PT85133B - Processo para a preparacao de hemoglobina - Google Patents

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Lakshman R Sehgal
Richard E Dewoskin
Gerald S Moss
Steven A Gould
Arthur L Rosen
Hansa Sehgal
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Northfield Lab
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Description

A presente invenção refere-se a um substituinte acelular das cé lulas vermelhas do sangue que compreende essencialmente uma solução de hemoglobina piridoxililada, polimerizada, de ligação-cruzada, isenta de tetrâmeros a qual é isenta de contaminantes do estroma. Ainda se refere a um processo para a preparação do substituinte acelular das células vermelhas do sangue.
Descrição de técnica
Durante vários anos a hemoglobina isenta de estroma foi conheci da na técnica como o transportador do oxigénio e pela capacidade de ligação do oxigénio reversível. Desde que surgiram proble mas de toxicidade a hemoglobina isenta de estroma utilizado como substituto do sangue, requereu mais modificações para fornecer um produto não tóxico para uso farmacêutico. Nas patentes de invenção norte-americanas NRs. 4 001 ?00; 4 001 401 e
053 59θ» descreve-se uma hemoglobina isenta de estroma, de li g?ção-cruzada, polimerizada como um substituto do sangue para transportar oxigénio para os tecidos e órgãos e como um amplia dor do plasma sanguíneo. A hemoglobina piridoxilada isenta de estroma mostrou-se favorável a alt erar as (__ í capacidades de 'igação do oxigénio reversível e aumentar a esta- bi7idade e o período de conservação do produto bio1ógico
J. Surgical Research 3,0:14-20 (1987 ).
A hemoglobina piroxiTada poi imerizada com giutarai deído tem sido descrita e caracterizada em L.R. Sehgal, et al , In Vitro and In
Vivo Char acteristics of Po^ymerized, Pyridoxyi ated Hemog^obin
So7ution, Fed. Proc.39:2383 (7980); L.R. Sehgal, et a-1 ., Preparation, and In Vitro. Characteristics of Po^ymerized, Pyridoxyi ated
Hemogiobin, Iransfusion 23(2):7 58 (March-Aprii 7983). A1ém disso, a capacidade da hemog7obina piridoxi7ada po7imerizada para actuar como um transportador de oxigénio, foi descrita em L.R. Sehgal, et al .. Po1 ymerized, Pyridoxi’ated Hemog^obin: A Red Ce^i Substitute with Normal Oxygen Capacity, Surgery 9 5(4):4.33-38 (ApriT 7931+).
Hemog^obin as an Ace7iu7ar Oxygen Carrier, Advances in ΒΊ ood
Substitute Research 79-28 (Aian R. Liss, Inc. 1983).
veícu7ar quantidades suficientes de oxigénio para manter a vida, secundários indesejáveis. 0 efeito secundário possuíam efeitos mais perturbador era 0 de uma diminuição na eficácia do rim. Pensou-se que esaas a^teraçÕes eram devidas h presença de contaminan tes indesejáveis, tais como endotoxinas bacterianas ou fragaentos contaminantes como estes podiam de facto produzir alterações renais,
vez que o rim estava ainda em risco neste estado, de circulação sanguínea reduzida. A causa para a disfunção rena·1 foi referida como quantidades inaceitáveis, fisioiogicamente, de tetrâmeros de hemoglobina não po1imerizados. Outros efeitos secundários indesejáveis da perfusão da hemoglobina tetramérica são a toxi. cidade rena1, vaso-constrição, hemog1obinuria, depressão do débito cardíaco, elevação da pressão sanguínea artéria1 média e extravasão do perfundido especial mente na cavidade peritonea1.
Na prática, nenhum substituto conhecido do sangue deriva do da hemog1 obina tinha sido tota1 mente bem sucedido, nãoJapresentando prob1emas de toxicidade. Estes produtos preparados de acordo com a situação técnica verificaram-se conter âiversas quantidades de hemoglobina tetramérica. Por exemp1O; o processo de preparação de acordo com as patentes de invenção norte-americanas Nos. h-.OQT.SOO; ^.OCnACH e ^.053*590 não proporcionaram um produto utilizável em terapêutica. Primeiro; ta1 como outros processos, havia nó produto final uma quantidade e1 evada indesejáve1 de hemog1 obina tetramérica, nao po1 imerizada. Segundo; podiam permanecer demasiados contaminantes, tais como to^ueno residual tóxico na soTução, uma vez que durante a preparação podiam não ser completamente eliminados. Terceiro; o produto descrito como de Hg não seria fisic^ogica mente funcional pe^o facto da so1ução da hemoglobina não absorver as proporções aumentadas de po 1 ím.ercs de peso mo1 ecu1 ar e1 evado proporcionavam, um produto de e1 evada quentes de executar, excepto em so1uções di1uídas de um. modo inaceitável
RESUMO DA INVENÇÃO
Um objectivo importante da presente invenção é proporcio nar uma soução de hemoglobina nao tóxica, terapeuticamente útil como um substituto, das células vermelhas do sangue, aceiu^ar.
Um outro objectivo é proporcionar uma solução de hemoglobina não tóxica com capacidades de ligação ao oxigénio rever síve1 que não requeira estudos de compatibilidade ou um receptor.
Um outro objectivo é proporcionar uma solução de hemog1 obi na po1 imérica pura, essencial mente desprovida de tetrâmeros de hemoglobina não modificados, com uma capacidade de transporte de oxigénio normal.
Ainda um outro objectivo é proporcionar um veículo d.e oxj. génio temporário que pode ser substancia·1 mente isento de antigénios virais e elementos patogénicos.
Com os objectivos referidos e outros em vista, a presente invenção proporciona uma hemoglobina piricoxii ada, po-1 imerizada, de ligação cruzada, isenta de tetr âmeros, que é substancia·1 mente isenta de estroma e de outros contaminantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Referindo os desenhos apensos, proporcionaram-se catorze figiras para serem descritas
Fig. i representa o diagrama esquemático do método da fa se de piridoxi’’ação j proporciona a piricoxi·1 ação e po* imerização de acordo com a pre
sente invenção;
Fig. 3-A, 35 e 3C representam gráficos que mostram um exa me densitométrico da hemoglobina piridoxi·1 ada, pcN imerizada, de ligação cruzada, essencia1 mente isenta de tetrâmeros, separada por e' ectroforese sobre gel de po* iacrii amida-SDS;
Fig. à mostra o esquema de e^uiçao da hemoglobina pirido xPada, po1 imerizada, de ligação cruzada, obtida a partir de uma coluna de filtração por gei .
Fig. 5 representa o esquema de eiuição de hemoglobina piridoxi1 ada e po*1 imerizada, de ligação cruzada, essencia1 mente isenta de tetrâmeros, obtida a partir de uma coluna de fftra ção por ge1 ;
Fig. 6A representa um gráfico que mostra a curva do espec tro da oxi-hemog1 obina;
Fig. 65, representa a curva espectra1 obtida com hemcg^obi na, piricoxi'ada, po1imerizada, de ligação cruzada, essencia'mente isenta de tetrâmeros, oxigenada;
Fig. 7, representa um gráfico que descreve a redação entre a concentração de hemoglobina piridoxi1 ada, ροΊ imerizada, de 1 iga ção cruzada, essencia*’mente isenta de tetrâmeros e a pressão osmo tica do co^óice (CO?);
Fig. 3, representa um gráfico da curva de dissociação da oxi-hemog1 obina para uma herLOg1 obina piridoxi1 ada, po” imerizada, de ligação cruzada , essencia1 mente isenta de tetrâmeros;
ção de hemoglobina piricoxi·* ada, po”imerizada, de •iga-^ão cruzada, essencia” mente isenta de tetrâmeros, obtido numa co”una de cr ornato
Fig. 10, representa um gráfico da re”ação entre a concentra /
c ção de hemoglobina piridoxiiada, po1 imerizada de 'igação cruza- ( da, essencial mente isenta de tetrãmeros, e a viscosidade da so iução;
Fig.τ', representa um gráfico que descreve a curva de extinção para hemoglobina isenta de estroma (SFH) e hemoglobina piridoxi1 ada, po-1 imerizada, de ''igação crizada, essencialmente isenta de tetrâmeros.
DESCRIÇÃO DETALHADA DOS ASPECTOS PREFERIDOS
A presente invenção diz respeito a um substituto aceluiar dos g^obu^os vermelhos que compreende essencial mente hemoglobina piridoxi1 ada, po?imerizada, de ligação cruzada isenta de tetrãne ros que é substancia·1 mente isenta de estroma e de outros agentes contaminantes.
Para os objectivos da presente invenção a designação ligação cruzada significa a disposição química das pontes moleculares em/ou no interior de uma mo'écu1 a ou entre as mo1 ecu> as, com a finalidade de alterar o formato, dimensão, função ou caracterís ticas físicas da rno’écu1 a.
termo essencia1 mente isento de tetrameros significa o grau, de pureza, no que se refere h contaminação por tetrameros em. que as respostas biológicas aos tetrameros administrados em mamíferos não mais se verificam. Ur. critério principa' consiste na ausência de alterações da função rena-1 quando quantidades eficazes farmacêuticas são perfundicas, com o níve* de pureza ce cerca de 98/ ou mais (menos do que 2/ de tetrãreros). 0 produto purificado ou uTtrapurifiçado possuía o mesmo significado que ser essencia.^mente isente de tetrameros. 0 terrnc scPucãc de ί ί ρο1 imerização define· uma so1ução que contém um agente de po in.erização ou de ligação cruzada'* ta-1 como o g1 utara·1 deído ésteres, imídicos, diaspirina e outros, como um veículo apropriado do ponto de vista bioquímico. 0 termo membrana semi permeável refere-se a una membrana permeável para certas espécies de mordeu’’as e não permeável para outras, particu1 armente uma membrana que actua como um f^tro seiectivo que exclui pesos moleculares de cerca de 30.000 dai tons e superiores.
produto do processo de acordo com a presente invenção, uma hemoglobina pirodoxi·* ada po1 imerizada, em sCução essencial men te isenta de hemoglobina tetramérica (natura1) e de vários outros contaminantes, é compatível fisio·1 ogicamente assim como utiiizáve’’ em terapêutica e clínica. 0 produto possui capacidade de ligação de oxigénio, reversível , que é necessária para as propriedades de transporte de oxigénio. De um modo muito notável o produto exibe boas características de carga e de descarga na utilização que se relaciona com a curva de dissociação hemoglobina-oxigénio (P^) semelhantes as do sangue total. 0 produto exibe uma afinidade e1 e vada para se ligar ao oxigénio nos capilares através dos pulmões e libertar em seguida, duma forma ddequada, o oxigénio nos tecidos do organismo. 0 produto também não requer estudos de compatibilidade com 0 receptor.
processo da presente invenção é o unico no facto de produzir um produto isento de contaminação com tetrãrreros num. grau até a data desconhecido, na fraccionacão e purificação de hemog^o bina po’imérica. 0 processo da presente invenção proporciona uma maior vantagem no facto de poder tornar 0 produto fina·1 svbstan-
bactérias, riquétzias, fungos, protozoários, virus e outros orga_ nismos.
mais importante do produto biológico é o facto de poder ser substancialmente isento de virus que causam hepatite ou a síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA). Um produto puro de hemoglobina tetramérica e de vários outros contaminantes terá uma utilidade clínica enorme, facilidade de utilização e segurança, tanto quanto se refere às propriedades fisiológicas. 0 produto bio. lógico da presente invenção, não provoca vaso-constrição, toxicidade renal, hemoglobinúria e outros problemas implicados com a administração endovenosa de soluções de hemoglobina conhecidas que contêm quantidades indesejáveis de hemoglobina tetramérica. Após administração endovenosa do produto aqui descrito, os resultados demonstram um decréscimo, não significativo, na produção de urina, um decréscimo, não significativo, na taxa de filtração glomecular, uma extravasão, não significativa, na cavidade peritoneal e ume alteração, não significativa, na cor da urina. Portanto o substituinte acelular dos glóbulos vermelhos do sangue, da presente invenção, encontra utilidade no tratamento de traumatismos, enfarte de miocárdio, paralisia, anemia aguda e perturbações de deficiência de oxigénio, tais como hipoxémia, hipoxia ou hipóxia em estado final devido à diminuição ou falência do pulmão para oxigenar adequadamente o sangue. 0 produto também encontra utilidade no tratamento de qualquer doença ou condição médic? que requeira um fluído ressuscitador (p. ex. trauma, choque hemorrágico específico), amplificação do volume intravascular ou a transfusão de substituição. Além disso, para tratamento médico o presente produto pode ser útil na preservação de órgãce para transplantações.
A presente invenção também abrange um método par? a utiliza.
ção deste produto biológico para tratamento clínico, por meio de administração endovenosa a um mamífero necessitado de um ta1 tra tamento numa quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico de hemoglobina piridoxi1 ada po-*imerizada de 'igação cruzada, substancia·1 mente isenta de estroma em conjunto com o veículo, aceitáve-1 em farmácia, não tóxico. Norma-1 mente uma transfusão de substituição abrange a substituição do sangue do paciente com o substituto aceTu^ar de glóbulos vermelhos da presente invenção por meio de utilização de técnicas convencionais no tratamento de certas condições ou alterações tais como, por exemplo, envenenamento, doença de auto-imunidade, etc. As quantidades efectives, do ponto de vista farmacêutico, variam re1 ativamente com o efeito terapêutico desejado, para uma doença particular ou com a condição médica a ser tratada e os parâmetros de dose habitua1 , ta-1 como, por exemplo, peso corpora1 do paciente. Gera^mente uma quantidade eficaz, do ponto de vista farmacêutico, consiste certa mente numa escaca de dose estabelecida pe^os médicos ou pessoa·1 paramédico para ser uti-1 na prática cínica. Na área médica ser a' evidente para o técnico como escolher uma dose para uma dada situação. 0 veículo aceitáve1 scb o ponto de vista farmacêutico con siste, de preferência, em agentes inertes não tóxicos e compatíveis com a hemoglobina.
os
Exemplos de tais veículos inCuem,
fisiológico (p.
ex. solução de actato de Binger, solução de etc.), solução de àextrose e equivalentes.
matéria-1 preferido para este prccesso da presente inven· ção, consiste em sangue humano fora do prazo. De preferência o sangue n~o é utilizado quando armazenado durante mais do que oito
semanas após a data de expiração do prazo registado na emba1 agem.
Todos os processos aqui descritos são aplicáveis a sangues doutros mamíferos com modificações técnicas mínimas.
processo comp1 eto pode rea1izar-se a cerca de uma tenperatura entre 2°C e 8°C, de preferência a 5°C. 0 sangue fora do pra zo é 'avado com cerca de duas a cinco vezes o seu volume de uma solução de cloreto de sódio isotónico a 0,9/. A solução de 1 ava gem pode conter eventua1 mente antibióticos, p. ex., penicilina, estreptomicina, glutamicina, sulfato de po7 imixina 3 e outros.
A adição de antibióticos não é essencia? para o processo, mas pode minimizar as contaminações bacterianas se o processo for rea1!zado fora do ambiente farmacêutico.
Os g1óbu1os verme1 hos são 1avados empacotados reunidos e ^isados com um tampão de fosfato de um meta1 a1 ca1 ino água isenta de pirogénio. A fase o estror.a dos g1óbu1os vermelhos (p. ex., seguinte da so^uç por meio de filtração por mi cr opor os.Um método preferido é a uti 'ização de cartuchos de fibra ção cruzada. Sistemas de filtração deste tipo são a Pe^icon adquirir os sistemas no comércio para jotes maiores ou men nores do
T Γ<
'iriioxi1 ada uti1 izando-se o 5’-fosfato de piridoxa1 numa propor ção mo1 ar compr eendid a
-3,refPiza-se na presença de um agente tartampão de tris-c1 oridrato cor uma concen-
tração fina·1, aproximadamente de 0,ΊΜ e cerca de i mg/1 de gZuta miona. A solução é comp1 etamente desoxigenada uti^izando-se um gás de troca como hé^io, azoto ou outro gás inerte, de um modo desejável com o azoto gasoso ou azoto ''íquido. Qualquer tubo a utilizar para bombear a solução deve ser de preferência impermeá ve» ou minimamente permeável ao oxigénio ta-1 como tubo Tygon B-M-f (Co^e Pa^mer Co., Chicago, IL). Adiciona-se um agente de redução ta3 como o ciano boro-hidreto de sodio ou, de preferência, boro-hidre to de sodio b solução desoxigenada. Pode-se eliminar o excesso de reagentes por meio de diá^ise com água isenta de pirogéneos uti·1!. zando um filtro para diá^ise renai , tal como C-DAK ,3 (Cordis Dow Corp., Miami, FL) ou TH-15 (Terumo Corp., Tokio, Japao). De um modo a1 ter nativo, podem-se utilizar cartuchos de u^trafi·1 tração para um peso moΊ ecu·1 ar não inferior 2 30·000 da1 tons (adquiridas no correr cio, Amicon, Corp, Romicon, MPlipore).
Subsequentemente, a solução de hemoglobina piridoxi1 ada isenta de estroir.a é po*imerizada, uti1 izando-se g^utara1 deído a 2% (E. M.
Crede, Foiyciences, Warington, PA). A solução de hemoglobina piri doxiTada isenta de estroma é submetida a um fPtro de diá^ise reda. A duração da po1 imerização é a quantidade de g1 utara’’ deído que dependente do volume da solução de hemoglobina do rendimento de polímeros desejado e da desejada.
gers* quanto maior a distribuição do peso mo’’ ecu1 ar de polímeros, maior o seu obtem-se um rendimento de 70$ de polímeros entre 3,5 θ horas mento entre 80 e 90$ po-de ser obtido em 7 horas, mas este resulta-
rá numa distribuição de peso mo1 ecu1 ar significativamente mais elevado de polímeros. (Fig. 3C).
processo de ροΊ imerização, quando realizado de acordo com a presente invenção, resulta num rendimento de polímeros e^e vado. Para se produzir um produto com utilidade clínico de confiança, é muito importante controlar a velocidade da reacção e superfície de interacção durante a po1 imerização de forma a pro duzir-se um produto numa escala de peso mo'lecu'1ar estreita, cuja media é cerca de 120.000 daltons. A reacção de po1 imerização pode ser controlada pe^a diminuição da pressão osmotica do conoide, uti1izando-se um oncometro ta? como um IL 186 (Instrumentation Labotatories, Danvers, MA) ou Wescor Colioid 0smometer( Wescor, Logan, Utah), para cromatografia líquida de a1 ta revolução (HPLC) ou por meio de qualquer outra técnica apropriada conhecida. Vesti gios de moléculas de peso mo1 ecu-1 ar elevado podem estar presentes tai como se determinou por meio de e1 ectrof orese sobre ge1 de po1 ia criíamida dodeci»-sulfato de sódio (SDS-PAGE).
Na interfase da membrana semi-permeávei, nas fases de pirX doxPação e po-1 imerização do processo da presente invenção o veículo bioquímico (isto é, a água, sais, açucares ou outras moléculas pequenas ou iões) está comp·* etamente 'iberto para se movimentar para trás e para a frente através da membrana, em resposta hs forças hidrostáticas hidrodinâmicas, osmcsicas ou oncóticas
cu1as ou iões do ingrediente activo (isto e, agentes de po1 imerização, agentes de redução, agentes de piridoxi''ação, etc.) estão menos Ίvres para se movimentarem através da membrana devido b sua dimensão e peso mais elevados.
As mo1 écu·1 as de hemoglobina não podem atravessar a membrana intacta.
Esta estrutura resulta numa exposi-
f ,w ciais aos agentes activos. As variáveis que podem ser alteradas são o débito da solução de hemoglobina, a concentração da solução de hemoglobina, a contração do agente activo e o débito do agente activo.
Além disso as variáveis referidas antes, tais como tempo, temperatura, área de superfície podem ser alteradas para modificar esta estrutura para uma escala maior de reagentes, reacções e eficácias. A reacção total pode realizar-se num meio compatível do ponto de vista fisiológico. Além disso, a solução de hemoglobi na pode movimentar-se atavés da reacção sem experimentar qualquer alteração significativa na diluição ou no ambiente iónico.
Esquematicamente, a fig. 1 mostra o processo de piridoxila çso do lote. No contentor ou recipiente de mistura (5) adiciona-se, uma solução de hemoglobina isenta de estroma e os reagentes que contêm o 5’-f°sfato de piridoxal (6). 0 pF é ajustado e controlado por meio de um eléctrodo de pH, (7)£> contentor, (5), pos. -sui uma válvula de ventilação ou tubuladora, (11). Para se obter uma agitação contínua utiliza-se um meio de agitação tal como o misturador de haste que compreende um motor eléctrico, (9) juntas (9a) para a ligação da haste às pás mistura (6) é bombeada para o recipiente (5) por através de uma membrana de troca de gás (1;
de ligação universais doras (10). A solução meio de uma bomba (4) ao recipiente (5). Uma e, em seguida retorna fornece o azoto com débito constante através fonte de azoto, (8) da membrana (1) para de gás (1) contém um desoxigenar a solução 6. A membrana de troca ventilador (3) para a libertação de gases. Uma solução que contém um agente redutor é adicionada através da abertura da seringa (p).
A circulação da solução da hemoglobina desoxigenada, continua atra vés deste conjunto por meio de uma acção de bombagem constante, fornecida por meio de uma bomba 4, até que ί w o rendimento desejado de hemoglobina piridoxi1 ada seja obtido.
A Figura 2 representa um diagrama esquemático da piridoxi fação e po-1 imerização, uti^izando-se respectivamente a técnica de membrana de acordo com a presente invenção. Para a piridoxi^ ação é adicionada no recipiente de mistura ou num segundo reservatório (18) uma solução de hemoglobina isenta de estroma e reagentes que contêm o 5’fosfato de piridoxa’’ O9)· 0 segundo reservatório (18) possui um ventilador ou uma vá^vu^a de saída 07) . Por meio de um agitador tal como o misturador de vareta que compreende o motor e^éctrico (16), ligações de juntas universais (16a) e o agitador (20) obtém-se uma agitação contínua. Inicialmente, a solução (19) é bombeada continuadamente através de duas vias de desoxigenação enquanto as aberturas (31) e (32) estão fechadas. Simultaneamente a solução 09) é bombeada do segundo reservatório (Ί3), por meio de uma bomba 0 5), através de uma membrana de troca de gás (i3) e por meio da bomba (2^ ) através de uma membrana de troca de gás (23) θ dum filtro de membrana de diá^ise rena1 (27) e, em seguida, retorna para o segundo reservatório 03). Fontes de azoto 02) e (2k) que fornecem um débito constante de azoto através das membra nas trocadoras de gás (13) e (23) respectivamente para desoxigenar a solução 09)· As membranas trocadoras de gás, 03) e (2j), contêm aberturas OU) e (22) para a Tcertação dos gases. 0 pH é controla do através do ei éctrodo de pH (25) munido com um condutor e^éctrico (26), Após a desoxigenação as aberturas (31) e (32) abrem-se. Uma solução que contêm um agente de redução (30) é bombeada por meio da bomba (23) co contentor ou do primeiro reservatório (29) através da membrana de ciá^ise rena1 (27) e retorna para 0 primeiro reserva tório (29).
Após piridoxi1 ação completa a solução que contêm 0 agente
de redução (30) é substituída por água isenta de pirogénios. A água isenta de pirogénios é em seguida bombeada por meio da bom ba (28) através do fluxo de membrana para diá^ise renal (27), para dia^isar 0 excesso de reagentes e retorna para 0 primeiro reservatório (29). As aberturas (3n) e (j2) estão fechadas por moías e a solução (19) circula continuamente enquanto é desoxi genada.
Para a po1 imerização as portas (31) e (32) são abertas.
A solução isenta de estroma, de hemoglobina pirodixiiada (19) é constantemente obrigada a circular através do conjunto. A água isenta de pirigénio, no primeiro reservatório (29) é substituída por uma solução de poi imerização que contém o agente de po1 imerização 30. A solução de po1 imerização é em seguida bombeada por meio da bomba (28) através do fiitro de membrana para diáiise renal (27) e retorna para o primeiro reservatório (29). Ã medida que se esgota, o agente de po1imerização á adicionado pouco a pouco para o primeiro reservatório.
Basicamente, a solução que contém 0 agente de redução para a piridoxiiação ou a solução da po1 imerização que contem agente de poiimerização, são bombeadas do um lado ds membrana semi-permeávei primeiro reservatório do filtro de membrana (29) para de diá^ise de hemoglobina desoxigenada ou é bombeada do segundo reservatório 0 3) para o 1 ado oposto da mem brana.
A fracção da solução que contém 0 agente de redução ου o ag ente ar ou ροΊ imerizar fracção de so'ução que contém 0 agente de redução ou o agente de que ί6 /
k.
(29). De igual modo a solução de hemoglobina desoxigenada, que contêm. ou a hemoglobina pirídoxi-1 ada ou a hemog1 obina po^imeriza da, vo^ta para 0 segundo reservatório 08). Esta operação proce£ sa-se continuadamente até que um rendimento desejado do produto tenha sido obtido.
Logo que o final da po^ imerização ocorre a concentração da hemob1 obina tetramérica não ροΊ imerizada da solução pode ser diminuída significativamente por qualquer técnica conhecida de filtra ção e purificação apropriada. A remoção de essencial mente toda a fracção tetramérica não modificada restante pode ser realizada por meio de bombagem da solução po-1 imerizada através de um cartucho de uitra-fi·1 tração e purificação por meio de cromatografia sobre ge1 ou, de um modo alternativo, apenas por cromatografia sobre gel.
Os vestígios restantes oa hemoglobina tetramérica não modi ficada podem ser compJexados, de acordo com a presente invenção, me diante adição de haptogi obina apenas, tratados com haptoglobina após utPização do cartucho de u1 tra-fi·1 tração e/ou cromatogra fia sobre gei ou e5 iminarido por meio de cromatografia de afinidade uti^izando-se um gei de ligaçao a haptogiobina. A haptog·* obina pode ra' ser ^igada de um modo irreversíve·* com a hemoglobina tetramérica ποΊ ar de i1 .
be a compre ci recuerer-se-á de ha;tcg-1 obina para a 'igação com urr grana oe hemog1 obina. a.-1 terna activado.
solução fina-1 é concentrações ser igada sobre um ge1 de agarose e· ectro’’ítíca.s equilibradas de modo a representarei r- ·>
adicionar incluem, iras não estão imitados sódio, potássio,
οΊοτο, cá^Oic, magnésio e equivalentes. Eventua”1 mente também poder. ser adicionados agentes anti-oxidantes convencionais, tais como g^vtationa, ascorbato ou glucose. A solução fina1 pode ser esteri izada mediante utilização de qualquer das técnicas conhe cicias apropriadas para aplicação a produtos bicógicos.
As propriedades críticas da solução da presente invenção em escacas ou quantidades aproximadas são referidas, por efeitos de comparação com as do sangue tot&i .
Hb
Capacidade de transporte de 0^ Coeficiente de ligação a 37°c F5C> (pC02 4o torr,
PH 7Λ, 37°c) ketemogi obir.a
Pressão do CoLoide Osmótico
Csmo·* aridade
Conteúdo Total Fosfo1 ípidico
Viscosidade (a 2p°C)
Hemog'' obina
Po imerizada
7-ί8 gm/di
9.7-25.Ο vo?%
1.30 cc/gm Hb i4-22 torr menos de i 5%
7-30 torr
290-31 C; mOsK menos de C'?004
Sangue
Totai
12-i 5 gm/cll
16.6-20.9 VOi% i .32 cc/gm Hb torr menos de 2% 20-25 torr 290-3Ί0 mo se mg/πΠ
3.2 cp (8gm/c.·’) 3.5(Hct=45%)
C
Os exemplos que se seguem demonstrara certos aspectos da presente invenção. Contudo deve entender-se que estes exemplos têm finalidade inustrativa apenas e não pressupõem serem tota^ mente definitivos re-! ativamente as condições e âmbito da presen te invenção. Todas as temperaturas são referidas em gr8us CELSIUS a menos que especificado outro modo. Também se deve avaliar que quando as condições de reacção específicas (p. ex. temperatura e tempos de reacção) sao fornecidas as condições que estão acima du abaixo dos iimites especificados também podem ser usadas mas geral 1 mente por una forma menos conveniente.
Uma melhor compreensão da presente invenção pode ser obtida através dos exemplos seguintes, não limitativos. Estes exemplos fo rara conduzidos b temperatura de cerca de 5°C θ b pressão atmosféri ca:
EXEZPLp, 1
Preparaçao de ura.a_ scrução de hemoglobina tetramérica isenta de estroira ►
Sangue humane de fora de prazo foi navado duas vezes cora solução de cioreto de sodio a 0,9/ que continha os seguintes anti biéticos por ‘'itro de solução:
Fenici ina 50.000 U
Estreptomicina 50 mg
Gentarai cina bo mg
Po-’imixina B, sob a forr.a de suTato 2,5 mg
/
1G /
C
As ce^as vermelhas do sangue (RBC) foram ^avadas duas ve zes com igua1 volume da solução referida antes e centrifugadas a 2.5OO g durante i 5 minutos. Mais do que 95^ da camada amarelara sob rena d ante foi etiminada com extractos de plasma (Fenva-1
Laboratories, Morton Grove, IL). As RBCc lavadas e empacotadas foram em seguida reunidas e ^isadas com 3 a 5 volumes de água isenta de pirogénics. Cem unidades de RBCS lavadas resultaram num volume entre i 5 e 20 litros com um hematócrito de 20 s 25-/¾.
Quinze a 20 litros de RBCS lavadas foram colocadas em qua renta a oitenta litros de água isenta de pirogéneos arrefecida em geio. 0 lisado obtido deste modo foi em seguida bombeado através de 2 a 5 cartuchos de fibra ocos de 0,1 ju. Uti^izou-se uma bomba de ar da Amicon Corp., Danvers, MA, LP.30. Os cartuchos de 0,1 71 foram, adquiridos da Romicon Inc. subsidiária da Rohm and Haas Co., Woburn, kA 0^ SO’’. A hemoglobina essencia·1 mente isenta de estroma de g^óbVOs vermelhos (RBC) mas com outros componentes de RBC enzj.
te este processo. A ausência de depósito traduzia a boa integridade da membrana. EecCheu-se cerca de 97$ àe hemoglobina essencialmente isenta de estrona.
Durante esta fase de primeira preparação o volume foi r eduzido para i2 a Ί 5 ^itros e mantido neste volume, ri mediante aoiçã
.. e una reco·
- ,T ηΊ trafi1 tr auo.í ocos com um f L· í centração final de hemoglobina compreendida entre cerca de
20-22 gm/dl·
EXEMPLO 2
Preparação de uma solução de hemoglobina tetramerica isenta de estroma
Método alternativo
Unidades individuais de sangue fora de prazo foram mistu radas com uma solução de cloreto de sódio a 0,9$. Os g^óbu^os ver me^hos e a camada amarelada de g^óbu^os brancos foi deixado a repousar durante a noite. A fase sobrenadante dos glóbulos amarelados foi em seguida extraída.
A camada de cédulas foi em seguida colocada em três a cin co volumes de solução de cloreto de sódio a 0,9$. As cé^u^as foram lavadas e concentradas mediante utilização de um filtro de fi bra cruzada oco de 0,2(K2O5-KROSFLOW, Microgon Corp., Laguna Beach, CA) e uma bomba de ar (LP30, Amicon Corp., Danvers, MA). As cellilas em massa foram lisadas por meio da adição de 3 a 5 vo lumes de água isenta de pirogénios. Procedeu-se h fi1 tração cru zada e reco^heu-se o u’’trafi-1 trado contendo a hemoglobina tetramá rica conjuntamente com enzimas provenientes dos g^óbu^os vermelhos enquanto que o estroma ficou retido no filtro.
Centrifugaram-se a^íquotas do filtrado várias vezes durante este processo. A ausência de um sedimento significava uma boa integridade da membrana. Obteve-se uma recolha de hemoglobina es_ senciaimente isenta de estroma de 97$· Simultaneamente com esta fase, o u^trafi1 trado que continha hemoglobina foi concentrado com auxílio de 3 a 4 cartuchos de filtração com um peso mo1 ecu-»ar de 30 Kd (H10 P30, Amicon Corp., Danvers, MA) e uma bomba de ar LP 30·
21/ f f l /
Concentrou-se o uHrafii trado para uma concentração fina1 de hemoglobina entre cerca de 20 e 22 gm/di.
EXEMPLO 3
Piridoxilação de hemoglobina isenta de estroma geometria do Tote misturado
Uma solução de hemoglobina isenta de estroma foi preparada de acordo com os processos descritos nos exemplos 1 ou 2. Misturaram-se em conjunto os reagentes seguintes:
1. ^'-fosfato de piridoxai, numa proporção mo·» ar com hemogf obina de 4; 7 ;
2. Tampão tris-HQ-numa concentração final 0,7M em soiução de hemoglobina;
3. G^utationa - 7 g/l de soiução;
à. ácido ascórbico- 0,2 g/7 .
5. Glucose 0,5 g/1; e
6. Antibióticos— os mesmos antibióticos como descritos no
Exempio i.
Os reagentes referidos antes fcran dissolvidos num volume mínimo de água isenta de pirogénios e ajustado o pH para o vaior compreen dido entre 7,25 θ 7Λ5· A mistura referida antes foi adicionada h solução de hemog·1 otina. 0 pH da solução de hemoglobina foi ajustado para 7,35“7Λ5 à temperatura de 5°C com função de NaOH 0,7 N. Finaimente, a concentração da hemoglobina foi ajustada para
17,5 - 18,5 g/dl
Ύ
Em seguida a solução (18-20L) foi transferida para um re- * servatório de aço inoxidável impermeável do gás. A desoxigenação da solução foi realizada mediante utilização duma membrana de tro ca de gás (Winiam Harvey, Bentiy Laboratories, Shiley Saies Corp., Irvine, CA). Fez-se borbulhar azoto através da membrana de troca com um débito de cerca de 170 i/fnin.A solução de hemoglobina foi bombeada através do trocador de gás com um débito de U-6 L/min. Uma eliminação de oxigénio adequada foi definida com ufta saturação de C>2 inferior a 5% e um conteúdo em oxigénio inferior a 1 voi$ por IL 282, Co-oxímetro, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). Isto foi realizado durante um período de a 8 horas, (ver Figura 1).
A solução de hemoglobina desoxigenada foi adicionada com uma solução de boro-hidreto de sódio 0,02 M (concentração final) por litro. 0 boro-hidreto de sódio foi dissolvido no mínimo de 300 a 'pOO ml de NaOH 0,001 N. Esta foi bombeada para a solução de hemoglobina através de uma abertura duma seringa e do recipiente de troca de gás com um débito de cerca de 100 mi/hora. A válvula de purga do reservatório de ácido inoxidável foi mantida aberta para impedir a subida da pressão. A seguir h adição do boro-hidre to de sódio a solução foi mantida desoxigenada. Obteve-se no perío do compreendido entre 6 a 10 horas um rendimento máximo compreendido entre 70 a 80% de hemoglobina piridoxiiada. 0 rendimento foi determinado mediante 0 vaior nà curva de dissociação hemogiobina-oxigénio (Pift).
Eiiminaram-se os excessos de reagentes por meio de diáiise com água isenta de pirogénio, utiiizando-se uma membrana de fiitra ção de diáiise renal (C-DAK 1.3, Cordis Dow Corp., Miami, FL cru TH-15, Terumo, Tokio, Japão). A solução foi mantidc21
Q
desoxigenada durante a diáiise por meio de manutenção em circuito de um oxigenador de membrana. 0 débito de azoto através do oxigenador de membrana foi de cerca de iQO L/minuto.
EXEMPLO 4
Piridoxilação de hemoglobina Isenta de estroma-Geometria facilitada da membrana
Preparou-se uma solução de hemoglobina isenta de estroma, acordo com o processo descrito no Exemplo Ί ou 2. Misturaram-se reagentes seguintes:
1. ^'Tosfato de piridoxa1 a uma proporção molar com a hemoglobina de 2;i ;
2. Tampão tris-HCl com uma concentração em solução de hemo giobina final de 0,1 M;
3. Giutationa- ig/1 de solução.
4. acido ascorbico - 0,2 g/i ;
5. Glucose 0,5 g/i ; e
6. Antibióticos- os mesmos antibióticos descritos no Exem pio i .
Os reagentes referidos foram disso-1 vidos num volume mínimo água isenta de pírogénios, ajustado o seu pE para 7,35-7,45·
A mistura referida foi adicionada a uma solução de hemoglobina. Ajustou-se o pE da solução de hemoglobina com solução de hidróxido de sódio Ο,ι N par-a um vaGor compreendido entre 7,35-7,45 4 temperatura de 5°c· á concentração de hemoglobina foi ajustada pa ra um νηΊ0Γ entre i?,5 e Ί3,5 β/«Ί ·
Em seguida transferiu-se a solução (’3-2CL) para uru reservg? tório de ácido inoxidável impermeável ao gás. Leaiizou-se a desoxi
genação da scPução mediante unia ou mais membranas de trocas de gás (Wi^iarn Harvey, Benfiy Labor ator ies, Shil ey Sa1 es Corp.,
Irvine, CA). Fez-se borbtnhar o azoto gus jso através do trocador com um debito de 170 L/min. A solução hemog1 obina foi bombeada·' r>·; atreves dum trocador do gás com um débito de 4 a 6 Mtros por mi ‘ w nuto. tma eliminação adequada de oxigénio foi definida como umaó saturação de oxigénio dc inferior a e ue conteúdo de oxigénio/¾ menor do que Ί/ em volume (por IL 282, Cooximeter, Instrumentation
--¾ Laboratories, Lexigton, MA), o que foi realizado entre 4 a 8 horas. '-?·
Neste processo a membrana oxigenadora ou o trocador de gás (2J) estava co^Ocada em série com um fftro de diá1ise rena1 (27) (lerurao, TH-1 5, ver fig. 2). As partes externas do filtro de diá ^ise estavam presas para prevenir a. perda de água, durante a desoxigenação.
Quando se a1cançou j fim da desoxigenação bombearam-se litros de uma solução de boro-hidreto de sódio a 5 g> na parte exterior do fiHro de diaTise. Desta forma, a piridoxi1 ação foi reaTizada rapidamente. Obteve-se um rendimento entre 75-80/ de
85-90/ num período entre duas a três horas. 0 rendimento foi determinado por avgTiação do Ví^or da curva de dissociação hemog1 0bina-oxigénio excesso de reagentes foram e1iminados por meio de divise com água isenta de pirogéníos através de um fPtro de õiaTise renal (C-DAiá 1,3, Cordis Dow Corp., Miami, FL ou TH-1 5, Terumo, Tokío, Japão). A so1ução foi mantida desoxigenada durante a ciá1 i se. 0 déoit-o de azoto, através do oxigenador, foi de cerca de TOO L/min.
EXEMPLO 5
Polimerização da. hemoglobina piridoxi?ada isenta de estroma
bma solução de hemoglobina piridoxi-1 ada isenta de estroma foi preparada de acordo com o processo descrito nos exemplos 3 ou à. A solução diaiisada foi adicionado:
1. Tampão de fosfato de sódio de 0,1 M de concentração fi na1 ;
2. Os antibióticos referidos antes no exemplo i ;
/ 3· Qiutationa- Tg/^itro
As substâncias químicas referidas foram dissolvidas em
5Ó0 mi de água isenta de pirogánios e adicionadas à solução de hemoglobina. A soTução do pH foi ajustada para um va^or de P,0 h temperatura de 5°C uti1izando-se uma solução de hidróxido de só dio 0,5 Μ. A concentração da hemoglobina foi ajustada para um vaOr entre ί4-π 5 g/d-1 mediante adição de tampão de fosfato 0,1 M. kanteve-se a solução desoxigenada por permanência de um oxigenador de membrana no circuito. 0 débito de azoto foi de Ί70 L/min. A so lução de hemoglobina foi bombeada para o recipiente de mistura ou para o reservatório secundário 03) através de uma membrana oxige nada ou trocadora de gás (23) num fftro de dia^ise rena·1 (27) (ver fig. 2), com um débito aproximado entre 5 a 7 nitros/minuto. Fez-se a co1heita de amostras através de uma abertura no oxigenador por meio de uma seringa. Não se iniciou a po-1 imerizaçao senão quan do o vafor de oxi-henog-1 obina determinado por meio de co-oximetria era inferior a 'Qfo. A solução foi po-1 imerizada através de uma membrana de diá^ise rena-1. A soTção de po-1 imerização foi preparada num vo'ume de Ό 1 e continha:
V.
·,« í 1. Tampão de fosfato de sódio 0,1 M (concentração final igual h da solução da hemoglobina);
2. Antibióticos numa concentração iguai â da solução de hemogi obina;
3. Giutationa- 1 g/iitro; e
4. 175-225 mi de solução de giutarai deido a 25%> (cerca de i4,8-i8,i rr.oies de giutara-1 deído por moí e je hemoglobina).
A osmo1 aridade da solução de po1 imerização era aproximadamente igual à da solução da hemoglobina.
débito da soiução de hemoglobina desoxigenada foi estabelecido primeiro através dum f litro de diáiise enquanto água isenta de pi rogénio circulava no exterior.
Quando se obteve a taxa de clrcu1ação requerida, a solução de poi imerização foi posta então a circular no exterior.
A solução foi bombeada (Coi e-Fa-1 mer purcps, 70n3 pump heads) com um débito aproximado de 0,4-0,6 L/min. Durante o processo a solução de hemoglobina do reservatório foi mantida sob agitação cuidadosa.
agente de ροΊ imerização (giutara1 deído a 25%) foi adicionado para a po-1 imerização da sonução numa sequência de acordo com o esquema seguinte:
Ί S hora 75 mi
2& hora 50 rr?
3.2 hora 50 m.i
4a hora 50 mi
5a hora 50 mi
hora 25 mi
7* hora 10 mi
’ -« .
·;
ContrcPou-se a po1 imerização através do v a1 or da pressão osmotivsnor da COP era quando o ca co^oida? (COP). A reacção foi detida cerca de ào torr., o que se obteve por meio de drenagem da solução de poi imerização df. parte exterior do filtro da diáiíse e bombeamento de água isenta de pirogénio. heaiizou-se a diá^ise corr água isenta de pirogénios durante aproximadamente duas horas. Obteve-se um rendimento de po”ímeros aproximadamente entre 30 a 90/.
/
EXEMPLO 6
Ultrapurificação da hemoglobina piridoxi'1 ada, ροΊ imerizada, isenta de estroma
Preparou-se uma solução de hemoglobina piridoxiiada, ροΊ imerizada, isenta de estroma de acordo com 0 processo descrito no exemp”o 5. A remoção dos tetrâmeros não modificados rea^izou-se em 3 fases:
Fase Ί : Ui trafjitração
A solução ροΊimerizada foi bombeada através de 3 a 4 cartuchos de ultrafatração com de peso mcfecvPar de corte de 100.000 da^ons (Amicon). Esta fase foi detida quando a concentração de hemog”oti na no uitrafi1 trado estava nitidamente inferior a 0,1/ e se irante ve neste níve1 durante duas horas ρεΊο menos. A so”vção de hemog^o bina ροΊ imerizada neste estádio era aproximadamente 90/ pura.
Fase 2; ri-1 tração poi1 gei
A segunda fase de purificação que resu”tou aproximadamente numa solução po’imérica com uma pureza entre 95 θ 9'3/ foi realizada
por meio de crornatografia sobre gei do seguinte modo:
Duas cornas para bioprocesso de cromatografia de 6o cm x 2? cm (P larmacia Fine Chemica^s, Piscataway, KJ) foram preenchidas com aproximadamente 55 litros de ftroge’’ ACA-54- (LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Este gel possui um limite de ex^usão de peso ecu1 ar de 90.000 daltons. As colunas foram ^igadas em série com um mínimo de espaço morto entre elas, do que resultou um gei com um comprimento e fectivo de aproximadamente 105 cm.
Uma quantidade entre meio a um 'itro de solução de hemoglobina ponimerizada proveniente da fase Ί, com uma concentração em hemoglobina entre 6 a 10 gm/di foi introduzida na coTuna com um dé bito aproximadamente de 3 itros/hora. A seguir à inpregnação, uti lizou-se uma solução tampão (fosfato de sódio 0,1 M pH 7,4-0, h tem peratura de 5°C) para eluir a hemoglobina com um débito de 3,0 L/hora (Figura 4). Os primeiros 2 litros de solução de hemoglobina po^ime rizada que e^uíu da coluna foram aproveitados e a solução restante eliminada. A frseção de 2 Nitros proveniente da ccTuna foi concentrada uti1 izando-se um sistema de u1 traff tração Araicon CH-2 com um a três cartuchos ΗτΡΊΟΟ (Figura 5)· Concentrou-se a solução uTtrapu rificada. Ee necessário a fase 2 foi repetida para reduzir a contami nação de tetrâmeros na solução po1 imerizada.
Fase 3: Cromatografia de Afinidade
Ligou-se naptoglobina (Hp) a gC áe agarose do seguinte modo:
Adicionou-se haptog1obina (com mais de 80% de pureza) a sefar_ se 4L activada cot CnBr (Pharmacia Fine Chemica^s, Piscataway, KJ), numa proporção de 3 n.g Ηρ/ml de ge’’ sedimentado. Adicionaram-se 4 volumes de tampão de 'igação (carbonato de hidrogénio de sódio O,1 h, c^ore tt
to de sódio 0,3 M, pH 7,9) para cada volume de sefarose. A mistu ra foi agitada cuidadosamente durante a noite à temperatura de 4°C. 0 rendimento desta reacçao foi de 2 mg Hp/ml de gel sedimen. tado. Adicionou-se à solução de hemoglobina piridoxilada, polime rizada um excesso de gel de afinidade de Hp (relativamente a hemo, globina isenta de tetrãmeros) e manteve-se em agitação cuidadosa à temperatura de 4°C durante 1 a 4 horas. A solução foi em seguida centrifugada cuidadosamente a 4.000 g por dois minutos e recor da a fracção sobrenadante. Para se maximizar a recolha de hemoglobina polimerizada realizaram-se mais lavagens e centrifugações. A hemoglobina piridoxilada, polimerizada, obtida deste modo era mais do que 99,5% isenta de hemoglobina tetramérica não modifica.
da.
Fase alternativa 5’ Formação de complexo com haptoglobina
Os vestígios finais de hemoglobina tetramérica não modificada foram eliminados da solução de hemoglobina piridoxilada, polimerizada, por meio de complexação com haptoglobina (Hp). Para isso adicionou-se haptoglobina numa proporção 1:1 molar à hemoglobina isenta de tetrãmeros. A solução foi misturada, à temperatura ambiente, durante aproximadamente ? horas.
ί
EXEMPLO 7
Composição farmacêutica de hemoglobina piridoxi'1 ada, po'1 imerizada isenta de estroma u1trapurifiçada.
Preparou-se uma solução de hemoglobina piridoxi1ada, pCi rcerizada isenta de estroma, u1 trapurif içada de acordo com o processo descrito no Exemplo 6. Ajustou-se o pH da solução com hidró xiâo de sódio 0,5 N a uma temperatura de 5°C para um va^or de cer ca de 9,02 e equi1 ibrou-se com um concentrado e1 ectro1 ítico para se obter uma solução com as seguintes concentrações finais;
I. a Ao r.Eq/L
K mEq/L
Cl »00 mEq/L
*4“ “4* Ca 5.o mEq/L
Kg 1.5 mEq/L
G1utatão •1 gu./
Adicionou-se h solução uma mistura a oxidação, nsta continha aproximadamente não menos do que as q'.
1 • G1ucose -6- Fosfato-O.3 gm
2. Cucose -6-F'osfato Desidrogenase-0.20 mg
Ferroioxina-6 mg
p • · Ferrodoxina ΝΑΏΡ oreluctase-3 mg
í. ΚλΏΡ-^0 mg Cata’’ ase-0.2 gm
Ajustou-se a concentração fina1
da hemoglobina para v^o res compreendidos entre 7 θ Ί8 g/d1.
EXEMPLO 8
Técnica de Esterilização
A hemoglobina piridoxi’’ada, po1 imerizada, purificada, preparada de acordo com o processo descrito no Exemplo t, foi esteri Tizada por meio de utilização de um esquema de filtração com filtros Profi1e Pa11 (Pa’’’’ Corp., G1 en Cove, NY):
010----> 007 —>· 005—> NR7P. (0.2^1 absoluto).
Iju 0.7 ja 0.5 /1 0.2 ju
A constituição dos filtros era propi1 eno fftro fina1 de c‘ ção possuía vestígios de endotoxina (0,25 ng/n1 ) determinada pe1c teste de 1isado de LiimTus Amoebacyte, quando preparada em ambien te não farmacêutico.
A hemoglobina piridoxi1ada, po1imerizada isenta de tetrãme metro registador Beckman DU (Beckman Instruments, (Fig. 6b). A solução Ί ogo que reconstituída para uma concentração normal de hemoglobina (12-1^ g/d1 ) produziu uma solução com u ma ρτ e s s ão o sir.ót i ca c οΊ o i d δ1 aceitáve·1 (COP), 14,5-22,5 torr,
Os valores da concentração de hemog·’obina da figura 7 foran de232 (Insurumentation Laboratories,
Eanvers, Eh). A COF foi medida num osmometro de co^oides Wescor, com heir-ag1 obina isenta de estroma não modificada (SFH). 0 processo de po-1 imerização não alterou a capacidade de ligação, ao oxigénio, da hemoglobina hemogi obina o produto possuía urna capacidade de transporte de oxl génio norma·1 .
do determinada sob condições fisiológicas de PH, pressão de CC-n e ίή
0X1· hemog'’ obina par-·, o produto, mestra-se na figura , temperatura de 37°C e
Uo torr de pressão CO . A curva, contínua foi obtida por ur. ana1 i sador de dissociação de oxigénio HEIE—O-Lcan (Lravemo1 Laborai o ries, mo*' ecxS ííT cr.tirr partir dos se
CA).
Utilizou-se como ,C, ' terçer atura duna c·'·' kz.A na a
Instruir, en oup, de efuição, fosfato de sódio
o.e C cor? excreto de 'Λ Ί ’
V. , orz:1’ a tada pera aproxinadamente 3,0 g/d1. 0 volume da amostra infectado foi de
O,1 m1 e débito de 1 m-1 /minuto (a borriba de HPLC)
2220} produto mostrou , rrode^o 223° Uvicord bil e
LIjj netrurcnts, à bandas po] iméricas,
CC' 1 / «0 » e S/ com peso mo^eciTar de 256.000 e com peso iro^ecu^ar de
320.000. Vestígios de polímeros com peso mo^ecu^ar mais elevado densitométricas do produto da presente invenção separados, por seio de e1 ectroforese de ge5 de po1 iacrilamida-SDS uti1 izando-se a técni em
LKb nota 306 (LKB Instruments, Gaitersbvrg, ND). A observação foi obtida num Helena Çuick Scan, R e D (Helena Labor st o ries, beaumont, de po imerização.
A viscosidade do produto alterou-se cor a po-1 imerização. 0 produto fina1 centrasão de hemoglobina de cerca de 3 g/d1 . Este va^or foi coir.rs vanor do sangue tota1 . A figura 'C repres ent a uma r e? aç ão entr e ε concentração da hemoglobina do produto e a viscosidade da solução , As determinações for ar realizadas cor ir.ode^o LVI (brookfield Engineering -ak·· ciente de parti sec a;icação de χ·· presentes na
Os vestígios nas i
Ko produto, a actividade de metag1 obina redvtase estava / c /
/ essencial mente inalterada, peio processo. 0 bisado iniciai assim como o produto fina·1 tinha uma actividade enzimática entre 1,0 e ,0 unidades. Uma unidade de actividade enzimática e defin aa como a redução de i hicrono^e do complexo ferrocianeto net a-hemog·’ obina num minuto por grama de hemogobina.
Ensaios fisiológicos e bioógicos
T- £
Estudes comparativos realizados em macacos não anestesiados indicaram que s infusão duma solução contaminada com mais de 2 a
3$ de hemoglobina tetramerica provocava uma diminuição na produção de urina aproximadamente 50$ e uma queda da razão de ff tração gi( rr.ecu^ar (‘'ibertação da criatimina) de aproxinacamente cuando comparadas com os níveis anteriores a infusão. A perfusão de sof ção de hemoglobina po imerizada, piridoxf ade es--eneia1 mente isent
I 0.1 o cor co de
C10 de aproxim pressão ar t er i a1 me-d c;
dos tetrameros, cue est de hemoglobina pfimerfaf, piridoxfade, essencial mente isenta de tetrâmeros.
Observaram-se mais de 2 litros de uma solução de hemogipbi
C - Extravasão na tetrarrérica nas cavidades de macacos com uma transfusão de troca para um; hematócrito de com. hemoglobina tetramérica.
Não foi observada qualquer ou muito pouca hemoglobina contida nas cavidades peritoneais dos de troca para um. hematócrito animais com uma transfusão
piridoxi' ada, essencia1 mente isenta de hemoglobina po1 imerizada, de tetrâmeros.
Destruição de, antigénios virais
Um conjunto de gióWos vermelhos humanos de 2 00 unidades, vírus de
L - Redução da presença da. hemoglobina na urina na tetrarrérica macacos resultou nurf.a excreção de hemoglobina tetra r eriça na pr r. r’
- *' '“O perft ni tara 1
C.
cir cuante.
de urina. As semi-vida entre duas a quatro horas in vivo (os animais de ensaio foram murganhos e macacos). A perfusão de uma solução de hemogio bina ροΊimerizada, piridoxi-1 ada, essencia-1 mente isenta de hemog^o bina tetramérica, (tretrâmeros presentes menos de £/) resultou em poucs ou nenhuma alteração aprecíáve1 da cor da urina (menos do que mg de hemog-1 obina por iQO mi de urina). Uma solução de bina piridoxiiada, ροΊ imerizada, tratada com haptogiobina (mais de ας isenta de tetrâmeros) não produziu alteração na cor urina, ainda que perfundida em doses terapêuticas muitc grandes, err. primatas.
A semi-vida do produto, produzido peio processo aqui descrito, foi aproximadamente de 2ã horas (fig. i**)
A figura 11 descreve a curva de extinção do plasma (semi-vida) para hemoglobina isenta de estroma não modificada (bFH) e o produto da presente invenção hemoglobina piridoxi1 ada, poimerizada, de igação cruz e iser.
ta de tetrãmeros, em solução de lactato de Ringer, cerca de 7 a g/^-1 de /V concentração de hemoglobina foi administr por via encovenosa a seis macacos machos adultos.
Os níveis de hemoglobina no p^as
Hicl foram determinados por meio de um
Co-oxímetro IL-232, cor. duas horas de intervalo no caso de SFH
OU com seis horas de intervalo, no caso do produto da presente invenção
F i z eram-se deter minaçõ continuamente até ensaios l· ez- se uma anterior descrição, entendem-se cor.o no âr.tít do presente inven-
ção ta1 corr.o reivindicada.

Claims (20)

1. - Processo para a preparação de uma hemoglobina piridoxilada, polimerizada, reticulada, substancialmente isenta de estroma, essencialmente isenta de tetrâmeros, caracterizado pelo facto de consistir na separação, do sangue, de estroma de células vermelhas do sangue e na piridoxilação, polimerização e eliminação essencialmente de todos os restantes tetrâmeros não modificados .
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida piridoxilação consistir em se adicionar uma solução de piridoxal-5'-fosfato ã hemoglobina extraída, se desoxigenar mediante adição de uma solução que contêm um agente de redução, se misturar até à obtenção de cerca de 70 % a cerca de 90 % de hemoglobina desoxigenada e piridoxilada e se remover os reagentes em excesso.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida piridoxilação. se realizar mediante adição de uma solução que contêm piridoxal-5'-fosfato, â hemoglobina extraída, de se desoxigenar mediante adição de uma solução que contém um agente de redução e de se misturar durante um período compreendido entre cerca de 30 minutos e cerca de dez horas.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida piridoxilação se obter mediante adição de uma solução que contêm piridoxal-51-fosfato, à hemoglobina extraída, de se desoxigenar por meio de uma solução, que contêm o agente de redução, bombeada continuamente de um primeiro reservatório para um primeiro lado de uma membrana semi-permeãvel,
Z ·' de se bombear continuamente a solução de hemoglobina desoxigenada que contém piridoxal-5’-fosfato, de um segundo reservatório para um segundo lado da referida membrana, de se difundir uma porção do referido agente de redução através da referida membrana, de se piridoxilar a hemoglobina no segundo lado referido, de se retomar uma porção não difundida da referida solução que contém um agente de redução para o primeiro reservatório e de se retcmar a solução de hemoglobina desoxigenada que contêm hemoglobina desoxigenada, piridoxilada para o referido segundo reservatório.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida polimerização consistir em se fazer contactar a hemoglobina desoxigenada, piridoxilada com uma solução contendo um agente de polimerização até à obtenção de uma pressão osmótica cerca de 40 Torr e de se eliminarem os reagentes em excesso.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida polimerização consistir em se submeter a hemoglobina desoxigenada piridoxilada a uma solução de polimerização durante um período compreendido entre cerca de 2 horas e cerca de 7 horas.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se adicionar ainda um agente de polimerização de hora a hora ã solução de polimerização, em uma quantidade compreendida, respectivamente, entre cerca de 70 ml a cerca de 80 ml na primeira hora, entre cerca de 45 ml e cerca de 55 ml na segunda hora, entre cerca de 45 ml e cerca de 55 ml na terceira hora, entre cerca de 45 ml e cerca de 55 ml na quarta hora, entre cerca de 45 ml e cerca de 55 ml na quinta hora, entre cerca de 20 ml e cerca de 30 ml na sexta hora, entre cerca de 5 ml e cerca de 15 ml na sétima hora e de se eliminarem os reagentes em excesso na oitava hora.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2, 5 ou 7, caracterizado pelo facto de se eliminarem os rea gentes em excesso mediante diãlise.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida polimerização.consistir em se bombear continuamente uma solução de polimerização de um primeiro reservatório para um primeiro lado de uma membrana semi-permeãvel, de se bombear continuamente uma solução de hemoglobina desoxigenada, piridoxilada de um segundo reservatório para um segundo lado da referida membrana, de se polimerizar hemoglobina piridoxilada no referido segundo lado, de se retornar a porção não difundida da referida solução de polimerização para o primeiro reservatório e de se retornar a solução que contém hemoglçbina piridoxilada, polimerizada para o segundo reservatório.
10. - Processo de acordo .com uma qualquer das reivindicações 4 ou 9, caracterizado pelo facto de a membrana semi-permeã vel consistir num filtro de diãlise renal.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 5, 6 ou 9, caracterizado pelo facto, de a referida solução de polimerização conter uma quantidade de glutaraldeído compreendida entre cerca de 14,8 moles e cerca de 18,1 moles por cada mole de hemoglobina.
12. - Processo de acordo com. a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminarem essencialmente todos os tetra f' ( ·* meros restantes não modificados mediante filtração e purificação.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se removerem essencialmente todos os tetrâmeros restantes não modificados mediante bombeamento de uma solução polimerizada através de cartuchos de ultrafiltração de fibra porosa e de se purificar por meio de cromatografia sobre gel e tratamento com haptoglobina.
14. - Processo de acordo- com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminarem essencialmente todos os tetrâmeros restantes não modificados por meio de bombeamento de uma solução polimerizada através de cartuchos de ultrafiltração de fibra porosa e de se purificar por meio de cromatografia sobre gel.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminarem essencialmente todos os tetrâmeros restantes não modificados por meio de bombeamento de uma solução polimerizada através de cartuchos de ultra-filtração de fibra porosa e de se tratar com haptoglobina.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminarem essencialmente os tetrâmeros restantes não modificados por meio de cromatografia sobre gel e de se tratar com haptoglobina.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se removerem essencialmente todos os restantes tetrâmeros não modificados por meio de cromatografia sobre gel.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminarem todos os restantes tetrâmeros não modificados por meio de tratamento com haptoglobina.
19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 13,15,16 ou 18, caracterizado pelo facto de o referido tratamento por meio de haptoglobina consistir em se adicionar a referida haptoglobina ou em se fazer reagir com haptoglobina ligada a gel.
20. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um substituinte acelular das células vermelhas do sangue de acordo com a reivindicação 1, substancialmente isento de agentes patogénicos, antigênios microbianos e antigénios virais.
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