DE2617822C3

DE2617822C3 - Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten

Info

Publication number: DE2617822C3
Application number: DE19762617822
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Chem. Dr. 6450 Hanau Bonhard; Uwe Boysen; Hans Dipl.-Chem. Dr. Schleussner
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1976-04-23
Filing date: 1976-04-23
Publication date: 1981-01-08
Also published as: DE2617822A1; FR2348703A1; FR2348703B1; DE2617822B2

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten.

Der Sauerstoff-Halbsättigungsdruck des Hämoglobins (Hb), Pio-Wert genannt, beträgt in intakten Erythrozyten bekanntlich 27 Torr. Neben dem intraerythrozytären pH-Wert von 7,25 ist für jenes Maß der Sauerstoff-Abgabebereitschaft vor allem der Gehalt an 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) verantwortlich. Für alle Infusionspräparate auf der Basis von freigelöstem Hämoglobin bzw. Derivaten davon, ist der pH-Wert des Blutplasmas von etwa 7,4 maßgebend, da sie zwängsläu-/ig unter diesen Bedingungen den Sauerstoff transport tieren müssen. Bereits diese Tatsache führt zu einer Linksverschiebung der Sauerstoff-Bindungskurve ent* sprechend einer Erniedrigung des Pso-Wertes auf günstigenfalls etwa 24 Torr, Ist eine solche Hämoglobinlösung aber erst infundiert, dann wird sofort im Dissoziations'Gleichgewicht ungebundenes 2,3-Diphosphoglycerat aufgrund seiner geringen Molekülgröße durch die Nieren ausgeschieden. Das DPG ist an Hb salzartig gebunden und dissoziiert entsprechend rasch nach, so daß in kurzer Zeit alles in der Blutbahn freigelöste Hb von DPG entblößt ist Infolgedessen sinkt der P₅o-Wert auf 15-17 Torr ab. Ein höherer P₅₀-Wert weist auf eine erhöhte Sauerstoff-Abgabebereitschaft eines Präparates hin.

Man war deshalb bestrebt, ein Hämoglobinpräparat zu finden, das leicht Sauerstoff für eine Sauerstoffversorgung des Gewebes abgibt Aus R. E. Benesch, R. Benesch, A. Bank, R. Renthal und B. A. Bray in Proc. I. Interamer. Symp. Hemoglobins, Caracas (1969), »Genetical, functional and physical studies of hemoglobins, pgs. 134-142 (Karger, Basel 1971) ist bekannt, daß Pyridoxal-5-phosphat (Fig. I) bevorzugt auch an der gleichen Stelle der Hb-Molekel gebunden wird wie DPG, überraschenderweise jedoch erheblich fester als Diphosphoglycerat an das Hämoglobin gebunden ist Das in dieser Druckschrift beschriebene Modellpräparat aus Hämoglobin und Pyridnxalphosphat wird durch Umsetzung von 1 Mol Hämoglobin mit 1 MoI Pyridoxalphosphat und anschließende Deoxygenierung und Reduktion mit einem lOfachen Oberschuß an Natriumborhydrid in Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 73 hergestellt

In der Druckscl· dft R. Benesch, R. E. Benesch und C. I.-Yu, »Reciprocal binding of oxygen and diphosphoglycerate by human hemoglobin«, Proc. nat Sei, Wash 59, 526-532 (1968) des gleichen Autors, auf die im Literaturanhang der erstgenannten Druckschrift hingewiesen wird, wird dasjenige Verfahren beschrieben, nach dem der Autor sein Hämoglobin gewinnt Danach erfolgt die Hämolyse mittels Toluol.

Ein so hergestelltes Produkt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besitzt zwar eine erhöhte Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, läßt sich jedoch nicht als Infusionslösung verwenden, da es pyrogene Reaktionen auslöst.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es möglich ist, ein für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat herzustellen, das aus einem Kondensationsprodukt von Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besteht und keine pyrogene Reaktion bewirkt Ein solches Pr.':iarat kann wegen seiner günstigen Sauerstoff-Affinität therapeutisch intravenös angewendet werden. In diesem Kondensationsprodukt liegt ein Hämoglobintetrameres mit einer statistischen Verteilung von Pyridoxalphosphat am Hämoglobin vor. Das Präparat hat selbst bei einem pH-Wert von 7,4 einen P₅₀-Wertvon32Torr.

Derartige pyrogenfreie und im Blutkreislauf als hervorragende Sauerstoff-Donatoren wirksame Infusionslösungen (Hb/PP) gewinnt man dadurch, daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher in H*-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzen* tration von 5 bis 8% mit Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1 N-Natronlauge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch Zusetzen Von reinem Stickstoff verdrängt ist, 1,1 g Pyridoxal-5--phosphat je Liter 6 bis 8%ige Hämoglobin^

lösung zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt und schließlich mit 1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 20⁰C einstellt und sterilfiltriert

Zur Erfindungshöhe/technischen Fortschritt wird geltend gemacht, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine Kombination aus einer Vielzahl einzelner Verfahrensmerkma¹«* darstellt, die durch keine der Entgegenhaltungen, weder einzeln noch in Kombination, nahegelegt wurde und daß es mit Hilfe dieses Verfahrens erstmals gelungen ist, ein Hämoglobinpräparat mit einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat zu erzielen, das im Gegensatz zu einem gemäß den Entgegenhaltungen hergestellten Produkt keine pyrogene Reaktion bewirkt und somit für die intravenöse Injektion geeignet ist.

Es kann eine Vorbehandlung erfolgen, bei der menschliche Erythrozyten bei 10-15⁰C 5 bis 15 Minuten mit verdünnten Lösungen von jS-Propiolactnn behandelt werden, wobei der Anteil von ß-P opiolacton (0-Pl) 4-12 g je Liter Erythrozytensedimem beträgt, anschließend mit einer schwach alkalischen Lösung von überschüssigem ß-P\ und dessen Reaktionsprodukten freigewaschen und durch Einrühren in 1 bis 2 Liter aqua pro injektione pro Liter Erythrozytensediment hämolysiert werden. Diese Vorbehandlung ist jedoch zur Herstellung des gewünschten Präparates nicht zwingend notwendig, es genügt auch eine einfache mehrfache Waschbehandlung. Das erhaltene Hämolysat wird dann mit einem Kationenaustauscher in de, H ⁺-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0-5,5 abgesunken ist und bei pH 5,3-5,7, gegebenenfalls nach Einstellen mit 1-normaler Natronlauge, vom Harz und der ausgefällten Stroma-Masse durch Kühlzentrifugation befreit. Durch Verdünnen mit aqua pro injektione wird auf eine Hämoglobinkonzentration von 5 — 8% und mit 1-normaler Natronlauge auf einen pH-Wert zwischen ~" und 9 eingestellt Die Elektrolyte werden durch entsprechende Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat pro Liter zugefügt gegebenenfalls die Lösung nochmals durch Kühlzentrifugation geklärt und anschließend in einem geschlossenen Gefäß unter einem Vakuum von 20 Torr Π Minuten gerührt, die R^aktionsmasse dann unter Reinstickstoff-Gasatmosphäre gesetzt, 30-60 Sekunden damit überspült, mit 1,1 g Pyridoxal-5-pho3-phat-monohydrat pro Liter 6-8%ige Hämoglobinlösung versetzt und uii'er der Stickstoffatmosphäre 1 Stunde bei Raumtemperatur weitergerührt. Dann wird 1 N-Natrcnlauge zugetropft, bis einen pH-Wert von 7,6 bei 2O⁰C erreicht ist. Die Lösung wird schließlich in Infusionseinheiten zu 300 ml oder 500 ml sterilfiltriert.

Das Säulen-Chfomatogramm solcher Präparate (Sephadex G-150, 90 χ 1,5 cm, 03 ml Auftragsvolumen) zeigt F i g. 2 der Zeichnungen.

Die Pio-Werte des erfindungsgemäßen Präparates bei einem pH-Wert von 7.45 liegen zwischen 30 und 40Torr und übertreffen damit den P 50-Wert des Hämoglobins in den Erythrozyten beträchtlich.

Als Ausgangsiriaterial können auch bereits abgelaufene Blutbank-Erythrozyten verwendet werden.

Außer einem einwandfreien Pyrogentest wurde das erfindungsgemäße Infusiönspräparat aus Hb/PP an Ratten und Mäusen auf akute Toxizität geprüft Dabei wurden noch 50 ml piner 8%igen Lösung pro kg Körpergewicht ohne abnormales Verhalten und ohne auffällige Symptome V^n den Ratten intravenös vertragen. Nachdem Mäuse eine intravenöse Dosis ran 100 ml pro kg Körpergewicht noch überlebten, wurde gemäß THAER: »Grundlagen der experimentellen Arzneimittelforschunt;« (1965) bestimmt, daß die LD50 größer als 50 ml kg Körpergewicht beträgt und die Substanz mit dem Prädikat »relativ harmlos« einzustufen ist

Im Gegensatz zu dem Produkt von R. E. und R. BENESCH konnte bei dem erfindungsgemäßen Präparat aufgrund eines konstanten Pso-Wertes nachgewiesen werden, daß die Schiffsche-Basen-Bindung des Pyridoxalphosphates an die Aminogruppe des N-terminalen Valins der /J-Kette des Hämoglobins gegen Dialysebehandlung in vitro resistent ist Es wurde eine erschöpfende Dialyse gegen 0,9% Kochsalzlösung bei 10⁰C durchgeführt

Ergebnis

Präparat

P 50 (Torr)
vor Dialyse

nach Dialyse

Hb/Pi¹ 731017
Hb/PP 731013

32 39

33 37

Vergleiche dazu Literatur-Zitat R.E. BENESCH eLal. 1971.

Die überlegene Wirksamkeit unter den physiologi-

jo sehen Bedingungen des Blutkreislaufes zeigt das Präparat Hb/PP auch im Tierversuch. Das Präparat gibt auch unter einem normalen venösen Sauerstoff-Partialdruck von 40 Torr bereits Sauerstoffmengen an das Gewebe ab, die freigelöstes normales Hämoglobin erst unter pathologischen Verhältnissen, d. h. wenn der venöse PO₂ auf etwa 20 Torr abgesunken ist (K.

MESSMER et al. in Vorbereitung), erreicht.

Das erfindungsgemäße Präparat und seine Herstellung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter er'äutert

Beispiel 1

Das Erythrozytensediment einer 4 Wochen gelagerten Blutkonserve (etwa 270 m!) wird IC Minuten mit '/3 seines Volumens einer l,6%igen Kochsalzlösung mit 1,2% ß-Propiolacton-Gehalt verrührt. Die Erythrozyten werden bei 0⁰C abzentrifugiert und nach Absaugen des Überstandes und der gebildeten Thrombozyten-Haut noch 4mal mit dem 1 - bis 2fachen Volumen folgender Lösungen auf der Kühlzentrifuge gewaschen:

1. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser

2. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser

3. 1 :1-Mischung l,6%ige Kochsalz-/3,8%ige Bicarbonat-Lösunj

4. l,6%ige Kochsalzlösung

Zur Hämolyse werden die gewaschenden Erythrozyten in die Meng- aqua pro injectione eingerührt, die dem Erythrozyten-Ausgangsvolumen entspricht, und mit Kationenaustauscher-Suspension in der H+-Form — zum Beispiel DOWEX 50 WX 8 — versetzt, bis der pH'Wert auf 5 absinkt Es folgt Abstumpfung auf einen pH-Wert von 5,5-5,7 mit 1 η-Natronlauge und Abtrennung von SWnma und Harz durch Kühlzentrifugierung und Abgießen. Mit aqua pro injectione wird der Überstand auf 8,6% Hämoglobin verdünnt, mit 1 n-Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt und pro Liter Lösung mit 3,6 g Natriumchlorid, 22 g Glukose-monohydrat,

0,29 g Kaliumchlorid, 0,23 g Calciumchlorid-dihydrat und 0,25 g Magnesiumsulfat-heptahydrat versetzt.

Nach erneuter Kühlzentrifugation wird dekantiert und in geschlossenem Gefäß 10 Minuten unter einem Vakuum von 20 Torr gerührt.

Durchleiten von Reinstickstoffgas vertreibt den letzten Sauerstoff, so daß anschließend das Hämoglobin überwiegend in der Desoxyform vorliegt Diese wird init 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat je Liter Lösung (entspricht etwa 3,5 Mol Pyridoxalphosphat pro 1 Mol Hb-Tetramer) umgesetzt, indem 1 Stunde bei 20⁰C Unter Stickstoff gerührt wird nach vorheriger Zugabe von 2,12 g Natriumbicarbonat pro Liter.

Es folgt eine Endeinstellung mit 1 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 (bei 20⁰C) und Sterilfiltration. Ausbeute:

Etwa 400 ml Lösung, 8%ig an Hb.
Fsö-Wefi bei pH 7,45:32Torf.

Beispiel 2 '

Die vereinigten Erythrozytensedimente sechs frischer Blutkonserven (etwa 1,5 1) werden gemäß Beispiel 1, jedoch 5 Minuten mit 2,0% ^-Propiolacton/1,6% Natriumchlorid-Lösung behandelt. Die Hämolyse erfolgt mit dem doppelten Erythrozyten-Volumen von etwa 3 Litern aqua pro injectione. Die pH-Einstellung mit 1 η-Natronlauge vor dem Zusatz von — der Verdünnung angepaßt — 0,82 g Pyridoxal-phosphatmonohydrat pro Liter Lösung erfolgt in Abweichung Von Beispiel 1 auf 9,0 und die Rührdauer unter Stickstoff beträgt 2 Stunden.

Nach wiederum analoger Aufarbeitung resultieren

4 Liter einer Hb/PP^Lösung, 6°/oig an Hb
P₅o'Wert:32Torr.

Beispiel 3

Das Erythrozyterisediment einer 1Ö Tage alten Blutkonserve wird ohne ^-Propioiaclon-Vorbehandlung den 4 Waschvorgängen analog Beispiel 1 unterworfen. Die gewaschenen Erythrozyten werden aber in 450 ml aqua pro injektione hämolysiert (stärkere Verdünnung). Zur Reaktion mit 1,1 g PyridoxaU5-phosphatrnonohydrat pro Liter Lösung (entsprechend 5 Mol Pyridoxalphosphat pro 1 MoI Hb-Tetramer) wird aber auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und anschließend 2 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt.

Nach der üblichen Elektrolyt-Endeiristellung erhält man etwa 700 ml Hb/PP-Lösung mit einem Gehalt von 5,5% Hb. P50-Wert: 39 Torr.

Beispiel 4

Vereinigte Erythrozytensedimente von 25 abgelaufenen Blutkonserven (etwa 6 1) werden gemäß Beispiel 1, aber nur 5 Minuten mit der angegebenen jJ-Propiolacton-/K.öchsalz"»LösUng gerührt Abweichend von Beispiel 1 "jrfolgt außerdem die pH-Einstellung auf einen Wert von 7,0 vor Zusatz des Pyridoxalphosphates.

Am Ende der analog Beispiel 1 durchgeführten Weiterverarbeitung werden 10,5 Liter eines Hb/PP-Prä' parates mit einem Hb-Gehalt von 8% gewonnen, das einen P₅₀- Wert von 34 Torr hat.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hömoglobinpräparates mit einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, das keine pyrogene Reaktion bewirkt, aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat, bei dem man Hämoglobin mit Pyridoxalphosphat umsetzt und das I ο Produkt anschließend deoxygeniert, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher in H+-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentr;^cugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkon7entration von 5 bis 8% mit Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1 N-Natronlauge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemoriohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäb durch Zusetzen von reinem Stickstoff verdrängt ist, 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat je Liter 6 bis 8°/oige Hämoglobinlösung zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur we'terrührt und schließlich mit 1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 20° C einstellt und sterilfiltriert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Z satz des Glucosemonohydrats die Lösung nochmals klärt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Waschen der menschlichen Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen zusätzlich ide Erythrozyten zunächst bei 10 bis 15°C 5 bis 15 Minuten mit verdünnten Lösungen von /3-Propiolacton in einem Verhältnis von 4 bis 12 g /J-Propiolacton je Liter Erythrozytensediment behandelt.