FI104722B - Pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmenetelmä - Google Patents

Description

1 104722

Pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmenetelmä - En metod för framställning av pyridoxylerat hemoglobin Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa pyridoksiloitua 5 modifioitua hemoglobiinia. Tarkemmin, keksintö koskee sellaista menetelmää, joka on helpompi ja vaivattomampi suorittaa kuin tekniikan tasolla tunnetut menetelmät.

Hemoglobiini on punasolujen hapenkuljetusproteiini ja on 10 noin 30 % solusta. Proteiinissa on neljä yksikköä, kaksi ! alfa- ja kaksi beta-yksikköä, jotka ovat sidottu yhteen tetrameeriksi solun sisällä. Punasolujen sisäpuolella hemoglobiinia pidetään kahden α-ketjun ja kahden B-ketjun tetrameerinä. Kun hemoglobiini on vapaana plasmassa, se 15 dissosioituu ja kaksi dimeeriä (α B) sidotaan haptoglo- biiniksi. Vapaana plasmassa hemoglobiini lähtee verenkierrosta noin 3 h puoliintumisajalla.

Happiaffiniteettiä mukautetaan pH:11a, C02-konsentraati-20 olla ja 2,3-DPG- (2,3-difosfoglyseraatti) yhdisteellä, jota on saatavilla vain punasolun sisällä. Solun ulkopuolella hemoglobiinin happiaffiniteetti on korkea ja siksi kyky kuljettaa happea kudokseen on matala. Antigeenit, »Il jotka ovat sitoutuneet soluseinään, joka ympäröi hemoglo-25 ’· biinia, määrittävät sellaisia tekijöitä kuin veriryhmä, j Rh-tekijä ja muut. Soluseinäjäännöksiä, jotka saadaan ·· lyysauksen jälkeen, kutsutaan peruskudokseksi.

V · * f » ·

» i · t I

• .·;·. Punasolusubstituentteja kehitetään tällä hetkellä käytet- 30 täväksi hapen kuljetusnesteiksi. Teoksessa "Blood substi- - tues", toim.: Thomas H S Chang & Robert P Geyer; Marcel Dekker Inc. NY 1989 (ISBN 0-847-8027-2) on tämän hetkinen . , tilanne tiivistettynä.

• * » _ * I « - ------ — ------ » ·

• M

35* On tiedetty jo pitkään, että hemoglobiinilla solun uiko- * « puolella on hapenkuljetusominaisuuksia ja voidaan antaa • I » potilaille riippumatta heidän veriryhmistään. Hemoglobii- * ·

» * . II

• I i 104722 2 ni dissosioituu kuitenkin kehossa kahdeksi alfa-beta-yk-siköksi, mikä synnyttää munuaisen häiriötoiminnan. Vaikka tämä häiriötoiminta on käänteinen, se voi olla hyvin vakava potilaille, jotka jo ovat heikentyneessä tilassa.

5 Muita sivuvaikutuksia tiedetään myös tapahtuneen.

W R Amberson (Biol Rev 12 s 48 (1937)) käytti punasoluhe-molysaatteja veren korvikkeena. Se oli munuaista vahingoittava myrkky. Rabiner et ai (J Exp Med 126 s 1127 10 (1967)) ehdotti haitallisen vaikutuksen riippuvan perus- kudosjäännösten läsnäolosta. Jopa hemoglobiiniliuoksella, jossa ei ollut peruskudosta, oli kuitenkin vaikutuksia munuaisiin ja osoitettiin antavan ohimenevän laskun krea-tiniinin puhdistumassa ja virtsatilavuudessa (G S Moss et 15 ai; Surg Gynecol Obstet 142 s 357 (1976); De Venuto et ai; J Lab Clin Med 89 s 509 (1977) ja Savitsky et ai;

Clin Pharm Ther 23 s 73 (1978)).

Teoksessa Methods in Enzymology voi 76 (Hemoglobins)?

20 toimittajat S P Colowick, N O Kaplan, Academic Press NY

(1981) on kuvattu hemoglobiinimolekyylin eri tyyppisiä modifikaatioita. Benesch et ai; Biochemistry voi 11, nr.

19 s 3576-3582 (1972) kuvasivat modifikaation, joka on yleisimmin käytetty laskemaan happiaffiniteettia liittäkö; mällä pyridoksaali-5'-fosfaattia. Tämä stabilisoi hemo- globiinimolekyylin konfiguraatioon, joka on samanlainen kuin hemoglobiini-DPG- (difosfoglyseraatti) kompleksi pu- « nasolun sisäpuolella. Viime aikoina tätä bispyridoksaali- • · · tetrafosfaattia on käytetty tämän tyyppiseen modifikaa-*30* tioon (P E Keipert, A J Adenican,S Kwong & R E Benesch,

Transfusion 29, s 768-773 (1989)).

Muita yhdisteitä, esim. inositoli-heksafosfaattia, voi-daan myös käyttää hemoglobiinin modifikaatioon, jolloin :35: ' saadaan tuote, jolla on alhaisempi happiaffiniteetti.

,·'··’ Bonsen et ai ovat osoittaneet US-patenteissa 4 001 200; 4 001 401, 4 053 590 ja 4 061 736 erilaisia reittejä nos- 3 104722 taa hemoglobiinin molekyylipainoa ja täten stabilisoida lisää rakennetta, jotta lisätään hemoglobiiniin perustuvan veren substituutin näennäistä puoliintumisaikaa.

5 Annettaessa hemoglobiinivalmisteita on eräs ongelma vie lä absoluuttinen vaatimus, ettei näissä valmisteissa ole mikro-organismeja ja viruksia. Erityisesti, on näytetty, että viruksia voidaan siirtää verenluovuttajilta vastaanottajille.

10

Jos hemoglobiinissa olevat virukset on tarkoitus inakti-voida, kuumennetaan olennaisesti soluton hemoglobiiniliu-os 45-85°C:een, kun sitä pidetään sen deoksimuodossa. Tämä voidaan saavuttaa käyttämällä pelkistäviä aineita tai 15 pirskottamalla hemoglobiiniliuosta inertillä hapettomalla kaasulla. Tavallisesti virusten inaktivointi suoritetaan hemoglobiiniliuoksessa peruskudoksen poistamisen jälkeen ja ennen pyridoksilointivaihetta.

20 U.S. patenteissa nr. 4 826 811 ja 4 831 012 on kuvattu yksityiskohtaisemmin hemoglobiibin, jossa ei ole perusku-dosta, polymerisaatio ja virusten inaktivointi kuumuudella, mitkä esitykset on liitetty tähän viitteeksi. Nämä kaksi patenttia antavat perusteellisen katsauksen alan

25.; tilasta ja niissä on ruunsaasti tekniikan tason viittei- E

: , tä.

•

«•I

» |i’’. Tunnetuissa pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmene-

telmissä käytetään punaisia verisoluja lähtöaineena. En- I

I · · 3d ' sin nämä solut pestään ja sitten lyysaataan vedellä tai vesipitoisella puskurilla ja hemoglobiini vapautetaan pe-ruskudoksesta. Tämän jälkeen peruskudos erotetaan hemo- : globiiniliuoksesta, esimerkiksi mikrohuokossuodatuksella.

, «Il — • I — 3'd*: Kaikki aikaisemmat tutkijat ovat alkaneet menetelmänsä :

pesemällä punasolut suolaliuoksella, hypertonisilla suolaliuoksilla tai muilla puskureilla, jotta saadaan mah- L

• * ♦ * · » * » . 104722 4 dollisimman puhtaita punasoluja ennen solujen lyysausta. Lyysauksen jälkeen on tehty suuria ponnistuksia erottaa peruskudos ja jäännösproteiinit hemoglobiinista sentrifu-gaatiolla, ultrasentifugaatiolla ja/tai suodatuksella.

5 Joissakin kuvauksissa hemoglobiini on jopa kiteytetty en nen kuin se on käytetty raaka-aineena veren korvikkeeksi. Hemoglobiinin häviö on olennaista kaikissa käytetyissä vaiheissa.

10 Hemoglobiini, jossa ei ole peruskudosta, pyridoksiloidaan sen jälkeen pyridoksilointiaineella, kuten pyridoksaali-5'-fosfaatti, edullisesti puskurin läsnäollessa ja alle 10°C:een lämpötilassa. Prosessin aikana on pidettävä huoli, ettei reaktiosysteemissä ole happea, esimerkiksi pel-15 kistämällä reaktioliuosta inertillä kaasulla. Myös reaktion lopussa lisätään edullisesti pelkistävää ainetta, kuten natriumboorihydridi, pelkistettyyn liuokseen. Tällä tavalla saatua pyridoksiloitua hemoglobiinia, jossa ei ole peruskudosta, voidaan sitten polymerisoida, esimer-20 kiksi glutaraldehydillä.

Näillä tunnetuilla pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmenetelmillä on lukuisia haittapuolia. Joukko erilli-siä reaktiovaiheita on tarpeellisia, mitkä alentavat

• f I

25.: saantoa ja kasvattavat bakteerikontaminaation riskiä.

Runsaampi määrä prosessivaiheita lisää myös prosessin »Il kokonaiskustannuksia. Täten tunnetun prosessin ensimmäi-*!*'. sessä vaiheessa, s.o. punaisten verisolujen pesu, noin 30 • · t % tuotehäviöt ovat tavallisia. Pesuvaihe on myös melko • « · 3d * herkkä, koska verisolut ovat hyvin sensitiivisiä ja lisäksi bakteerikontaminaation riski on hyvin suuri, koska veri ja punaiset verisolut ovat erinomainen ravintoalusta mikro-organismeille. Tämä on tehnyt melkein mahdottomaksi suorittaa pesuvaihetta tehdasmaisessa mittakaavassa.

3 $'; Täten, on tarve prosessista, jossa valmistetaan pyridok-siloitua hemoglobiinia, jossa ei ehdottomasti ole mikro- • I I « ·

• I

· I

i ·

-I f I I

I · « 1 I « i i *

I I

i ] 104722 5 organismeja eikä viruksia, missä mainittu prosessi on yksinkertainen suorittaa ja jossa on pienempi määrä prosessivaiheita verrattuna tekniikan tason prosessien kanssa.

Tämä saavutetaan tämän keksinnön prosessilla.

5

Yllättäen on havaittu, että alla kuvatulla prosessilla voidaan lyysaus, kuumakäsittely ja pyridoksilointi yhdistää yhdeksi vaiheeksi hyvällä kokonaissaannolla. Pyridok-siloitua hemoglobiinia voidaan käyttää veren korvikkeen 10 tuottamisessa, esim. Shegal et ai mukaan, U.S. patentti 4 826 8111, joka on polymerisoitu glutaraldehydillä ja puhdistettu sisältämään vain pienen määrän tetrameeriä (< 2 %) tai dimerisoidun tai polymerisoidun hemoglobiinin tuottamisessa muilla tunnetuilla menetelmillä.

15 Tämän keksinnön mukaisesti pyridoksiloitu hemoglobiini valmistetaan antamalla vesipitoinen suspensio punaisia verisoluja tai hemoglobiinia, jossa ei olennaisesti ole peruskudosta, lisäämällä kemiallista pelkistävää ainetta 20 ja pyridoksaali-5'-fosfaattia ja kuumentamalla täten saa tua reaktioseosta lämpötilassa, joka on 20-85°C, 0,5-15 h ajan.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa on mahdol- * « « 35; lista käyttää punaisten verisolujen suspensiota suoraan lähtömateriaalina niin, että tekniikan tason pesuvaihetta vältetään. Sen jälkeen tapahtuva pelkistävän aineen li- : * -

säys, pyridoksilointi ja kuumennuskäsittely voidaan kaik- I

I ) r ki suorittaa samassa reaktioastiassa ilman mitään väli- = f t · •30 erotus- tai muita luomisvaiheita. Täten keksinnön proses si on olennaisesti yksi-vaiheinen, yksi-astia-prosessi, mikä on prosessin suuri yksinkertaistaminen ja antaa vähentyneen riskin tuotehäviöistä ja mikro-organismi- ja ' • » ’ 5/·; viruskontaminaatioista.

M· ; 35* “

On myös mahdollista käyttää lähtömateriaalina verisoluja, joille on tehty lyysaus ja joista peruskudos on poistettu (Ml = • · I _ r · I — ' I I = < » · · .

6 104722 täydellisesti tai osittain. Tässä tapauksessa solut voidaan, mutta niitä ei tarvitse pestä etukäteen. Täten e-dellä mainitut edut saadaan myös tämän keksinnön suoritusmuodossa .

5

Vaikka ei ole toivottua rajoittaa keksintöä millään teorialla, on oletettu että pyridoksilointivaiheessa muodostunut reaktiotuote on Schiffin emäs, joka normaalisti on epästabiili. Tekniikan tason prosessissa tämä emäs on 10 stabilisoitu sen jälkeen tapahtuvalla natriumboorihydri- dilisäyksellä. Tämän keksinnön prosessissa kuitenkin ensin lisätty pelkistävä aine tekee ympäristön riittävästi pelkistäväksi stabiloimaan Schiffin emäksen, joka muodostui pyridoksilointivaiheessa. Hemoglobiini pidetään myös 15 sen pelkistävässä muodossa, mikä on tarpeellista pyridok- silointireaktiolle ja mikä on myös riittävän stabiili, ettei se denaturoidu kuumennusvaiheessa. Pyridoksiloinnin ja kuumennuksen jälkeen saatu tuote on riittävän stabiili käytettäväksi polymerisaatiovaiheessa.

20

Kun liuoksessa oleva hemoglobiini ja vielä läsnäolevat punasolut altistetaan kuumennusvaiheelle, jäännössolut lyysautuvat ja pyridoksilaatioreaktio, jossa on vapaa pelkistetty hemoglobiini, on täydellinen samaan aikaan :25; kuin läsnäolevat virukset on inaktivoitu ja muut ei-hemo- :··: globiiniproteiinit denaturoidaan ja saostetaan. Tämä te- kee sellaisten proteiinien poistamisen helpoksi ja on ·· keksinnön prosessin lisäetu. Voidaan myös huomata, että .·. : kuumennusvaiheen aikana läsnäolevalla pelkistävällä ai- » · · ,345. neella on tavallisesti bakterisidisia ominaisuuksia ja myötävaikuttaa mikro-organismien inaktivaatioon.

Pyridoksilaatio ja kuumennus pitäisi suorittaa pelkistetyissä olosuhteissa varmistamaan, että hemoglobiini pide-;33: tään sen pelkistetyssä muodossaan. Pelkistävän aineen läsnäolo reaktioalustassa varmistaa, että pelkistynyt .···. ympäristö ylläpidetään ja tämä tarkoittaa, että reaktio- m 104722 7 alustan yläpuolella olevan ilmakehän ei tarvitse ehdottomasti olla hapetonta. Tämä on keksinnön prosessin toinen tärkeä etu. Myös kun pyridoksilaatio ja kuumennus on kerran suoritettu, ei pelkistettyjen olosuhteiden vaatimus 5 ole enää niin ehdoton seuraavissa vaiheissa.

Pyridoksiloidun hemoglobiinin polymerisaatio voidaan suorittaa kirjallisuudesta tunnetuilla tavoilla, kuten aikaisemmin mainittu US-A-4 826 811. Ennen polymerisaatiota 10 voidaan lisätä suola, joka muodostaa saostuman pelkistä vän aineen kanssa, kuten liukoinen kalsiumsuola, esimerkiksi kalsiumkloridi ja mahdollisesti puskuriaine, kuu-mennusvaiheesta olevaan reaktioseokseen saostamaan sellaiset suolat kuin sulfiitti, minkä jälkeen saostuneet 15 materiaalit poistetaan, esimerkiksi sentrifugoimalla.

Jäljelle jääneestä liuoksesta poistetaan liuenneet suolat, esimerkiksi geelisuodatuksella tai dialyysillä. Sa-ostamiselle vaihtoehtona voidaan myös suorittaa suolan-poistoprosessi. Polymerisaatio suoritetaan sitten tunne-20 tulla tavalla käyttämällä tunnettua reagenssia, kuten glutaraldehydiä, tai muita kirjallisuudessa hemoglobiinin dimerisaatioon tai polymerisaatioon kuvattuja aineita.

Keksinnön prosessissa sopiva lähtömateriaali on tuore tai :25^ vanhentunut punasolujen konsentraatti, s.o. punasolut, ·:·: joita on varastoitu liian pitkään, jotta niille annettai- siin lupa transfuusioon. Tuoretta tai vanhentunutta ihmi- sen verta voidaan myös käyttää. Punasolut suspendoidaan .·. : kylmään vesipitoiseen alustaan, kuten vesi, jossa ei ole • ·« — jp| kuumetta aiheuttavaa ainetta, ja lämpötila voi nousta huoneenlämpötilaan käsittelyn aikana. Vesipitoisen alustan määrä ei ole kriittinen ja voi olla 1-20 tilavuutta, r edullisesti noin 5 tilavuutta, solususpensiotilavuutta " kohti. Sitten vesipitoinen suspensio puskuroidaan noin : •35: pH:hon 8, esimerkiksi lisäämällä dinatriumvetyfosfaattia

: noin 0,03 M pitoisuuteen. On tietysti myös mahdollista I

.. käyttää puskuriliuosta suoraan suspensioalustana veriso- : * · 8 104722 luille. Tässä suspensiossa verisolut ovat osittain lyy-satut.

Sitten lisätään kemiallinen pelkistävä aine puskuroituun 5 solususpensioon. Pelkistävänä aineena voidaan käyttää di- tioniittia, bisulfiittia, metabisulfiittia tai alkalime-talli- tai ammoniumsulfiittia. Näistä aineista on natri-umditioniitti edullinen. Pelkistävää ainetta lisätään riittävä määrä varmistamaan, että kaikki hemoglobiini on 10 pelkistyneessä muodossa ja pidetään pelkistyneet olosuh teet koko prosessin aikana. Edullinen pelkistävä aine, natriuraditioniitti on niin vahvasti pelkistävä, ettei se vaadi hapetonta ilmakehää reaktioastiassa. Muut mainitut pelkistävät aineet voidaan pitää niiden pelkistävässä 15 voimassaan olennaisesti hapettomalla ilmakehällä reaktio- astiassa. Ammattimies voi helposti määrittää tässä suhteessa tarpeelliset reaktio-olosuhteet.

Yleisesti, pelkistävää ainetta lisätään sellaisena määrä- 20 nä, joka vastaa hemoglobiinin ja pelkistävän aineen vä listä molaarista suhdetta 1:5-1:100, ja sitten edullisesti 1:10-1:60. Natriumditionaatille on noin 0,03 M pitoisuus osoittautunut olevan sopiva.

25: Pyridoksilaatiota varten solususpensioon, jossa on pel- kistävä aine, lisätään pyridoksiloiva aine, kuten pyri-doksaali-5'-fosfaatti. Pyridoksaali-5'-fosfaatti voidaan • lisätä liuoksena, tavallisesti puskurissa, edullisesti [·*': TRIS-puskuri. Pyridoksaali-5'-fosfaatti lisätään yleensä « · · 30.' määränä, joka vastaa hemoglobiinin ja pyridoksaali-5'- fosfaatin välistä molaarista suhdetta 1:1-1:12 ja sitten edullisesti 1:4-1:8. Hemoglobiinin ja pyridoksaali-5'-fosfaatin välinen molaarinen suhde noin 1:6 on osoittautunut olevan sopiva.

35·: : Pyridoksilaatioprosessi on täydellinen kuumennuskäsitte- .···. lyn aikana. Pyridoksilaatioreaktion aika voi olla noin • · • · · « · · « i -.=:= i *:*·: 3 104722 9 0,5 - noin 10 h riippuen prosessin spesifisistä yksityiskohdista ja laitteista.

Pyridoksiloinnin aikana hemoglobiini altistetaan kuumen-5 nuskäsittelylle. Tässä käsittelyssä virukset ja mikro- organismit inaktivoidaan suureksi osaksi ja ei-hemoglo-biini-proteiinit seostetaan myös suuressa määrin, mikä helpottaa niiden sen jälkeistä poistoa. Verisolujen lyy-saus tehdään myös täydellisesti. Kuumennuskäsittelyn ai-10 kana hemoglobiinin pitäisi olla pelkistetyssä muodossa ja tämä varmistetaan tavallisesti pelkistävän aineen läsnäollessa. Lämmitys pitäisi suorittaa 20-85°C:een lämpötila-alueella, edullisesti 60-80°C ja erityisesti noin 70°C: ssa, noin 10 h ajan. Lyhyempiä tai pidempiä aikoja voi-15 daan myös käyttää ja ammattimiehen pätevyyteen kuuluu määrittää sopiva käsittelyaika yksinkertaisten mikro-organismien tai virusten läsnäolon määrän osoittamiseksi rutiinitestien perusteella.

20 Koska pelkistävää ainetta on vielä läsnä reaktioalustassa kuumennusvaiheen aikana, tämä myötävaikuttaa ylläpitämään pelkistävät olosuhteet tämän vaiheen aikana. Lisäksi läsnä voi olla ilmakehä inerttiä, hapetonta kaasua, kuten typpi tai argoni, vaikka tämä ei aina ole ehdottoman tar-:25; peellista.

:*. _ Voidaan myös huomata, että edullisella pelkistävällä ai- neella, natriumditioniittilla, on voimakkaan bakterisidi-set ominaisuudet. Tämä myötävaikuttaa bakteerien inakti-

i i · Z

vointiin.

» t · _ • · i

Kuumennusvaiheen jälkeen reaktioseosta pitäisi käsitellä sellaisten materiaalien kuin epäorgaanisten suolojen, in- ^

aktivoitujen mikro-organismien ja denaturoitujen ei-hemo- L

\}5; globiiniproteiinien poistamiseksi. Tätä varten voidaan : : : lisätä suolaa, joka muodostaa saostuman käytetytyn pel- ^ kistävän aineen kanssa, kuten liukoinen kalsiumsuola, e-

• I

10 104722 simerkiksi kalsiumkloridi. Puskuroivaa ainetta voidaan mahdollisesti myös lisätä. Lisäksi tai vaihtoehtona reak-tioseoksesta voidaan poistaa suola, esimerkiksi geelisuo-datuksella tai dialyysillä.

5

Kun on käytetty edullista pelkistävää ainetta, natriumdi-tioniittia, voidaan lisätä kalsiumkloridia esimerkiksi noin 0,03 M pitoisuuteen saostamaan muodostuneet sulfidit ditioniitista, seuraavaksi tapahtuvan suolanpoistokäsit- 10 telyn jälkeen. Reaktioalusta sentrifugoidaan sitten saos tuneiden orgaanisten ja epäorgaanisten materiaalien poistamiseksi. Tämän jälkeen liuenneet suolat voidaan poistaa sellaisilla prosesseilla kuin geelisuodatus tai dialyysi.

15 Pyridoksilaation jälkeen kohdistetaan täten käsitelty he moglobiini polymerisaatiolle. Tämä polymerisaatio suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla ja on kuvattu esimerkiksi US-A-4 826 811:ssä. Polymerisaatioaineena on käytetty dialdehydiä, edullisesti glutaraldehydiä vesipitoi- 20 sessa liuoksessa. Yksi tapa suorittaa polymerisaatio on järjestää glutaraldehydiliuos ja pyridoksiloitu hemoglo-biiniliuos kummallekin puolelle puoliläpäisevää kalvoa. Glutaraldehydi voi kulkea membraanin läpi, kun taas suuret hemoglobiinimolekyylit eivät voi ja tällä tavalla saadaan kontrolloitu polymerisaatioreaktio. Reaktiota jatketaan, kunnes polymeeri on saavuttanut sopivan mole-kyylipainon. Tämä voi kestää 10 h asti.

« ♦ t *

Puhdistuksen jälkeen saadussa hemoglobiinipolymeerissä ei • · % 3Λ* ole olennaisesti ei-toivottua hemoglobiinitetrameeriä ja

I « I

’·* * siinä ei ole enempää kuin noin 2 paino-% tätä tetrameeriä perustuen hemoglobiinin kokonaismäärään. Tuotteessa ei siksi ole olennaisesti haitallisia sivuvaikutuksia, jotka liittyvät tetrameeriin.

:T Polymerisaation jälkeen saatu hemoglobiinituote voidaan .!/ formuloida sopivaan annosmuotoon annettavaksi potilaille.

• « • I ·

< I I

9 * * * * * m 11 104722

Sellaisissa annosmuodoissa voi myös olla lisäaineita, jotka tunnetaan hyvin sellaisina alalla.

Keksintöä kuvataan lisää seuraavilla esimerkeillä, jotka 5 eivät kuitenkaan toimi rajoittamaan keksintöä sen puit teissa.

Esimerkki 1: 100 g:aan punaisia verisoluja, joissa oli noin 30 g hemo-10 globiinia, lisättiin 500 ml 0,03 M dinatriumvetyfosfaat- ti-liuosta pH:ssa 8,5. Tämän jälkeen lisättiin natriumdi-tioniittia määränä, joka antoi 0,03 M pitoisuuden, joka vastaa hemoglobiinin ja natriumditioniitin moolista suhdetta noin 1:32 ja pyridoksaali-5'-fosfaattia liuotettuna 15 TRIS-puskuriin, säädettynä pH:n 8,5. Hemoglobiinin ja py ridoksaali-5 '-fosfaatin välinen moolinen suhde säädetään l:6:ksi. Tässä vaiheessa hemoglobiinin pitoisuus on noin 3,5 paino-%, jossa on noin 1 paino-% methemoglobiinia ja 97-99 paino-% pelkistettyä hemoglobiinia.

20

Saatua reaktioseosta kuumennetaan sitten noin 70°C:ssa noin 10 h suljetussa lasiastiassa. Kuumennuskäsittelyn jälkeen methemoglobiinipitoisuus on 1-2 paino-% ja pyri-doksiloidun hemoglobiinin saanto on noin 96 %.

;2S; : ·;·· Edellä olleet reaktiot suoritettiin suljetussa astiassa ;·. ja pelkistävä ympäristö turvataan natriumditioniitin läs- näololla. Kuumakäsittelyn jälkeen seuraavat vaiheet voi- c *”\ daan kuitenkin suorittaa avonaisesti ilman läsnäollessa • · · I Cl s 30. ja edullisesti noin 5°C lämpötilassa.

» * : _ • « — »

Reaktioseokseen lisätään kuumennusvaiheen jälkeen kal-siumkloridia 0,03 M pitoisuuteen. Tämä saostaa sulfiitin, joka muodostui natriumditioniitista, yhdessä ei-hemoglo-35 biiniproteiinien kanssa, jotka on denaturoitu kuumennus- käsittelyn aikana. Saostetut materiaalit poistetaan sent-rifugaatiolla. Tämän vaiheen jälkeen methemoglobiinin pi-

f I

MM. -- 12 104722 toisuus on noin 2 paino-% ja 50-80 % hemoglobiinista on transformoitu oksihemoglobiiniksi.

Hemoglobiiniliuoksesta poistetaan sitten suola Sephadex1 5 G-25-pylväässä (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka on ta sapainotettu 0,14 M NaCl;llä.

Pyridoksiloidun reaktion saannon on havaittu olevan 100 %, elektroforeesin mukaan, ja P50 02:lle on 22-25 torria.

10 Hillin vakio on 2,0-2,2. Kromatografisessa analyysissä tuote täsmää kirjallisuuden pyridoksiloidun hemoglobiinin tietojen kanssa.

Saatu pyridoksiloitu hemoglobiini voidaan sitten polyme-15 rimerisoida glutaraldehydin kanssa sinänsä tunnetulla ta valla, esimerkiksi kuten kuvattiin U.S. patentissa nr.

4 826 811.

Esimerkki 2 20 100 g punaisia verisoluja pestiin 3 x 500 ml:11a suola liuosta. Sentrifugaation jälkeen pestyt solut lyysattiin lisäämällä 500 ml tislattua vettä ja peruskudos poistettiin sentrifugaatiolla ja suodatuksella.

:25 Liuokseen lisättiin dinatriumvetyfosfaattia ja natriumdi- : tioniittia, kumpaakin määränä, joka antoi 0,03 mol/1 pi- ·· toisuuden. Tämän jälkeen lisättiin pyridoksaali-5'-fos- » · ♦ · : faattia määränä, joka antoi noin 1:6 mooliseksi suhteeksi • · hemoglobiinin ja pyridoksaali-5'-fosfaatin välille ja • · » 30 saatua liuosta kuumennettiin suljetussa astiassa 70°C:ssa io h.

Lisättiin kalsiumkloridia saostamaan sulfaatit ja sulfii- • « · ’ " tit, jotka olivat muodostuneet reaktiossa ja sentrifugaa- :,35 tion jälkeen hemoglobiiniliuoksesta poistettiin suola ultrasuodatuksella tai kromatografiällä.

”* · * * 13 104722 Määritettiin ΡΜ 02:lle ja havaittiin olevan 25 torria.

Hillin vakio oli 2,0-2,2. Elektroforeesilla osoitettiin, että pyridoksaali-5'-fosfaatin liittyminen oli täydellinen.

5

Tyypilliset arvot liuokselle olivat seuraavat:

Cu CO-Hb Met-Hb Pelk. Hb (Hb=hemoglobiini) 97 % 0,5 % 1,0 % 1,5 % 10

Esimerkki l

Esimerkki 2 toistettiin, eroina että verisolut lyysattiin 10 tilavuudessa vettä ja että peruskudos suodatettiin pois. Sitten suodos puskuroitiin dinatriumvetyfosfaatilla 15 0,03 M pitoisuuteen ja pH:hon 8,5.

Pyridoksaali-5'-fosfaattia lisättiin vesipitoisena liuoksena sen pH:n ollessa säädettynä 8,5:een, TRIS-puskuria ei käytetty 20

Saadulla hemoglobiinituotteella oli samat ominaisuudet kuin esimerkissä 2 olleet.

9 Γ • · ♦ -...... Γ

IMI

* · • · t V · · · • · · * · · - 9 · · 1 • · · —

9 · L

Claims (11)

14 104722

1. Förfarande för framställning av pyridoxylerat hemo- 25 globin i en process i ett steg och i en behällare, k ä n- ~ v netecknatav att tili en vattenhaltig suspension ;·. av röda blodceller eller av väsentligen stromafritt hemo- • ·« globin sättes ett kemiskt reduKtionsmedel och pyridoxal 5'-fosfat, varefter den erhällna reaktionsblandningen • te ’· " 3 0 värmes vid en temperatur mellan 20 och 85°C under en tid V 1 av 0,5 tili 15 timmar.

1. Menetelmä valmistaa pyridoksiloitua hemoglobiinia yksivaihe, yksi-astia-prosessissa, tunnettu siitä, että vesipitoiseen punaisten verisolujen suspensioon tai 5 hemoglobiiniin, jossa ei olennaisesti ole peruskudosta, lisätään kemiallista pelkistävää ainetta ja pyridoksaali-5'-fosfaattia, minkä jälkeen saatua reaktioseosta kuumennetaan 20-85°C:een lämpötilassa 0,5-15 h aika.

2. Förfarande enligt patentkrav l, känneteck-n a t av att reduktionsmedlet utgöres av ett ditionit, 35 bisulfit, metabisulfit eller sulfit av en alkalimetall • · eller av ammonium. Ϊ « - • 1_ • · 1 - • · 1 • · · • r · · - 16 104722

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että pelkistävä aine on ditioniitti, bisulfiitti, metabisulfiitti tai alkalimetalli- tai am-moniumsulfiitti.

3. Förfarande enligt patentkrav l eller 2, kanne-tecknatav att reduktionsmedlet utgöres av natrium-ditionit. 5 4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, k ä n- netecknatav att reaktionsblandningen värmes vid en temperatur mellan 60 och 80°C, företrädesvis vid ca 70°C, under en tid av ca 10 timmar. 10 5. Förfarande enligt patentkrav 1, känneteck- n a t av att det kemiska reduktionsmedlet tillsättes i en mängd som svarar mot ett molförhällande mellan hemoglobi-net och reduktionsmedlet frän 1:5 tili 1:100, företrädesvis frän 1:10 tili 1:60. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistävä aine on natriumdi-tioniitti.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene- 20 telmä, tunnettu siitä, että reaktioseosta kuumen netaan 60-80°C:ssa, edullisesti noin 70°C:ssa noin 10 h ajan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- '"25 n e t t u siitä, että pelkistävä aine lisätään määränä, joka vastaa hemoglobiinin ja pelkistävän aineen välistä *:· moolista suhdetta 1:5-1:100, edullisesti 1:10-1:60. « *·· • » « · t • · · • ·

6. Förfarande enligt patentkrav l, känneteck- n a t av att pyridoxal-5'-fosfatet tillsättes i en mängd som svarar mot ett molförhällande mellan hemoglobinet och pyridoxal-5'-fosfatet frän 1:1 tili 1:12, företrädesvis 20 frän 1:4 tili 1:8.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- ♦ · · *30 n e t t u siitä, että pyridoksaali-5'-fosfaatti lisätään määränä, joka vastaa hemoglobiinin ja pyridoksaali-5'-fosfaatin välistä moolista suhdetta 1:1-1:12, edullisesti 1:4-1:8. • · # · · • « i « · :.:3^ 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen mene- « telmä, tunnettu siitä, että pelkistävät olosuhteet pidetään reaktioalustassa reaktioiden aikana. 15 104722

7. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-6, k ä n-netecknatav att reducerande betingelser upprätt-hälles i reaktionsmediet under reaktionerna. 25 . . 8. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-7, innefat- tande det följande steget att tili reaktionsblandningen • sättes ett sait som bildar en fällning med reduktionsmed-let, företrädesvis kalciumklorid, och eventuellt en buf- • · · 30 fertsubstans, och/eller reaktionsblandningen underkastas 4 4 0 en avsaltningsbehandling, varefter utfällda material fränskiljes. • · · • · · • * · V v : 9. Förfarande enligt patentkrav 8, känneteck- 35. a t av att efter avlägsnandet av utfällda material och • · olösta salter, hemoglobinet dimeriseras eller polymerise-ras. i · • · · « · · . « » · " · · I * « · 17 104722

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, mihin sisältyy lisävaihe, että lisätään reaktio-seokseen suolaa, joka muodostaa saostuman pelkistävän aineen kanssa, edullisesti kalsiumkloridi ja mahdollisesti 5 puskuroiva aine ja/tai altistetaan reaktioseos suolan- poistokäsittelylle, minkä jälkeen saostuneet materiaalit erotetaan.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet-10 t u siitä, että hemoglobiini dimerisoidaan tai polymeri- soidaan sen jälkeen, kun saostuneet materiaalit ja ei-liuenneet suolat on poistettu.

10. Förfarande enligt patentkrav 9, känneteck-n a t av att hemoglobinet dimeriseras eller polymeriseras med glutaraldehyd.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-15 t u siitä, että hemoglobiini dimerisoidaan tai polymeri- soidaan glutaraldehydillä.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että polymerisoitu hemoglobiinin hemoglobiini- 20 tetrameerisisältö on vähemmän kuin 2 paino-% hemoglobiinin kokonaismäärästä. . ^ P"' Pa h pnflcrav

11. Forfarande enligt patentkrav 9,känneteck- n a t av att det polymeriserade hemoglobinet har en hait av hemoglobintetramer som är mindre an 2 viktprocent av total mängden hemoglobin. * 4 • * • ·4 4 m »M «··« • · • > · • 44 • ( « « · • · » 4 • »« • · · • 4 · i « i l | : « * I I • I • · 1 f • I * • · • I I • 4 4 • I | · 1 4 · *» 4 • «