运与进一步处理从而得到本发明另一种血红蛋白组合物的稳定中间体。在一些实施方案中，该稳定的中间体还可任选脱氧、交联与纯化以除去过量的试剂和反应的副产物，例如二溴水杨酸。在一些实施方案中，包装该稳定的NO阻断的四聚体血红蛋白。

在本发明的其它实施方案中，该化合物是非热源性、无内毒素与无基质的。在本发明的一些实施方案中，该蛋白质化合物是低粘度的。在一些实施方案中，本发明的蛋白质化合物是无氧的。

在一些实施方案中，提供巯基保护基团的试剂选自：4-吡啶基甲基氯、烷氧基烷基氯、二甲氧基甲烷、N-(羟甲基)乙酰胺、三苯基甲基氯、乙酰基氯、乙酸酐、卤代乙酰胺、碘乙酸酯、苄基氯、苯甲酰氯、二碳酸二叔丁酯、对-羟基苯甲酰甲基溴、对-乙酰氧基苄基氯、对-甲氧基苄基氯、2，4-二硝基苯基氟、四氢吡喃、乙酰氨基羟基甲烷、丙酮、双-碳乙氧基(carboethoxy)乙烯、2，2，2-三氯乙氧基羰基氯、叔丁氧基羰基氯、异氰酸烷酯与烷氧基烷基异氰酸酯。在一些优选的实施方案中，该卤代乙酰胺是碘乙酰胺。在一些实施方案中，该巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧基甲基的衍生物、羧酰胺基甲基(carboxamidomethyl)、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基(carboethoxy)乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。在一些实施方案中，该巯基保护基团是羧酰胺基甲基(carboxamidomethyl)。

本发明的一些实施方案提供了含有含铁的蛋白质化合物与药学上可接受的载体的组合物。一些实施方案提供了装有组合物的容器，所述组合物含有本发明的蛋白质化合物，任选含有药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，哺乳动物患有急性贫血、贫血相关疾病、缺氧或局部缺血。在一些实施方案中，哺乳动物需要容积输注血液替代品来转运氧。在一些实施方案中，哺乳动物受外伤并有严重失血。

在本发明方法的一些实施方案中，通过植入、注射或输液来给药。

在本发明方法的其它实施方案中，哺乳动物患有包括贫血、贫血相关疾病、缺氧与局部缺血的疾病。肾脏衰竭、糖尿病、AIDS、化疗、放疗、肝炎、G.I.失血(G.I.blood loss)、铁不足或月经过多可导致贫血与贫血相关疾病。在本发明的一些实施方案中，该方法包括施加促红细胞生成素治疗。

在本发明方法的一些实施方案中，所治疗的疾病是烧伤、中风、新发生的中风(emerging stroke)、暂时局部缺血发作、心肌昏厥与休眠(myocardialstunning and hibernation)、急性心绞痛、不稳定心绞痛、新发生的心绞痛或梗死导致的局部缺血。在该方法的其它实施方案中，该疾病是一氧化碳中毒。

在本发明方法的其它实施方案中，所治疗的哺乳动物的疾病是手术后恢复。在本发明方法的一些实施方案中，该疾病是糖尿病人伤口愈合。在本发明方法的还有其它实施方案中，该疾病是镰状细胞贫血，可先给药再进行手术。在本发明方法的其它实施方案中，该疾病是急性冠状综合征。在本发明方法的其它实施方案中，该疾病是心源性休克。

在本发明方法的一些实施方案中，间含铁的蛋白质化合物给予需要输血的哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，该哺乳动物受外伤。在所述方法的实施方案中，所治疗的哺乳动物的疾病是环境压力或身体压力导致的氧递送能力不足。

在本发明方法的实施方案中，联合放疗给予含铁的蛋白质化合物。在本发明还有其它实施方案中，该方法还包括给予所述哺乳动物氧依赖性药物。

在本发明方法的实施方案中，将含铁的蛋白质化合物给予所述哺乳动物从而能在体内显影血管内空间，而维持观测视野范围内组织的氧合作用。

纳入参考

如同每份出版物或专利申请专门且独立地表明纳入参考的程度一样，本说明书中提及的所有出版物和专利申请纳入本文作为参考。

附图说明

本发明的新颖特征详见附加的权利要求。参考以下给出的利用本发明主旨的说明性实施方案详述与附图可更好地理解本发明的特征与优点：

图1是显示本文所公开方法各步骤的流程图。

图2描述了显示WBC裂解抗性的溶解实验的时程。

图3描述了本文公开的电泳分离所用的大小标准品。

图4A描述了电泳分离天然血红蛋白、dXCMSFH与约20KDa的大小标准品的重叠情况。

图4B描述了电泳分离天然血红蛋白、dXCMSFH与大小标准品的重叠情况的全电泳图谱。

图5描述了交联反应产物的HPLC尺寸排阻分离。

图6显示了牛全血、无基质Hb、交联血红蛋白与新鲜人血的氧亲和曲线。

图7A-D分别描述了猪安全性试验的心脏输出、全身性血管阻力与平均动脉血压。

具体实施方式

本文所用的术语“无内毒素的”或其语法上的等价词表示采用非常灵敏的试验技术，例如比浊试验或产色试验检测到经处理的血红蛋白减少了与内毒素接触并基本上或全部除去所有内毒素。这些方法能检测低于0.05EU/ml。因此，无内毒素的血红蛋白包含的内毒素含量可低于注射用水(WFI)中存在的量或与其相当。

本文所用的术语“无热源的”或其语法上的等价词表示可将血红蛋白给予哺乳动物而不会导致IL-8过度表达、补体激活、血小板激活、炎性反应或发热反应。

本文所用的术语“无氧的”、“脱氧的”或其语法上的等价词表示经处理的血红蛋白基本上或完全除去了与血红素袋结合的所有氧。因此，无氧的血红蛋白基本上或完全处于较高能量的“紧张”或“T”构象。

本文所用的术语“无基质的”或其语法上的等价词表示经处理或加工的血红蛋白基本上或完全除去所有基质物质，因而该制品不再对BRC膜特征性的红细胞表面型抗原显示免疫反应性。基质是细胞膜结构蛋白，除去基质也除去了细胞膜相关的抗原。因此，无基质的血红蛋白基本上或完全缺乏与在血红蛋白周围仍含有部分质膜的溶血红细胞制品相关的毒性和/或热源特性，所以，分子稳定后，可将此稳定的无基质血红蛋白给予个体而不导致输血反应毒性或炎性反应。

术语“NO-阻断的四聚体Hb”指本发明的无内毒素、无基质的巯基阻断四聚体血红蛋白。术语“稳定的NO-阻断血红蛋白”指本发明的交联、无内毒素、无基质的巯基阻断血红蛋白。

术语“dNO-阻断的四聚体Hb”指本发明的脱氧、无内毒素、无基质、巯基阻断、交联的血红蛋白。此类化合物的一个实施方案是“dXCMSFH”，其是本发明的脱氧、无内毒素、无基质、酰胺基甲基化的交联血红蛋白的具体实例。

术语“dTBSFH”指本发明的脱氧、无内毒素、无基质、巯基阻断的未交联血红蛋白。

术语“dCMSFH”指本发明的脱氧、无内毒素、无基质、酰胺基甲基化的未交联血红蛋白，其是dTBSFH的具体实例。

术语“哺乳动物”指人和非人动物。

本发明的组合物与方法涉及巯基保护的交联四聚体血红蛋白(稳定的NO阻断Hb)，其中血红蛋白分子中的至少一个半胱氨酸部分含有巯基保护基团，例如羧酰胺基甲基，从而使得半胱氨酸中的巯基不能与一氧化氮(NO)结合。最好血红蛋白中的至少两个半胱氨酸部分受巯基保护基团保护，从而使得半胱氨酸部分中的巯基不能与一氧化氮(NO)结合。给予本文公开的这些NO-阻断的血红蛋白能防止血管的血管活性反应。本发明稳定的NO-阻断的四聚体血红蛋白可进一步交联以得到p50约20mm Hg-约45mm Hg的携氧容量与延长的循环半衰期。血红蛋白优选是无热源、无内毒素、无氧与无基质的。因此，本发明巯基保护的交联血红蛋白(稳定的NO-阻断的四聚体Hb)的氧交换容量高，其功能优于天然血红蛋白。

I.血红蛋白组合物

1.血红蛋白来源与分子结构

本发明所用的血红蛋白(或从中分离的血液或RBC)可得自各种哺乳动物来源，例如人、牛(牛属(genus bos))、野牛(野牛属(genus bison))、绵羊(绵羊属(genus ovis))、猪(猪属(genus sus))来源、其它脊椎动物或转基因制备的血红蛋白。或者，本发明所用的无基质血红蛋白可以由细菌，或更优选酵母菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞表达载体系统合成产生(Hoffman，S.J.等，美国专利号5,028,588与Hoffman等，WO 90/13645，二者均纳入本文作为参考)。或者，血红蛋白可得自转基因动物；这种动物可经工程改造以表达非内源性血红蛋白(Logan，J.S.等，PCT申请号PCT/US92/05000；Townes，T.M.等，PCT申请号PCT/US/09624，二者均全文纳入本文作为参考)。本发明所用的无基质的血红蛋白优选从野牛、牛或人来源分离。

牛属包括：牛亚属(subgenus bos)，包括普通牛(bos taurus)(西方牛，包括牛(oxen)和原牛(aurochs))与埃及牛(bos aegyptiacus)；大额牛亚属(subgenus bibos)，包括大额牛(bos frontalis)(野牛(gaur)，大额牛(gayal)或印度野牛)与爪哇牛(bos javanicus)(爪哇牛)；novibos亚属，包括林牛(bossauveli)(林牛(kouprey)或灰牛(grey ox))；与牦牛亚属(subgenus poephagus)，包括牦牛(bos grunniens)(牦牛(yak)；也称为野牦牛(bos mutus))。普通牛包括非洲和亚洲相似的类型，例如瘤牛(bos indicus)，瘤牛(zebu)；与祖先原牛(bos primigenius)，原牛(aurochs)。亚洲野牛(bos gurus)包括以下亚种：老挝亚种(bos gaurus laosiensis)，指名亚种(bos gaurus gaurus)(例如印度、尼泊尔的)也称为“印度野牛”，云南亚种(bos gaurus readei)，马来亚种(bosgaurus hubbacki)(例如泰国、马来西亚的)与大额牛(bos gaurus frontalis)，家养野牛或野牛-牛杂交种。

野牛是包含野牛亚科的6个种的分类学属。野牛在亚洲(例如水牛)和非洲(例如非洲水牛)也称为水牛。野牛属包括的种有，例如大角野牛(bisonlatifrons)(长角野牛)，古代野牛(bison antiquus)，西方美洲野牛(bisonoccidentalis)，普氏美洲野牛(bison priscus)，美洲野牛(bison bison)，美洲草原野牛(bison bison bison)，美洲森林野牛(bison bison athabascae)，欧洲野牛(bison bonasus)，欧洲低地野牛(bison bonasus bonasus)，欧洲高加索野牛(bison bonasus caucasicus)和欧洲匈牙利野牛(bison bonasus hungarorum)。在本发明的一些实施方案中，血红蛋白是牛或野牛属的。应知道任何哺乳动物种类可用作血红蛋白来源，其属于本发明范围内。

牛Hb比人Hb更易获得且更丰富。从过时(outdated)的RBC提取的人Hb通常用于Hb人工血液研究。然而，过时RBC的量不足以产生大量可行的氧递送治疗剂或血液替代品。

无论是动物、合成或重组获得的血红蛋白可由“天然存在”的血红蛋白蛋白质构成，或者可含有一些突变型血红蛋白蛋白质或完全由突变型血红蛋白蛋白质构成。优选的突变型血红蛋白包括其突变导致更可取的氧结合/释放特征的那些蛋白质。这种突变型血红蛋白蛋白质的例子包括Hoffman，S.L.等(美国专利号5,028,588和5,776,890)与Anderson，D.C.等(美国专利号5,844,090和5,599,907)提供的，所有专利全文纳入本文作为参考。

血红蛋白(Hb)是含铁的蛋白质血红素化合物，其分子量约60,000道尔顿，在哺乳动物与其它动物血液的红细胞中转运氧。血红蛋白将氧从肺转运到身体其它地方，例如转运至肌肉，其中它释放部分氧负荷。血红蛋白分子是4个球状蛋白亚基的装配体。各亚基由和非蛋白血红素基团紧密结合的蛋白质链构成。各蛋白质链排列为一组α-螺旋结构区段，这些区段以“肌红蛋白”排列方式连接在一起，如此称谓是因为此排列方式是血红素/球蛋白中使用的相同折叠基序。此折叠模式含有适合于强烈结合血红素基团的袋。血红素基团由维持在杂环中的铁原子构成，称为卟啉。这些铁原子是氧结合的位点。铁原子与该环中心位于同一平面的所有4个氮原子同等结合。在每侧可与铁形成垂直于该平面的两条额外的键从而形成第5和第6位置，一个位置与蛋白质强烈相连，另一位置用于结合氧。铁原子可以是Fe²⁺或Fe³⁺状态，但高铁红蛋白(正铁红蛋白)(Fe³⁺)不能结合氧。

在成人中，主要的血红蛋白类型是称为血红蛋白A的四聚体(含有4个亚基蛋白)，它由非共价结合的两条α和两条β亚基构成，两种亚基分别各自由141和146个氨基酸残基组成。这表示为α₂β₂。这些亚基结构相似，大小大致相同。各亚基的分子量约为16,000道尔顿，四聚体的总分子量约为64,000道尔顿。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。α和β链之间的接触方式有两种：α₁β₁和α₁β₂。然而，成人血红蛋白也可含有δ球蛋白亚基。δ球蛋白亚基替代β球蛋白，与α球蛋白配对为α₂δ₂从而形成血红蛋白A2。

牛Hb与人Hb结构相似。牛Hb也含有两条α链和两条β链，其分子量分布相似。

2.保护血红蛋白中半胱氨酸的巯基

血红蛋白中半胱氨酸部分的巯基可与一氧化氮结合，导致血液或血管活性物质的血流动力学特性短暂或持续改变并可导致高血压反应。保护血红蛋白中半胱氨酸部分的巯基可避免这种情况发生，从而使得到的血红蛋白不能与NO结合。

牛血红蛋白只含有两个参与结合NO的巯基(每条β链上的Cys93)。因此，优选用巯基保护基团保护牛Hb的两个巯基。人血红蛋白含有6个巯基(αCys 104、βCys 93和βCys 112)，其中至少两个(每条β链上的Cys 93)参与结合NO。优选用巯基保护基团保护人Hb中的此二巯基，最多6个巯基。

本发明的SFH可与各种试剂反应从而保护血红蛋白的半胱氨酸部分中的巯基。本发明包括本领域已知用于保护功能基团，例如但不限于羟基、巯基或羧基的所有试剂，而不是对本发明的限制。

所述试剂的一些例子包括但不限于：4-吡啶基甲基氯、烷氧基烷基氯、二甲氧基甲烷、N-(羟甲基)乙酰胺、三苯基甲基氯、乙酰基氯、2-氯乙酸、乙酸酐、卤代乙酰胺(如碘乙酰胺、溴乙酰胺、氯乙酰胺或氟乙酰胺)、卤代乙酸酯(如碘乙酸酯、溴乙酸酯、氯乙酸酯或氟乙酸酯)、苄基氯、苯甲酰氯、二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)、对-羟基苯甲酰甲基溴、对-乙酰氧基苄基氯、对-甲氧基苄基氯、2，4-二硝基苯基氟、四氢吡喃、乙酰氨基羟基甲烷、丙酮、双-碳乙氧基乙烯、2，2，2-三氯乙氧基羰基氯、叔丁氧基羰基氯、异氰酸烷酯与烷氧基烷基异氰酸酯。在一优选的实施方案中，所述试剂是卤代乙酰胺。在另一优选的实施方案中，所述试剂是碘乙酰胺。应理解本领域已知可用于酰胺基甲基化血红蛋白的半胱氨酸部分中巯基的任何试剂属于本发明范围。

本发明包括本领域已知用于保护功能基团，例如但不限于羟基、巯基或羧基的所有保护基团，而不是对本发明的限制。保护基团的一些例子包括但不限于：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基(carboethoxy)乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。在一优选的实施方案中，所述保护基团是羧酰胺基甲基，从而通过保护血红蛋白的半胱氨酸部分中的巯基得到无热源、无内毒素、无基质的酰胺基甲基化Hb(CMSFH或稳定的NO阻断Hb)。更具体地说，保护血红蛋白的半胱氨酸中的巯基可得到无热源、无内毒素、无基质的巯基保护Hb(TBSFH或NO阻断的Hb)。

3.通过四聚体血红蛋白内的交联来调节氧亲和力与稳定化

牛Hb与人Hb的区别在于调节氧亲和力的方式。在四聚体形式的成人血红蛋白中，氧的结合是一合作过程。氧气饱和血红蛋白可增加该分子与氧的结合亲和力。结果，血红蛋白的氧结合曲线是S形的。通过血红蛋白蛋白质复合物的空间构象变化可实现这种主动合作结合。当血红蛋白中的一个亚基蛋白质变得氧合时，它诱导整个复合物的构象或结构改变从而导致其它亚基对氧的亲和力增加。

当血红蛋白与氧结合时，它从高状态能量的“紧张”或“T”状态(脱氧或无氧的)向能量较低的“松弛”或“R”状态(氧合的)转变。已克隆并测序了人α和β球蛋白基因(Liebhaber等，Proc.Natl.Acad.Sci.，(美国).，77：7054-58，(1980)；Marotta等，J Biol.Chem.，252：5040-43，(1977)；与Lawn等，Cell，21：647，(1980)，所有文献全文纳入本文作为参考)。人T状态脱氧血红蛋白的四聚体结构因6根离子键而增加了稳定性，血红蛋白处于T状态时有效地防止了解离为二聚体。在此构象中，脱氧血红蛋白的两条β链之间的β裂隙接触区域(也称为β袋，磷酸酯袋与2，3-二磷酸甘油酸酯结合位点)基本上不同于氧合血红蛋白中的。据信，T状态中β裂隙的构象改变是通过2，3-二磷酸甘油酸酯稳定的氧亲和力降低的原因。血红蛋白的T状态稳定并耐受变性作用。

在红细胞内部，2，3-二磷酸甘油酸酯与其在人血红蛋白内的结合位点结合将血红蛋白的氧亲和力降低至与在pH 7.2-7.4的生理范围内氧转运和递送相似的水平。2，3-二磷酸甘油酸酯与血红蛋白的结合弱，可能需要高浓度(即，接近1M或更高的浓度)来调节血红蛋白的氧亲和力。例如，在快速适应高海拔的人中，其血液中2，3-二磷酸甘油酸酯(2，3-DPG)的浓度增加，因而这些人能在氧张力较低的条件下将更大量的氧释放给组织。

因此，当红细胞破裂产生无基质的血红蛋白(SFH)时，2，3-二磷酸甘油酸酯不能维持在血红蛋白附近，可能与其解离。结果(除非还有改进)，人SFH比RBC中的血红蛋白显示更高的氧亲和力。与天然RBC相关的血红蛋白约27mm Hg的p50相比，溶液中无基质的人血红蛋白的p50约为12-17mm Hg。在生理条件下，SFH对氧的亲和力增加可防止向组织高容积地释放入所结合的氧。

相反，额外具有一根内部盐桥的牛Hb的氧亲和力受局部环境的离子强度影响。牛血红蛋白不需要2，3-DPG来维持氧的p50在30mm Hg-40mm Hg的范围。与通过2，3-DPG结合来诱导相比，通过改变离子强度来调节亲和力的优点在于血浆中通常存在浓度足够的离子种类，而2，3-DPG只包含在RBC中。因此，非细胞牛Hb的氧亲和力比非细胞人Hb更容易调节。

将人Hb与吡哆醛-5-磷酸(PLP)反应可在人Hb中实现通过普通离子相互作用来调节亲和力的优点。PLP通过在倒数第二个β链组氨酸残基附近引入负电荷与除去同一链氨基末端的正电荷来修饰人Hb。现在，此类改变的人Hb对局部环境中带电物质的反应更类似于牛Hb，而不是仅依赖于2，3-DPG的结合来影响氧亲和力。

在RBC中，α链与其相应的β链的结合非常强烈，在生理条件下不会解离。然而，一个α/β二聚体与另一α/β二聚体的结合相当弱，在RBC外，即使在生理条件下该两个二聚体也可解离。解离后，二聚体渗过肾小球。肾脏快速清除无基质的血红蛋白(SFH)是由于其四级分子排列(quaternarymolecular arrangement)所致。

为避免以此方式除去人和牛血红蛋白等，可通过本领域已知的各种方法偶联或交联无细胞的血红蛋白。方法之一是将Hb与另一分子，例如聚乙二醇(PEG)偶联，从而在Hb分子周围形成亲水性屏障同时增大其体积进而增加其循环半衰期。Hb也可进行分子内交联以防止四聚体解离成αβ二聚体和/或进行分子间交联以形成聚合物，这样也能增大携氧分子的体积，因而增加了其循环半衰期。利用位点特异性交联试剂可形成分子内共价键，这些共价键可将Hb转化为稳定的四聚体，从而防止其解离为αβ二聚体。另一方面，利用非特异性交联剂，例如戊二醛可在位于Hb四聚体内或之间的氨基酸残基间形成非特异性共价结合。这可得到各种分子量与氧亲和力的血红蛋白聚合物(polyHb)。具有多醛官能团的化学试剂可用作交联剂。这些交联剂包括，例如戊二醛、开环棉子糖和葡聚糖。在醛类的情况中，可使醛的羰基与Hb四聚体的氨基反应而启动形成共价交联物。与天然四聚体Hb相比，Hb聚合为更大的分子可增加polyHb的血管内半衰期，防止Hb解离为αβ二聚体。polyHb最终可渗出全身循环(systemic circulation)而遍及肾脏、淋巴系统与网状内皮系统(RES)。

可利用几种其它化学试剂来交联血红蛋白α/β二聚体并防止它们经肾小球渗漏入尿，而仍保持天然血红蛋白的氧转运和递送特性。双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯(DBSF)是用作交联剂来交联血红蛋白的延胡索酸活化二酯(Tye，美国专利号4,529,719，其全文纳入本文作为参考)。双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯通过使水杨基部分与血红蛋白中已知能结合阿司匹林的位点结合来实现此改变，然后通过延胡索酸酯活化官能团与α和β链而实现交联。这将此两个二聚体维持在与赖氨酸残基交联的正确方向。将α或β链与形成血红蛋白的四聚体另一半的相似链交联可防止该四聚体解离并得到稳定的本发明血红蛋白，在没有CO₂存在下体外进行p50检验检测到其具有p50约为20mm Hg-约45mm Hg的携氧容积。也可能在相对的二聚体对中不相似链之间交联。因此，交联血红蛋白通过将修饰的血红蛋白构象锁定为T状态从而解决了氧亲和力，以及肾脏快速渗漏的问题。

存在一氧化碳可降低血红蛋白的氧结合容积，因为两种气体竞争血红蛋白上同一结合位点，与氧相比，一氧化碳优先结合。血红蛋白与CO的结合亲和力比与氧的高200倍，这意味着少量的CO就可降低血红蛋白转运氧的能力。当血红蛋白与CO结合，其形成非常亮的红色化合物，称为羧基血红蛋白。当吸入的空气中CO水平低至0.02％时(即，例如处于吸烟、汽车与炉子的环境中)，可能会发生头痛与恶心；如果CO浓度增加至0.1％，会出现意识不清。在吸烟严重的人中，CO可阻断最多20％的氧活性位点。血红蛋白也具有氧化硫(SO)、二氧化氮(NO₂)、一氧化氮(NO)与硫化氢(H₂S)的竞争性结合亲和力。血红素基团中的铁原子处于Fe²⁺氧化状态以支持氧转运。氧化为Fe³⁺状态将血红蛋白转化为不能结合氧的高铁血红蛋白。二氧化氮与一氧化二氮能将性很多年转化为高铁血红蛋白。

二氧化碳占据血红蛋白上不同的结合位点。血红蛋白能结合质子与二氧化碳，从而导致蛋白质构象改变并促进氧释放。质子沿着蛋白质结合在不同位点，二氧化碳在α氨基处结合从而形成氨基甲酸酯。相反，当血液中的二氧化碳(即，肺部附近的)水平降低时，释放二氧化碳，该蛋白质对氧的亲和力增加。通过二氧化碳的结合与释放来如此控制血红蛋白对氧的亲和力即为已知的波尔(Bohr)效应。

如上所述，质子与血红蛋白结合的变化影响了构象改变，从而促进氧在二氧化碳浓度增加造成pH降低的组织中卸载。这造成血红蛋白的氧亲和力协同曲线向左偏移，从而提高了每克血红蛋白递送氧的效率。提高修饰的血红蛋白的这种偏移可为心脏功能不佳的患者提供有效的治疗性干预，从而能在心脏较少工作的情况下提供更有效的氧合作用。此外，如此修饰以得到优秀的氧卸载能力的血红蛋白可用于治疗具有氧合作用不足相关表现的患者。

II.酰胺基甲基化交联血红蛋白的制备方法

图1描述了本发明一些实施方案的步骤。这些步骤可彼此独立或一个接着另一个执行，这不是对本发明的限制。本发明方法可省略一个或多个步骤。本发明血红蛋白的制备方法可包括：步骤101，其包括通过洗涤从含有红细胞的制品中除去血浆蛋白和内毒素；步骤102，其包括裂解这些红细胞；步骤103，其包括通过从裂解的红细胞中除去基质(包括膜和白细胞)来分离血红蛋白；步骤104，包括除去血红蛋白中的氧；步骤105，包括向血红蛋白溶液中加入能为血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；步骤106，包括分离其半胱氨酸基团上连接有巯基保护基团的血红蛋白；步骤107，包括交联所述血红蛋白；与步骤108，包括在生物学相容的缓冲液中平衡所述血红蛋白并制备无热源、无内毒素、无氧、无基质、半胱氨酸受保护的交联血红蛋白。可根据制备本发明血红蛋白的需要改变这些步骤的次序，这不是对本发明的限制。

1.准备材料与装置

可从活的或新鲜宰杀的供体获得牛来源的全血。血液收集后，通常与至少一种抗凝剂混合以防止血液明显凝结。合适的血液抗凝剂是本领域典型已知的，包括，例如柠檬酸钠、乙二胺四乙酸与肝素。抗凝剂可以固体形式，例如粉末或以水溶液形式与血液混合。应理解血溶液来源可以是新鲜收集的样品或旧的样品。本发明方法利用血库中过期的人血。此外，血溶液之前可维持于冷冻和/或液体状态。在本方法中，优选是血溶液在使用前不冷冻。

可先化验血溶液中抗生素，例如青霉素的水平，再引入抗凝剂。测定抗生素水平可证实血液样品的供体未用抗生素治疗过，从而在一定程度上确保血液样品不含有感染性生物。或者，可采用畜群控制方案来监测与确保处理的牲畜无疾病或不存在抗生素。在抗凝步骤前或其期间可过滤血溶液，例如通过过滤以除去大的凝聚物和颗粒。150μm的过滤器是此操作的合适滤器。

可利用各种试验来证实本发明组合物的无热源性，例如但不限于白介素-6和其它细胞因子诱导(Pool，E.J.等，J.Immunoassay，19：95-111，(1998)；与Poole，S.等，Dev.Biol.Stand.，69：121-123，(1988))；人单核细胞细胞系试验(Eperon，S.等，J.Immunol.Meth.，207：135-145，(1997)；与Taktak，Y.S.等，J.Pharm.Pharmacol.，43：578-582，(1991))；鲎变形细胞裂解物(LAL)试验(Fujiwara，H.等，Yakugaku Zasshi，110：332-40，(1990)；和Martel F.等，Rev Fr Transfus Immunohematol，28：237-250，(1985))与家兔热源试验(Bleeker W.K.等，Prog Clin Biol Res，189：293-303，(1985)；Simon，S.等，Dev.Biol.Stand.，34：75-84，(1977)；与Allison，E.S.等，Clin.Sci.Mol.Med.，45：449-458，(1973))，所有参考文献全文纳入本文作为参考。家兔热源试验一直是优选的热源性试验，直到提高的LAL-试验取代了此原先的技术。应该理解本领域已知除去热源的其它方法，这些方法属于本发明的内容，包括过滤器、吸附剂、亲和力材料等。

血清酯酶，例如酯酶A不使与血红蛋白分子结合的内毒素灭活。因此，当被代谢血红蛋白的肝细胞摄取时，内毒素维持是活性毒素。Friedman，H.I.等报道了大鼠模型中的三联体肝毒性与此理论一致(参见Friedman，H.I.等，Lab Invest，39：167-77，(1978)；和Colpan等，美国专利号5,747,663)报道了从细胞裂解物溶液中减少或除去内毒素的方法。Wainwright等(美国专利号5,627,266)描述了固定在固体支持物上的内毒素结合蛋白和此分子在除去溶液内毒素中的应用。

在本发明的一些实施方案中，可通过防止将内毒素引入本发明的化学方法来确保消除内毒素污染。通常，内毒素是通过利用污染了内毒素的水、非无菌的技术或收集期间细菌接触的简单过程而无意加入。内毒素难以检测，标准LAL结合试验在有血红蛋白存在下不能起作用，因为原始收集物中的内毒素与血红蛋白强烈结合。然而，已证实可采用比浊(turbidometric)和产色(chromogenic)试验进行非常低限度的检测。水和血液收集物最可能引入内毒素的候选物，因为血红蛋白的制备步骤增加会提高毒性水平。利用透析和过滤方法来制备使血红蛋白与可能污染了内毒素的千倍体积的水/缓冲液接触。可用NaOH或NaOCl预处理膜系统以减少或除去内毒素。然后可冲洗与清洁各种装置上的这些材料。

优选清洁所有用于制备本发明血红蛋白的膜和装置使之足以除去或消除可能存在于这些材料与装置上的内毒素。在进行这种清洁前优选用预先鉴定不携带内毒素的血红蛋白稀释溶液预先洗涤可能与本发明血红蛋白接触的表面和装置。这种溶液用于和内毒素结合，从而除去了这种膜或装置上可能残留的内毒素。参见，例如Tye，美国专利号6,894,150。每次使用后弃去用于洗涤的血红蛋白稀释溶液。优选采用逆流透析以进行离子除去或缓冲液平衡从而防止内毒素在随后的产物中积累。

2.步骤101.洗涤RBC以除去血浆蛋白和内毒素.可采用任何合适的方法洗涤血溶液中的RBC，例如通过透滤或利用至少一种溶液(如等渗溶液)不连续稀释与浓缩步骤的组合来将RBC与血清白蛋白(如，免疫球蛋白(IgG))或抗体相分离。应理解可以分批或连续加料的方式洗涤RBC。本领域熟知可接受的等渗溶液，包括例如柠檬酸/盐溶液或PBS，这些溶液的pH和重量克分子渗透浓度不破裂RBC的细胞膜且能替代全血的血浆部分。本发明方法可用的纯化水来源包括蒸馏水、去离子水(DI)、注射用水(WFI)和/或低热源水(LPW)。WFI是优选的，它是去离子的蒸馏水。纯化水的具体方法并不重要，只要内毒素含量低。

本发明所用的水和试剂基本上无内毒素污染。本发明所用的水和试剂优选完全无内毒素污染。降低内毒素污染风险的方法之一是减少与血红蛋白制品接触的水和缓冲试剂的用量。因此，在本发明的一些实施方案中，采用逆流透析以平衡缓冲液和/或除去反应产物来制造血红蛋白制品。适用于本发明的逆流透析方法可得自，例如VariPerm M，bitop，Witten(参见，例如Schwarz，T.等，Electrophoresis，15：1118-1119，(1994))，SpectrumLaboratories，Inc.，Laguna Hills，Calif.等。估计采用真空纤维技术可得到内毒素含量与标准合成技术相比降低100倍的本发明血红蛋白制品。应知道本领域已知除去内毒素的其它方法，这些方法属于本发明的范围。

在用于收集红细胞的方法中，可用等渗溶液洗涤血液样品数次，可在4”直径的碗中以3,000rpm离心来分离血浆。所用的等渗溶液优是盐溶液。细胞优选至少洗涤3次，每次离心之间进行清洗，并以最终体积和等渗溶液体积相同的体积重新悬浮。或者，可采用切流膜过滤来进行RBC浓缩。

利用超声仪不令人满意，因为它将膜变为球形(常称为“细微颗粒(dust)”)。适用于本发明的振荡方法可包括磁性搅拌棒(直径0.25”)与机械摇杆或振荡器。(可利用容积为1-2升的容器)。此示例性方案描述了装置以阐明施加于所收集细胞上的作用力界限以防此时细胞膜发生不需要的破裂。

应知道可采用本领域常规已知的分离RBC与其它血液组分的方法。例如沉降，该分离方法在RBC与其它血液组分，例如白细胞(WBC)和血小板分离前不会破裂大量RBC的细胞膜，例如少于约30％的RBC(的细胞膜破裂)。

白细胞存在于输入的包装RBC中时可导致人受者的发热反应。需要使用白细胞减少过滤器(leucoreduction filter)，它能让RBC通过而显著减少WBC数量。使用比用于单个人包装细胞单元的原型(prototype)大的原型来评估白细胞减少。预冷洗涤的牛红细胞12小时允许在约15分钟内进行白细胞减少过滤。结果见表1。如Coulter 

细胞与颗粒计数仪(Celland Particle Counter)的仪器所定量测定的，通过使红细胞悬浮液通过白细胞减少过滤器而得到3log的WBC减少量。这是有WBC存在下选择性裂解RBC而不裂解WBC的替代方法，随后过滤除去WBC。下文更详尽地讨论了这种选择性裂解。

表1：白细胞减少过滤

样品	原始WBC/mm3	体积调节后最终的WBC/mm3	除去％	Log10除去
					12小时预冷的牛红细胞	6.13×103	28	99.6％	3

3.步骤102.红细胞裂解.可采用能释放血红蛋白而不破坏Hb转运与释放氧的能力的各种裂解方法，例如机械裂解、化学裂解、低渗裂解或其它已知的裂解方法。可采用低渗裂解在去离子水中从红细胞中释放血红蛋白。优选在4-20体积的去离子水中进行裂解。在一个方法中，用NS平衡无血浆的血细胞，然后稀释入4体积的去离子水(DI)。这样通过低渗裂解可破裂无血浆的血细胞。这些细胞因快速摄入水而破裂。红细胞能在约30秒内裂解，而WBC耐受性更强。在RBC裂解而在WBC开始裂解前采用流动法(flow process)收集RBC，加入额外体积的9％盐溶液使盐溶液的总浓度达到0.9％。同步增加盐度可防止WBC破裂。采用过滤从裂解的RBC中除去基质和WBC。然后可采用0.22μm过滤器将血红蛋白作为滤液获得，而保留物浓缩了基质、红细胞膜和未裂解的WBC。图2描述了裂解实验的时程，该实验显示WBC可耐受裂解约5分钟。可在两分钟期间白细胞明显发生裂解前终止红细胞裂解。

也可采用红细胞裂解的其它方法，例如“缓慢低渗裂解”或“冻融”。参见，例如全文纳入本文作为参考的Chan等，J.Cell Physiol.，85：47-57，(1975)。在本发明的一些实施方案中，通过将等渗盐溶液中的红细胞与12体积的无内毒素的去离子水流动混合并轻柔搅拌细胞来使其裂解。应知道本领域已知裂解RBC的其它方法，这些方法属于本发明的范围。

4.步骤103.分离基质与血红蛋白.以纯血红蛋白计，红细胞的含量约为98.5％，其中含有少量其它蛋白质，包括碳酸酐酶。红细胞的膜称为空胞或基质，其含有所有血液型抗原。Rabiner等首先证实溶血红细胞的一些毒性特性与红细胞的膜(基质)及其相关脂质有关(Rabiner等，J.Exp.Med.，126：1127，(1967)，全文纳入本文作为参考)。可通过冷冻破坏这些膜，因此血液保藏需要气候控制的冷藏。此外，许多经输血传播的人类病毒性疾病与红细胞基质有关。因此，鉴于红细胞细胞膜的免疫原性特性，例如炎症、凝集、凝结、免疫介导的补体反应、血小板激活等以及病毒污染的可能性，无基质的血红蛋白(“SFH”)是有益的。

与常规血液治疗剂相比，有效的无基质血红蛋白血液替代品或氧递送疗剂可具有几种优势。使用无基质血红蛋白血液替代品可明显降低不良免疫反应的程度与严重性以及病毒性疾病，例如肝炎与HIV传播的风险。此外，与红细胞的保存能力有限相反，无基质的血红蛋白血液替代品或氧递送治疗剂可长期保存，较少需要严格环境控制的保存装置。

可利用0.65μm过滤器超滤溶血产物来除去基质，该过滤器保留细胞组分而使血红蛋白流过。或者，随后可利用0.22μm过滤器或300,000道尔顿分子量过滤器经过滤除去细胞碎片。适用于本发明的超滤膜可购自，例如Millipore Corporation。可采用从裂解的RBC相分离Hb的其它方法，包括沉降、沉淀(Ty，美国专利号4,529,719)、离心或微孔过滤。应知道本领域已知除去基质的其它方法，这些方法属于本发明的范围。

碳酸酐酶.一旦红细胞膜裂解，采用在本方法中几处用到的透滤除去碳酸酐酶。例如，可在交联前、期间与之后进行透滤与缓冲液交换。可采用ELISA定量测定碳酸酐酶的存在。

显微镜分析10ml离心样品未发现任何细胞碎片。

磷脂水平降低.本发明稳定的NO-阻断四聚体血红蛋白的另一关键要素是存在的磷脂水平低。磷脂得自血红蛋白来源的红细胞的表面脂质层。以上处理步骤除去了这些有害的脂质，因此消除了与其存在相关的问题。可采用本领域技术人员已知的HPLC和/或ELISA进行磷脂检验。发现磷脂酰胆碱低于检测界限。

将血红蛋白浓缩为14％的溶液.这种处理后，利用不使血红蛋白通过的膜浓缩无基质的溶血产物。优选利用具有10,000MW截断值的过滤器浓缩无基质的溶血产物。优选将无基质的溶血产物浓缩为1％-25％(g/l)溶液。更优选将无基质的溶血产物浓缩至约5％-约20％。最优选将无基质的溶血产物浓缩至约6％-约10％。可用缓冲液平衡浓缩的溶液并调节pH。优选将pH调节至pH 7.40。然而，约6.5-约8.5的pH也可用于本发明。

然后任选将浓缩的Hb溶液施加入一个或多个并联的层析柱以通过高效液相层析进一步分离血红蛋白与其它污染物，例如抗体、内毒素、磷脂和酶与病毒。合适的介质的例子包括阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质与亲和介质。层析柱可含有适合于分离Hb与非血红蛋白蛋白质的阴离子交换介质。合适的阴离子交换介质包括，例如二氧化硅、氧化铝、钛凝胶、交联的葡聚糖、琼脂糖或用阳离子化学官能团如二乙基氨基乙基或季氨基乙基衍生的衍生部分，如聚丙烯酰胺、聚羟乙基-甲基丙烯酸酯或苯乙烯二乙烯基苯。与可能存在于裂解RBC相中的其它蛋白质与污染物相比，本领域技术人员不难合理地确定用于选择性吸附和解吸Hb的合适阴离子交换介质与相应的洗脱剂。

除去磷酸根离子.Bucci等(美国专利号5,290,919)报道可能需要除去人溶血产物中的有机磷酸酯，例如2，3-二磷酸甘油酸酯，因为在血红蛋白中交联反应的位点与2，3-二磷酸甘油酸酯所占据的位点相同。在本发明的一些实施方案中，无基质的人Hb溶液基本上不含无机磷酸盐。因此，在本发明的一些实施方案中，无基质的人Hb(交联前)在过滤后应处理以用氯交换磷酸盐。为此目的，可使无基质的人Hb在有或没有氧存在下通过预先制备并用氯平衡的离子交换柱。可采用总无机磷酸盐分析检测此步骤的作用。合适的离子树脂可购得，它们属于本发明的范围。离子树脂除去了在与DBSF反应期间可与阿司匹林竞争结合位点的磷酸盐。然后可将该溶液浓缩至所需范围。利用牛Hb时无需此项操作。

5.步骤104.除去氧.可在足以除去制品中存在的氧的条件下处理巯基阻断的无基质Hb，或更具体地说，CMSFH。在一方面，本发明涉及除去CMSFH制品中氧的改进方法。这种脱氧作用可在本文所述任何步骤之前或之后实施，这不是对本发明范围的限制。例如，可在除去基质的步骤、除去内毒素的步骤、巯基保护的步骤、除去磷酸盐的步骤、裂解RBC的步骤或交联血红蛋白的步骤之前或之后进行脱氧步骤。在一个实施方案中，可在保护本发明血红蛋白的半胱氨酸部分中的巯基之前实施这种脱氧作用。在本发明的另一实施方案中，可在交联血红蛋白之前实施这种脱氧作用。在本发明的一些实施方案中，可能需要更多时间来完成本方法的这些步骤。在这种情况下，优选脱氧条件。

可采用气相色谱、锆检测器(例如，“MOCON”分析仪(Mocon，明尼阿波利斯，明尼苏达))，通过检测pO₂或光谱漂移(它是脱氧血红蛋白形成的特征)来测定脱氧作用的程度。

可通过抽真空，或真空离心除去血红蛋白中的氧。所用的CMSFH可以是从基质除去中得到的超滤液(稀释液)或为将血红蛋白浓缩至约10％(w/v)而进行第二阶段超滤中得到的保留物。通过施加足够等于溶液所处温度时水分压的真空度不难使所得的每种CMSFH溶液脱氧，虽然可以足够产生大于溶液表面张力的作用力的速度离心溶液。这些离心通常是低速的并可用制备型离心机，或者是各种连续流的方法。需要考虑CMSFH容器的几何构造以确保有足够的气体交换表面积，以及可维持温度并使溶液不结冰。

可采用接触器膜技术(Contactor membrane technology)除去Hb溶液中的O₂。在利用氧气替代氮气时也可将接触器膜技术用于氧合作用。为实现高通量可串联连接3或4片这种膜并用于脱氧或氧合血红蛋白溶液的商品化产品。Hb浓度影响溶解的O₂除去的速率。随着Hb浓度降低，O₂除去速率增加。该实验不能将O₂浓度降至＜100ppb。然而，该测试可在无氧手套盒(anaerobic glove box)中进行以使系统为气密性。手套盒可将环境维持在极低的O₂水平(＜5ppb)。此手套盒环境可提供O₂的屏障以确保Hb不再重新吸收O₂。可采用大于28.5”的Hg真空度(＜50mm Hg)来优化O₂除去。

最好将以上述方式制备的脱氧、无内毒素、无基质、羧酰胺甲基化Hb(dCMSFH)维持于惰性环境中，制品的pH宜调节至6.0-9.5的范围，最优选约为pH8.3-8.4。可用1.0N乙酸或1.0N NaOH调节溶液的pH。当为其它目的需要稀释、悬浮或加入水(包括缓冲液等)时，这种水应是脱氧的且无内毒素的。随后所有步骤可在以任何所需方法维持无氧的条件下进行。如上所述，优选的方法包括利用氮正压环境手套盒，然而可等效地利用其它惰性气体(例如，氩)以代替氮。

6.步骤105.保护血红蛋白中半胱氨酸的巯基.可在交联步骤之前或之后利用巯基保护基团进行保护血红蛋白的半胱氨酸的步骤。在本发明的一个实施方案中，先进行保护半胱氨酸部分中巯基的步骤，再交联。在本发明的另一实施方案中，先进行血红蛋白脱氧的步骤，再保护半胱氨酸部分中的巯基。在本发明的一些实施方案中，在保护血红蛋白中的巯基之前不脱氧。本发明包括本领域已知用于保护功能基团，例如但不限于羟基、巯基或羧基的所有试剂。

所述试剂的一些例子包括但不限于：4-吡啶基甲基氯、烷氧基烷基氯、二甲氧基甲烷、N-(羟甲基)乙酰胺、三苯基甲基氯、乙酰基氯、2-氯乙酸、乙酸酐、卤代乙酰胺(如碘乙酰胺、溴乙酰胺、氯乙酰胺或氟乙酰胺)、卤代乙酸酯(如碘乙酸酯、溴乙酸酯、氯乙酸酯或氟乙酸酯)、苄基氯、苯甲酰氯、二碳酸二叔丁酯、对-羟基苯甲酰甲基溴、对-乙酰氧基苄基氯、对-甲氧基苄基氯、2，4-二硝基苯基氟、四氢吡喃、乙酰氨基羟基甲烷、丙酮、双-碳乙氧基乙烯、2，2，2-三氯乙氧基羰基氯、叔丁氧基羰基氯、异氰酸烷酯与烷氧基烷基异氰酸酯。在本发明巯基受保护的血红蛋白的具体例子中，所述试剂是碘乙酰胺。应理解本领域已知的任何试剂可用于酰胺基甲基化。

优化碘乙酰胺(IAM)的反应：因为副产物之一是碘离子，因此利用碘化物特异性电极监测碘乙酰胺反应。每当量巯基可使用两摩尔以上的碘乙酰胺。表2显示了碘乙酰胺反应中牛Hb与IAM反应所用IAM试剂摩尔数的时程的网格。这些结果显示了每摩尔Hb的游离巯基含量并以相对于牛Hb的摩尔当量单位给出。

表2.牛Hb与IAM反应.结果以剩余的游离巯基的当量给出

时间		0	15	30	45	60	75	90	120
											IAM摩尔数
	2	22	11.0	00.5	00.5
											4					0.5	0.2	0.1	＜0.1

7.步骤106.分离巯基保护的血红蛋白与反应物.通过观察到的碘化物出现速率确定反应完成后，利用Ringer乙酸盐平衡与透滤除去过量的IAM。

8.步骤107.与DBSF交联和与PLP反应.通过分子内交联以防四聚体解离成α，β二聚体从而防止了无基质的Hb解离为α，β二聚体，因此其循环半衰期增加。这样可将Hb局限于T状态，结果可改进氧亲和力，因此改进了Hb的氧转运特性。

合适的交联剂的例子包括能交联Hb蛋白的多功能试剂，例如戊二醛，琥珀醛，聚氧乙烯和葡聚糖的活性形式，α-羟基醛(如乙醇醛)，N-马来酰亚胺基-6-氨基己酰基-(2′-硝基，4′-磺酸)-苯基酯，间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-碳酸酯，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯，N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯，琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯，磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯，盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，N，N′-亚苯基双马来酰亚胺以及属于双-酰亚胺酯(bis-imidate)类、酰基二叠氮化物(diazide)类或芳基二卤化物类的化合物等。糖类可用作交联剂。糖类的例子包括但不限于：单糖(半乳糖、葡萄糖、甲基吡喃葡糖苷和甘露醇)、二糖(乳糖、麦芽糖、纤维素二糖、蔗糖与海藻糖)、三糖(棉子糖)与多糖(分子量为15,000-71,000Da的葡聚糖)。

血红蛋白交联可在无氧存在下进行。可除去与血红蛋白分子紧密结合并干扰交联反应的无机磷酸盐以增加产出。与血红蛋白分子紧密结合并在血红蛋白代谢时变为肝毒素的内毒素不能与血红蛋白接触。

交联剂的适当用量可以是能发生分子内交联以稳定Hb，也能发生分子间交联以形成Hb聚合物，从而增加血管内保留时间的用量。可采用各种方案来交联Hb使之具有所需分子量分布与氧结合特性，这些方案不限制本发明的范围。交联剂与猝灭剂的类型和浓度，交联/聚合反应的持续时间与还原剂的使用在这些反应中均是可变的，以工程改造交联Hb分散体的分子量分布、氧结合特性与metHb水平。

采用pH控制与过量的交联剂优化交联：表3显示了在2小时期间增加pH与交联剂(DBSF)摩尔比的网格。结果显示了不同pH时未反应的α链百分比与2小时结束时的DBSF当量。利用与NaOH反应来滴定所产生的酸使pH维持恒定。2小时后，产酸早已停止。采用凝胶电泳分离，找寻残留的未交联α链来测定交联的结果。在制备本发明稳定的NO阻断四聚体血红蛋白的标准方法中，使用2当量DBSF可获得超过98％的交联率。

表3：pH与DBSF摩尔比值.剩余未交联血红蛋白的百分比

	pH	7	7.5	8	8.2	8.4
							DBSF当量
1						21％
							1.2						19％
1.5						3％
							2.0		38％	11％	2.5％	1.7％	1.5％
2.5						1.7％

在本发明的一些实施方案中，dCMSFH与双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯(DBSF)交联(Tye，美国专利号4,529,719，全文纳入本文作为参考)。可按照DBSF交联剂∶dCMSFH的摩尔比大于1∶1将DBSF交联剂加入dCMSFH制品中，同时搅拌。DBSF交联剂∶dCMSFH的摩尔比优选2∶1。在加入前，将dCMSFH制品的pH调节为8.4，并在反应期间维持于8.4。通过加入酸或碱小心地维持反应混合物的pH，因为溶液未缓冲。使反应进行完。

采用SDS凝胶电泳测定交联程度：SDS可使蛋白质变性以形成在中性pH时为羧基的负电荷所覆盖的长杆状物。然后可采用电泳通过体积排阻分离蛋白质，因为SDS负电荷大大过量减小了天然蛋白质的电荷不均匀性。Beckman Coulter PA-

利用所结合的肽在216nm的吸光度快速记录凝胶电泳结果。如图3所示，可利用标准蛋白质混合物来校验该情况中10KDa与100KDa之间感兴趣分子量范围的列。

天然血红蛋白进行SDS凝胶电泳可得到两个峰，基线分离几乎在它们之间。第一峰显示是血红蛋白的α链，第二峰显示是β链。它们的含量几乎相同，因为分子中各链的数量相同。该情况见图4A所示，该图是图4B所示重叠的电泳图谱的放大区域。天然血红蛋白以虚线表示(保留时间13.98和14.14)，本发明的交联血红蛋白(dXCMSFH)以实线表示，体积标准品以点线表示。为方便观察，将图4A所示重叠的电泳图谱略作偏移。所示扩大区域集中于约20KDa的体积标准品处，这是天然血红蛋白的两条α链和β链的感兴趣区域。该图所示的交联物质实验取自交联过程的中点，此时大多数α链早已交联，而显著含量的β链还未反应。

图4B显示了全宽度电泳图谱的重叠情况，天然血红蛋白再次以虚线表示，交联实验物质再次以实线表示，体积标准品再次以点线表示。两条α链的延胡索酰基交联得到一对结合的肽，因此其洗脱时间显示晚于未反应的β链。在图4B中保留时间为16-17分钟处可见约36,000-45,000KDa分子量较高的一系列3个新的主要产物峰。这些产物峰不能定量测定，因为体积标准品均是单链肽，不能扩展用于定量测定此反应的二聚化产物。然而，可发现形成了三个分子量较高的产物。

除了形成α-α交联以外，也形成了β-β交联。存在少量的90,000KDa的物质，表明形成少量分子间交联。

人Hb与PLP反应.吡哆醛-5-磷酸(PLP)能修饰许多血红蛋白。虽然人血红蛋白的dXCMSFH的特性因与吡哆醛-5-磷酸反应而获益，牛血红蛋白的dXCMSFH无需此步骤。PLP通过在倒数第二个β链组氨酸残基处引入负电荷与除去同一链氨基末端处的正电荷来修饰人血红蛋白。这些电荷变化稳定了类似于血红蛋白-DPG(二磷酸甘油酸酯)复合物的新分子构象。具有此新构象的血红蛋白明显具有类似于红细胞中天然血红蛋白的氧亲和力。产物中每个四聚体可具有一个或两个PLP分子。在以前的PLP-血红蛋白制品中，血管内保留时间太短以致于这种制品不可接受为再生液体(resuscitation fluid)。此外，发现它们可导致渗透性利尿。

因此，利用人Hb的交联反应完成后，将吡哆醛-5-磷酸(PL)加到脱氧、无内毒素、无基质、羧酰胺甲基化的交联人Hb(dXCMSFH)制品中。采用Benesch等(Benesch等，Biochemistry，11：3576，(1972)及其参考文献；Benesch等，Proc.Natl.Acad Sci.，70(9)：2595-9，(1974)；Benesch等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，63(4)：1123-9，(1975)；Benesch等，Methods Enzymol.，76：147-59，(1981)；Benesch等，J.Biol.Chem.，257(3)：13204，(1982)；Schnackerz等，J.Biol.Chem.，258(2)：872-5，(1983)，所有这些参考文献全文纳入本文作为参考)所述的方法，使PLP与dXCMSFH反应，然后用硼氢化钠还原形成dXCMSFH-吡哆醛-5′-磷酸(dXCMSFH-PLP)，该方法的不同之处是所有试剂无内毒素和氧并且在无氧存在下反应。当利用牛Hb时无需此处理。

测定残留的未交联血红蛋白.可采用高效液相(HPLC)、体积排阻层析(SEC)来测定交联Hb的总百分比、交联四聚体的百分比或交联的高阶种类Hb/polyHb分散体的百分比。盐，例如MgCl₂可用于将任何未交联四聚体Hb解离为α-β二聚体，而交联的四聚体Hb保持完整。因此，未交联的Hb可以单独的峰洗脱，与分子内交联的Hb相分离。

可在不使血红蛋白二级结构变性的条件下，利用0.5M MgCl₂溶液作为缓冲液，在反应混合物的Biorad Bio-Sil^R SEC-12.5-5柱上采用体积排阻HPLC检测未反应物质的含量，因为在这些条件下平衡有利于分子量为32KDa的αβ二聚体，估计其保留时间大于此实验中所见的任何峰。如图5所见，HPLC曲线显示主峰为64KDa，最小峰为128KDa。在较晚的洗脱时间没有物质，因此没有分子量较低的物质。此实验证实完全不存在未反应的血红蛋白，也说明大多数物质是分子量为64KDa的稳定Hb四聚体。

9.步骤108.通过平衡制备血红蛋白溶液.可用Ringer乳酸盐或Ringer乙酸盐溶液平衡脱氧的稳定的NO阻断四聚体Hb，特别是dXCMSFH，该处理在透滤条件下能除去过量的DBSF和反应的副产物，例如二溴水杨酸。优选采用逆流透析进行任何离子除去或缓冲液平衡，从而防止内毒素在随后产物中积累。平衡后，可将溶液无菌过滤入合适的输液容器。适用于本发明的输液容器可包括但不限于无菌IV袋。优选的输液容器可防止气体交换(即，氧不能透过)，dXCMSFH可在没有氧存在下保存。预计能防止血红素氧化而形成高铁血红蛋白。

测定修饰的血红蛋白的氧亲和力.血红蛋白能在生理条件下按照系统中氧分压的函数结合与释放氧。可利用TCS Corporation制造的Hemox-Analyzer或Dolman等(Anal.Biochem.，87：127，(1978)；该文献全文纳入本文作为参考)所述的鳃细胞(gill cell)测定本发明血红蛋白衍生物的氧亲和力。

Hemox-Analyzer(TCS Corporation制造)可测定血红蛋白氧解离曲线。获得血红蛋白氧解离曲线的其它方法可能不可再现、不精确且不易实施。血红蛋白氧解离曲线可随pH、温度、CO₂浓度、血红蛋白的种类、人血红蛋白变体、溶血的血红蛋白等而不同。曲线的形状以及曲线沿X轴的偏移可描述血红蛋白负载与卸载氧的能力。该信息可用于研究血液与修饰的血红蛋白，因为它是体内功能的体外测试。它可检测血红蛋白负载和卸载氧的能力。通过导致血红蛋白氧半饱和的O₂的p50(以mm Hg计的氧分压)可快速描述整个血红蛋白解离曲线。

化学修饰血红蛋白或血红蛋白的遗传变体可导致p50降低，即在任何给定的氧压力与氧结合更紧密。在体内这意味着较少的氧输入组织。

Hemox-Analyzer依赖于动脉(氧合的，红色)与静脉(较低氧合的，蓝色)血液颜色的变化与氧电极。在专门的发光光度小室中制备少量稀释样品，该小室在底部具有可使纯化气体经搅拌的溶液缓慢鼓泡的小孔并装配了氧电极。整个小室的温度精确控制在37℃以平衡体温。分析分光光度计和氧电极的输出值并作图。在图谱开始时，将纯氧经样品鼓泡直至氧饱和度大于氧在空气中所占部分(21％)以使样品完全氧合，然后气体鼓泡器换为氮，开始除去氧。如此获得氧平衡曲线。

RBC中人血红蛋白的p50约为28。当RBC与在红细胞中形成盐桥以降低氧亲和力的2，3DPG分离时，p50降至约14。取决于pH与CO₂的浓度，牛血红蛋白的p50无论在红细胞中或在游离溶液中都是约25-约40。图6显示了牛全血、无基质的Hb、本发明的交联dXCMSFH与新鲜人血的氧亲和力曲线。在交联的血红蛋白中，交联作用将血红蛋白锁定在紧张状态，因此丧失了S形曲线。与牛全血、无基质的Hb和新鲜人血相比，当在较低p O₂将O₂递送至组织时，交联的血红蛋白递送更多氧。交联血红蛋白的p50高于人血红蛋白与牛血红蛋白的。牛全血的p50值是24.73mm Hg，无基质的Hb是21.20mm Hg，新鲜人血是32.43mm Hg(明显高于人RBC的)。因此，本发明稳定的NO-阻断四聚体Hb，特别是XCMSFH可证明每克血红蛋白递送氧的效率较高。虽然本文检测的这些数值与文献值不相同(即，人血p50文献值是27mm Hg，而本文的值是23.72mm Hg)，但本文的值是氧卸载性能的良好相对检测值。

本发明的脱氧、无内毒素、无基质、羧酰胺甲基化的交联Hb(dXCMSFH)是稳定的牛血红蛋白四聚体，其锁定在紧张或T状态，具有类似于正常人红细胞内的血红蛋白的p50(如图6所示)或更高。因此，相等量的人红细胞血红蛋白与dXCMSFH的血红蛋白能从肺中携带相同量的氧离开。然而，根据图6所示数据，dXCMSFH在回静脉前可递送稍多的氧。

III.分析

1.本发明稳定的NO-阻断四聚体血红蛋白的物理特征

本发明稳定的NO-阻断四聚体血红蛋白的分子量分布约为65kDa，在10-22℃时pH为6.0-7.9，p50为20-45mm Hg，重量克分子渗透浓度为290-310mOsm/Kg。本发明修饰的血红蛋白具有6.0-20g/dL的总血红蛋白，高铁血红蛋白水平低于或等于5％，氧合血红蛋白水平低于10％。本发明修饰的血红蛋白的内毒素水平低于或等于0.02EU/ml，磷脂酰胆碱水平低于检测下限，符合无菌检验并且外来有机物水平低。本发明修饰的血红蛋白的钠离子水平为125-160mmol/l，钾离子水平为3.5-5.5mmol/l，氯离子水平为105-120mmol/l，钙离子水平为0.5-1.5mmol/l。本发明修饰的血红蛋白的N-乙酰基半胱氨酸水平低于或等于0.22％。

2.分析方法

理化分析

可在制备过程中的任何步骤分析本文所述脱氧稳定的NO阻断四聚体Hb，特别是dXCMSFH。例如(但不限于)可在除去基质后、除去内毒素后、裂解后、除去氧后、保护半胱氨酸部分的巯基后或者交联后等分析血红蛋白。可分析血红蛋白的纯度、吸光度、结构、p50、一氧化氮结合能力、白细胞(WBC)计数、血红蛋白溶液中的微生物生长、交联、氨基酸分析、蛋白质分析或者冷冻或保存的影响。本领域已知各种分析技术，这些技术属于本发明的范围。本文提供了分析技术的一些实例，但这些技术不限制本发明的范围。

A.质谱(MS).有许多类型的质谱仪和样品引入技术以进行广泛分析，本文包括所有这些仪器和技术。在一些本发明优选的实施方案中，所用的技术是质谱。质谱仪可由3个不同部分构成：电离器、离子分析仪和检测器。电离方法包括但不限于：电子撞击(EI)、化学电离(CI)、电喷雾(ESI)、快速原子轰击(FAB)与基质辅助的激光解吸(MALDI)。分析仪包括但不限于：四极透镜(quadrupole)、扇形场(磁性和/或静电)、飞行时间(TOF)与离子回旋共振(ICR)。其它相关技术是，例如离子迁移率光谱/质谱(IMS/MS)、串联质谱(MS/MS)、Orbitrap质谱、FTICR质谱、单阶或双阶反射器(reflectron)(RETOF-MS，用TOF-MS梯测序)、用RETOF-MS MALDI源后分解(Post-source decay)、用线性TOF-MS源内分解(In-source decay)与表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)。质谱仪可与LC或GC耦联。

B.UV-可见光.在本发明的一些实施方案中，可利用光学吸光度光谱(UV/VIS)来测定血红蛋白的吸光度范围。UV/VIS在测定大分子浓度，例如蛋白质中起作用。可利用有机染料(例如，考马斯蓝试剂)来提高吸光度并将其转移入可见光范围。理解控制蛋白质彼此相互作用的作用力有助于理解例如大分子装配、陪伴分子协助的蛋白质折叠与蛋白质易位的过程。可采用共振拉曼光谱(RRS)来研究分子结构与动力学。共振拉曼散射需要在电子吸收带(electronic absorption band)内激发，导致散射极大增加。通过使用不同的激发波长，此方法有助于研究大分子的特定部分。

C.液相层析法(LC).液相层析法是从复杂混合物中分离蛋白质、肽和其它分子的工具。在本发明的一些实施方案中，采用LC分离、纯化和分析血红蛋白与用于本发明制剂的赋形剂。LC的实例包括亲和层析、凝胶过滤层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、二级管阵列-LC和高效液相(HPLC)与亲和力和体积排阻层析HPSEC。

凝胶过滤层析与HPSEC层析根据大小分离蛋白质和肽。可采用凝胶过滤层析来分析分子大小、分离混合物中的组分或进行大分子制品的脱盐或缓冲液交换。

亲和层析是生物选择性吸附，然后从固定的配体上回收化合物的过程。

离子交换层析根据蛋白质的总电荷差异分离分子。该方法通常用于蛋白质纯化，但也可用于纯化肽或其它荷电分子。可通过增加离子强度来打断离子相互作用或通过改变蛋白质的pH以实现洗脱。

可采用HPLC来分离、纯化和检测本发明的血红蛋白。可采用反相层析(RPC)测定蛋白质结构。此方法的正常流程是1)通过蛋白水解或化学切割使蛋白质片段化；2)纯化；和3)测序。肽进行RPC的常规流动相可以是，例如水配制的0.1％三氟乙酸(TFA)梯度变化为合适的有机溶剂，例如乙腈配制的0.1％TFA，该流动相能增加蛋白质/肽的溶解性，能在约230-240nm处检测、易于从蛋白质/肽中除去(即通过蒸发)。

可采用体积排阻测序(SEC)和离子交换层析(IEC)测定本发明血红蛋白的结构。采用层析方法后可实现活性的完全再生，SEC柱可实现10-1000千道尔顿的分级分离。优选采用梯度洗脱IEC柱，因为与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的分辨率相当，并且与SEC相比增加了加样容积。在液相亲和层析(LAC)中，相互作用是基于模拟底物、受体等的蛋白质结合。可通过引入竞争性结合物质或改变有助于解离的蛋白质构象来洗脱蛋白质。HPLC可与MS耦联。

D.电泳.可采用电泳分析本发明的血红蛋白。电泳可以是凝胶电泳或毛细管电泳。

凝胶电泳：凝胶电泳技术可用于分离蛋白质。大分子的分离取决于两种影响因素：电荷与质量。在电泳期间，当施加电流时迫使大分子移动过孔。它们通过电场的迁移速率取决于电场、分子的大小和形状、样品的相对疏水性、以及分子在其中移动的缓冲液的离子强度和温度。采用此项技术能分离和鉴定差别小至一个氨基酸的蛋白质分子。凝胶电泳也能测定蛋白质的关键特性，例如等电点与大致的分子量。电聚焦或等电聚焦技术能根据电荷差异分离不同的分子，这得益于分子的电荷能随其环境pH的改变而改变。

毛细管电泳：毛细管电泳是广泛的分离技术的总称，其涉及对注入毛细管的缓冲液施加高电压以实现分离。差别包括根据分析物的大小和电荷差异分离(称为毛细管区带电泳(CZE)或游离溶液CE(FSCE))，利用表面活性剂胶束分离中性化合物(胶束动电毛细管层析(MECC)，或称为MEKC)，通过凝胶网络筛分溶质(毛细管凝胶电泳，GCE)，根据电泳迁移率分离阳离子(或阴离子)(毛细管等速电泳，CITP)，以及在pH梯度内分离两性离子溶质(毛细管等电聚焦，CIEF)。毛细管电层析(CEC)是涉及在注有硅胶固定相的毛细管上施加电压的相关电动分离技术。CEC的分离选择性组合了电泳与层析方法。许多CE分离技术依赖于毛细管内存在溶液的电诱导流动(电渗流，EOF)从而将溶质泵向检测器。GCE和CIEF对分离生物分子(例如蛋白质)是重要的。

E.核磁共振(NMR).NMR可用于分析本发明的血红蛋白。NMR光谱法能以原子分辨率测定血红蛋白的结构。此外，能采用NMR研究时间依赖性现象，例如大分子的分子内动力学、反应动力学、分子识别或蛋白质折叠。可采用均匀或选择性同位素标记将诸如¹⁵N、¹³C和²H的异核(Heteronuclei)引入蛋白质。这些样品的光谱可以极端简化。此外，采用这些方法可测定与大分子结构和动力学有关的新信息。

F.X-射线晶体学.可采用X-射线晶体学来分析本发明的血红蛋白。X-射线晶体学技术记录X-射线经晶体中原子的相邻隔开的晶格衍射所产生的模式，然后分析这些模式来揭示该晶格的性质。此项技术可了解该物质及其分子结构。采用Bragg规则可测定晶格的间距。与到来的X-射线光子实质相互作用的实体是围绕原子的电子，而非原子核本身。可采用此项技术测定本发明血红蛋白的结构。通常利用某物质的单晶体进行X-射线衍射，但如果没有单晶体可用，也可用微晶粉末化样品，这样可能需要不同仪器。

G.阵列.可利用阵列分析本发明的血红蛋白。阵列包括进行针对已知蛋白质靶标的多样品平行分析。开发的各种微阵列平台能加速测定蛋白质在细胞或组织中的丰度、定位与相互作用。微阵列提供的平台能鉴定针对一组特征鉴定的蛋白质、抗体或肽的蛋白质相互作用或功能。蛋白质芯片将蛋白质安排在小表面上，并能采用荧光成像直接检测组织中的蛋白质水平。蛋白质可以排列在平坦的固相上或毛细系统(微流体阵列)中，几种不同的蛋白质可应用于这些阵列。然后可采用非特异性蛋白质染色来检测所结合的蛋白质。

H.氨基酸分析.在一些实施方案中，可采用氨基酸分析(AAA)技术分析本发明的血红蛋白。AAA是测定蛋白质中各氨基酸数量的方法。氨基酸分析有四步：水解、衍生、分离衍生的氨基酸与数据解析和计算。

在水解步骤中，可向样品中加入含量已知的内部标准品(正亮氨酸)。然后可将至少含有5nmol各氨基酸的样品(即，10μg蛋白质)转移至水解试管，真空下干燥。将试管置于含有HCl与少量苯酚的小瓶中，在真空下通过HCl蒸气水解蛋白质。水解在约110℃进行约24小时。水解后，干燥样品。

可利用氨基酸分析仪在碱性条件下通过使游离氨基酸与例如异硫氰酸苯酯(PITC)反应产生苯基硫代氨甲酰基(PTC)氨基酸衍生物来自动衍生。也可将含有已知含量的(500pmol)17种常规游离氨基酸的标准溶液加样于不同的氨基酸分析仪样品点上并衍生。可采用此方法产生用来测定样品的氨基酸含量的校验文件。衍生后，可将含有PTC-氨基酸的甲醇溶液转移至窄孔(narrow bore)HPLC系统，利用反相C18二氧化硅柱分离。用于分离的缓冲液系统可以是，例如50mM乙酸钠，pH 5.45作为缓冲液A；70％乙腈/32mM磷酸钠，pH 6.1作为缓冲液B。可采用缓冲液A和缓冲液B的梯度来运行该程序。利用可与氨基酸分析仪系统相连的数据分析系统鉴定并定量测定层析峰面积。

或者，可采用Moore和Stein的利用茚三酮的经典氨基酸分析方法。

临床化学分析方法

A.氧转运.利用CO-血氧计综合分析血红蛋白以获得饱和、去饱和与高铁血红蛋白水平。利用紫外辐射检验氧转运，包括脱氧血红蛋白(HHb)水平、氧合血红蛋白(O₂Hb)水平、高铁血红蛋白(MetHb)水平、羧基血红蛋白(COHb)水平、总血红蛋白(tHb)水平、本发明血红蛋白的氧饱和度(SO₂％)、氧含量(O₂Ct)与氧容积(O₂Cap)。Nova Biomedical Instrumentation制造的一种仪器适用。

B.电解质.利用标准电解质/化学分析仪检测电解质，例如氯化钾、氯化钙、氯化钠等。Nova Biomedical、Hitachi、Roche等提供了合适的仪器。

C.重量克分子渗透浓度.也检测了本发明血红蛋白的重量克分子渗透浓度。利用凝固点降低法进行此项分析，以得到本发明的生物相容的体积膨胀和氧递送试剂。合适的仪器得自Advanced Instruments Inc.，其可检测0.0-4000mOsmol/kgH₂O范围内的所有具有渗透活性的溶质。

D.碳酸酐酶.可通过双夹心ELISA检测碳酸酐酶，其中用能结合样品中的CA的家兔抗-牛CA包被聚苯乙烯支持物。通过反应产物的可见光吸光度定量测定酶底物反应。

E.磷脂水平降低.可采用HPLC和/或ELISA进行磷脂试验。根据II类定量测定试验的当前USP指南设计ELISA确认方案来测定磷脂酰胆碱的存在。该方案包括确认线性/范围、准确度和精确度。

F.内毒素试验.用于输液的终产物必须无内毒素。内毒素实际上是细菌细胞壁的物质，它在低剂量就引起受者发热；而更高的水平可引发更严重的症状组合。LAL(鲎变形细胞裂解物)动力学-比浊试验因其结果可再现并且灵敏度高而优于其它试验，例如产色与凝胶-凝结。

通过与USPC制造的参比标准内毒素(RSE)、EC5、Lot F作比较，测定常规测试所用的对照标准内毒素(CSE)的效力。当在常规测试中要用内毒素而非参比内毒素来产生尖峰(spike)和曲线时，需要作此比较。这是因为不同批次的CSE具有明显不同的效力。通过比较1小瓶RSE与4小瓶同一批次的CSE并计算平均效力来比较RSE/CSE。进行一式三份的标准曲线试验，相关系数为-0.98或更小是合格所需的。作多条CSE标准曲线，将一条标准曲线存档用于进一步测试。对要用LAL试验测试的所有产物进行抑制/增强研究。采用Associates of Cape Cod，Falmouth Technology Park，East FalmouthMA 02536-4445的方案，利用Associates of Cape Cod制造的Pyros 

培育试管读数计进行LAL试验。

i.准备试剂和仪器

按照具体生产商的使用说明使用动力学-比浊试验所用的所有试剂，除了以下两种例外：1)用5ml Pyrosol^TM重建缓冲液而不是LAL试剂水(Reagent Water)重建LAL，与2)CSE不用正好5ml LAL试剂水重建。用缓冲液重建LAL以克服LAL试验通过纯血红蛋白溶液的极端增强。CSE用一定用量的水重建得到浓度为1000EU/ml的最终溶液。根据USPC RSE来标准化CSE以测定待加入的用量，该用量可以比Associates of Cape Cod所推荐的5ml多或少。这可得到恒定的CSE溶液浓度，防止每当CSE批次改变时再次计算内毒素尖峰(spike)。如指导所示使用所有其它试剂。

将所有玻璃器皿加热至180℃，持续4小时以除去热源。所有的稀释液与溶液转移在100型层流通风橱中进行。所有移液洗头是无菌、无热源的。

ii.测定CSE效力

用5ml LAL试剂水重建1小瓶RSE(规定为10,000EU/瓶)得到2,000EU/ml的溶液。作两条RSE曲线以覆盖目前Q.C.测试的所有范围。中范围曲线包含以下浓度(EU/ml)：1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125。低范围曲线由以下浓度(EU/ml)构成：0.004、0.002、0.001、0.0005、0.00025和0.0001。一式两份制作这些曲线，进行线性回归以测定这些曲线的斜率和Y-截距，将这些曲线存档以和CSE曲线作比较。

RSE曲线制作后，用一定用量的水重建4小瓶CSE(500ng/瓶)得到浓度为1000EU/每小瓶的最终溶液。制备每小瓶在两个范围中各自的稀释液，从而使CSE曲线的至少3种浓度直接位于RSE曲线上。中范围曲线包含以下浓度(ng/ml)：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625和0.003125。低范围曲线由以下浓度(ng/ml)构成：0.004、0.002、0.001、0.0005、0.00025和0.0001。一式两份制作这些曲线，间插开始时间以替换相应的RSE曲线。

将各CSE标准品以EU/ml计的内毒素浓度除以ng/ml计的相应浓度。在计算时不包括以星号在原始数据上标出的未直接处于RSE曲线上的任何开始时间。计算得到的各标准品EU/ng效力的平均值来测定各范围的CSE效力。然后计算两个范围中效力的平均值来测定1.0-0.001EU/ml整个范围上CSE的效力。然后利用CSE的总效力根据下式计算要加入该批次中各CSE小瓶中从而得到1000EU/ml溶液的LAL试剂水用量：

iii.测试方法

向含有400μl样品的脱氧10×75mm培养试管中加入100μL LAL。轻柔漩涡搅拌试管2秒，将其置于LAL装置的培育模块中。各试管以此方式分别加入。当试管底部触动机械开关时开始计时各试管。试管在整个测试期间于37.0±0.5℃培育。前60秒不取任何读数；这使得试管的内含物达到所述温度以及气泡分散。试管插入后60-120秒期间，各孔的光检测器以10秒为间隔取7个读数。然后计算这些读数的平均值并以之代表100％的透光率。该调零阶段消除了因试管缺陷和样品颜色或内在浊度所致的数据误差。随后可每10秒取读数值，将其转化为透光率，然后转化为光密度(OD)。计算在400-550秒收集的OD值的平均值，然后将其从所有随后的测试OD值中扣除。(此基线校正弥补了背景的OD)。

开始时间T₀定义为将样品置于培育孔中与光密度达到20mAU之间的时间。通过比较开始时间与存档的log₁₀(T_o)与log₁₀(已知内毒素浓度)标准曲线来测定内毒素水平。

利用小型编程计算机(small-programmed-computer)从LAL装置收集数据。LAL装置软件将OD值保存在数据文件中，根据指令，例如开始时间校正、标准品的线性回归与内毒素浓度测定进行数据分析。

一式两份测试所有处理中(in-process)的样品(无尖峰的(unspiked)和有尖峰的(spiked)(具有4-λ尖峰))，其中λ等于标准曲线上的最低标准。此外，测试了无尖峰的LAL试剂水与LAL试剂水中的4-λ尖峰。一式三份测试所有的最终产物样品(无尖峰的与有尖峰的)。

结果.dXCMSFH中内毒素的水平低于1EU/ml。在该方法优选的实施方案中，实现了内毒素的消除低于0.01EU的水平并适用于复杂应用和较大体积。这产生了0.1EU/ml到低于0.02EU/ml的读数。

V.制剂

1.包括赋形剂的药物组合物、给药途径与剂量.可将本发明的稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH掺入常规药物制剂(例如，可注射溶液)，以用于治疗需要它的哺乳动物。药物组合物可通过皮下、静脉内或肌肉内注射，或作为大体积的胃肠外溶液等给予。在一些实施方案中，可通过将Hb包裹在脂质体中来配制本发明的dXCMSFH。药物递送中经常采用脂质体包裹以降低所包裹药物的毒性，以及增加药物的半衰期。脂质体包裹的血红蛋白(LEHb)以生理上与RBC相似的结构包裹Hb，因此防止了Hb解离及其从血流中快速清除。LEHb分散体的半衰期取决于双层的表面化学性质以及双层表面电荷与囊泡大小分布。因此，降低囊泡大小与修饰囊泡表面可显著增加循环寿命。脂质体与聚乙二醇的表面偶联可延长半衰期。脂质体经网状内皮系统(RES)的吸收影响到可安全给予的LEHb浓度，因为RES过载将损害免疫系统。

也可将本发明的脱氧、稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH配制为人工血液和氧递送治疗剂。除dXCMSFH外，这种制剂可包含其它组分。例如，胃肠外治疗组合物可包含无菌等渗盐溶液。所述制剂可以是适用于直接给予的形式，或需要在给药前稀释的浓缩形式。因此，本发明的制剂可包含介于0.001％-90％(w/v)间的dXCMSFH。在本发明的一些实施方案中，本发明dXCMSFH的胞外血红蛋白溶液可包含约5％-约20％、约5％-约17％、约8％-约14％与约10％的血红蛋白(％w/v)。在本发明的一些实施方案中，dXCMSFH的胞外血红蛋白溶液可包含约5％-约7％的血红蛋白(％w/v)。在本发明的一些实施方案中，含有dCMSFH的溶液包含约6.4％的血红蛋白。血红蛋白百分比的选择取决于所选择的血红蛋白产物的肿胀特性。配制用于本发明的血红蛋白溶液可以是正常肿胀到过度肿胀(hyperoncotic)。可调节血红蛋白百分比以获得各适应症的所需肿胀压力。

本发明的dXCMSFH可用于用作利用红细胞转运氧的哺乳动物的血液替代品和氧递送治疗剂的组合物中。哺乳动物包括但不限于：人，牲畜，如牛、猫、马、狗、绵羊、山羊、猪等。在本发明的一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

在适当时期中，从初次剂量或重复剂量开始，本发明dXCMSFH的剂量可以是约1-约15,000毫克血红蛋白/公斤患者体重。当用作氧递送组合物或用作血液容积补充剂时，剂量可以是100-7500mg/kg患者体重、500-5000mg/kg体重或700-3000mg/kg体重。因此，人患者的剂量可以是1克到1000克以上。应理解各种剂型的单独剂量中所含活性成分的单位含量本身无需构成有效量，因为可通过给予多份单独剂量达到所需的有效量。剂量的选择取决于所用的剂型、所治疗的病症与本领域技术人员确定要达到的具体目的。

为用于本发明，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可透析或通过超滤交换入生理上可接受的溶液。可将本发明的dXCMSFH配制为50-150g/l浓度。该溶液可包含与全血等渗并可维持血红蛋白的可逆携氧和递送特性的生理相容电解质载体。生理上可接受的溶液可以是，例如生理盐水、盐水-葡萄糖混合物、Ringer乙酸盐、Ringer溶液、乳酸化的Ringer溶液、Locke-Ringer溶液、Krebs-Ringer溶液、Hartmann平衡盐水、肝素化柠檬酸钠-柠檬酸-葡萄糖溶液与多聚血浆替代品，如聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇与环氧乙烷-丙二醇缩合物。

本发明的各制剂还可含有惰性组分，包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、盐和本领域熟知的其它物质，它们的选择取决于所用剂型、所治疗的病症、本领域技术人员确定要达到的具体目的与这种调节剂的特性。例如，除dXCMSFH外，本发明的血红蛋白溶液可含有0-200mM的一种或多种生理缓冲液，0-200mM的一种或多种碳水化合物，0-200mM的一种或多种醇类或多元醇，0-200mM的一种或多种生理上可接受的盐，0-1％的一种或多种表面活性剂，0-20mM的还原剂。除dXCMSFH外，本发明的血红蛋白溶液可含有0-50mM葡糖酸钠、0-50mM的一种或多种碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇或本领域已知的其它碳水化合物)，0-300mM的一种或多种氯化物盐与任选的0-0.5％表面活性剂，例如Tween.^TM.[聚山梨酸酯80]和/或0-20mM N-乙酰基半胱氨酸。

取决于血红蛋白应用的目的，可在几秒到几小时期间给予本发明的dXCMSFH。例如，当用作氧载体来治疗严重的出血时，常见的给予用时程尽可能快。作为容积增强剂或氧治疗剂，血红蛋白溶液的典型输液速率可以是，例如约100ml/h-约3000ml/h、约1ml/kg/h-约300ml/kg/h或约1ml/kg/h-约25ml/kg/h。在本发明的一些实施方案中，给药速率可以更高。

合适的组合物也可包含0-200mM的一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸氢盐或Goode缓冲液)。本发明的组合物也可包含盐，例如氯化钠、氯化钾、乙酸钠、氯化钙、氯化镁。所述盐的浓度可以是0-2M。

此外，本发明组合物可包含一种或多种碳水化合物(例如，还原性碳水化合物，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖或非还原性碳水化合物，如蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘露糖醇、异蔗糖(isosucrose)或水苏糖)与一种或多种醇类或多元醇(如聚乙二醇、丙二醇、葡聚糖或多元醇)。碳水化合物或醇类的浓度可以是0-2M。

本发明的dXCMSFH也可含有一种或多种表面活性剂与0-200mM的一种或多种螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、ophenanthroline、二乙胺三胺五乙酸(DTPA，也称为五乙酸)等)。表面活性剂可以是组合物的0.005-1％。本发明组合物的pH可以是约6.0-9.5。在一些实施方案中，所述组合物可包含0-150mMNaCl、0-10mM磷酸钠、0.01-0.1％表面活性剂和/或0-50μM的一种或多种螯合剂，pH 6.0-9.5。制剂可包含5mM磷酸钠、150mM NaCl、0.025％-0.08％聚山梨酸酯80和/或25μM EDTA，pH 6.0-9.5。

制剂的其它添加剂可包括抗菌剂、肿胀压力剂(oncotic pressureagent)(例如，白蛋白或聚乙二醇)与其它配制可接受的盐、糖和本领域已知的其它赋形剂。本发明的各制剂还可包含以下成分，包括载体、稀释剂、填充剂、盐和本领域已知的其它物质，这些成分的选择取决于所要实现的具体目的和本领域技术人员不难确定的这些添加剂的特性。可采用本领域已知的任何方法配制本发明组合物。这种配制方法包括，例如简单混合、连续加入、乳化、透滤等。

2.包装与储存本发明NO-阻断的四聚体Hb，包括稳定(交联)与不稳定(未交联)Hb的.可将本发明NO-阻断的四聚体Hb，包括dXCMSFH、dCMSFH和dTBSFH的各种具体实例储存在常规，优选氧不透过的容器中(例如，不锈钢罐子、玻璃容器、氧不透过的塑料袋或用低氧可透过塑料袋包扎的塑料袋，其中在内部塑料袋和包扎的塑料袋之间放置氧清除剂)。在一些优选的实施方案中，无氧存在下储存本发明的dXCMSFH、dCMSFH或dTBSFH。dXCMSFH、dCMSFH或dTBSFH可以在使用前氧合，例如(仅仅是举例)在在导管中进行心脏治疗前氧合。在一些实施方案中，dXCMSFH、dCMSFH或dTBSFH可在控氧环境中储存于氧可透过或氧不可透过(“厌氧”)的容器中。这种控氧环境可包括，例如手套盒、手套袋(glovebag)、培养箱等。控氧环境中的氧含量优选低于大气氧浓度(参见Kandler，R.L.等，美国专利号5,352,773，纳入本文作为参考)。在本发明的一些实施方案中，可将dXCMSFH、dCMSFH或dTBSFH包装在密闭的Tyvek或Mylar(对苯二甲酸乙二酯)袋或囊中。在一些实施方案中，可冻干本发明的dXCMSFH、dCMSFH或dTBSFH并以粉末储存。可在室温或升高的温度下储存这些制品(Kandler等，PCT公布号WO 92/02239；Nho，PCT公布号WO 92/08478，二者均纳入本文作为参考)，或者更优选冷藏。在一些实施方案中，为便于运输与进一步处理可将dCMSFH或dTBSFH储存在HyCloneBioProcess Containers^TM中。

当用氧不可透过的膜包装时，可用各种材料制造所述容器，包括聚合物膜(例如，基本上氧不可透过的聚酯、乙烯乙烯基醇(EVOH)或尼龙)与其层压物。当容器是氧不可透过包扎时，可从各种材料制造所述容器，包括聚合物膜(例如，基本上氧不可透过的聚酯、乙烯乙烯基醇(EVOH)或尼龙)与层压物，例如透明层压材料(例如，含有二氧化硅或EVOH的层压物)或金属箔层压物(例如，银或铝箔层压物)。聚合物可以是各种聚合材料，包括例如聚酯层(如，48号聚酯)、尼龙或聚烯烃层，如聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯或聚丙烯或其共聚物。

所述容器可以是各种构造，例如小瓶、圆筒、盒子等。在一优选的实施方案中，所述容器是袋子的形式。可以通过在其外周连续粘合一个或多个(例如两片)薄片来形成紧密闭合、氧不可透过并具有可填充中心的构造。在包含聚烯烃的层压物的情况中，例如低线性密度、低密度、中等密度或高密度聚乙烯或聚丙烯及其共聚物，袋子的外周可采用加热粘合或密封。本领域技术人员熟知如何测定袋子的形状和获得紧密闭合、氧和/或湿气不可透过构造的合适温度。当容器是膜时，例如聚酯膜，可通过各种合适的方法使得该膜基本上氧不可透过。可层压或处理该膜以降低或消除氧透过性。

在一些实施方案中，可加入一种或多种抗氧化剂，例如抗坏血酸(Wiesehahn，G.P.等，美国专利号4,727,027；与Kerwin，B.D.等，美国专利号5,929,031)、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸、生育酚、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚或苯酚化合物(Osterber等，PCT公布号WO94/26286；与Kerwin，B.D.等，美国专利号5,929,031)以进一步稳定dXCMSFH、dCMSFH和dTBSFH(所有参考文献纳入本文作为参考)。或者，更优选将本发明的dXCMSFH冻干并以粉末储存，或可包装在密封的Tyvek或Mylar(聚对苯二甲酸乙二酯)袋子或囊中。例如Kerwin，B.D.等，美国专利号5,929,031所述的包装方法纳入本文作为参考。在一些实施方案中，可对处于这种储存容器中的dXCMSFH、dCMSFH和dTBSFH进行照射或其它无菌处理使之足以延长组合物的储存寿命。制剂中可包含氧清除剂，例如n-乙酰基-半胱氨酸。

可在适合储存的温度储存本发明的dXCMSFH、dCMSFH和dTBSFH两年或更长时间，当在低氧环境中储存时优选是两年或更长时间。储存一年或更长时间的合适储存温度是约0℃到约40℃。优选的储存温度范围是约0℃到约25℃。制备本发明的dXCMSFH、dCMSFH和dTBSFH的工艺包括维持处理步骤在足以将微生物生长或生物负担(bioburden)减到最低的条件下，如维持温度在低于约20℃到高于0℃。

VI.使用方法

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用于形成可通过，例如输液、静脉内或动脉内注射或其它方法给予受者的药物组合物。本发明的dXCMSFH制剂可用于作为利用红细胞的任何应用中的血液替代品、血容量的增容剂与氧灌注剂的组合物中。一种应用利用本发明的组合物来治疗血容量丧失并必须替换血液容量和氧递送容量的出血。此外，由于本发明脱氧的稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可制成药学上可接受的，因此本发明的制剂不仅能递送氧，而且还能用作简单的增容剂以提供肿胀压力(因为存在大量血红蛋白分子所致)。因此，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用作手术过程中所除去血液的替代品，在该期间将患者的血液除去并保存以便在手术结束时或恢复期间重新输注(例如，急性血量正常血液稀释(acute normovolemichemodilution)或血液提升(hemoaugmentation)等)。

用作血液替代品的本发明脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH的典型剂量是每公斤患者体重10mg-7g或以上的胞外血红蛋白。因此，人患者的典型剂量是几克到350克以上。应该知道各种剂型的单独剂量中所含活性成分的单位含量本身无需构成有效量，因为可通过给予多份，例如注射剂等达到所需的有效量。剂量的选择取决于所用的剂型、所治疗的病症与本领域技术人员确定要达到的具体目的。

在本发明的一些实施方案中，为给予哺乳动物，脱氧稳定NO-阻断的四聚体Hb，例如dXCMSFH溶液可含有以重量计约5％-约25％的dXCMSFH。在本发明的一些优选实施方案中，为给予哺乳动物，dXCMSFH溶液可含有以重量计约7％-约15％的dXCMSFH。在本发明一些其它的优选实施方案中，为给予哺乳动物，dXCMSFH溶液可含有以重量计10％的dXCMSFH。在本发明的一些实施方案中，待给予哺乳动物的剂量含有约7g dXCMSFH。在本发明的一些实施方案，待给予哺乳动物的剂量含有约1g脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH。在本发明的一些实施方案中，用于治疗环境的示例性生产单位是含有500ml的0.5mmoldXCMSFH溶液的容器(溶液中约64g/L或约6.4重量％)。较大单位溶液可用作许多治疗性干预的血液替代品或用于提高氧递送能力。较小单位溶液可用于标记与诊断性目的以及治疗性干预。以dXCMSFH重量计，在一优选的实施方案中，较小单位溶液含有最多达4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或最多达25％的dXCMSFH溶液。以dXCMSFH重量计，在另一实施方案中，溶液含有浓度低至2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％的dXCMSFH。

取决于血红蛋白应用的目的，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可在数秒到数小时期间给予。例如，作为容积提升治疗，给药的常规时程应尽可能快。血红蛋白溶液作为氧递送/灌注剂或容积增强剂的典型输注速率可以是约100ml-3000ml/小时。然而，当用于刺激红细胞生成时，给药可慢一些，所以给药速率可因本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH的剂量远低于治疗出血所需的剂量而较慢。

在一些实施方案中，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可通过提供患贫血的哺乳动物额外的氧递送容量、刺激红细胞生成、有效地补充铁以支持RBC产生与用作红细胞生成素治疗的佐剂而用于治疗肾脏衰竭、糖尿病、AIDS、化疗、放疗、肝炎、G.I.失血、铁不足、月经过多等所致的贫血。

类似地，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用于向需要这种额外的氧递送容量的哺乳动物(例如，运动员、士兵、登山者、飞行员、吸烟受害者等)提供额外的氧递送容量。可利用这种额外的氧递送容量来克服环境(即，例如高海拔与吸烟)与身体(即，例如紧急表现需求)应激。因此本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用于治疗一氧化碳中毒及其并发的缺氧和局部缺血，因为本发明的化合物与组合物可向组织供氧同时清除结合了一氧化碳的细胞血红蛋白，从而满足患者的氧需求直至新RBC产生。

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可应用于需要给予哺乳动物高容积血红蛋白以及只给予小容积的本发明血红蛋白的领域。本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用于通常会丧失大量血液的手术期间或用于治疗大量失血的外伤受害者。所述情况可包括平民事故与军事状况。

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用作兽医学临床应用的血液替代品。

此外，因为本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH在血管结构中的分布不受限于粘度或红细胞的大小，本发明组合物可用于将氧递送至红细胞不能穿过的区域。这些区域可包括位于红细胞流障碍的下游的任何组织区域，例如血栓块、镰状细胞包含体、动脉包含体、血管成形术气球、外科手术仪器、氧饥饿或缺氧的组织等的下游区域。

此外，可采用本发明的方法治疗所有类型的组织局部缺血，包括脑的局部缺血事件。这种组织局部缺血包括，例如中风、新发生的中风、暂时局部缺血发作、心肌昏厥与休眠、急性或不稳定心绞痛、新发生的心绞痛、梗死等。用本发明的血红蛋白预处理也可加速组织从物理损伤，例如烧伤中恢复，所述血红蛋白可增加灌注和组织的氧合作用，这也可降低感染风险。利用本发明的稳定NO-阻断四聚体Hb也可从肺中更好地摄取氧，因为这些较小分子在小毛细血管中分布更好。在整容手术中或其后，细微的组织层(tissue bed)因微循环破坏而丧失RBC流。利用本发明的稳定NO-阻断四聚体Hb可为组织代谢和再生长提供更好的氧合作用，从而减少因血管化作用丧失而形成的疤痕。

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用于治疗镰状细胞贫血患者。目前通过输入红细胞联同稀释和疼痛控制来治疗处于血管闭合危险的镰状细胞贫血患者。本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH不仅能递送氧来防止进一步镰状化(如红细胞所发生的)，它们还可穿过已被变形的红细胞阻塞的血管以更好地缓解疼痛并尽可能降低组织损伤。反复输液也可导致镰状细胞贫血患者群中针对红细胞和血小板的同种异体免疫，利用本发明血红蛋白可避免此不利作用。在镰状细胞贫血患者的治疗中，本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH能提供显著的治疗性优点，因为它们引发较低程度的血管收缩或根本不引发。这有利于治疗血管闭合危险，也有利于处于血管闭合危险突然发作的风险中的镰状细胞贫血患者的其它治疗。例如，本发明的dXCMSFH可用于替代用于镰状细胞贫血患者手术前输注的浓缩红细胞以尽可能降低麻醉风险。本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH也可周期性给予以尽可能降低中风的风险。

本发明的稳定NO-阻断Hb，即重新氧合的XCMSFH因其大小而可灌注并将氧递送至组织层，所述组织层因体积大的红细胞灌注不佳而只能依赖于扩散。例如，本发明的化合物与组合物可用作急性冠状综合征(ASC)与移植的组织保护剂，在所述情况中受损的区域或收集的器官在终止血流期间受灌注。这样就可防止再灌注损伤并能救治和保存灌注的组织，以用于随后的正常循环。此外，在移植过程中，如上所述可在取下器官前用本发明化合物与组合物冲洗以除去天然血液物质和组分并继续支持组织生命力来准备用于收集的器官。

本发明的化合物与组合物也可用作伤口愈合试剂，其分子大小和氧递送能力可在RBC因大小或刚性而无法灌注的血管化不佳区域(例如糖尿病足部损伤、心脏血管再形成术恢复与术后恢复，即例如整容手术或癌症切除乳房重建)产生优良的灌注。本发明的稳定NO-阻断四聚体Hb还可用于癌细胞的不佳血管化肿瘤组织层中，其中适当利用本发明可增加氧张力、更有效地利用放疗并提高氧依赖性药物的作用。

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH可用作心源性休克的一氧化氮小分子抑制剂。心源性休克影响许多具有急性心肌梗塞表现而在梗死后发生循环停止的患者。尽管可用导管或旁路嫁接(bypassgrafting)进行干预，但死亡率依旧约50％。利用本发明的化合物和组合物能向心脏和血管提供防止一氧化氮过量生产并支持患者活过梗死后至关重要的最初30天期间的氧合水平。此时间点后存活率极大提升。

本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH含有铁，因此可采用MRI(磁共振成像)检测。因此，在一些实施方案中，本发明考虑了利用本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH作为成像试剂。

本发明也涉及含有本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH的可植入递送装置(例如药盒、植入物等)，所述装置能响应于增加氧递送容量的感觉需要而将dXCMSFH释放入如循环系统中。在一些实施方案中，这种装置能以例如恒定速率递送dXCMSFH，从而促进红细胞生成(单用，或与红细胞生成素联用)。在一些实施方案中，可用传感工具(例如，血红蛋白、O₂水平、CO₂水平等的电子探针)控制所述装置，从而能以与患者的氧递送容量需要相当的速率递送本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb。这种传感工具本身可以是可植入的或是植入装置的一部分，或者可以位于体外。在一些实施方案中，可利用这种装置实现或促进个体的血诊断。

也可利用本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH，(例如)通过将氧体外递送至细胞培养物和除去溶液中的氧来形成非药物组合物，所述非药物组合物可(例如)用作需要参比标准品的分析仪器的参比标准品、试剂溶液、细胞培养物的气体含量的对照品。此外，本发明的dXCMSFH可用于在运输期间氧合所捐献的组织和器官。

可利用本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是dXCMSFH清除表面或液体的内毒素。因此，本发明考虑了含有本发明的脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb的装置，例如药盒、过滤器、珠、柱、试管等。可使液体，例如水、盐水、培养基、白蛋白溶液等流过这种装置来除去可能存在于这种液体中的内毒素，或者降低存在于这种液体中的内毒素浓度。优选将脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb固定(例如通过亲和力、离子键或共价键等)于存在于这种装置中的固体支持物。在一些实施方案中，使脱氧稳定NO-阻断四聚体Hb与可加入所处理液体中，然后除去(例如通过过滤或亲和固定)的珠结合。在一些实施方案中，所述珠可以是铁磁性或顺磁性金属，或者其本身可以具磁性，因而不难通过磁性工具使之与所处理的液体分离。

脱氧巯基阻断的Hb(交联或未交联)，即dCMSFH、dTBSFH和dXCMSFH可用于除去需要除氧的溶液中的氧，也可用作分析试验与仪器的参比标准品。也可体外利用脱氧巯基阻断的Hb(交联或未交联)，即CMSFH、TBSFH和XCMSFH通过维持氧水平来提高细胞培养中细胞的生长。

可利用本发明的重新氧合的稳定NO-阻断四聚体Hb，具体是XCMSFH来观察血管内空间。目前观察血管壁的光学技术因红细胞输液的不透明作用而归类为非光学技术。本发明的稳定NO-阻断Hb，即XCMSFH不仅能递送氧从而防止局部缺血，而且还能提供光学透明的视野来原位观察组织层，测定病理学、癌症、易损斑(vulnerable plaque)、脂质损伤、支架(stent)放置等，例如利用红光波长带的可见光阐明对象特征。可利用本发明的稳定NO-阻断四聚体Hb拓展光学相干性断层显像(Optical CoherenceTomography)的应用。目前采用间歇式盐水冲洗在体内产生短暂可见视野，但利用能连续使局部区域氧合的本发明稳定NO-阻断四聚体Hb能实现优秀的显影与持续检验。

VII.实施例

实施例1

比较全血初步处理的两种方法

材料：牛血液收集物：将牛血收集入1加仑容器中，该容器中可装有100ml的6％乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液并在冰上冷却。

将牛动脉全血分为A批和B批。A批由2200ml全血构成，用haemonetics细胞回收器(Cell Saver)5洗涤得到无血小板、无凝结因子、无胞外钾、无抗凝剂和无细胞基质的浓缩红细胞(方法A)。B批由1800ml全血构成，用Millipore 0.65μm过滤器洗涤(方法B)。

方法A.用细胞回收器5除去血浆蛋白：利用Haemonetics的细胞回收器5从新鲜收集加有抗凝剂的牛血的其它组分中浓缩红细胞。此时不要破裂白细胞或红细胞。

通过150μm的粗过滤器后，在装有225ml浓缩红细胞的自旋碗中洗涤这些细胞，用3升盐水从碗的外沿向着中心逆流洗涤。轻柔离心，一些WBC在洗涤中被洗脱，这是有利的。表4显示了以500ml为增量的血清蛋白质除去的进展情况。这是一种连续流技术(continuous flow technique)。表4所示样品是应用于碗的样品容积。通过分光光度法读取280nm处的蛋白质浓度追踪进展情况，数值以A₂₈₀单位表示(290nm处的吸光度)。表4所示数据点在洗涤过程中的所示点取得。结果表明当用3升NS洗涤整碗红细胞时，log(血清蛋白质降低)大于3。这也可推测log(未与红细胞膜结合的病毒、朊病毒等的降低)大于3。表4中所有数值都根据稀释度进行了修正。

表4：用细胞回收器5除去血浆蛋白

样品状态	A280吸光度单位
		含有粗制血浆的样品的A280	277.35

500cc NS洗涤后滤液的A280	43.20
		1000cc NS洗涤后滤液的A280	7.69
1500cc NS洗涤后滤液的A280	0.86
		2000cc NS洗涤后滤液的A280	0.05

方法B.用Millipore 0.65μm过滤器除去血浆蛋白：B批通过150μm过滤器。然后利用能使血浆蛋白质流过而截留细胞组分，例如白细胞和红细胞的切流膜过滤这些物质。切流膜过滤可能较慢，但较为省力，因为可自动运行。它更适合于大规模的过滤。可采用其它类型的大规模离心。表5显示了此连续透滤的结果，其中所有结果都根据稀释度进行了修正。此方法表明log(血浆蛋白质降低)大于3，这也暗示了相似的log(病毒、朊病毒等的降低)。

表5.用Millipore 0.65μm过滤器除去血浆蛋白

样品状态	A280吸光度单位
		1000cc血液中血浆的A280	221.6
1000cc NS洗涤后滤液的A280	82.1
		2000cc NS洗涤后滤液的A280	26.5
3000cc NS洗涤后滤液的A280	8.07
		4000cc NS洗涤后滤液的A280	2.76
5000cc NS洗涤后滤液的A280	0.81
		6000cc NS洗涤后滤液的A280	0.29
7000cc NS洗涤后滤液的A280	0.102

评估白细胞丧失/除去.需要在血红蛋白制备期间除去所有WBC以从血红蛋白溶液中除去粒细胞(granolocyte)蛋白水解酶。因此，在除去血浆蛋白的阶段，需要除去WBC而不导致它们裂解。在离心期间，细胞回收器5技术可除去漂浮暗黄层中的一些WBC。然而，切流膜可保留所有WBC，因此观察到WBC损失可能意味着WBC发生裂解。表6显示了用细胞回收器5或Millipore 0.65μm过滤器过滤后，对保留的WBC的评估。对容积适当修正后，两种方法显示均能在RBC存在下提供充分防止白细胞裂解的作用。

表6.评估白细胞丧失/除去

样品

初始WBC

最终WBC(经容积调整)

回收％

细胞回收器5	5.79×103	6.10×103	100％
				Millipore 0.65μm	5.79×103	5.63×103	100％

然后将A批和B批冷冻8小时，再使之流过也能除去病毒物质的Baxter白细胞减少过滤器(leuko-reducing filter)。A批得到1500ml RBC，而B批得到1200ml RBC。在整个清洗过程中从各批中取样。

裂解细胞并除去基质.用6000ml DI水稀释A批的1500ml RBC。细胞裂解45秒后，向溶液中加入750ml 90％N盐水(NS)以尽可能降低裂解任何存在的白细胞。用4800ml DI水裂解B批的1200ml RBC。此时不向B批中加入盐水。然后，使两批均流过0.22μm Pellicon过滤器。一旦血红蛋白滤出并收集于单独的烧瓶中，将其转移至第二个10K道尔顿的Pellicon过滤器上。该过滤器滤出任何存在的盐，弃去。纯的血红蛋白再循环入原始的烧瓶，浓缩至所需百分比，例如13.5％(w/v)。

用碘乙酰胺(IAM)阻断血红蛋白的巯基.将样品浓缩至13.5％Hb后，如上所述除去氧，用0.1M磷酸钠缓冲液将pH调节至7.4。残留的氧＜10ppb。每摩尔dSFH加入两摩尔当量的IAM，反应进行1小时。利用碘化物电极监测反应进程。利用PBS通过超滤除去未反应的IAM。一旦除去碘化物，中间体dCMSFH得以稳定，可将其包装入氧屏障容器并在室温安全储存。

脱氧与交联：再次将稳定的中间体产物dCMSFH置于无氧(＜10ppm)和溶氧除去至低于0.010ppm水平的环境中。可采用膜接触器技术将处于氧水平低于10ppm的控制空气中的血红蛋白脱氧。利用水球形(polorgraphic)溶氧探针读取两批的原始氧饱和读数。A批的原始读数为4mg/L。B批的原始读数为7mg/L。利用蠕动泵以600ml/分钟的流速，应用＞28.5in/Hg的真空压力将血红蛋白泵入并再循环通过膜接触器。两批的最终氧饱和水平＜0.01ppm。然后，用0.5M NaOH将两批的pH调节至8.4来交联。一旦pH调节好，向A批中加入2.94g双-3，5-二溴水杨基延胡索酸酯(DBSF)(每摩尔巯基两摩尔当量)，而向B批中加入1.47g(每摩尔巯基两摩尔当量)。一旦交联完成，用0.5M柠檬酸将pH调节回7.4，将两批储存在气密性容器放于冰箱内。

利用带有标准样品制品的Beckman CoulterPA-

蛋白质组仪器，通过毛细管凝胶电泳分析监测反应来测定交联程度以监测反应时程。当95％以上的四聚体得到交联，反应完成(数据未显示)。也利用Hemox分析仪来评估样品，根据双波长分光光度法记录血氧平衡曲线。

方法A与方法B的总体比较：同时进行方法A与方法B纯化来比较释放Hb同时除去基质并防止白细胞裂解的效率。各方法提供的纯化物质的质量可接受，两种方法提供的纯化物质的质量可接受，预计两种方法可联用于本发明方法中。

实施例2

裂解白细胞

本实施例显示测定了WBC裂解的相对时间。与WBC相比，优先裂解RBC可优化红细胞裂解以获得最大量的血红蛋白，也不会引入裂解的WBC的蛋白酶。

方法：将2000ml全血只通过细胞回收器5的100μ储存过滤器(reservoir filter)过滤。然后在7个烧杯中注入200ml血液。一个烧杯指定为对照。然后指定其余6个烧杯的特定裂解时间：30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟。对照烧杯加入910ml 0.9％盐溶液，开始计时。在时间增加至30秒、1、2、3、4和5分钟，各取10ml样品用于白细胞分析。

就其余的6烧杯而言，加入800ml DI水。30秒后，向第一个烧杯中加入110ml 9％盐水以终止裂解。搅拌约30秒后，取10ml样品用于白细胞分析。1分钟后，向第二个烧杯中加入110ml 9％盐溶液。同样地，搅拌30秒后，取10ml样品。就其余4个烧杯而言，在第2、3、4和5分钟加入110ml 9％盐溶液以终止裂解。在各时间增量从各烧杯取10样品，通过标准WBC定量测定进行白细胞分析。

结论：如图2所示，白细胞可在介于2-3分钟之间发生裂解。因此，为优化红细胞裂解，可在两分钟时终止裂解。体积因加入DI水和盐水而增加。表7所示结果依稀释度进行了修正。

表7：测定WBC的相对裂解时间

时间	对照值(K/mm3)(对照烧杯)	实验值(K/mm3)(烧杯1-6)
			30秒	5.9	5.2
1分钟	5.4	4.9
			2分钟	5.8	5.0
3分钟	7.4	4.5
			4分钟	6.8	4.0
5分钟	5.7	3.4

实施例3

家兔安全性试验

材料：饲养家兔并采用标准动物畜牧学方法处理。在剃去毛的局部麻醉耳静脉处形成一IV入口，插入22或24号导管，用于dXCMSFH输液。利用注射泵计量IV输液；总体积通常在45-60分钟给予。如果要从家兔采血，应将20-22号导管插入另一只耳朵的动脉。利用Velcro布料包裹型束身带完成上述方法与输液。

方法：方案A：如上所述准备用于输液的家免。如TCS Hemox-分析仪所测，37℃，pH 7.40缓冲NS配制的待给予dXCMSFH的氧p50为28-32，以本发明修饰的血红蛋白计是12％(w/v)。待输液的dXCMSFH的用量以家兔的10％估计血容积(56ml/kg)为基础。将此用量置于注射器中，用泵在45-60分钟输液。然后从家兔的耳中取出IV导管，将其送回笼中观察。对照家兔接受未用NO阻断化学修饰的Hb。

方案B：如上所述准备静脉和动脉入口。从动脉导管取出显著量的家兔血，54-75cc，同时从静脉入口输入相同体积的dXCMSFH。此过程在12-20分钟的总时间内完成。在随后的第2天和第3天，通过肝素锁闭的静脉导管在30分钟间隔输入15cc的dXCMSFH，每天两次，每次间隔4小时。

结果：如表8所示，25只家兔按照方案A在约1小时期间输液。所有家兔在72小时到75天期间存活，无一死亡。3只家兔输入未用NO阻断化学修饰的Hb。如表9所示，所有这些家兔在开始输液后7-12分钟内死亡。如表10所示，4只家兔按照方案B接受较大用量的dXCMSFH。所有这些家兔存活并在两个星期以上都是健康的，没有任何后发死亡。在方案A或B中，用dXCMSFH处理的家兔显示100％存活，无明显的病态迹象。因此，接受650-7500mg/kg XCMSFH的实验对象良好耐受实验方案A和B，而接受125-160mg/kg水平的无进一步化学修饰的无细胞Hb的处理组在第一次给予后死亡。

表8

家兔ID	体重(Kg)	剂量dXCMSFH(mg/Kg)	结果
				11	2.47	567	存活
15	2.4	583	存活
				13	2.62	534	存活
B7	2.36	636	存活
				CO	2.52	476	存活
B3	2.24	670	存活
				B1	2.8	714	存活
C02	2.65	566	存活
				E03	2.38	630	存活
04	2.1	1143	存活
				07	2.26	1062	存活
C8	2.39	1004	存活
				MH2	3.12	808	存活
LHD	2.78	647	存活
				D03	2.3	783	存活
D01	2.06	874	存活
				05	2.29	629	存活
03	2.02	713	存活
				01	2.12	679	存活
JSD	2.13	676	存活
				D04	2.26	637	存活
MH4	2.51	574	存活
				K03	2.27	634	存活
D08	2.28	632	存活

D12

2.42

595

存活

表9

家兔ID	体重(Kg)	实消耗的时间(分钟)	剂量dSFH(mg/Kg)	结果
					06	2.04	7	98	死亡
10	2.39	12	126	死亡
					09	2.42	8	83	死亡

表10

家兔ID	体重(Kg)	dXCMSFH(mg/Kg)	剂量dXCMSFH(mg/Kg)	结果
					B03	3.1	12000	3871	存活
F02	2.79	11500	4122	存活
					F01	3.02	13800	4570	存活
F05	2.65	12700	4792	存活

实施例4

猪安全性试验

材料与方法：研究了12只体重10-16公斤的猪仔。先采用2D超声心动图非侵入性筛选心脏异常并检测主动脉瓣直径，再纳入研究。制成IV入口后立即给予每只猪仔5mg Lasix(浓度为40mg/ml)，然后开始顶加载(toploading)XCMSFH溶液。XCMSFH溶液的氧p50为32，浓度为12g％(120mgXCMSFH/ml)。每只猪仔接受1200mg XCMSFH/kg体重。

利用后肢上的血压缚带获得非侵入性的心脏数据。利用多普勒超声仪(USCOM)检测整个输液期间各个时间每次心跳(beat to beat)的输出量。选择用于分析的数据代表了在任何时间点获得的最佳超声波形。研究物质的顶加载受限于产生充血性心力衰竭的液体上限。

将等于14.3％计算血液体积(70ml血液/kg体重)的用量在1小时期间经外周IV入口输入。对象猪未麻醉、未给予镇静剂或未侵入性监测。

结果：图7A-D依次代表了作为所输注的XCMSFH函数，对体重进行修正的心脏输出量、全身性血管阻力、心脏收缩血压和心脏舒张血压。所有猪仔对输液耐受良好；无一死亡。采用相关变量的最小方格法(leastsquares method)来评估数据，得到斜率和截距。不难看出任何参数的数据中有很大差异，而无论所输入XCMSFH的用量。这与对象既未注射镇静剂，也未受束缚有关。睡醒、如厕与处理似乎可解释大多数差异，虽然对象的参数即使在实验开始前也有明显差别。

此研究的结果显示这些指数的平均值(最大值、最小值)分别是：心脏输出量，1.12L/分钟(2.7，0.45)；全身性血管阻力，7008达因.秒/cm⁵(21590-3364)；心脏收缩血压，156.69mmHg(193-130)；和心脏舒张血压，95.75mmHg(113-72)。这些指数的基线值分别是：心脏输出量，1.26L/分钟(1.62，0.72)；全身性血管阻力9588达因.秒/cm⁵(12662-4991)；心脏收缩血压，140mmHg(159-123)；与心脏舒张血压，84.25mmHg(111-72)。观察到心脏输出量略有降低(＜5％)，而全身性阻力增加了约30％。输液期间心脏收缩和舒张血压均略有升高(分别是12％和14％)。XCMSFH的各种剂量过载与血液动力学指数之间的相关性见图7A-D。虽然XCMSFH对这些指数的作用极低，但此作用似乎依赖于所递送的过载容积％。

在此项研究中，发现明显不依赖于所输入XCMSFH的用量的所有参数有显著差异。这些心脏参数中的最低变化量是血液容积增加(液体基本上过载的对象)所致。此项研究的结果表明所有对象从实验中存活下来，观察到的心脏参数中最小差异与血管活性有关。

朊病毒安全性：采用许多检测方法来确保本发明Hb中无朊病毒。首先选择合适的动物，只从没有喂食过动物蛋白、未给予抗生素并且小于30个月龄的封闭猪群中选择动物。防止污染的第二点是小心避免将脑物质混入血液。选择“菌形击昏器(mushroom stunner)”的牺牲方法来消除脑物质污染的可能性，从而消除了含朊病毒的物质引入所收集血液的可能性。此外，在处理Hb时，除去血浆蛋白的洗涤过程也能除去朊病毒。另外，当经过300,00Da分子量过滤器过滤Hb时，能除去任何朊病毒。最后，Pall过滤器处理本发明Hb以除去白细胞。此时，可除去小的形成体，例如朊病毒和病毒。实施所有这些预防措施以确保本发明Hb安全用于人类治疗和紧急情况。

脱氧与氧合状态.包装本发明的NO-阻断与稳定的NO-阻断四聚体血红蛋白并以脱氧物质储存和转运。对于许多治疗应用，修饰的血红蛋白以脱氧状态使用。对于需要灌注的应用，例如清洁用于观察的活组织区域、灌注局部缺血区域或移植前离体维持器官，修饰的血红蛋白可以其再氧合的状态使用以支持组织功能。

虽然本文显示与描述了本发明的优选实施方案，本领域技术人员可知道这种实施方案只是例子而已。本领域技术人员知道在不脱离本发明的情况下存在许多变化、改变与替代方案。应该知道可采用本文所述本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本发明的范围应由权利要求定义，这些权利要求中的方法和结构及它们的等价物应包括于其中。

Claims (125)

1.一种含铁的蛋白质化合物，其分子量约60,000道尔顿到约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团，从而使得所述蛋白质化合物在所述半胱氨酸位点结合一氧化氮的能力降低。

2.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述化合物是交联的四聚体血红蛋白。

3.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

4.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是无氧的。

5.如权利要求2所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联所述血红蛋白。

6.如权利要求2所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰所述血红蛋白。

7.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是人血红蛋白。

8.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是牛或猪血红蛋白。

9.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

10.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

11.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述化合物的氧递送能力提高。

12.如权利要求1所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述化合物以约20mmHg到约45mmHg的p50转运氧。

13.一种含有如权利要求1所述含铁蛋白质化合物与药学上可接受的载体的组合物。

14.一种装有组合物的容器，所述组合物含有如权利要求1所述含铁蛋白质化合物。

15.一种含铁的蛋白质化合物，其分子量约60,000道尔顿到约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团，其中所述化合物以约20mmHg到约45mmHg的p50转运氧。

16.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述化合物是交联的四聚体血红蛋白。

17.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

18.如权利要求16所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联所述血红蛋白。

19.如权利要求16所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰所述血红蛋白。

20.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是人血红蛋白。

21.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是牛或猪血红蛋白。

22.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

23.如权利要求16所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

24.如权利要求15所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述化合物结合一氧化氮的能力降低。

25.一种含有如权利要求1所述含铁蛋白质化合物的组合物。

26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述化合物是非热源性、无内毒素与无基质的。

27.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述化合物是无氧的。

28.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。

29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述组合物被包装。

30.一种含有如权利要求2所述含铁蛋白质化合物的组合物。

31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述化合物是非热源性、无内毒素与无基质的。

32.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述化合物不含氧。

33.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组合物不含二溴水杨酸。

34.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。

35.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组合物被缓冲。

36.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组合物被包装。

37.一种补充哺乳动物血液的方法，包括给予所述哺乳动物一组合物，所述组合物包含含铁的蛋白质化合物与药学上可接受的载体，所述化合物的分子量约60,000道尔顿到约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团从而使得所述蛋白质化合物不能在所述半胱氨酸位点结合一氧化氮。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述含铁的蛋白质化合物是交联的四聚体血红蛋白。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联所述血红蛋白。

41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰所述血红蛋白。

42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白是人血红蛋白。

43.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白是牛或猪血红蛋白。

44.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

45.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

46.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述化合物的氧递送能力提高。

47.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述化合物以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。

48.如权利要求37所述的方法，其特征在于，通过植入、注射或输液给予。

49.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物患有贫血、贫血相关病症、缺氧或局部缺血。

50.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物需要输血。

51.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物受外伤。

52.一种制备交联血红蛋白的方法，其中所述血红蛋白在其半胱氨酸上连接有巯基保护基团，包括：

(a)从含有红细胞的制品中除去内毒素；

(b)裂解所述红细胞；

(c)除去所述裂解的红细胞中的基质来分离血红蛋白；

(d)任选从所述血红蛋白中除去氧；

(e)向血红蛋白溶液中加入能为所述血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和

(f)分离在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述试剂选自：4-吡啶基甲基氯、烷氧基烷基氯、二甲氧基甲烷、N-(羟甲基)乙酰胺、三苯基甲基氯、乙酰基氯、乙酸酐、卤代乙酰胺、碘乙酸酯、苄基氯、苯甲酰氯、二碳酸二叔丁酯、对-羟基苯甲酰甲基溴、对-乙酰氧基苄基氯、对-甲氧基苄基氯、2，4-二硝基苯基氟、四氢吡喃、乙酰氨基羟基甲烷、丙酮、双-碳乙氧基乙烯、2，2，2-三氯乙氧基羰基氯、叔丁氧基羰基氯、异氰酸烷酯与烷氧基烷基异氰酸酯。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述卤代乙酰胺是碘乙酰胺。

55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

56.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

57.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(a)任选从在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白中除去氧；和

(b)交联在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

58.如权利要求52所述的方法，其特征在于，采用接触器膜技术除去所述氧。

59.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

60.如权利要求52所述的方法，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联在半胱氨酸基团上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

61.如权利要求52所述的方法，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

62.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述红细胞是人红细胞。

63.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述红细胞是牛或猪红细胞。

64.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白不能与一氧化氮结合。

65.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白的氧递送能力提高。

66.如权利要求52或57所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。

67.一种制备四聚体血红蛋白的方法，其中所述血红蛋白中的半胱氨酸连接有巯基保护基团，所述方法包括：

(a)从含有红细胞的制品中除去内毒素；

(b)裂解所述红细胞；

(c)除去所述裂解的红细胞中的基质来分离血红蛋白；

(d)任选将所述血红蛋白脱氧；

(e)向血红蛋白溶液中加入能为所述血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和

(f)分离在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。

68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述试剂选自：4-吡啶基甲基氯、烷氧基烷基氯、二甲氧基甲烷、N-(羟甲基)乙酰胺、三苯基甲基氯、乙酰基氯、乙酸酐、卤代乙酰胺、碘乙酸酯、苄基氯、苯甲酰氯、二碳酸二叔丁酯、对-羟基苯甲酰甲基溴、对-乙酰氧基苄基氯、对-甲氧基苄基氯、2，4-二硝基苯基氟、四氢吡喃、乙酰氨基羟基甲烷、丙酮、双-碳乙氧基乙烯、2，2，2-三氯乙氧基羰基氯、叔丁氧基羰基氯、异氰酸烷酯与烷氧基烷基异氰酸酯。

69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述试剂是碘乙酰胺。

70.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

71.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

72.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(a)任选从在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白中除去氧；和

(b)交联在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

73.如权利要求67所述的方法，其特征在于，采用接触器膜技术除去所述氧。

74.如权利要求67或72所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

75.如权利要求72所述的方法，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联在半胱氨酸基团上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

76.如权利要求72所述的方法，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述血红蛋白。

77.如权利要求67或72所述的方法，其特征在于，所述红细胞是人红细胞。

78.如权利要求67或72所述的方法，其特征在于，所述红细胞是牛或猪红细胞。

79.如权利要求67或72所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白不能与一氧化氮结合。

80.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白的氧递送能力提高。

81.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述四聚体血红蛋白以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。

82.一种制备血红蛋白的方法，其中所述血红蛋白中的半胱氨酸连接有巯基保护基团，所述方法包括：

(a)向血红蛋白溶液中加入能为血红蛋白的半胱氨酸提供巯基保护基团的试剂；和

(b)分离在其半胱氨酸上连接有巯基保护基团的血红蛋白。

83.一种通过以下工艺制备交联的四聚体血红蛋白的方法，该工艺包括：

(a)任选从在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的四聚体血红蛋白中除去氧；和

(b)交联所述血红蛋白。

84.如权利要求83所述的方法，其特征在于，所述在半胱氨酸上连接有巯基保护基团的所述四聚体血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

85.如权利要求83所述的方法，其特征在于，还包括从所述交联的四聚体血红蛋白中除去二溴水杨酸。

86.如权利要求83所述的方法，其特征在于，还包括加入缓冲液。

87.如权利要求83所述的方法，其特征在于，还包括包装所述交联的四聚体血红蛋白。

88.一种包含权利要求83、84或85所述产物的包装物。

89.一种通过给予有效量的权利要求2所述产物来治疗需要红细胞的哺乳动物的方法。

90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，治疗所述哺乳动物的贫血、贫血相关病症、缺氧或局部缺血。

91.如权利要求89所述的方法，其特征在于，治疗所述对象因失血所致的外伤。

92.一种治疗患病哺乳动物的方法，包括给予所述哺乳动物一组合物，所述组合物包含含铁的蛋白质化合物与药学上可接受的载体，所述含铁蛋白质化合物的分子量约60,000道尔顿-约500,000道尔顿并具有至少一个半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巯基保护基团，从而使得所述蛋白质化合物在所述半胱氨酸位点结合一氧化氮的能力降低。

93.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述含铁的蛋白质化合物是交联的四聚体血红蛋白。

94.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白是非热源性、无内毒素与无基质的。

95.如权利要求92所述的方法，其特征在于，用双3’，5’二溴水杨基延胡索酸酯交联所述血红蛋白。

96.如权利要求92所述的方法，其特征在于，通过与吡哆醛-5’-磷酸反应修饰所述血红蛋白。

97.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白是人血红蛋白。

98.如权利要求92所述的含铁蛋白质化合物，其特征在于，所述血红蛋白是牛或猪血红蛋白。

99.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团选自：4-吡啶基甲基、乙酰基氨基甲基、烷氧基烷基、三苯基甲基、羧酰胺基甲基、乙酰基、苄基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、对-羟基苯甲酰甲基、对-乙酰氧基苄基、对-甲氧基苄基、2，4-二硝基苯基、异丁氧基甲基、四氢吡喃基、乙酰氨基甲基、苯甲酰氨基甲基、双-碳乙氧基乙基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、N-烷基氨基甲酸酯与N-烷氧基烷基氨基甲酸酯。

100.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述巯基保护基团是羧酰胺基甲基。

101.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述化合物的氧递送能力提高。

102.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述化合物以约20mmHg-约45mmHg的p50转运氧。

103.如权利要求92所述的方法，其特征在于，通过植入、注射或输液给予。

104.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病选自贫血、贫血相关病症、缺氧和局部缺血。

105.如权利要求104所述的方法，其特征在于，肾脏衰竭、糖尿病、AIDS、化疗、放疗、肝炎、G.I.失血、铁不足或月经过多导致所述贫血和贫血相关病症。

106.如权利要求104所述的方法，其特征在于，还包括给予所述哺乳动物红细胞生成素治疗。

107.如权利要求104所述的方法，其特征在于，烧伤、中风、新发生的中风、暂时局部缺血发作、心肌昏厥与休眠、急性心绞痛、不稳定心绞痛、新发生的心绞痛或梗死导致所述局部缺血。

108.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是一氧化碳中毒。

109.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是术后恢复。

110.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病伤口愈合。

111.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是镰状细胞贫血。

112.如权利要求111所述的方法，其特征在于，在手术前进行所述给予。

113.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是急性冠状综合征。

114.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物需要输血。

115.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物受外伤。

116.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是因环境应激或身体应激所致的氧递送能力缺乏。

117.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述疾病是心源性休克。

118.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述给予与放疗一起实施。

119.如权利要求92所述的方法，其特征在于，还包括给予所述哺乳动物氧依赖性药物。

120.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物的所述给药运行在体内观察血管内空间。

121.如权利要求120所述的方法，其特征在于，还包括在给予所述哺乳动物之前再氧合所述含铁的蛋白质化合物。

122.一种灌注器官的方法，包括给予有效量的权利要求2所述产物。

123.如权利要求122所述的方法，其特征在于，体外进行所述给药。

124.如权利要求122所述的方法，其特征在于，离体进行所述给药。

125.如权利要求122所述的方法，其特征在于，还包括再氧合权利要求2所述产物。

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