DE2617822A1

DE2617822A1 - Haemoglobinpraeparat mit erhoehter sauerstoffabgabe

Info

Publication number: DE2617822A1
Application number: DE19762617822
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl Chem Dr Bonhard; Uwe Boysen; Hans Dipl Chem Dr Schleussner
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1976-04-23
Filing date: 1976-04-23
Publication date: 1977-10-27
Also published as: FR2348703A1; DE2617822C3; DE2617822B2; FR2348703B1

Description

Biotest-Serum-Institut GmbH, 6000 Frankfurt am Main

Hämoglobinpräparat mit erhöhter Sauerstoffabgabe

Die Erfindung bezieht sich auf ein für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten.

Der Sauerstoff-Halbsättigungsdruck des Hämoglobins (Hb) PcQ-Wert genannt, beträgt im intakten Erythrozyten bekanntlich 27 Torr. Neben dem intraerythrozytären pH-Wert von 7,25 ist für jenes Maß der Sauerstoff-Abgabebereitschaft» vor allem der Gehalt an 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) verantwortlich. Für alle Infusionspräparate auf der Basis von freigelöstem Hämoglobin, beziehungsweise Derivaten davon,

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ist der pH-Wert des Blutplasmas von etwa 7,4 maßgebend, da sie zwangsläufig unter diesen Bedingungen den Sauerstoff transportieren müssen. Bereits diese Tatsache führt zu einer Linksverschiebung der Sauerstoff-Bindungskurve entsprechend einer Erniedrigung des P^-Wertes auf günstigenfalls etwa 24 !Dorr. Ist eine solche Hämoglobinlösung aber erst infundiert, dann wird sofort im Dissoziations-Gleichgewicht ungebundenes 2,3-Diphosphoglycerat aufgrund seiner geringen Molekülgröße durch die Nieren ausgeschieden. Das DPG- ist ab Hb salzartig gebunden und dissoziiert entsprechend rasch nach, so daß in kurzer Zeit alles in der Blutbahn freigelöste Hb von DPG entblößt ist. Infolge dessen sinkt der Pj-Q-Wert auf 15 - Ί7 Torr ab. Ein höherer

Q weist auf eine erhöhte Sauerstoff-Abgabebereitschaft eines Präparates hin.

Bisher wurde noch kein Hämoglobinpräparat gefunden, daß leicht Sauerstoff für eine Sauerstoffversorgung des Gewebes abgibt. Es ist bekannt, daß Pyridoxal-5-phosphat (Fig. I) bevorzugt auch an der gleichen Stelle der Hb-Molekel gebunden wird wie DPG, überraschenderweise ist es jedoch fester als Diphosphoglycerat an das Hämoglobin gebunden. Das von R.E. BENESCH, R. BENESCH, A. BEBE, R. und B.A. BRAT in Proc. I. Interamer. Symp. Haemoglobins, Car/acas (1969), "Genetical, functional and physical

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studies of hemoglobins, pgs. 134 - 142 (Karger, Basel 1971) beschriebene Modellpräparat aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat läßt sich nicht als Infusionslösung verwenden, da es pyrogene Reaktionen auslöst.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es möglich ist, ein für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten herzustellen, daß aus einem Kondensationsprodukt von Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besteht und keine pyrogene Reaktion bewirkt. Ein solches Präparat kann wegen seiner günstigen Sauerstoff-Affinität therapeutisch intravenös angewendet werden. In diesem Kondensationsprodukt liegt ein Hämoglobintetrameres mit einer statistischen Verteilung von Pyridoxalphosphat am Hämoglobin vor. Das Präparat hat selbst bei einem pH-Wert von 7»4 einen Pt-Q-Wert von 32 Torr.

Derartige pyrogenfreie und im Blutkreislauf als hervorragende Sauerstoff-Donatoren wirksame Infusionslösungen (Hb/PP) gewinnt man, wenn man von dem Verfahren der Hämoglobingewinnung von R.E. BEMESGH und R. BENESCH (Proc. of the National Academy of Science USA jjo,, 526 - 532 (1968)) abweicht und dabei folgendermaßen vorgeht:

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Menschliche Erythrozyten werden bei 1O-15°C5-15 Minuten mit verdünnten Lösungen von ß-Propiolaction behandelt, wobei der Anteil von ß-Propiolacton (ß-Pl) 4 - 12 g je Liter Erythrozytensediment beträgt, anschließend mit einer schwach alkalischen Lösung von überschüssigem ß-Pl und dessen Reaktionsprodukten freigewaschen und durch Einrühren in 1 bis 2 Liter aqua pro injektione pro Liter Erythrozytensediment hämolysiert. Diese Vorbehandlung ist jedoch zur Herstellung des gewünschten Präparates nicht zwingend notwendig, es genügt auch eine einfache mehrfache Waschbehandlung. Das erhaltene Hämolysat wird dann mit einem Kationenaustauscher in der H⁺-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 - 5»5 abgesunken ist und bei pH 5j5 - 5»7» gegebenenfalls nach Einstellen mit 1-normaler Natronlauge, vom Harz und der ausgefällten Stroma-Masse durch Kühlzentrifugation befreit. Durch Verdünnen mit aqua pro injektione wird auf eine Hämoglobinkonaentration von 5 - 8 % und mit 1-normaler-Natronlauge auf einen pH-Wert zwischen 7 und 9 eingestellt. Die Elektrolyte werden durch entsprechende Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat pro Liter zugefügt, gegebenenfalls die Lösung nochmals durch Kühlzentrifugetion geklärt und anschließend in einem geschlossenen Gefäß unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten gerührt,, die Reaktionsmasse dann unter Reinstickstoff-Gasatmosphäre gesetzt, 30 - 60 Sekunden damit überspült, mit 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter

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6-8 %ige Hämoglobinlösung versetzt und unter der Stickstoffatmosphäre 1 Stunde bei Raumtemperatur weitergerührt. Dann wird 1 N - Natronlauge zugetropft, bis ein pH-Wert von 7j6 bei 20 ⁰C erreicht ist. Die Lösung wird schließlich in Infusionseinheiten zu 300 ml oder 500 ml sterilfiltriert.

Das Säulen-Chromatogramm solcher Präparate (Sephadex G-150, 90 χ 1,5 cm, 0,3 ml Auftragsvolumen) zeigt Fig. II der beigefügten Zeichnungen.

Die PcQ-Werte des erfindungsgemäßen Präparates bei einem pH-Wert von 7»4-5 liegen zwischen 30 und 40 Torr und übertreffen damit den P,-₀-Wert des Hämoglobins in den Erythrozyten beträchtlich.

Als Ausgangsmaterial können auch bereits abgelaufene Blutbank-Erythrozyten verwendet werden.

Außer einem einwandfreien Pyrogentest wurde das erfindungsgemäße Infusionspräparat aus Hb/PP an Ratten und Mäusen auf akute Toxizität geprüft. Dabei wurden noch 50 ml einer 8 %igen Lösung pro kg Körpergewicht ohne abnormales Verhalten und ohne auffällige Symptome von den Ratten intravenös vertragen. Nachdem Mäuse eine intravenöse Dosis von 100 ml pro kg Körpergewicht noch überlebten, wurde gemäß QHAER: "Grund-

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lagen der experimentellen Arzneimittelforschung" (1965) bestimmt, daß die

LD₁-Q größer als 50 ml 4- kg Körpergewicht beträgt,

und die Substanz mit dem Prädikat "relativ harmlos" einzustufen ist.

Im Gegensatz zu dem Produkt von R.E. und R. BENESCH konnte bei dem erfindungsgemäßen Präparat aufgrund eines konstanten Pc-Q-Wertes nachgewiesen werden, daß die Schiff 'sche-Basen-Bindung des Pyridoxalphosphates an die Aminogruppe des N-terminalen Valins der ß-Kette des Hämoglobins gegen Dialysebehandlung in vitro resistent ist. Es wurde eine erschöpfende Dialyse gegen 0,9 % Kochsalzlösung bei 10 ΐ durchgeführt.

Ergebnxs	vor Dialyse	(Torr) nach	Dialyse
Präparat	52 59		55 57
Hb/PP 751017 Hb/PP 751015

Vergleiche dazu Literatur-Zitat R.E. BENESGH et. al. 1971.

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Die überlegene Wirksamkeit unter den physiologischen Bedingungen des Blutkreislaufes zeigt das Präparat Hb/PP auch im Tierversuch. Das Präparat gibt auch unter einem normalen venösen Sauerstoff-Partialdruck von 40 Torr bereits Sauerstoffmengen an das Gewebe ab, die freigelöstes normales Hämoglobin erst unter pathologischen Verhältnissen, d. h. wenn der venöse POp auf etwa 20 Torr abgesunken ist (K. MEßMER et. al. in Vorbereitung), erreicht.

Das erfindungsgemäße Präparat und seine Herstellung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Das Erythrozytensediment einer 4 Wochen gelagerten Blutkonserve (etwa 270 ml) wird 10 Minuten mit 1/3 seines Volumens einer 1,6 %igen Kochsalzlösung mit 1,2 % ß-Propiolacton-Gehalt verrührt. Die Erythrozyten werden bei 0 ⁰C abzentrifugiert und nach Absaugen des Überstandes und der gebildeten Thrombozyten-Haut noch 4mal mit dem 1- bis 2-fachen Volumen folgender Lösungen auf der Kühl zentrifuge gewaschen:

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1. 3»8 % Natriumbicarbonat/Wasser 2 ι' » H κ

3. 1i1 Mischung 1,6 %±ge Kochsalz-/3,8 %ige Bicarbonat-Lösung

4. 1,6 %ige Kochsalzlösung

Zur Hämolyse werden die gewaschenen Erythrozyten in die Menge aqua pro inlectione eingerührt, die dem Erythrozyten-Ausgangsvolumen entspricht, und mit Kationenaustauscher-Suspension in der H⁺-Form - zum Beispiel DOWEX 50 WX 8 versetzt, bis der pH-Wert auf 5 absinkt. Es folgt Abstumpfung auf einen pH-Wert von 5» 5 - 5j7 mit 1n-Natronlauge und Abtrennung von Stroma und Harz durch Kühlzentrifugierung und Abgießen. Mit aqua pro inlectione wird der Überstand auf 8,6 % Hämoglobin verdünnt, mit In-Natronlauge auf pH 7»5 eingestellt und pro Liter Lösung mit 3»6 g Natriumchlorid, 22 g Glukose-monohydrat, 0,29 g Kaliumchlorid, 0,23 g Oacliumchlorid-dihydrat und 0,25 g Magnesiumsulfat-heptahydrat versetzt.

Nach erneuter Kühlzentrifugation wird dekantiert und in geschlossenem Gefäß 10 Minuten unter einem Vakuum von 20 Torr gerührt.

Durchleiten von Reinstickstoffgas vertreibt den letzten Sauerstoff, so daß anschließend das Hämoglobin überwiegend

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^V ΛΑ

in der Desoxyform vorliegt. Diese wird mit 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat je Liter Lösung (entspricht etwa 3,5 mol Pyridoxalphosphat pro 1 Mol Hb-Tetramer) umgesetzt, indem 1 Stunde "bei 20 ⁰C unter Stickstoff gerührt wird nach vorheriger Zugabe von 2,12 g Natriumbicarbonat pro Liter.

Es folgt eine Endeinstellung mit 1n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 (bei 20 ⁰C) und Sterilfiltration.

Ausbeute: Etwa 400 ml Losung, 8 %ig an Hb. P₅₀-Wert bei pH 7,45: 32 Torr

Beispiel 2

Die vereinigten Erythro zyt ens ediment e sechs frischer Blutkonserven (etwa 1,5 1) werden gemäß Beispiel 1, jedoch J| Minuten mit 2,0 % ß-Propiolacton/1,6 % Natriumchlorid-Lösung behandelt. Die Hämolyse erfolgt mit dem doppelten Erythro zyt en-Volumen von etwa 3 Litern aqua pro in^ectione. Die pH-Einstellung mit In-Natronlauge vor dem Zusatz von - der Verdünnung angepaßt - 0,82 g Pyridoxal-phosphatmonohydrat pro Liter Lösung erfolgt in Abweichung von Beispiel 1 auf 9jO und die Eührdauer unter Stickstoff beträgt 2 Stunden.

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Nach wiederum analoger Aufarbeitung resultieren

4- Liter einer Hb/PP-Lösung, 6 %ig an Hb ;: 32 Torr

Beispiel 5

Das Erythrozytensediment einer 10 Tage alten Blutkonserve wird ohne ß-Propiolacton-Vorbehandlung den 4- Waschvorgängen analog Beispiel 1 unterworfen. Die gewaschenen Erythrozyten werden aber in 4-50 ml aqua pro iniectione hämolysiert (stärkere Verdünnung). Zur Reaktion mit 1,1 g Pyrodoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter Lösung (entsprechend 5 mol Pyridoxalphosphat pro 1 mol Hb-Tetramer) wird aber auf einen pH-Wert von 7_T3 eingestellt und anschließend 2 Stunden unter Stickstoff bei Baumtemperatur gerührt.

Nach der üblichen Elektrolyt-Endeinstellung erhält man etwa 700 ml Hb/PP-Lösung mit einem Gehalt von 5,5 % Hb. P₅₀-Wert: 59 Torr

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Al 26178

Beispiel 4

Vereinigte Erythrozytensedimente von 25 abgelaufenen Blutkonserven (etwa 6 1) werden gemäß Beispiel 1, aber nur _£ Minuten mit der angegebenen ß-Propiolacton-ZKochsalz-Lösung gerührt. Abweichend von Beispiel 1 erfolgt außerdem die pH-Einstellung auf einen Wert von 7,0 vor Zusatz des Pyridoxalphosphates.

Am Ende der analog Beispiel 1 durchgeführten Weiterverarbeitung werden 10,5 Liter eines Hb /PP-Pr äp ar at: es mit einem Hb-Gehalt von 8 % gewonnen, das einen P^-Wert von 34 Torr hat.

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Claims

^4) Für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat mit einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besteht, das keine pyrogene Reaktion bewirkt.
2.) Verfahren zur Herstellung eines Präparates gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen mehrmals, insbesondere wenigstens 4mal behandelt, dann hämolysiert und mit einem Kationenaustauscher in H⁺-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5*0 - 5»5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5 - 8 % mit Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7-9 mit 1 N-Hatronlauge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat/1 zugibt, vorzugsweise die Lösung nochmals klärt und dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch reinen Stickstoff verdrängt ist, 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat «je Liter 6-8 %ige Hämoglobinlösung zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt und schließlich

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mit 1 N-Uatronlauge auf einen pH-Wert von 7*6 bei 20 "C einstellt und sterilfiltriert.
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Erythrozyten zunächst bei 10-15^5-15 Minuten mit verdünnten Lösungen von ß-Propiolacton in einem Verhältnis von 4 - 12 g ß-Propiolacton je Liter Erythrozytensediment behandelt und anschließend das Behandlungsmittel und seine Reaktionsprodukte mit schwach alkalischen Lösungen auswäscht.

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