CN101711255A - 具有改变的电子传递途径的修饰珠蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰的卟啉基载氧蛋白如血红蛋白，发现在其未修饰状态下具有一个电子传递的低亲和性位点以及一个经由一个或多个蛋白质氨基酸在还原剂和四价铁血红素铁之间的高亲和性电子传递。本发明提供这样的包含增强这种途径的修饰的蛋白。

Description

具有改变的电子传递途径的修饰珠蛋白
技术领域
本发明涉及修饰的载氧化合物(氧载化合物，oxygen-carryingcompound)例如血红蛋白及它们的应用。
背景技术
用捐献的血对患者输血具有许多缺点。首先，可能缺少患者的血型。第二，存在捐献的血可能被诸如肝炎病毒和HIV这样的传染原(病原体，infectious agent)污染的危险。第三，捐献的血保存期限有限。另外，存在一些其中血液可能不容易获得的情形，例如战场上或国内紧急事件的情形。
输血的一种替代方案涉及使用血液代用品。血液代用品是一种也可提供对于保持血容量必要的渗透压的载氧溶液。最近研究了两种类型的代用品，即氟碳代血液(氟碳乳剂，fluorocarbon emulsion)和血红蛋白溶液。
存在于红细胞中的血红蛋白由两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链构成，它们各自载有一个血红素分子。一条α样珠蛋白链和一条β样珠蛋白链结合而形成非常稳定的二聚体(dimer)。α样和β样珠蛋白基因属于相关珠蛋白基因家族，其在不同发育阶段被表达并受氧张力、pH和从胚胎到胎儿到新生儿的发育所调控。然后两个二聚体以反平行方式排列而形成四聚体。二聚体结合而形成四聚体不如单体结合而缔合成二聚体那么强。因此，四聚体具有分解而形成二聚体的趋势且在四聚体、二聚体和单体之间总是存在一个平衡。在高浓度珠蛋白下，主要形式是四聚体；通过稀释，二聚体变成主要形式。由于结合力部分是静电的，所以这种平衡也受溶剂、盐、pH和其它因素影响。
然而，使用天然的血红蛋白作为血液代用品存在阻碍。首先，需要大剂量，需要大量生产蛋白，其通过重组方式或者来自捐献的人血液或回收的非人血液。第二，获得无传染原和有毒物质的血红蛋白很重要。第三，尽管血红蛋白通常是68,000分子量的四聚体，但它可以分解而形成α-β二聚体。该二聚体被肾快速清除，并且对于无细胞血红蛋白来说停留时间太短而不能用作血液代用品。
已经采取几种方法以克服这些困难。这些方法包括通过重组DNA系统表达血红蛋白、化学修饰血红蛋白、以及生产血红蛋白变体。血红蛋白及其变体在包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞如CHO细胞的各种细胞体系中被表达。
已知血红蛋白的许多天然变体。这些变体包括：自动聚合的变体、阻止四聚体分解的变体、以及在碱中稳定的变体。还有超过30种具有降低的氧亲和性的天然血红蛋白变体。这样的变体的若干实例在WO88/091799中披露。
改善血红蛋白使用的另一种方法是通过加入其他聚合物而修饰该蛋白，从而改善血液中该蛋白的稳定性。例如US 5,900,402描述了使用非抗原性聚合物，优选聚环氧烷(聚氧化烯烃或聚烷撑氧，polyalkylene oxide)或聚乙二醇。
因为血红蛋白(和实际上的肌红蛋白或其它载氧蛋白)涉及氧的运输和储存，由于具有这种功能(因为蛋白的卟啉环中存在的铁离子的氧化还原性质)，它们负责生成反应活性氧物种。含氧衍生物(Fe(II))的自动氧化导致生成非功能性的三价铁血红素(ferrichaem)(Fe(III))和超氧化物离子(O2 -)，其随后歧化而生成H2O2。这些物种最终能够损害蛋白和/或血红素基团。在导致这种破坏的途径中的一个重要中间体是四价铁血红素(ferry haem)(Fe(IV)＝O2-)本身，其是通过血红素与H2O2和脂过氧化物的反应形成的。蛋白/卟啉基自由基阳离子(P+·)伴随从三价铁血红素和过氧化氢生成四价铁血红素，如化学方程式(1)中列出的：
P-Fe(III)+H2O2→P·+Fe(IV)＝O2-+H2O    (1)
尽管它们短暂存在，但是四价铁血红素和自由基也可能是有极大毒性的。这些氧化级联可能是损害性的，因为：(i)过氧化氢是一种已知产生细胞损伤的强氧化剂，(ii)四价铁血红素和蛋白质基自由基都可以通过夺取氢原子而引发脂质、核酸和氨基酸的氧化，以及(iii)血红素修饰可以导致产生对蛋白交联物种的高毒性血红素以及导致血红素损失和“游离”铁的释放。
特别是当蛋白从红细胞的保护性环境取出时，存在对于血红蛋白介导的过氧化损伤的趋势。这将会例如在自发性溶血或在溶血性贫血(例如镰状细胞贫血)期间发生。已经表明，正是通过这种过氧化机制，而不是如以前所认为的通过游离铁催化的Fenton化学(Holt et al，(1999)Increased lipid peroxidation in patients withrhabdomyolysis.Lancet 353，1241；Moore，et al(1998)A causativerole for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinizationin the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis-induced renalfailure.J.Biol.Chem.273，31731-31737)在挤压性损伤(横纹肌溶解)后，肌红蛋白诱导肾损伤。
最近还表明，当在蛛网膜下腔出血中从红细胞释放时，血红蛋白能够在体内引起类似的损伤(Reeder，et al(2002)Toxicity ofmyoglobin and haemoglobin：oxidative stress in patients withrhabdomyolysis and subarachnoid haemorrhage.Biochem.Soc.Trans.30，745-748)。此外，不受控制的无细胞血红蛋白(作为血液代用品开发)的血红素介导的氧化反应已作为毒性重要的潜在途径出现，或者直接地或者通过与细胞信号转导途径相互作用(Alayash，A.I.(2004)Oxygen therapeutics：can we tame haemoglobin？Nat.Rev.Drug Discovery 3，152-159)。在缺血/再灌注的内皮细胞培养模型系统[McLeod，L.L.and Alayash，A.I.(1999)Detection of aferryl-haemoglobin intermediate in an endothelial cell model afterhypoxia-reoxygenation.Am.J.Physiol.277，H92-H99]以及在缺少它们的抗氧化剂机制如谷胱甘肽的细胞(D’Agnillo & Alayash(2000)Interactions of haemoglobin with hydrogen peroxide alters thiol levelsand course of endothelial cell death.Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.279，H1880-H1889)中，已经证实四价铁血红蛋白的毒性。
四价铁血红蛋白可能引起细胞损伤，包括细胞调亡和坏死的细胞死亡。已经表明，用化学修饰的血红蛋白灌注大鼠肠，引起局部氧化性应激，导致放射性标记的白蛋白的肠系膜泄漏(Baldwin et al(2002)Comparison of effects of two haemoglobin-based O2 carriers onintestinal integrity and microvascular leakage.Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.283，H1292-H1301)。重要地，这种血红蛋白的氰根络合物衍生物，其中用氰化物阻断血红素铁且不能用来进入氧化还原反应，不产生细胞变化。
US 5,606,025描述了血红蛋白结合到超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶，作为减少再灌注损伤和其它与血红蛋白血液代用品相关的自由基介导过程的一种方法。
发明内容
我们的研究进一步详细考察了在血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)中产生四价铁(IV)物种的机制以及这种离子负责产生氧化性应激的机制。
我们已经发现，来自某些物种(包括人)的肌红蛋白和血红蛋白表现出两种截然不同的从外部还原剂到四价铁血红素铁的电子传递途径。低亲和性途径(通常＞5mM)表示从还原剂到在蛋白的疏水性袋(pocket)中的四价铁血红素铁的直接电子传递。第二种高亲和性途径(通常＜100μM，但经常＜10μM)涉及在还原剂和四价铁血红素铁之间经由一个或多个蛋白质氨基酸的电子传递。这种高亲和性通过蛋白途径(high affinity through-protein pathway)在天然人肌红蛋白和血红蛋白α亚基(亚单位，subunit)中存在，但在人血红蛋白β亚基和海兔(海螺，Aplysia)肌红蛋白中缺乏。允许这种电子传递的氨基酸的实例分别是肌红蛋白和血红蛋白α链中的Tyr103和Tyr42。
我们的发现是基于通过我们已经观察到具有抗氧化性的许多铁螯合剂在还原四价铁Mb方面观察到的共性。这些还原剂对四价铁衰变的速率常数的影响作为还原剂浓度的函数绘图显示为可以表示为双直角双曲线函数的复合曲线。现在我们还发现，更多的传统还原剂例如抗坏血酸盐也表现出这种双直角双曲线浓度依赖性。这两种双曲线表示对还原剂具有不同亲和性的两个结合位点。通过使用动力学模型，模拟和使用所选的天然蛋白和工程改造蛋白，我们将这种浓度依赖性解释为表示从还原剂到血红素铁的两种截然不同的电子传递途径。
尽管在血红蛋白的α链和在肌红蛋白中存在，但是这种高亲和性途径看起来没有在相当于位置42处缺少酪氨酸残基的其它卟啉基载氧蛋白同样的活性。这对于β血红蛋白尤其如此。
根据本发明，我们提出通过引入相当于(等同于)Tyr42的氨基酸、或能够对四价铁离子构成高亲和性电子传递途径的任何其它残基，而将这种途径引入到这样的蛋白中。这样的修饰将增高四价铁离子通过该途径被还原的能力。有效地，这样的修饰暴露四价铁离子，使得这种离子可以更快地被还原，由此降低它损害周围组织或底物如脂质的能力。
因此，本发明提供了一种修饰的卟啉基(porphyrin-based)载氧蛋白，其中所述蛋白包含对四价铁离子增强或引入高亲和性电子传递途径的修饰。
蛋白优选是血红蛋白β链(Hbβ)。修饰可以是针对Phe41，特别是其中Phe41被Tyr取代。
本发明还提供编码这些蛋白的核酸、它们的生产方法以及这些蛋白在治疗方法中的应用。本发明的这些和其它方面在以下进一步描述。
附图说明
图1：不同肌红蛋白物种利用还原剂去铁酮(deferiprone)的浓度依赖性四价铁还原。马肌红蛋白(●)，但不是海兔肌红蛋白(■)，显示出双直角双曲线(double rectangular hyperbola)浓度依赖性。
图2：重组抹香鲸肌红蛋白利用还原剂去铁酮的浓度依赖性。野生型抹香鲸肌红蛋白(◆)，但不是抹香鲸肌红蛋白，的Tyr103＞Phe突变体(▲)，显示出双直角双曲线浓度依赖性。
图3：提出的用于还原具有高亲和性通过蛋白的电子传递途径的血红素蛋白的两个位点模型。还原剂(xH)以亲和性KD1和KD2结合到以其四价铁氧化态形式(P-[Fe(IV)＝O2-]2+，其中P表示蛋白)的肌红蛋白上的两个可能的位点上。仅从这两个位点可以发生从还原剂到四价铁的电子传递。该高亲和性结合位点位于或靠近酪氨酸103(PxH-[Fe(IV)＝O2-])，允许电子((kmax≈0.01s-1)通过蛋白传递到四价铁血红素铁而生成三价铁蛋白(P-Fe(III))。低亲和性位点位于该血红素袋中，允许电子直接在还原剂和四价铁血红素(P-[Fe(IV)＝O2-]xH)之间传递。这个模型也允许两个位点被还原剂(PxH-[Fe(IV)＝O2-]xH)填充。对于动力学模拟来说，假定在一个位点上的结合不影响结合到第二个位点的亲和性。该模型也包括一个其中氧化的还原剂可以再生的步骤。
图4：残基的位置，通过与已知来自结晶结构的马肌红蛋白(C)的电子通道残基Tyr103比较，该残基可以在α人血红蛋白(A)、β人血红蛋白(B)中引入或消除通过蛋白的电子传递。马肌红蛋白的Tyr103靠近血红素且表面暴露，使它理想地用作从外部还原剂到四价铁血红素铁的电子通道。人血红蛋白α亚基在大致同样的空间环境中具有酪氨酸(Tyr42)，然而，在人血红蛋白β中这个残基是氧化还原惰性的苯丙氨酸。
图5：通过抗坏血酸盐的野生型四价铁人血红蛋白还原的浓度依赖性。四价铁肌红蛋白(10μM)在pH7.4的磷酸钠中与抗坏血酸盐反应。通过拟合到双指数函数中来计算对于α亚基(●)和β亚基(○)的四价铁还原速率常数。α亚基，但不是β亚基，显示出双直角双曲线浓度依赖性。
图6：通过抗坏血酸盐的重组α-Tyr＞Val四价铁人血红蛋白还原的浓度依赖性。四价铁肌红蛋白(10μM)在pH7.4的磷酸钠中与抗坏血酸盐反应。通过拟合到双指数函数中来计算α亚基(●)和β亚基(○)的四价铁还原速率常数。α亚基和β亚基都显示出单一的直角双曲线浓度依赖性。
图7：通过抗坏血酸盐的重组α-Tyr42＞Trp四价铁人血红蛋白还原的浓度依赖性。四价铁肌红蛋白(10μM)在pH7.4的磷酸钠中与抗坏血酸盐反应。通过拟合到双指数函数中来计算α亚基(●)和β亚基(○)的四价铁还原速率常数。α亚基和β亚基都显示出单一的直角双曲线浓度依赖性。
具体实施方式
卟啉基载氧蛋白(porphyrin-based oxygen-carrying protein)
卟啉基载氧蛋白是指其中以其天然形式带有卟啉分子并且其多肽单独或以复合体携带并释放结合于该卟啉分子的氧的任何多肽链。这样的蛋白的变体例如野生型卟啉基载氧蛋白的天然或合成突变体也被本发明考虑。
卟啉基载氧蛋白在它天然状态下将缺少在血红蛋白α亚基，例如SEQ ID NO：1的蛋白或它的哺乳动物同系物中存在的高亲和性氧传递途径。这种途径经由包括在C螺旋的位置7处的酪氨酸残基的电子传递途径介导的(如本领域已知的，血红蛋白亚基蛋白也参照单个的螺旋或交叉螺旋残基的残基进行编号，如下表1中列出的(基于US 5,028,588，其内容结合于此作为参考)。因此人血红蛋白α链的Tyr42在本领域也鉴定为残基C7。相应地，在其它血红蛋白α链中的等效残基也将是在C7位置。该途径是一个经由一个或多个蛋白质氨基酸在还原剂和四价铁血红素铁之间的电子传递。这种高亲和性通过蛋白途径存在于天然人肌红蛋白和血红蛋白α亚基中，但在人血红蛋白β亚基中缺乏。
待进行修饰的载氧蛋白包括哺乳动物血红蛋白亚基，但可以包括其中蛋白被改变成携带氧的非哺乳动物血红素蛋白和其它遗传改造蛋白。这些蛋白将是重组的，具有改变的序列(氨基酸残基的取代，但也可以包括残基的插入)，以引入从在大量溶液中的还原剂到血红素四价铁的高亲和性通过蛋白的电子途径。
可以预期，通过在诸如人血红蛋白β亚基的蛋白中引入高亲和性途径，我们将能够通过允许与血液代用品一起给予的还原剂如抗坏血酸盐、尿酸盐或去铁酮更快地减少这些血红素蛋白的高毒性四价铁氧化态，并由此限制底物如脂质和DNA的氧化，而降低血液代用品的毒性。
因此，本发明可用于在其天然状态不具有高亲和性途径的任何血红蛋白亚基。一方面，该蛋白是人血红蛋白β链，其序列如以下SEQ ID NO：2列出。可以使用的其它血红蛋白亚基是那些在相当于残基42/C7的位置上不具有酪氨酸残基的脊椎动物或无脊椎动物血红蛋白亚基。
脊椎动物血红蛋白包括哺乳动物血红蛋白。哺乳动物血红蛋白是特别高度保守的。人β链的类似物的实例包括β珠蛋白超家族的成员，例如分别在血红蛋白F(HbF)或血红蛋白A2(HbA2)中发现的γ或δ血红蛋白。这样的类似物的这些或其它非限制性实例包括表2的哺乳动物物种类似物，它们也都具有Phe42残基。可以从在线数据库，包括通过Research Collaboratory for StructuralBioinformatics的蛋白质数据库(pdb)获得这些序列。这些pdb参考提供了用于血红蛋白β家族亚基蛋白以及在可应用的情况下的相应α亚基蛋白的序列。该β家族亚基序列可以与其相应的α亚基使用或单独使用，或与另一个β家族亚基蛋白联合使用。
表2
Figure G2008800215311D00101
其它脊椎动物血红蛋白α亚基类似物包括具有相当于Phe42的残基的鸟类、爬行类和鱼类血红蛋白。这样的亚基的非限制性实例包括表3中给出的那些，其在第3列中指出了类似于哺乳动物β链亚基的Phe42的氨基酸残基的位置
表3
 物种   PDB Code   与Phe 42相当的残基
 鸟类：
 斑头雁(Anser indicus)   1A4F   Phe41
 灰雁(Anser anser)   1FAW   Phe41
 鸡(Gallus gallus)   1HBR   Phe41
 爬行类：
 巨型乌龟(陆龟，Geochelonegigantean)   1V75   Phe41
 鱼类：
 赤魟(Dasyatis akajei)   1CG5   Phe42
 南极鱼(Pagothenia bernacchii)   1PBX   Phe42
在节肢动物或其它多细胞生物(例如软体动物，线虫蠕虫和非线虫蠕虫)以及那些单细胞生物中，可以鉴定其它无脊椎真核生物β血红蛋白类似物。
载氧蛋白的修饰
通过取代或插入可以修饰载氧蛋白以引入高亲和性电子传递途径。
特别地且如图5中所描述的，血红蛋白β亚基的苯丙氨酸位于邻近于血红素且表面暴露，使它理想地充当从外源还原剂到四价铁血红素铁(如果它是氧化还原活性基团)电子通道。因此本发明提供了一种插入或取代，从而在类似的位置提供氧化还原活性残基。
该氧化还原活性氨基酸可以例如是酪氨酸、色氨酸或组氨酸。特别地优选酪氨酸。
因此一方面，本发明提供一种哺乳动物β珠蛋白亚基，其被修饰以在蛋白中定位(放置，locate)一个氧化还原活性残基，以使蛋白表现出高亲和性电子传递途径。通过显示该蛋白对还原剂具有双直角双曲线浓度依赖性，可以观测到该途径的存在。
一方面，C7位置被取代从而引入氧化还原活性氨基酸，特别是上述提到的那些。可替换地，该β珠蛋白亚基可以包括一个插入以将该残基引入到蛋白中，例如C螺旋中，例如在C6残基和C7残基之间，或在C7残基和CD1残基之间。这样的插入可以进一步结合该蛋白的C螺旋的进一步修饰例如C1-C6位置中的残基的缺失或取代。
可以使用分子模型化方法以鉴定哺乳动物血红蛋白β链中的其他位置，其也位于四价铁血红素铁附近且可以被取代以引入氧化还原活性氨基酸。
其它修饰
在一个实施方式中，除了野生型载氧蛋白的弱化修饰外，该蛋白可以包含一个或多个(例如1-5个，例如1或2个)另外的取代，或1-5个例如1、2或3个氨基酸(其可以是相邻的或非相邻的)的缺失或插入。这些可以是这样的改变，其影响该蛋白的其他性能如它的氧亲和性或协同性，稳定性和组装速率的增强，血红素流失速率或自动氧化速率的降低，或对蛋白水解降解和聚集的抗性，它与氧化氮的结合或它通过重组方式以可溶形式生产的能力。这样的修饰在本领域本身是已知的且可以整合于本发明的蛋白中。
在一个优选的方面，该修饰是降低氧化氮(NO)的结合的修饰。大量限制NO结合同时仍然允许氧传输的血红蛋白变体是已知的。具有降低的与氧化氮反应的速率的许多血红蛋白β链的变体在US 6,455,676中披露，其内容结合于此作为参考。
特别地，除了弱化修饰外，以下改变可以包括在载氧蛋白中：
B13(Leu＞Phe或Trp)；G12(Leu＞Phe或Trp)；B10(Leu＞Phe)和E4(Val＞Leu)；B10(Leu＞Trp)和E4(Val＞Leu)；B14(Leu＞Phe或Trp)；G8(Leu＞Phe)和G12(Leu＞Trp)；E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Trp)；E11(Val＞Trp)和G8(Leu＞Met)；E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Phe)；E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Met)；E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Ile)；E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Phe)；E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Trp)；E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Met)；E11(Val＞Met)和G8(Leu＞Trp)；E11(Val＞Met)和G8(Leu＞Trp)和E7(His＞Gln)；E11(Val＞Trp)和G8(Leu＞Ile)；E7(His＞Gln)和E11(Val＞Trp)；E7(His＞Gln)和E11(Val＞Leu)；E7(His＞Gln)和E11(Val＞Phe)；E7(His＞Gln)和E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Phe或Trp)；E7(His＞Gln)和E11(Val＞Leu或Trp)和G8(Leu＞Phe或Trp)；E11(Val＞Trp或Phe)和G12(Leu＞Trp或Met)；E11(Val＞Trp或Phe)和B13(Leu＞Trp或Met)；B10(Leu＞Trp)和B13(Leu＞Trp或Met)；B10(Leu＞Phe)和B13(Leu＞Trp)；B10(Leu＞Trp或Phe)和G12(Leu＞Trp)；B10(Leu＞Phe)和G12(Leu＞Met)；G8(Leu＞Trp)和G12(Leu＞Trp或Met)；或G8(Leu＞Trp)和B13(Leu＞Trp或Met)。
上面使用的编号是基于螺旋链编号，其可以参照对人β链的表1的一级序列编号。在其它载氧蛋白中在相当的位置也可以做这些修饰。
蛋白多聚体
在一个实施方式中，载氧蛋白以多聚体的形式存在。这样的形式可以延长血液循环中蛋白的寿命，改善载氧能力或降低副作用。
在血红蛋白β亚基蛋白的情况下，这样的形式包括四聚体血红蛋白。在这种形式下，两个β链可以与两个α链形成四聚体。可选地，两个或多个亚基可以例如通过化学交联或作为重组表达的结果而彼此共价连接。
该α链可以是野生型α链，即SEQ ID NO：1的人α链或同源脊椎动物或无脊椎动物α链。脊椎动物α链包括哺乳动物、鸟类、爬行类和鱼类α链。这样的α链包括发现的与上述表2-4中提及的β链结合的那些，且它们的序列可以从pdb登录(pdb entry)获得。
α链可以包含一个或多个(例如1-5个，例如1或2个)另外的取代，或1-5个例如1，2或3个氨基酸(可以是相邻的或不相邻的)的缺失或插入。这些可以是影响该蛋白的其他性能的改变，例如与其他蛋白的相互作用、与氧化氮的结合或易于通过重组方式生产。
在一方面，该α链可以被修饰以例如通过缺失或通过用氧化还原惰性残基取代而在去除位置42的酪氨酸残基。这里作为氧化还原惰性残基考虑的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
对α链考虑的修饰与氧化氮结合的特别改变包括：E11(Val＞Leu)和E7(His＞Gln)；E11(Val＞Phe或Trp)和E7(His＞Gln)；E11(Val＞Phe或Trp或Leu)和E7(His＞Gln)和G8(Leu＞Phe或Trp)；B10(Leu＞Phe)和E4(Val＞Leu)；B10(Leu＞Trp)和E4(Val＞Leu)；B10(Leu＞Trp)和E7(His＞Gln)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Phe)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Trp)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Trp)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Phe)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Trp)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Phe)和G8(Leu＞Ilc)；B10(Leu＞Trp)和E7(His＞Gln)和E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Trp)；B10(Leu＞Trp)和E11(Val＞Trp)和G8(Leu＞Trp)；E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Phe)；E11(Val＞Leu)和G8(Leu＞Trp)；B13(Met＞Phe或Trp)；G12(Leu＞Phe或Trp)；或B14(Phe＞Trp))。
上面使用的编号是基于螺旋链标号，其可以参照对于人α链的表1的一级序列编号。在其他载氧蛋白中的相应位置也可作这样的修饰。
也可以提供彼此和/或与其他载氧蛋白共价或非共价结合的其他更高级形式。例如，聚合的血红蛋白亚基链或交联的链在本领域本身是已知的并且这些方法可以应用于本发明。
保护基团
在另一方面，本发明的载氧蛋白，无论是单体形式或多聚体形式，都可以轭合(结合)于一个保护基团。各种类型的保护基团在本领域同样是已知的且可以在本发明中使用。在保护基团是一种蛋白的情况下，该保护基团可以作为一种融合体产生，例如在该载氧蛋白的N-端或C-端。可替换地，该蛋白可以与载氧蛋白共表达或分别表达，并且这两个蛋白利用交联剂通过化学方式结合。
例如，一类保护基团是酶促抗氧化蛋白。这些包括过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)。可以使用任何适宜的过氧化氢酶或SOD，尽管优选地这些是人类酶。这些酶可以重组地或通过本领域常用的任何其他方式生产。
US 5,606,025，其内容整合于此作为参考，描述了这样的酶与血红蛋白的轭合并且这样的方法可以用于本发明。因此可以使用以前报道的任何适宜的惰性交联试剂，其适用于制备用作载氧复苏液(oxygen-carrying resuscitative fluid)的交联血红蛋白，例如为戊二醛，琥珀酰水杨酸衍生物(diasprin derivative)，包括来源于寡糖的氧化性开环的聚醛，二磷酸酯，三磷酸酯等。感兴趣的酶具有类似于在血红蛋白的珠蛋白链上的那些化学基团，以便当它通过与交联剂的反应使它们发生交联时，它们将适当地化学结合到血红蛋白上。
载氧蛋白和酶促抗氧化蛋白的相对量可以在宽范围内变化，其中载氧蛋白占据主要成分。基于载氧蛋白的重量，酶的总重量适宜在0.1-10％的大致范围，且优选地在0.5-2.5％大致范围。如在一个实施方式中，当SOD和过氧化氢酶都化学结合到聚血红蛋白时，SOD对过氧化氢酶的重量比率适宜为约1∶1-5∶1，且优选地为约1.5∶1-2.5∶1。
也可以用作上述酶促基团或在可替代方案中的另一类保护基团是无抗原性的聚合物基团，例如聚环氧烷保护基团。这样的基团也可以用在单体载氧蛋白上或用于为二聚体或更高形式的这些蛋白上。
例如US 5,900,402，其内容整合于此作为参考，描述了聚环氧烷，最优选地聚乙二醇(PEG)与载氧蛋白的轭合。
该轭合优选地通过聚环氧烷的羟基末端与载氧蛋白的赖氨酸残基的自由氨基基团的共价键接而形成。例如参见美国专利5,234,903，其披露了mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯-Hb轭合物。用于轭合聚合物与载氧蛋白的其他方法在本领域同样也是已知的，如通过经由酰胺或酯键接，也适用于本发明。虽然优选血红蛋白赖氨酸的ε氨基基团修饰，但也考虑其他轭合方法。可以通过血红蛋白和聚合物之间的任何原子的共价键接。此外，也考虑例如亲脂性或亲水性相互作用的非共价轭合。
另外的适用于共价轭合载氧蛋白的活化聚合物的实例在美国专利5,349,001、5,321,095、5,324,844和5,605,976以及PCT公开WO95/11924和WO96/00080中描述，将各自的披露内容结合于此作参考。
轭合物优选包括聚乙二醇(PEG)作为聚环氧烷。该聚环氧烷包括单甲氧基-聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物等。聚合物也可以用C2-4烷基代替单甲氧基基团在远端进行帽化。
为了适用于本文，聚环氧烷必须在室温下可溶于水。可以使用(数均)分子量为约200-约100,000Da的聚环氧烷链。例如优选的PAO具有约1,000-约30,000的分子量，而更优选具有约2,000-约25,000分子量的PAO。一些特别优选的本发明的轭合物包括具有约5,000Da分子量的聚环氧烷链。
无抗原性聚合物基团的链的数目对载氧蛋白的比率可以为约1∶1-约20∶1，优选地约5∶1-15∶1，例如约10∶1。这些链可以是上文限定的尺寸范围。
总之，轭合之前载氧蛋白单体的分子量是约17,000Da。在这样的蛋白轭合至如上所述的无抗原性聚合物基团的情况下，轭合物为蛋白(即，载氧蛋白或该蛋白和酶促基团的轭合物)重量的约30％-60％，例如约45％-55％，其余是无抗原性的聚合物基团。
因此，本发明的一个示例性实施方式是本发明载氧蛋白与45％-55％重量的分子量约2,000-约25,000的聚环氧烷的轭合物。在该实施方式的一方面，载氧蛋白可以是其中修饰在Phe41处的血红蛋白β链。在该实施方式的另一方面，聚环氧烷是PEG。在进一步的方面，载氧蛋白是其中减弱修饰在Phe41处的血红蛋白α链且聚环氧烷是PEG。
在上述实施方式中，载氧蛋白可以是单体形式或两个或多个单元的聚合物的形式。
组合物
本发明的载氧蛋白理想地配制成一种组合物，其包含生理学可接受的载体，适合给予哺乳动物，特别是人。一般地，这样的载体是一种无菌溶液，其包含在储存期间用于保持溶液的生理pH和稳定性的缓冲剂和防腐剂。这些载体可以是例如汉克溶液(Hank’ssolution)或林格溶液(Ringer’s solution)、生理盐水、由盐水和葡萄糖构成的混合物、以及肝素化的柠檬酸钠-柠檬酸-葡聚糖溶液等的生理学相容性缓冲液。本发明的载氧蛋白可以与胶体状血浆代用品和血浆扩容剂如线性多糖(例如，葡聚糖)、羟乙基淀粉、平衡的流体凝胶以及其他血浆蛋白进行混合。另外地，载氧蛋白可以与水溶性、生理学可接受的聚合物血浆代用品混合，其实例包括聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙稀吡咯烷酮、和环氧乙烷-聚丙二醇缩聚物。
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种具有抗氧化性能的化合物。这些化合物可以包括抗坏血酸盐和尿酸盐。抗氧化剂可以包括在任何合适浓度的，其可以根据目标用途和抗氧化剂的性质而改变。例如，尿酸盐的适宜浓度可以在50-400μM的范围内，且对于抗坏血酸盐为50-200μM，尽管根据需要可以使用更低或更高的量。
组合物还可以包括铁螯合剂，其在螯合通过载氧蛋白分解释放的铁方面起作用。这样的铁螯合剂的实例包括去铁胺(desferrioxamine)和去铁酮。铁螯合剂或其混合物可以以例如10-5000uM的浓度存在。
载氧蛋白的给予
本发明的蛋白可以用作血液代用品。存在许多其中需要对氧水平的恢复、保持或替换有用的疾病。这些疾病包括创伤；缺血(例如心脏病发作、中风或脑血管损伤引发的缺血)；其中需要血液代用品来替代手术前去除的血液的血稀释；感染性休克；癌症(例如，将氧递送到含氧量低的肿瘤块内核)；慢性贫血；镰状细胞贫血；心脏停搏；和缺氧症。因此本发明的载氧蛋白及其组合物可以用于治疗上述疾病的方法中。
本发明的载氧蛋白及其组合物也可离体用于器官灌注中。血液代用品在器官灌注中特别地有用，在需要在移植前在离体的器官中维持氧含量从而保持在可接受状态。器官包括心脏、肝、肺、肾。
考虑到患者疾病的特性和治疗方案，在上述任一种方法中使用的本发明载氧蛋白的浓度和量要根据医生的意见。一般地，载氧蛋白可以0.1-6g/dl，例如0.1-4g/dl的浓度使用。载氧蛋白通常静脉内给予。
也考虑共同给予无毒试剂以增强氧化氮产生(例如，精氨酸)。
核酸
本发明也提供编码本发明的修饰载氧蛋白的核酸。该核酸可以是DNA或RNA。DNA可以是单链或双链的。
本发明的核酸可以是分离和/或纯化的形式，或者没有或基本上没有与它天然相关的物质，例如除了可能的一个或多个用于表达的调控序列外，没有或基本上没有侧挂人类基因组中的基因的核酸。
一般地，本发明的核酸通过修饰编码载氧蛋白的野生型序列而可以获得。野生型血红蛋白和其他载氧蛋白的核酸序列在本领域是已知的且可以广泛地得到。一般地，例如定点突变这样的重组技术可以用于修饰已知的野生型序列，以使该序列编码本发明的修饰载氧蛋白。
哺乳动物核酸的野生型序列也可以被修饰以优化在异源体系中，例如在细菌或酵母细胞中的表达的密码子用途。
本发明的核酸可以整合入重组可复制载体中。该载体可以用于在相容宿主细胞中复制核酸。因此进一步的实施方式中，本发明提供了一种制备本发明的核酸的方法，其通过向可复制载体中引入本发明的核酸；向相容宿主细胞中引入该载体；以及在可以导致载体复制的条件下生长该宿主细胞。
优选地，载体中本发明的核酸可操作地连接一个控制序列，其能够提供用于通过宿主细胞表达编码序列，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”指其中所述组分以允许它们以其期望方式发挥作用的关系连接(结合，juxtaposition)。控制序列“可操作地连接”到编码序列是以该编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式连接。
可以选择或构建合适的载体，含有适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、增强子序列，标记基因和其它适当的序列。载体可以是适当的质粒、病毒如噬菌体噬粒或杆状病毒、粘粒、YAC、BAC或PAC。载体包括基因治疗载体例如基于腺病毒的、腺相关病毒、逆转录病毒(例如HIV或MLV)或α病毒载体的载体。
载体可以提供有复制起点，可选地用于表达载氧蛋白的启动子和可选地该启动子的调控子。载体可以含有一个或多个可选择的标记基因，例如在细菌质粒情况下的氨苄西林抗药性基因或对于哺乳动物载体的新霉素抗药性基因。载体可以体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。用来在各种各样的不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。适宜的宿主细胞包括细菌、真核细胞例如哺乳动物和酵母、以及杆状病毒系统。本领域可获得的用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞和许多其它的细胞。
可以选择启动子和其它表达调控信号以与表达载体设计的宿主细胞相容。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH启动子、裂殖酵母(S.pombe)nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括可以引入对重金属例如镉响应的金属硫蛋白启动子。也可以使用例如SV40巨大T抗原启动子或腺病毒启动子等的病毒启动子。所有的这些启动子在本领域中很容易得到。
载体可以包括其它序列例如启动子或增强子以驱动插入的核酸、核酸序列的表达，从而作为融合体和/或编码分泌信号的产生载氧蛋白，以使在宿主细胞中产生的多肽从细胞分泌出来。
用于生产用于基因治疗的本发明多肽的载体包括带有本发明微小基因序列的载体。
宿主细胞以及载氧蛋白的生产
根据本发明的宿主细胞例如以上提及的那些，可以在导致载氧蛋白表达的条件下进行培养，随后通过回收蛋白从而提供为基本上分离形式的蛋白。
为了提供功能性载氧蛋白，在回收期间或回收之后，蛋白可以用血红素源产生，或蛋白可以与适宜的血红素源例如二价铁-原卟啉或三价铁原卟啉(高铁血红素)混合。
例如US 5,801,019，其内容结合于此作为参考，描述了在酵母细胞中各种修饰血红蛋白，包括血红蛋白亚基的多聚体的表达和回收。这样的方法可以用于本发明产生载氧蛋白。
在载氧蛋白是血红蛋白β链亚基的情况下，它可以与互补亚基例如α链亚基共表达。共表达蛋白可以是单独蛋白的形式或是与β链亚基的融合体。
在表达之后，利用包括但不限于层析(例如离子交换、亲和性和分筛柱层析)、离心、差异溶解度的标准方法，或用于纯化蛋白的任何其它标准技术来回收蛋白。
实施例
进一步通过下面的实施例来描述本发明
实施例1：
通过四价铁还原动力学测定，来自马但不是海兔的肌红蛋白具有高亲和性通过蛋白(throug-protein)的电子传递途径。
在本实施例中，动力学检测来自不同物种的肌红蛋白的四价铁血红素还原到三价铁血红素蛋白的动力学，以确定存在或不存在高亲和性通过蛋白途径。依照该工艺步骤，来自Sigma-Aldrich(Poole，Dorset，UK，通过凝较过滤进一步纯化)的三价铁马肌红蛋白，或在5mM磷酸钠pH7.4中的重组三价铁海兔肌红蛋白Mb(20μM)在25℃下与H2O2(20μM)反应15min。这时，通过加入硫化钠(1mM)测定，三价铁肌红蛋白到四价铁肌红蛋白的转化率超过95％。加入过氧化氢酶(10nM)以除去未反应的H2O2并且继续反应另外的1min。在使用的pH下，四价铁血红素蛋白在几小时内是稳定的。然后以1∶1体积比将还原剂加入到0.1M磷酸钠pH7.4中，以使四价铁肌红蛋白的最终浓度为10μM。在使用其他强缓冲液(例如0.1M醋酸钠，pH5)四价铁血红素不稳定的情况下，pH可以“跳到”其他值。光谱跟踪直到反应完成。利用最小二乘法，将时间过程(425nm-408nm)拟合到单指数函数。然后这些速率常数作为还原剂浓度的函数绘图，且将该分布拟合(最小二乘法)到双直角双曲线(图1)：
k obs = k a [ S ] [ S ] + K D 1 + k b [ S ] [ S ] + K D 2 + A R
其中ka和kb是每一个双曲线的最大速率，而KD1和KD2是解离常数，S是还原剂浓度，而AR是四价铁自动还原的速率常数。
还原剂浓度对来自马的四价铁肌红蛋白还原观察到的速率常数变化的依赖性显示出双直角双曲线依赖性，这在海兔肌红蛋白中没有观测到。来自马的肌红蛋白在位置103和146处具有两个酪氨酸残基，而海兔肌红蛋白没有酪氨酸残基。
实施例2：
靠近血红素的酪氨酸残基对于高亲和性通过蛋白电子传递途径是关键。
野生型和重组抹香鲸肌红蛋白以及重组Tyr103＞Phe抹香鲸肌红蛋白与过氧化氢反应，并且如实施例1中所述测定通过去铁酮的四价铁血红素还原的动力学。通过蛋白电子传递途径(在野生型抹香鲸肌红蛋白中很明显)在Tyr103＞Phe突变体中没有观测到(图2)。这表明存在连接血红素和外部环境的氧化还原活性酪氨酸对于高亲和性途径是关键成分。
图1和图2的数据可以用一种双位点模型合理地说明，其中还原剂(xH)以亲和性KD1和KD2结合至以其四价铁氧化态(P-[Fe(IV)＝O2-]2+，其中P表示蛋白，图3)的肌红蛋白上的两个可能位点。电子从还原剂到四价铁的电子传递仅从这两个位点发生。高亲和性结合位点位于或靠近Tyr103(PxH-[Fe(IV)＝O2-])，允许电子通过蛋白传递(kmax≈0.01s-1)到四价铁血红素铁，从而产生三价铁蛋白(P-Fe(III))。低亲和性位点位于允许电子在还原剂和四价铁血红素(P-[Fe(IV)＝O2-]xH)之间直接传递的血红素袋中。该模型也允许两个位点被还原剂(PxH-[Fe(IV)＝O2-]xH)填充。为了动力学模拟，假设在一个位点是的结合将不影响与第二个位点结合的亲和性。该模型包括其中被氧化的还原剂可以再生的一个步骤。该模型也允许预测其它基于晶体结构的血红蛋白。与肌红蛋白相比，人血红蛋白α亚基的结构在类似空间位置(Tyr42)显示一个邻近血红素的酪氨酸，且它表面暴露，使其理想地充当从外部还原剂到四价铁血红素铁的电子途径(图4)。人血红蛋白β中对应的残基是氧化还原惰性的苯丙氨酸。因此该模型预测，人血红蛋白α亚基但不是β亚基将具有高亲和性通过蛋白的电子传递途径。
实施例3：
人血红蛋白的异源亚基表现出不同的四价铁还原机制。
重组人血红蛋白与过氧化氢反应且如实施例1中所述测定被抗坏血酸盐的四价铁血红素还原的动力学。四价铁血红素还原的时间过程不是如肌红蛋白观测的单指数，但可以利用产生两个速率常数的双指数函数描述，一个速率常数代表观察到的α亚基的四价铁还原的速率常数，而另一个代表观察到的β亚基的四价铁还原的速率常数。四价铁还原的动力学(图5)显示，这些亚基对还原剂与仅具有一个血红蛋白亚基(指定为α亚基)行为极不相同，表现出具有高亲和性电子传递途径。
实施例4：
α-Tyr42的定点突变消除高亲和性通过蛋白的电子传递途径，降低了四价铁血红素还原速率。
利用定点突变生成α基因的突变体。在表5(见下)中可以找到引物序列。在PCR反应中根据供应商的说明书使用高精确度酶PhusionTM(Finnzymes)或者Pfu UltraTM(Stratagene)，使用如下PCR程序：95℃2min；95℃30s；55℃1min；72℃5min；16个循环；72℃10min。然后利用Dpnl(Fermentas)消化模板DNA并利用标准工艺步骤将突变的质粒转化到大肠杆菌BL21 DE3中。所得的克隆体用BigDye terminator v.3.0(Applied Biosystems)测序以确证正确的序列。
含有编码修饰α链的质粒的大肠杆菌进行生长培养并利用标准方法回收修饰的α链，基本上如以下实施例5中所述。
表4用于定点突变的引物序列
  名称  序列(5’-3’)
  aY42V正向  CCTTCCCAACCACCAAAACCGTGTTCCCACACTTTGATCTG(SEQID NO：3)
  aY42V反向  CAGATCAAAGTGTGGGAACACGGTTTTGGTGGTTGGGAAGG(SEQID NO：4)
  aY42随机正向  CCTTCCCAACCACCAAAACCNNKTTCCCACACTTTGATCTG(SEQID NO：5)
  aY42随机反向  CAGATCAAAGTGTGGGAAMNNGGTTTTGGTGGTTGGGAAGG(SEQID NO：6)
具有α-Tyr42＞Val(图6)或α-Tyr42＞Trp(图7)突变的重组人血红蛋白与过氧化氢反应，并且如实施例1中所述测定通过抗坏血酸盐的四价铁血红素还原的动力学。在两种突变体中，在失去高亲和性通过蛋白途径的情况下，对α亚基四价铁还原速率影响是显著的，如通过没有第一个双曲线所证实的。因此α-Tyr42突变为部分氧化还原活性的色氨酸在10μM抗坏血酸盐浓度下降低了α亚基四价铁还原速率2倍，且α-Tyr42突变为氧化还原惰性的缬氨酸在10μM抗坏血酸盐浓度下降低α亚基四价铁还原速率12倍。
实施例5：
Hbβ链的定点突变。
使用上面实施例4中所述的方法，利用如下引物对来形成对人血红蛋白β链的β链突变，以引入β-Phe41＞Tyr突变。
  名称   序列(5’-3’)
 bF41Y正向   CCGTGGACCCAGCGTTACTTTGAATCCTTCGGTG(SEQ ID NO：7)
 bF41Y反向   CACCGAAGGATTCAAAGTAACGCTGGGTCCACGG(SEQ ID NO：8)
人血红蛋白α和β链的基因被优化以在大肠杆菌中表达并克隆入载体pETDuet中，导致生成HbpETDuet。如上所述，利用定点突变生成α和β基因的突变体。在PCR反应中根据供应商的说明书，使用高精确度酶Phusion(Finnzymes)或者Pfu Ultra(Stratagene)，其中使用如下的PCR程序：95℃2min；95℃30s；55℃1min；72℃5min；16个循环；72℃10min。然后模板DNA用Dpnl(Fermentas)消化且用标准的工艺步骤将突变的质粒转化到大肠杆菌BL21 DE3种。所得的克隆体用BigDye terminator v.3.0(AppliedBiosystems)测序以确认正确的序列。
带有质粒HbpETDuet的大肠杆菌BL21 DE3在含有1L TB培养基和100μg/ml羧卞西林的2L烧瓶中，在37℃和120rpm下生长培养直到OD620≥1。然后通过加入0.1mM IPTG诱导血红蛋白的表达。而且加入0.3mM δ-氨基乙酰丙酸和CO气体以提高蛋白产率。诱导后将培养条件变为22℃和60rpm。收获细胞并在超声处理之前，在10mM NaP的缓冲液pH6.0中再悬浮。利用具有CM琼脂FF(GEHealthcare)的离子交换层析纯化血红蛋白。样品上柱后，用10mMNaP缓冲液pH6.0清洗直到吸收率返回到基线。用70mM NaP缓冲液pH7.2洗脱血红蛋白并用VivaSpin柱(Vivascience)浓缩。然后浓缩的样品用洗脱缓冲液施加到Sephacryl S-200凝较过滤柱(GEHealthcare)。如上浓缩含血红蛋白的馏分并在-80℃储存直至使用。
测试包含突变的α和β链的重组血红蛋白，以证明高亲和性电子传递途径从α链转移到β链。
表1
人血红蛋白A0的氨基酸序列和螺旋残基标志
Figure G2008800215311D00271
Figure G2008800215311D00281
序列：
SEQ ID NO：1(Hbα)
  1 vlspadktnv kaawgkvgah ageygaeale rmflsfpttk tyfphfdlsh gsaqvkghgk
 61 kvadaltnav ahvddmpnal salsdlhahk lrvdpvnfkl lshcllvtla ahlpaeftpa
121 vhasldkfla svstvltsky r
SEQ ID NO：2(Hbβ)
  1 vhltpeeksa vtalwgkvnv devggealgr llvvypwtqr ffesfgdlst pdavmgnpkv
 61 kahgkkvlga fsdglahldn lkgtfatlse lhcdklhvdp enfrllgnvl vcvlahhfgk
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Claims (21)

1.一种修饰的卟啉基载氧蛋白，所述蛋白在其未修饰状态下包含一个电子传递的低亲和性位点以及一个经由一个或多个蛋白质氨基酸在还原剂和四价铁血红素铁之间的高亲和性电子传递，其中所述蛋白包含一个对所述铁离子增强或引入高亲和性电子传递途径的修饰。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其是哺乳动物血红蛋白链亚基。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其是β链亚基或所述β链超家族的成员。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其是人β、γ或δ链。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其通过取代Phe41进行修饰。
6.根据权利要求5所述的蛋白，其中所述修饰是Phe41＞Tyr。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其通过插入一个氨基酸进行修饰。
8.根据权利要求7所述的蛋白，其中所述插入是将氧化还原活性氨基酸插入到血红蛋白的C-螺旋中。
9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其包含降低NO结合的非野生型残基。
10.一种蛋白，包含权利要求1-9中任一项所述的蛋白的二聚体、四聚体或多聚体。
11.根据权利要求10所述的蛋白，其中所述二聚体、四聚体或多聚体是交联的。
12.一种蛋白，包含两个α珠蛋白亚基和权利要求1-11中任一项所述的蛋白的两个亚基。
13.根据前述权利要求任一项所述的蛋白，轭合至一个保护基团。
14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述保护基团是抗氧化酶。
15.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述保护基团是聚环氧烷。
16.一种组合物，包含在生理学可接受载体中的根据前述权利要求中任一项所述的蛋白。
17.一种治疗人对象的方法，包括向需要治疗的对象给予有效量的根据权利要求16所述的组合物。
18.一种编码根据权利要求1-14中任一项所述的蛋白的核酸。
19.一种表达载体，包含可操作地连接到一个启动子的根据权利要求18所述的核酸。
20.一种宿主细胞，包含根据权利要求19所述的表达载体。
21.一种制备根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白的方法，包括在根据权利要求20所述的宿主细胞中表达一种蛋白从而回收根据权利要求1-14中任一项所述的蛋白，以及可选地修饰所述蛋白从而提供一种根据权利要求10-15中任一项所限定的蛋白。
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