NL8720283A - Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes. - Google Patents

Description

N.0. 34975 8 7 2 0 2 83 f >* 1 f \ <t

Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING Gebied van de uitvinding

De uitvinding heeft betrekking op een acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes dat een oplossing van in wezen tetrameer-5 vrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine, welke oplossing vrij is van stroma-verontreinigingen, omvat. Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van het aeel-lulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes.

Beschrijving van de stand der techniek 10 Het is al enige jaren bekend dat stromavrij hemoglobine het vermogen heeft zuurstof te transporteren en zuurstof (of liganden) reversibel te binden. Omdat problemen met de giftigheid het gebruik als een bloedvervangingsmiddel in de weg stonden, waren verdere aanpassingen aan stromavrij hemoglobine nodig om te komen tot een niet-giftig, 15 bruikbaar farmceutisch produkt. In de Amerikaanse octrooischriften 4.001.200, 4.001.401 en 4.053.590 wordt een gepolymeriseerd, verknoopt, stromavrij hemoglobine geopenbaard als bloedvervangingsmiddel dat zuurstof naar de weefsels en de organen moet brengen en als bloedplasma-zwelmiddel. Het pyridoxyleren van het stromavrije hemoglobine blijkt 20 een gunstige invloed te hebben op het vermogen zuurstof reversibel te binden en blijkt de stabiliteit en de houdbaarheid van het biologische produkt te verhogen. (J. Surgical Research 30, 14-20 (1981)). Gepyri-doxyleeerd, met glutaaraldehyd gepolymeriseerd hemoglobine is beschreven in L.R. Segal, et al, In Vitro and In Vivo Characteristics of 25 Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin Solution, Fed. Proc. 39, 2383 (1980); L.R. Sehgal, et al, Preparation and In Vitro Characteristics of Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin, Transfusion 23(2), 158 (maart-april 1983). Verder is de werking van het gepolymeriseerde, gepyridoxy-1 eerde hemoglobine als zuurstofdrager geopenbaard in L.R. Seghal, et 30 al, Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin: A Red Cell Substitute with Normal Oxygen Capacity, Surgery 95(4), 433-38 (april 1984); L.R.

Seghal, et al, An Appraisal of Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin as an Acellular Oxygen Carrier, Advances in Blood Substitute Research 19-28 (Alan R. Liss, Inc. 1983).

35 Jarenlang is door onderzoekers gemeld dat volgens uiteenlopende technieken bereide hemoglobine-oplossingen weliswaar in staat zijn voldoende hoeveelheden zuurstof te dragen om het leven in stand te houden, maar toch ongewenste bijeffecten hebben. Het meest verontrustende ne- ,8720283 •Γ jk 2 veneffect is een verminderde werking van de nieren. Verondersteld werd dat deze veranderingen het gevolg zijn van de aanwezigheid van ongewenste contaminanten zoals bacterieel endotoxine of brokstukken van de membranen van rode cellen (stroma). Hoewel contaminanten als deze in-5 derdaad wijzigingen in de nierwerking met zich kunnen brengen, leiden hemoglobine-oplossingen die nagenoeg vrij zijn van de bovenbedoelde contaminanten toch noch tot een aanzienlijke verstoring van de nier-functie. Ook al is deze storing tijdelijk en omkeerbaar, toch kan deze in een ziektetoestand zoals bij shock door bloedverlies, wanneer de 10 nier bij deze toestand van geringe bloedtoevoer toch al in gevaar is, bijzonder alarmerend zijn. De oorzaak van de verstoorde nierfunctie wordt toegeschreven aan fysiologisch onaanvaardbare hoeveelheden niet-gepolymeriseerd hemoglobine-tetrameer. Andere ongewenste bijeffecten van de infusie van tetrameer hemoglobine zijn vergiftiging van de nier, 15 vaatvernauwing, hemoglobinurie, vermindering van de hartslag, verhoging van de gemiddelde slagaderlijke bloeddruk en extravasatie van infuus-vloeistof, in het bijzonder in de buiklvlieshol te.

In de praktijk is er tot nu toe geen bekend van hemoglobine afgeleid bloedvervangingsmiddel erin geslaagd toxiciteitsproblemen volledig 20 te vermijden. De volgens de stand van de techniek bereide produkten blijken uiteenlopende hoeveelheden hemoglobine-tetrameer te bevatten.

De bereidingswijze volgens de Amerikaanse octrooischriften 4.001.200, 4.001.401 en 4.053.590 levert bijvoorbeeld geen therapeutisch bruikbaar produkt. Ten eerste is er, net als bij andere werkwijzen, sprake van 25 een ongewenste grote hoeveelheid niet-gepolymeriseerd hemoglobinetetra-meer in het uiteindelijke produkt. Ten tweede kunnen er te veel verontreinigingen, zoals giftig rest-tolueen, in de oplossing achterblijven doordat deze tijdens de bereiding niet volledig zijn verwijderd. Ten derde zal het produkt dat volgens de beschrijving een Pgg van 100-30 120 mm Hg heeft, fysiologisch onwerkzaam zijn omdat de hemoglobine-op-lossing geen zuurstof in de longen zal opnemen. Tenslotte leiden grotere hoeveelheden polymeren met hoger molecuul gewicht tot een produkt met een grote gevoeligheid voor gelering zodat de daaropvolgende stappen van filtrering en zuivering moeilijk of niet uitvoerbaar zijn dan al-35 leen in onaanvaardbaar verdunde oplossingen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Belangrijk doel van de uitvinding is het verschaffen van een niet-giftige hemoglobine-oplossing die therapeutisch bruikbaar is als een acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes.

40 Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een niet- .8720283 * 4 3 § giftige hemoglobine-oplossing die in staat is reversibel zuurstof te Λ binden en die geen onderzoek naar de verenigbaarheid met een ontvanger vergen. Een verder doel is het verschaffen van een zuivere, poly-mere hemoglobine-oplossing die in wezen vrij is van niet-gemodificeerd 5 hemoglobinetetrameer met een normaal zuurstof dragend vermogen.

Een ander doel is het verschaffen van een tijdelijke zuurstofdra-ger die nagenoeg vrij van microbiële en virale anti genen en ziektekiemen kan worden gemaakt.

Met het oog op de bovenstaande en andere doeleinden, verschaft de 10 uitvinding een in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd, ge-pyridoxyleerd hemoglobine dat nagenoeg vrij is van stroma en andere contami nanten.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Als tekeningen gaan hierbij veertien figuren die in het navolgende 15 uitvoerig worden beschreven, en die de uitvinding en de afwijking ten opzichte van de stand der techniek toelichten, waarbij: FIG. 1 een schematische weergave van de ladingsgewijze uitvoering van de pyridoxylering is; FIG. 2 een schematische weergave van de pyridoxylering en polyrae-20 risering met behulp van een membraan volgens de uitvinding is; FIG. 3A, 3B en 3C grafische weergaven zijn van een dichtheidsme-ting van in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyri-doxyleerd hemoglobine dat is afgescheiden door elektroforese op SDS-po-lyacrylamidegel; 25 FIG. 4 een elutiepatroon van verknoopt, gepolymeriseerd en gepyri - doxyleerd hemoglobine verkregen met een gelfiltratiekolom weergeeft; FIG. 5 een elutiepatroon van in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine verkregen met een gelfiltratiekolom weergeeft; 30 FIG. 6A een grafiek is die de spectrale curve voor oxyhemoglobine weergeeft; FIG. 6B een grafiek is die de spectrale curve welke is verkregen met geoxygeneerd, in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine weergeeft; 35 FIG. 7 een grafiek is die het verband tussen de hemoglobineconcen-tratie van het in wezen tetrameervrije, verknoopte, gepolymeriseerde en gepyrodoxyleerd hemoglobine en de colloïde osmotische druk (COP) weergeeft; FIG. 8 een grafiek is die de dissociatiecurve van oxyhemoglobine 40 voor een in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyri- .8720283 * 4 i doxyleerd hemoglobine weergeeft; FIG. 9 een grafiek is die het elutiepatroon van in wezen tetrameervrij, verkoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine van een hoge-druk-vloeistofchromatografiekolom weergeeft; 5 FIG. 10 een grafiek is die het verband tussen de hemoglobinecon-centratie van het in wezen tetrameervrije, verknoopte, gepolymeriseerde en gepyridoxyleerde hemoglobine en de viscositeit van de oplossing weergeeft; en FIG. 11 een grafiek is die de plasma-verdwijningskromme voor stro-10 mavrij hemoglobine (SFH) en in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine weergeeft.

UITVOERIGE BESCHRIJVING VAN DE VOORKEURSUITVOERINGSVORM

De uitvinding heeft betrekking op een acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes dat een in wezen tetrameervrij, verknoopt, 15 gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine dat vrijwel geen stroma en andere verontreinigingen bevat, omvat.

In het kader van de uitvinding wordt onder de term "verknoopt" verstaan de chemische invoering van moleculaire "bruggen" of op in een molecuul of tussen moleculen met het oog op wijziging van de vorm, de 20 afmeting, de functie of de fysische eigenschappen van het molecuul. De term in wezen tetrameervrij duidt op een zuiverheidsgraad met betrekking tot contaminatie met tetrameer waarbij bepaalde biologische res-ponsen op aan een zoogdier toegediend tetrameer niet langer aanwezig zijn. Een belangrijk kriterium is het ontbreken van wijzigingen in de 25 nierfunctie bij infusie van farmaceutisch effectieve hoeveelheden, d.w.z. bij een zuiverheid van ongeveer 98% of beter (minder dan ongeveer 2% tetrameer aanwezig). De begrippen "ultra gezuiverd" of "gezuiverd" produkt hebben dezelfde betekenis als in wezen tetrameervrij. De term pol.ymerisatieoplossing duidt op een oplossing die een "verkno-30 pingsmiddel" of polymerisatiemiddel zoals glutaaraldehyd, imidoesters, diaspirine of andere in een biologisch geschikte drager bevat. De term halfdoorlatend membraan duidt op een membraan dat doorlatend is voor sommige moleculaire deeltjes en niet voor andere en, in het bijzonder, op een membraan dat als een selectief filter werkt dat moleculen van 35 ongeveer 30.000 dalton en meer tegenhoudt.

Het voortbrengsel van de werkwijze volgens de uitvinding, een oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine dat wezenlijk vrij is van tetrameer (natief) hemoglobine en verschillende andere con-taminanten, is fysiologisch aanvaardbaar en therapeutisch en klinisch 40 bruikbaar. Het voortbrengsel heeft het vermogen zuurstof reversibel te . 872 02 8 3 / 5 binden hetgeen nodig is voor zuurstoftransport. Als belangrijkste kenmerk heeft het voortbrengsel goede beladings- en ontladingskenmerken in het gebruik hetgeen overeenkomt met het hebben van een zuurstof-hemo-globine-dissociatiecurve (P50) dÏe gelijkt op die van natuurlijk 5 bloed. Het voortbrengsel heeft een sterke neiging tot het binden van zuurstof in de haarvaten in de longen en geeft vervolgens de zuurstof op de juiste wijze aan de weefsels in het lichaam af. Het voortbrengsel vergt ook geen onderzoek naar de verenigbaarheid met de ontvanger.

De werkwijze volgens de uitvinding is bijzonder doordat het een 10 produkt oplevert dat in een tot nu toe bij de fractionering en zuivering van polymere hemoglobinen onbekende mate vrij is van verontreiniging met tetrameer. Een ander voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat daarmee het eindprodukt nagenoeg vrij van microbiële en virale antigenen en ziektekiemen kan worden gemaakt. Tot dergelijke 15 antigenen en ziektekiemen behoren bijvoorbeeld bacteriöle, rickett-siële, schimmel achtige, protozoïsche, virale en andere organismen.

Het belangrijkste is dat het biologische produkt nagenoeg vrij kan worden gemaakt van virussen die hepatitis en verworven afweerdeficientie (AIDS) veroorzaken. Een van tetrameer hemoglobine en verschillende an-20 dere contaminanten vrij produkt heeft een zeer ruime klinische bruikbaarheid, gebruiksgemak en veiligheid.

Wat betreft de fysiologische eigenschappen: het biologische produkt volgens de uitvinding veroorzaakt geen vaatvernauwing, niervergif-tiging, hemoglobinurie of andere problemen die samenhangen met de in-25 traveneuze toediening van bekende hemoglobine-oplossingen die ongewenste hoeveelheden tetrameer hemoglobine bevatten. Resultaten hebben aangetoond dat bij intraveneuze toediening van het hier beschreven produkt geen merkbare vermindering in de urineproduktie, geen merkbare glomeru-laire filtratiesnel heid, geen waarneembare extravasatie in de buik-30 vliesholte en geen waarneembare kleurverandering van de geproduceerde urine optreden.

Daardoor is het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens de uitvinding bruikbaar voor de behandeling van trauma, hartspier!nfarct, beroerte, acute anemie en verstoringen in de 35 zuurstofvoorziening, zoals hypoxemie, hypoxie en therminale hypoxie die het gevolg zijn van het feit dat de volledige oxygenering van het bloed door de long is gestoord of onderbroken. Het produkt is ook toepasbaar bij de behandeling van ziekten of medische omstandigheden die een re-animatievloeistof (bijvoorbeeld bij trauma, in het bijzonder shock door 40 bloedverlies), intravasculaire volumevergroter of uitwisselingstrans- .8720283 * 6 % fusie vereisen. Het produkt kan niet alleen van nut zijn voor een medische behandeling maar ook voor het bewaren van organen voor transplantaties.

De uitvinding omvat verder methoden voor het toepassen van dit 5 biologische produkt voor geneeskundige behandeling waarbij aan een zoogdier dat aan een dergelijke behandeling behoefte heeft intraveneus een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van een wezenlijk tetra-meervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxy-leerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch 10 aanvaardbare drager wordt toegediend. Een uitwisselingstransfusie brengt in wezen mee het vervangen van het bloed van de patiënt door het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens de uitvinding met gebruikmaking van gangbare werkwijzen voor de behandeling van bepaalde toestanden of storingen zoals bloedvergiftiging, au-15 toimmunisatie-aandoeningen e.d.. De farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid is afhankelijk van de gewenste therapie voor de desbetreffende ziekte of medische toestand en van typische doseringsparameters zoals het lichaamsgewicht van de patiënt. In het algemeen is de farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid uiteraard het doseringsgebied dat door 20 artsen en ander geneeskundig personeel in de praktijk klinisch zinvol wordt geacht. Voor een medisch deskundige is het duidelijk hoe in een gegeven situatie een doseringshoeveelheid moet worden gekozen. De farmaceutisch aanvaardbare drager is bij voorkeur niet giftig, inert en verenigbaar met hemoglobine. Voorbeelden van dergelijke dragers zijn 25 onder meer water, in evenwicht gebrachte zoutoplossing, fysiologische zoutoplossing (b.v. gelactateerde Ringer's oplossing, Hartman's oplossing e.d.), dextrose-oplossing en dergelijke.

Het uitgangsmateriaal voor de werkwijze volgens de uitvinding is bij voorkeur verouderd menselijk bloed. Bij voorkeur wordt het bloed in 30 deze werkwijze niet gebruikt indien het langer dan acht weken na de op de zak gestempelde vervaldatum bewaard is geweest. Alle hier beschreven werkwijzen zijn toepasbaar op ander zoogdierbloed, eventueel met kleine, voor de deskundigen bekende aanpassingen.

De volledige werkwijze kan worden uitgevoerd bij ongeveer 2°C tot 35 ongeveer 8°C, bij voorkeur bij ongeveer 5°C. Het verouderde bloed wordt met ongeveer twee tot ongeveer vijf volumes van een isotone zoutoplossing zoals 0,9% natriumchloride gewassen. De wasoplossing kan eventueel antibiotica, bijvoorbeeld penicilline, streptomycine, gentamycine, po-lymyxine-B-sulfaat en dergelijke bevatten. Toevoeging van antibiotica 40 is niet essentieel voor de werkwijze maar kan, indien de werkwijze .8720283 7 wordt uitgevoerd in een niet-farmaceutische omgeving, de besmetting met bacteriön mi nimali seren.

De rode bloedcellen worden gewassen, verenigd en gelyseerd, hetzij met een alkalimetaalfosfaatbuffer (b.v. natriumfosfaat) of met pyro-5 geenvrij water. De volgende stap is het afscheiden van het stroma van de rode bloedcellen uit de oplossing. De verwijdering van het stroma van de rode cellen kan geschieden door filtratie met microporiën. Een werkwijze die de voorkeur heeft is het gebruik van "cross-flow" filtratie met hol!e-vezelpatronen. Voorbeelden van cross-flow filtratiesyste-10 men zijn het Peil icon systeem (Millipore Corp., Bedford, MA); het HF-Lab 15 ultrafiltratiesysteem (Romicon Corp., Woburn, MA); het KF2Q0-100 KR0SFL0W (Microgon, Lagona Hills, CA) of het DC-30-systeem (Amicon, Danvers, Mass). De systemen zijn ook beschikbaar voor kleinere en grotere ladingen dan die welke in het onderstaande voorbeeld be-15 schreven is.

In de volgende stap wordt de stromavrije hemoglobine-oplossing met pyridoxal-5'-fosfaat in een molverhouding van ongeveer 2:1 tot 4:1 ten opzichte van hemoglobine gepyridoxyleerd. Het is gewenst de pyridoxyle-ring te doen plaatsvinden in aanwezigheid van een zure buffer zoals 20 Tris-hydrochloridebuffer in een eindconcentratie van ongeveer 0,1M en ongeveer 1 g/1 glutathion. De oplossing wordt met een gaswisselaar met helium, stikstof of een ander inert gas, bij voorkeur met stikstof uit een gastank of een vloeistoftank, volledig gedeoxygeneerd. Alle slangen die wordt gebruikt om de oplossing te verpompen dienen bij voorkeur on-25 doorlatend of minimaal doorlatend te zijn voor zuurstof, zoals Tygon B-44 slangen (Cole-Palmer Co., Chicago, IL). Aan de gedeoxygeneerde oplossing wordt een reductiemiddel zoals natriumcyanoboorhydride of bij voorkeur natriumboorhydride toegevoegd. Een overmaat aan reagentia kan door dialyse met behulp van een nierdialysefilter zoals C-DAK 1.3 30 (Cordis Dow Corp., Miami, FL) of TH-15 (Terumo Cor., Tokio, Japan) tegen pyrogeenvrij water worden verwijderd. In plaats daarvan kunnen ul-trafiltratiepatronen met een molecuulgewicht-afkapping van niet meer dan 30.000 dalton worden gebruikt (deze patronen zijn verkrijgbaar bij Amicon Corp., Romicon, Millipore).

35 Vervolgens wordt de stromavrije gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing met 25% glutaaraldehyd (E.M. Grade, Polysciences, Warington, PA) gepolymeriseerd. De stromavrije, gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing wordt via een nierdialysefilter of een ander geschikt membraan-filter aan glutaaraldehyd blootgesteld. De duur van de polymerisatie en 40 de hoeveelheid toegevoegd glutaaraldehyd zijn afhankelijk van het volu- . 87 2 028 3

V

δ me van de hemoglobine-oplossing, de gewenste opbrengst aan polymeren en de gewenste molecuulgewichtsverdeling. In het algemeen geldt dat hoe langer de polymerisatietijd is hoe groter de molecuulghewichtsverdeling van polymeren, hoe groter de opbrengst ervan en hoe lager de COP van de 5 eindoplossing is. Kenmerkend wordt in 3,5 tot 4 uur ongeveer een opbrengst van 70% aan polymeren verkregen. Dit is bij voorkeur het eindpunt van de polymerisatie. Een opbrengst van 80 tot 90% kan in 7 uur worden bereikt, maar leidt tot een aanzienlijk hogere molecuulgewichtsverdel ing van de polymeren (Fig. 3C).

10 De polymeriseringswerkwijze leidt, wanneer deze wordt uitgevoerd volgens de uitvinding, tot een hoge opbrengst aan polymeren. Om een produkt met een betrouwbare klinische bruikbaarheid te bereiden is het zeer belangrijk dat de snelheid van de reactie en het oppervlak van interactie tijdens de polymerisatie zodanig worden geregeld dat een pro-15 dukt met een smal molecuul gewichtsgebied, waarvan het gemiddelde ongeveer 120.000 dalton is, wordt verkregen. De polymerisatiereactie kan worden gevolgd aan de hand van de afname van de colloïde osmotische druk met behulp van een oncometer zoals IL 186 (Instrumentation Laboratories, Danvers, LA) of Wescor Colloid Osmometer (Wescor, Logan, 20 Utah), hoge-druk-vloeistofchromatografie (HPLC) of enige andere aan de deskundige bekende, geschikte techniek. Geringe hoeveelheden moleculen met hoog molecuul gewicht kunnen blijkens bepaling met natriumdodecyl-sulfaat-polyacrylamidegel el ektroforese (SDS-PAGE) aanwezig zijn.

In het vlak van het halfdoorlatende membraan bij de pyridoxyle-25 rings- en polymeriseringsstappen van de werkwijze volgens de uitvinding is de biochemische drager (d.w.z. water, zouten, suikers of andere kleine moleculen of ionen) in hoge mate vrij om als reactie op hydrostatische, hydrodynamische, osmotische of oncotische krachten door het membraan heen en weer bewegen. De moleculen of ionen van de werkzame 30 stof (d.w.z. polymerisatiemiddelen, reductiemiddelen, pyridoxylerings-middelen e.d.) zijn als gevolg van hun grotere omvang en gewicht wat minder vrij om door het membraan te bewegen. De hemoglobinemoleculen kunnen het intacte membraan in het geheel niet passeren. Deze opzet leidt tot een beheerste onderwerping van hemoglobinemoleculen of andere 35 uitgangsstoffen aan de actieve stof. De variabelen die kunnen worden gewijzigd zijn de vloeisnelheid van de hemoglobine-oplossing, de concentratie van het hemoglobine in oplossing, de concentratie van de actieve stof en de vloeisnelheid van de actieve stof. Naast de genoemde variabelen kunnen variabelen zoals de tijd, temperatuur en werkzaam op-40 pervlak worden gewijzigd teneinde deze opzet aan te passen voor een .8720283 9 « breed scala aan reactanten, reacties en rendementen. De gehele reactie kan in een fysiologisch aanvaardbaar medium plaatsvinden. Verder kan de hemoglobine-oplossing door de reactie lopen zonder dat belangrijke wisselingen in verdunning of ionomgeving worden ondervonden.

5 Schematisch geeft figuur 1 de ladingsgewijze methode van pyridoxy-lering weer. Een oplossing van stromavrij hemoglobine en reagentia waaronder pyridoxal-51-fosfaat 6 wordt aan het mengvat of de houder 5 toegevoegd. De pH wordt bijgesteld en gevolgd met een pH-elektrode 7.

De houder 5 heeft een uitlaat of ontluchtklep 11. Een roerinrichting 10 zoals een toroïde-menger die een elektromotor 9, universele koppelingen 9a voor het koppelen van de motoras aan de roerassen en roerder 10 omvat zorgt voor ononderbroken menging. De oplossing 6 wordt met behulp van een pompinrichting 4 uit de houder 5 door de membraan-gaswisselaar 1 gepompt en vervolgens naar de houder 5 teruggeleid. Een stikstofbron 15 8 voert een constante stroom stikstof door de membraangaswisselaar 1 zodat de oplossing 6 wordt gedeoxygeneerd. De membraangaswisselaar 1 bevat uitlaat 3 voor de afvoer van gassen. Een oplossing die een reduc-tiemiddel bevat wordt door spuittoevoer 2 toegevoegd. De omloop van de oplossing van gedeoxygeneerd hemoglobine door deze opstelling door mid-20 del van constante pompwerking van de pompinrichting 4 gaat door totdat de gewenste opbrengst aan gepyridoxyleerd hemoglobine is verkregen.

Figuur 2 illustreert schematisch een opstelling voor het pyridoxy-leren respectievelijk polymeriseren met behulp van de membraantechniek volgens de uitvinding. Voor het pyridoxyleren wordt een oplossing van 25 stromavrij hemoglobine en reagentia waaronder pyridoxal-51-fosfaat 19 aan het mengvat of tweede reservoir 18 toegevoegd. Het tweede reservoir 18 heeft een uitlaat of ontluchtklep 17. Een roerinrichting zoals een torofde menger die een elektromotor 16, universele koppelingen 16a en roerder 20 omvat, zorgt voor ononderbroken menging. Aanvankelijk wordt 30 oplossing 19 continu door twee deoxygeneringsleidingen gepompt, waarbij doorgangen 31 en 32 dichtgeklemd zijn. Tegelijkertijd wordt de oplossing 19 door pompinrichting 15 uit het tweede reservoir 18 door een membraangaswisselaar 13 en door pompinrichting 21 door membraangaswisselaar 23 en een nierdialysemembraanfilter 27 gepompt en vervolgens 35 naar het tweede reservoir 18 teruggevoerd. De stikstofbronnen 12 en 24 zorgen voor een constante stikstofstroom door membraangaswisselaars 13 respectievelijk 23 ter deoxygenering van oplossing 19. Voor de afvoer van gassen bevatten de membraangaswisselaars 13 en 23 uitlaten 14 en 22. De pH wordt door pH-elektrode 25, die via een elektrische leiding 40 26 met een pH-meter is verbonden, gecontroleerd. Na deoxygenering wor- . 872 0283 % 10 den de toegangen 31 en 32 geopend. Een een reductiemiddel bevattende oplossing 30 wordt door pompinrichting 28 uit vat of eerste reservoir 29 door het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt en naar het eerste reservoir 29 teruggevoerd.

5 Wanneer de pyridoxylering is voltooid is wordt de reductiemiddel bevattende oplossing 30 vervangen door pyrogeenvrij water. Het pyro-geenvrije water wordt dan door pompinrichting 28 door nierdialysemembraanfilter 27 gepompt om de overmaat reagentia te dialyseren en vervolgens naar het eerste reservoir 29 teruggevoerd. De toegangen 31 en 10 32 worden met klemmen gesloten en oplossing 19 wordt continu rondgeleid en daarbij gedeoxygeneerd.

Voor de polymerisatie worden de toegangen 31 en 32 geopend. De oplossing van stromavrij, gepyridoxyleerd hemoglobine 19 wordt constant door de opstelling rondgeleid. Het pyrogeenvrije water in het eerste 15 reservoir 29 wordt vervangen door een polymerisatie-oplossing, die een polymerisatiemiddel 30 bevat. De polymerisatie-oplossing wordt dan door pompinrichting 28 door het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt en naar het eerste reservoir 29 teruggevoerd. Naarmate polymerisatiemiddel wordt onttrokken, wordt het stapsgewijs aan het eerste reservoir toege-20 voegd.

In principe wordt de oplossing die een reductiemiddel bevat voor de pyridoxylering op de polymerisatie-oplossing die een polymerisatiemiddel bevat uit een eerste resrevoir 29 naar een zijde van een half-doorlatend membraan in het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt terwijl 25 de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing respectievelijk de gepyridoxy-1 eerde, gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing uit een tweede reservoir 18 naar de tegenover liggende zijde van het membraan wordt gepompt. Een deel van de oplossing die een reductiemiddel of polymerisatiemiddel bevat, diffundeert door het membraan en pyridoxyleert of polymeriseert 30 het hemoglobine aan de andere zijde van het membraan. Het gedeelte van de oplossing dat een reductiemiddel of polymerisatiemiddel bevat dat niet diffundeert wordt aan het eerste reservoir 29 teruggevoerd. Evenzo wordt de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing die hetzij het gepyrido-xyleerde hetzij het gepolymeriseerde hemoglobine bevat naar het tweede 35 reservoir 18 teruggevoerd. Dit proces gaat ononderbroken door totdat de gewenste opbrengst aan produkt is verkregen.

Aan het eind van de polymerisatie kan de concentratie aan niet-ge-polymeriseerd tetrameer hemoglobine in de oplossing belangrijk worden verlaagd door een aan de deskundige bekende geschikte filtrering of 40 zuivering. Verwijdering van vrijwel al het overblijvende niet-gemodifi- . 87 2 028 3 11 ceerde tetrameer kan geschieden doordat men de gepolymeriseerde oplossing door ultrafiltratiepatronen met holle vezels pompt en vervolgens door middel van gelchromatografie in plaats daarvan met alleen gelchro-matografie zuivert.

5 De overblijvende sporen niet-gemodificeerd tetrameer hemoglobine kunnen volgens de uitvinding worden gecomplexeerd door alleen toevoeging van haptoglobine, behandeling met haptoglobine na toepassing van ultrafiltratiepatronen met holle vezels en/of gelchromatografie of verwijdering door middel van affiniteitschromatografie met aan gel gebon-10 den haptoglobine. Haptoglobine bindt zich irreversibel aan tetrameer hemoglobine, ook in aanwezigheid van gepolymeriseerd hemoglobine. Haptoglobine bindt hemoglobine in een molverhouding van 1:1. Indien de complexering in een vrije oplossing wordt uitgevoerd is er 1,3-1,5 g haptoglobine nodig om I g hemoglobine te binden. Het haptoglobine kan 15 in plaats daarvan ook aan een geactiveerd agarosegel worden gebonden.

De pH van de eindoplossing wordt ingesteld op ongeveer 9 en in evenwicht gebracht met elektrolytconcentraties die overeenkomen met die van normaal plasma. Voor klinische toepassing kunnen als elektrolyten onder meer worden toegevoegd natrium, kalium, chloride, calcium, magne-20 si urn en dergelijke. Eventueel kunnen ook gangbare antioxydanten zoals glutathion, ascorbaat of glucose worden toegevoegd. De eindoplossing kan volgens elke bekende techniek die voor toepassing op biologische produkten geschikt is, worden gesteriliseerd.

De essentiële eigenschappen van de oplossing volgens de uitvin-25 ding in benaderde hoeveelheden of gebieden worden hieronder ter vergelijking weergegeven naast die van normaal bloed.

Gepolymeriseerd HB Normaal bloed Hb 7-18 g/dl 12-15 g/dl 30 02-draagvermogen 9,7-25,0 vol.% 16,6*20,9 vol.%

Bindingscoefficient (bij 37°C) 1,30 cc/g Hb 1,32 cc/g Hb P50 ('bij pCOg 40 torr, pH 7,4, 37°C) 14-22 torr 26 torr

Methemoglobine minder dan 15¾ minder dan 2¾ 35 Colloïde osmotische druk 7-30 torr 20-25 torr

Totaal fosfolipidegehalte minder dan 0,004 mg/ml Viscositeit (bij 25°C) 3,2 cP (8 g/dl) 3,5 (Het = 45¾)

De volgende voorbeelden illustreren bepaalde aspecten van de uit-40 vinding. Het moet echter duidelijk zijn dat deze voorbeelden alleen ter . 872 028 3 12 toelichting dienen en geen begrenzing van de voorwaarden en de strekking van de uitvinding geven. Alle temperaturen zijn uitgedrukt in graden Celsius tenzij anders aangegeven. Ook dient een en ander zo te worden begrepen dat wanneer kenmerkende reactieomstandigheden (bijvoor-5 beeld temperatuur, reactieduur) worden gegeven, de omstandigheden die boven en beneden deze aangegeven gebieden liggen ook kunnen worden gebruikt, ook al zijn zij in het algemeen minder geschikt.

Verder inzicht in de uitvinding kan worden verkregen uit de volgende niet beperkende voorbeelden. Deze voorbeelden werden uitgevoerd 10 bij ongeveer 5°C en atmosferische druk.

Voorbeeld I

Bereiding van een oplossing van stromavrij tetrameer hemoglobine

Verouderd menselijk bloed werd tweemaal gewassen met een oplossing van 0,9¾ natriumchloride die de volgende antibiotica per liter oplos-15 sing bevatte:

Penicilline 50.000 E

Streptornycine 50 mg

Gentanycine 40 mg 20 Polymixine-B-sulfaat 2,5 mg

De rode bloedcellen (RBC) werden tweemaal met gelijke volumes van de bovengenoemde oplossing gewassen en 15 minuten bij 2.500 g gecentrifugeerd. Meer dan 95¾ van de leerachtige buitenlaag werd verwijderd met 25 een plasma-extractor (Fenwal Laboratories, Morton Grove, IL). De gewassen en gepakte RBCs werden vervolgens verzameld en gelyseerd met 3 tot 4 volumes pyrogeenvrij water. Honderd eenheden gewassen RBCs resulteerden in een volume van 15-20 1 met een hematocriet van 20-24¾.

Vijftien tot twintig liter gewassen RBCs werd in 40-80 liter koud 30 pyrogeenvrij water gegoten. Het aldus bereide lysaat werd vervolgens door 2 tot 4 hol!e-vezelpatronen van 0,1/U gepompt. Daarbij werd een luchtpomp (LP30, Amicon Corp., Danvers, MA) gebruikt. De bij 0,1/U afkappende patronen waren verkrijgbaar bij Romicon Ine., dochter van Rohm and Haas Co., Woburn, MA 01801. Het hemoglobine, dat wezenlijk 35 vrij van RBC-stroma was, kwam met de overige enzyminhoud van de RBC als ultrafiltraat door het filter. Porties van het filtraat werden verscheidene malen tijdens dit proces gecentrifugeerd. De afwezigheid van een neerslag duidde op een goede integriteit van het membraan.

Er werd een opbrengst van 97¾ in wezen stromavrij hemoglobine verkregen.

. 4è 7 2 0 2 8 3 m · · 13

Tijdens de eerste scheidingsstap werd het lysaatvolume verlaagd 5 tot 12-15 liter en door toevoeging van pyrogeenvrij water op dat volume gehouden totdat de benodigde hoeveelheid hemoglobine was gewonnen. Tegelijk met deze stap werd het ultrafiltraat dat het hemoglobine bevatte 5 geconcentreerd met behulp van 3 tot 4 bij 30k afkappende patroonfilters met holle vezels (H10 P30, Amicon Corp., Danvers, MA) en een LP 30 luchtpomp. Het ultrafiltraat was tot een uiteindelijke hemoglobinecon-centratie van ongeveer 20-22 g/dl geconcentreerd.

Voorbeeld II

10 Bereiding van een oplossing van stromavrij tetrameer hemoglobine

Alternatieve methode

Afzonderlijk eenheden verouderd bloed werden met 0,9% natriumchlo-ride-oplossing gevuld. De rode cellen en leerachtige buitenlaag liet men gedurende de nacht uitzakken. De bovenstaande vloeistof en de leer-15 achtige laag werden vervolgens geëxtraheerd.

De gepakte cellen werden vervolgens in 3-5 volumes 0,9% natrium-chloride-oplossing gegoten. De cellen werden gewassen en geconcentreerd met behulp van een doorstroomfilter met holle vezels van 0,2/U (K205 - KR0SSFL0W, Microgon Corp·, Laguna Beach, CA) en een luchtpomp (LP 30, 20 Amicon Corp., Danvers, MA). De gepakte cellen werden vervolgens door toevoeging van 3-5 volumes pyrogeenvrij water gelyseerd. De doorstroom-ftitratie werd vervolgens herhaald, waarbij het tetramere hemoglobine met de enzyminhoud van de rode cellen in het ultrafiltraat werd verzameld, terwijl het stroma door het filter werd vastgehouden.

25 Porties van het filtraat werden tijdens dit proces verscheidene malen gecentrifugeerd. De afwezigheid van een neerslag duidde op een goede integriteit van het membraan. Er werd een opbrengst van 97% aan in wezen stromavrij hemoglobine verkregen. Tegelijk met deze stap werd het ultrafiltraat dat het hemoglobine bevatte, met behulp van 3-4 pa-30 troonfilters met bij 30k afkappende holle vezels (H10 P30, Amicon Corp., Danvers, MA) en een LP 30 luchtpomp geconcentreerd. Het ultrafiltraat werd tot een uiteindelijke hemoglobineconcentratie van ongeveer 20-22 g/dl geconcentreerd.

Voorbeeld III

35 Pyridoxylering van het stromavrije hemoglobine - opstelling in gemengde lading

Volgens voorbeeld I of II werd een oplossing van stromavrij hemoglobine bereid. De volgende reagentia werden gemengd: . 872 028 3 14 1. Pyridoxal-5'-fosfaat in een mol verhouding van 4:1 ten opzichte van hemoglobine; 2. Tris-HCl-buffer - 0,1M eindconcentratie in de hemoglobine-oplossing; 5 3. Glutathion - 1 g/1 oplossing; 4. Ascorbinezuur - 0,2 g/1; 5. Glucose 0,5 g/1; en 6. Antibiotica - dezelfde antibiotica als in voorbeeld I.

10 De bovenstaande reagentia werden in het kleinst mogelijke volume pyrogeenvrij water opgelost en de pH werd ingesteld op 7,25-7,45. Het bovenstaande mengsel werd aan de hemoglobine-oplossing toegevoegd. De pH van de hemoglobine-oplossing werd met 0,1 N NaOH ingesteld op 7,35-7,45 bij 5°C. Uiteindelijk werd de hemoglobineconcentratie bijge-15 steld op 17,5-18,5 g/dl.

De oplossing (18-20 1) werd naar een gasdicht roestvrij stalen reservoir overgebracht. Deoxygenering van de oplossing geschiedde door middel van een membraangaswisselaar (William Harvey, Bently Laboratories, Shiley Sales Corp., Irvine, CA). Met een snelheid van on-20 geveer 170 1/min werd stikstofgas door de wisselaar geborreld. De hemoglobine-oplossing werd met een snelheid van 4-6 1/min door de gaswisselaar gepompt. Een voldoende verwijdering van zuurstof werd bepaald als een 02~verzadiging van minder dan 5% en een zuurstofgehalte van minder 1 vol.% (met door IL 282 Co-oximeter, Instrumentation Laboratories, 25 Lexington, MA). Dit werd bereikt in 4-8 uur (zie fig. 1).

Aan de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing werd per liter oplossing 0,02 M natriumboorhydride (eindconcentratie) toegevoegd. Het na-triumboorhydride werd in niet minder dan 300-500 ml 0,001 N NaOH opgelost. Deze oplossing werd via de spuittoegang van de gaswisselaar met 30 een snelheid van ongeveer 100 ml/uur in de hemoglobine-oplossing gepompt. In het roestvrij stalen reservoir werd een ontluchtklep opengelaten om drukopbouw te voorkomen. Na de toevoeging van het NaBH4 werd de oplossing zuurstofvrij gehouden. Een maximale opbrengst van ongeveer 70-80% gepyridoxyleerd hemoglobine werd verkregen in 6-10 uur. De op-35 brengst werd bepaald door meting van de verschuiving in de zuurstof-he-moglobine-dissociatiekromme (P50)·

De overmaat aan reagentia werd verwijderd door dialyse tegen pyrogeenvrij water met behulp van een nierdialysefilter (C-DAK 1.3, Cordis Dow Corp., Miami, FL of TH-15, Terumo, Tokio, Japan). Tijdens de dialy-40 se werd de oplossing zuurstofvrij gehouden met behulp van een membraan- . 872 02 8 3 e 15 oxygenator. De Ng-stroomsnelheid door de oxygenator bedroeg ongeveer 100 1/min.

Voorbeeld IV

PyridoxyIering van het stromavrije hemoglobine -5 Opstelling met een membraan

Volgens de werkwijze van voorbeeld I of II werd een oplossing van stromavrij hemoglobine bereid. De volgende reagentia werden vermengd: 1. Pyridoxal-5'-fosfaat - met een molverhouding van 2:1 ten opzichte 10 van hemoglobine; 2. Tris-HCl-buffer - 0,1M eindconcentratie in de hemoglobine-oplossing; 3. Glutathion - 1 g/1 oplossing; 4. Ascorbinezuur - 0,2 g/1; 5. Glucose 0,5 g/1; en 15 6. Antibiotica - dezelfde antibiotica als in voorbeeld I.

De bovenstaande reagentia werden in het kleinst mogelijke volume pyrogeenvrij water opgelost en de pH werd ingesteld op 7,35-7,45. Het bovengenoemde mengsel werd aan de hemoglobine-oplossing toegevoegd. De 20 pH van de hemoglobine-oplossing werd met 0,1 N NaOH ingesteld op 7,35-7,45 bij 5°C. De hemoglobineconcentratie werd bijgesteld tot 17,5-18,5 g/dl.

De oplossing (18-20 1) werd naar een gasdicht roestvrij stalen reservoir overgebracht. Deoxygenering van de oplossing geschiedde door 25 middel van een membraangaswissel aar (William Harvey, Bently

Laboratories, Shiley Sales Corp., Irvine, CA). Met een snelheid van ongeveer 170 1/min werd stikstofgas door de wisselaar geborreld. De hemoglobine-oplossing werd met een snelheid van 4-6 1/min door de gaswisselaar gepompt. Een voldoende verwijdering van zuurstof werd bepaald als 30 een Og-verzadiging van minder dan 5% en een zuurstofgehalte van minder 1 vol.% (met door IL 282 Co-oximeter, Instrumentation Laboratories,

Lexington, MA). Dit werd bereikt in 4-8 uur.

Bij deze werkwijze was de membraanoxygenator of gaswisselaar 23 in serie geschakeld met een nierdialysefilter 27 (Terumo, TH-15) (zie fig.

35 2). De uitwendige delen van het dialysefilter werden vastgeklemd om wa-terverlies tijdens de deoxygenering te voorkomen.

Toen het eindpunt van de deoxygenering was bereikt, werd 3 liter van een 5 g.% natriumboorhydride-oplossing aan de buitenzijde van het dialysefilter gepompt. Op deze wijze werd de pyridoxylering snel vol-40 tooid. In een half uur werd een opbrengst van 75-80¾ gepyridoxyleerd . 872 cm 16 hemoglobine verkregen en in 2-3 uur werd een maximale opbrengst van 85-90% verkregen. De opbrengst werd bepaald door meting van de verschuiving in de zuurstof-hemoglobine-dissociatiekromme (P50)·

De overmaat reagentia werd verwijderd door dialyse tegen pyrogeen-5 vrij water met behulp van het in serie geschakelde nierdialysefilter (C-DAK 1.3, Cordis Dow Corp., Miami, FL of TH-15, Terumo, Tokio,

Japan). De oplossing werd gedurende de dialyse zuurstofvrij gehouden.

De stikstofstroomsnelheid door de oxygenator bedroeg ongeveer 100 1/min.

10 Voorbeeld V

Polymerisatie van stromavrij, gepyridoxyleerd hemoglobine Volgens de werkwijze van voorbeeld III of IV werd een oplossing van stromavrij, gepyridoxyleerd hemoglobine bereid. Aan de gedialyseer-de oplossing werden toegevoegd: 15 1. 0,1 M natriumfosfaatbuffer (eindconcentratie); 2. Antibiotica zoals genoemd in voorbeeld I; en 3. Glutathion - 1 g/1.

20 De bovenstaande chemicaliën werden in 500 ml pyrogeenvrij water opgelost en aan de hemoglobine-oplossing toegevoegd. De pH van de oplossing werd bij 5°C met 0,5 N NaOH ingesteld op 8,0. De hemoglobine-concentratie werd door toevoeging van 0,1 M fosfaatbuffer bijgesteld tot tussen 14-15 g/dl. De oplossing werd zuurstofvrij gehouden met be-25 hulp van de membraanoxygenator. Er werd een ^-stroom van ongeveer 170 1/min in stand gehouden.

De hemoglobine-oplossing werd uit het mengvat of tweede reservoir 18 door de membraanoxygenator of gaswisselaar 23 in een nierdialysefilter 27 gepompt (zie fig. 2) met een snelheid van ongeveer 5-7 1/min.

30 Monsters werden getrokken door de spuittoegang aan de oxygenator. De polymerisatie werd niet gestart indien het percentage oxyhemoglobine zoals bepaald met co-oximetrie groter was dan 10%. De oplossing werd gepolymeriseerd over het nierdialysemembraan. De polymerisatieoplossing werd aangevuld tot een volume van 10 1, en bevatte: .8720283 5 17 1. 0,1 M natriumfosfaatbuffer (dezelfde eindconcentratie als in de hemoglobine-oplossing); 2. Antibiotica - dezelfde concentratie als in de hemoglobine-oplossing; 5 3. Glutathion - 1 g/1; en 4. 175-225 ml 25% glutaaraldehydoplossing (ongeveer 14,8-18,1 mol glutaaraldehyd per mol hemoglobine).

De osmolariteit van de polymerisatieoplossing was ongeveer dezelf-10 de als die van de hemoglobine-oplossing.

De stroom gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing werd eerst door het dialysefilter geleid terwijl pyrogeenvrij water aan de buitenzijde werd rondgeleid. Zodra de vereiste stroomsnelheid was ingesteld, werd de polymerisatie-oplossing aan de buitenzijde rondgeleid. De oplossing 15 werd verpompt met een snelheid van ongeveer 0,4-0,6 1/min (Cole-Palmer pumps, 7018 pompkoppen). De hemoglobine-oplossing in het reservoir werd gedurende het gehele proces grondig gemengd.

Vervolgens werd het polymerisatiemiddel (25% glutaaraldehyd) volgens het onderstaande schema aan de polymerisatieoplossing toegevoegd: 20

Na 1 uur - 75 ml

Na 2 uur - 50 ml

Na 3 uur - 50 ml

Na 4 uur - 50 ml 25 Na 5 uur - 50 ml

Na 6 uur - 25 ml

Na 7 uur - 10 ml

De polymerisatie werd gevolgd aan de hand van de afname van de 30 col!ofde osmotische druk (C0P). De reactie werd gestopt wanneer de C0P ongeveer 40 torr bereikte. Dit geschiedde door de polymerisatie-oplossing aan de buitenzijde van het dialysefilter te laten weglopen en pyrogeenvrij water in te pompen. De dialyse tegen pyrogeenvrij water werd gedurende ongeveer 2 uur uitgevoerd. Er werd een opbrengst van on-35 geveer 80-90% polymeren verkregen.

Voorbeeld VI

Oltrazuivering van stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine

Volgens de werkwijze van voorbeeld V werd een oplossing van stro-40 mavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine bereid. De verwij- . 872 0283 18 dering van niet-gemodificeerd tetrameer geschiedde in drie stappen: STAP 1: Ultrafiltratie

De gepolymeriseerde oplossing werd door 3 tot 4 ultrafiltratiepa-tronen met holle vezels met een molecuulgewichtafkapping van 100.000 5 dalton (Amicon) gepompt. Deze stap werd beëindigd wanneer de hemoglo-bineconcentratie in het ultrafiltraat duidelijk beneden 0,1% was en tenminste 2 uur beneden dat niveau bleef. De oplossing van gepolymeri-seerd hemoglobine was in dit stadium ongeveer 90% zuiver.

STAP 2: Gelfiltratie 10 De tweede zuiveringsstap die leidde tot een voor ongeveer 95-98% zuivere polymeeroplossing geschiedde door gelchromatografie en wel als volgt:

Twee bioproces-chromatografiekolommen van 60 cm x 25 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) werden gevuld met ongeveer 55 1 ACA-54 15 Ultrogel (LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Dit gel had een molecuul-gewicht-uitsluitingsgrens van 90.000 dalton. De kolommen werden in serie verbonden met een minimale dode ruimte daartussen hetgeen resulteerde in een effectieve gellengte van ongeveer 105 cm.

Een half tot een liter van de gepolymeriseerde hemoglobine-oplos-20 sing van stap 1 met een hemoglobineconcentratie van 6-10 g/dl werd met een snelheid van ongeveer 3 1/uur op de kolom gebracht. Na het laden werd de buffer (0,1 M natriumfosfaat, pH 7,40 bij 5°C) gebruikt om het hemoglobine met een snelheid van 3,0 1/uur te elueren (Fig. 4). De eerste 2,0 1 van de oplossing van gepolymeriseerd hemoglobine die van de 25 kolom werd geëlueerd werd vastgehouden. De overbijvende oplossing werd weggeworpen. De fractie van 2 1 van de kolom werd met het Amicon CH-2 ultrafiltratiesysteem met 1 tot 3 H1P100 patronen geconcentreerd (Fig. 5). De uitragezuiverde oplossing werd geconcentreerd. Stap 2 werd zonodig herhaald om de verontreiniging met tetrameer in de gepolymeri-30 seerde oplossing te verlagen.

STAP 3: Affi niteitschromatografie

Haptoglobine (Hp) werd als volgt aan een geactiveerd agarosegel gebonden.

Haptoglobine (meer dan 80% zuiver) werd aan met CNBr geactiveerd 35 Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) in een verhouding van 3 mg Hp/ml gesedimenteerd gel toegevoegd. Per volume sepharose werden 4 volumes koppelingsbuffer (0,1 M natriumbicarbonaat, 0,3 M NaCl, pH 7,9) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een nacht kalm bij 4°C geroerd. De opbrengst van deze reactie was 2 mg Hp/ml gesedimen-40 teerd gel. Een overmaat van het Hp-affiniteitsgel (ten opzichte van het .8720283 19 ft « vrije tetramere hemoglobine) werd aan de oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine toegevoegd en 1 tot 4 uren kalm bij 4°C geroerd. De oplossing werd daarna kalm gecentrifugeerd (4.000 g gedurende 2 minuten) en de bovenstaande vloeistof werd geïsoleerd. Er werd ver-5 der gewassen en gecentrifugeerd om de opbrengst aan gepolymeriseerd hemoglobine zo groot mogelijk te maken. Het aldus verkregen gepolymeri-seerde, gepyridoxyleerde hemoglobine was voor meer dan 99,5% vrij van niet-gemodificeerd tetrameer hemoglobine.

ALTERNATIEVE STAP 3: Complexenng met haptoglobine 10 De laatste sporen niet-gemodificeerd tetrameer hemoglobine werden uit de oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine verwijderd door complexering met haptoglobine (Hp). Haptoglobine werd in een molverhouding van 1:1 aan vrij tetrameer hemoglobine toegevoegd. De oplossing werd ongeveer 2 uur bij kamertemperatuur gemengd.

15 Voorbeeld VII

Farmceutisch preparaat van ultragezuiverd, stromavrij, gepolymeriseerd, gep.yri doxyl eerd hemoglobine__

Volgens de werkwijze van voorbeeld VI werd een oplossing van ultragezuiverd stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine 20 bereid. De pH van de oplossing werd bij 5°C met 0,5 NaOH op ongeveer 9,02 gebracht en met een elektrolytconcentraat in evenwicht gebracht tot de volgende concentraties in de eindoplossing:

Na 140 mEq/1 25 K 4,0 mEq/1

Cl 100 mEq/1

Ca++ 5,0 mEq/1

Mg 1,5 mEq/I

Glutathion 1 g/1 30

Aan de oplossing werd een enzymcocktail toegevoegd om deze te stabiliseren ten opzichte van o^ydatie. Deze bevatte bij benadering niet minder dan de volgende hoeveelheden per liter eindoplossing: . 87 2 028 3 20 1. Glucose - 6 - fosfaat - 0,3 g 2. Glucose - 6 - fosfaatdehydrogenase - 0,20 mg 3. Ferrodoxine - 6 mg 5 4. Ferrodoxine - NADP-reductase - 3 mg 5. NADP - 40 mg 6. Katalase - 0,2 g

De uiteindelijke hemoglobineconcentratie werd gebracht op 7-18 g/dl.

10 Voorbeeld VIII

Sterilisatietechniek

Het volgens de werkwijze van voorbeeld VI bereide gezuiverde gepo-lymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine werd volgens het onderstaande filtratieschema met de Pall Profile Filters (Pall Corp., Glen Cove, 15 NY) gesteriliseerd: 010----» 007 ---* 005 ---* NR7P.(0,2/U absoluut)

1/U 0,7/U 0,5/U 0,2/U

20 Het filtermed!urn was polypropyl een. Het uiteindelijke sterilisa- tiefilter van 0,22/U was van nylon. Alle filters waren van farmaceutische kwaliteit.

De aldus gesteriliseerde oplossing vertoonde geen groei op bloed-agarplaten (37°C/4 dagen of 25°C/10 dagen) of in een thioglycolaatme-25 dium. De oplossing bevatte spoorhoeveelheden (0,25 ng/ml) endotoxine, op basis van een Limulus Amoebacyte lysaattest, indien bereid in een niet-farmaceutische omgeving.

Voorbeeld IX Biochemische kenmerken 30 Het tetrameervrije gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine bevatte een met een Beekman DU spectrofotometer (Beekman Instruments, Lincolnwood, IL) verkregen normaal absorptiespectrum (Fig. 6B). De oplossing leidde bij reconstitutie tot een normale hemoglobineconcentratie (12-14 g/dl), tot een oplossing met en aanvaardbare colloïde os-35 motische druk (COP) (14,5-22,5 torr) (Fig. 7). Met het oog op figuur 7 werd de hemoglobineconcentratie bepaald op de IL 282 co-oximeter (Instrumentation Laboratories, Danvers, MA). De C0P werd gemeten op de Wescor Colloid Osmometer Model4400 (Boyce Scientific Inc., Hanover Park, IL). Ter wille van de vergelijking is de met niet-gemodificeerd 40 stromavrij hemoglobine (SFH) verkregen kromme ook afgebeeld. Het poly- .8720283 « 21 merisatiepraces was niet van invloed op het zuurstof bindende vermogen van het hemoglobine (1,30 cc/g). Het produkt had bij reconstitutie tot een normale hemoglobineconcentratie een normaal zuurstof dragend vermogen.

5 De P50 van het produkt lag tussen 14-22 torr wanneer deze werd bepaald onder fysiologische omstandigheden van pH, pC0£ en temperatuur. Een kenmerkende oxy-hemoglobine-dissociatiekromme voor het produkt is weergegeven in figuur 8. Het monster werd onder standaardomstandigheden bij pH 7,40, temperatuur 37°C en pC0£ 40 torr opgenomen.

10 De doorlopende kromme werd verkregen met de Hem-O-Scan zuurstofdisso-ciatie-analysator (Travenol Laboratories, Deerfield, Illinois).

Op basis van HPLC bleek de molecuul gewichtsverdeling van het produkt te liggen tussen 120.000 en 600.000 dalton (Fig. 9). Het uit de gegevens geschatte gemiddelde molecuul gewicht was ongeveer 120.000. Fi-15 guur 9 geeft het elutiepatroon van een HPLC-kolom (TSK gel, type 6 4.000 S.W., Varian Instruments Group, Palo Alto, CA) weer. De gebruikte elutiebuffer was 0,1 M natriumfosfaat, pH 7,0 (bij 25°C) met 0,1 M na-triumchloride (osmolariteit = 353 mOsm). De hemoglobineconcentratie van het monster werd ingesteld op ongeveer 3,0 g/dl. Het geïnjecteerde 20 monstervol urne was 0,1 ml en de stroomsnelheid 1 ml/min (de HPLC-pomp Model 2150); UV-monitor (Model 2238 Uvicord SII) en schrijvende integrator (Model 2220) werden vervaardigd door LKB Instruments,

Gaithersburg, MD).

Het met SDS-PAGE gekarakteriseerde produkt vertoonde 4 polymeer-25 banden (Fig. 3A). Deze vertegenwoordigden ongeveer 58¾ met een molecuul gewicht van 120.000, 26¾ met een molecuulgewicht van 192.000, 11% met een molecuul gewicht van 256.000 en 4% met een molecuul gewicht van 320.000. Op het gel waren spoorhoeveelheden van polymeren met hoger molecuulgewicht zichtbaar. De figuren 3A, 3B en 3C geven densitometrische 30 aftastingen weer van het produkt volgens de uitvinding dat met de in de LKB noot 306 (LKB Instruments, Gaithersburg, MD) beschreven techniek met behulp van SDS-polyacrylamidegel-elektroforese is gescheiden. De aftasting werd verkregen met een Helena Quick Scan, R and D (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) in verschillende stadia van de polymeri-35 satie.

De viscositeit van het produkt veranderde met de polymerisatie.

Het eindprodukt had een viscositeit van 3,1 centipoise bij een hemoglobineconcentratie van ongeveer 8 g/dl. Deze waarde was vergelijkbaar met die van normaal bloed. Figuur 10 geeft het verband weer tussen de hemo-40 globineconcentratie van het produkt en de viscositeit van de oplossing.

.8720283 * 22

De metingen werden verricht met de Brookfield Model LVT viscometer (Brookfield Engineering Laboratories Inc·, Stoughton, MA) bij een temperatuur van 25°C en een afschuif snel heid van 450 sec"!.

De fosfolipiden die in het membraan van de rode cellen aanwezig 5 waren, waren met dunne-laag-chromatografie (DLC) niet in het eindprodukt waarneembaar. In een enkele lading waren op de DLC-platen sporen van vrije vetzuren zichtbaar.

De methemoglobinereductase activiteit in het produkt was tijdens het proces zo goed als ongewijzigd. Zowel het uitgangslysaat als het 10 eindprodukt bezaten enzymactiviteiten tussen 1,0 en 2,0 u. Een eenheid van enzymactiviteit is gedefinieerd als 1/uM gereduceerd ferrocyani-de-methemoglobinecomplex per gram hemoglobine minuut.

Voorbeeld X

Fysiologische en biologische bepalingen 15 A. Wijzigingen in de nier

Vergelijkende studies uitgevoerd met niet-verdoofde bavianen wezen erop dat infusie van een met meer dan 2-3% tetrameer hemoglobine verontreinigde oplossing een daling in de urineproduktie van ongeveer 50% en een daling in de glomerulaire filtratiesnelheid (verwijdering van 20 creatinine) van ongeveer 15% veroorzaakte ten opzichte van de niveaus vóór infusie. Infusie van een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolyme-riseerd hemoglobine die in wezen vrij is van tetrameer gaf geen waarneembaar effect.

B. Hemodynamische effecten 25 Bij bavianen hield een daling van ongeveer 25% in de hartsnelheid en een stijging van ongeveer 14% in de gemiddelde slagaderdruk verband met de infusie van een oplossing van hemoglobine die was verontreinigd met meer dan 5-7% tetrameer hemoglobine. Dit was het gevolg van een primaire vaatvernauwende werking van het tetrameer en deze was afwezig 30 bij infusie van een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat in wezen vrij was van tetrameer.

C. Extravasatie

In de buikholten van bavianen die een uitwisselingstransfusie tot een hematocriet van 0% met tetrameer hemoglobine hadden gehad werd tot 35 2 liter oplossing van tetrameer hemoglobine waargenomen. Weinig of geen hemoglobine bevattende vloeistof werd waargenomen in de buikvlieshol ten van dieren die een uitwisselingstransfusie hadden gehad tot een hematocriet van 0% met een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat in wezen vrij was van tetrameer.

40 D. Afbraak van virale anti genen .8720283 ΐ 23

Een verzameling van 100 eenheden menselijke rode bloed!ichamen, het uitgangsmateriaal bij voorkeur voor de werkwijze volgens de uitvinding, bleek bij test positief op viraal hepatitis B oppervlakte antigen. Afbraak van dit antigen trad na 1-2 uur polymerisatie zoals be-5 schreven in voorbeeld V op.

E. Reductie van in urine aanwezig hemoglobine

Infusie van een hemoglobine-oplossing die tetrameer hemoglobine bevatte in een baviaan leidde tot de uitscheiding van tetrameer hemoglobine in de urine. Dit deed zich voor zodra de massa aan toegediend 10 tetrameer hemoglobine het vermogen van de baviaan om hemoglobine tetrameer door middel van circulerend haptoglobine te binden had overschreden. De urine had daarbij een dieprode kleur die kenmerkend is voor hemoglobine en bevatte 1-2 g hemoglobine per 100 ml urine. Oplossingen van tetrameer hemoglobine hadden in vivo een halveringstijd van 2-4 uur 15 (muizen en bavianen als proefdieren). Infusie van een oplossing van ge-pyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat wezenlijk vrij was van tetrameer hemoglobine (minder dan 2% tetrameer aanwezig) had weinig of geen waarneembare kleurverandering van de urine tot gevolg (minder dan 30 mg hemoglobine per 100 ml urine). Een met haptoglobine behandelde, 20 gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing (meer dan 99,5% vrij van tetrameer) leverde geen verandering in de kleur van de urine, zelfs bij infusie in zeer grote therapeutische doses in de primaat.

De halveringstijd van het volgens de werkwijze van de uitvinding 25 bereide produkt bedroeg ongeveer 24 uur (Fig. 11). Figuur 11 geeft de plasma-verwijderingskromme (halveringstijd) weer voor het niet-gemodi-ficeerde, stromavrije hemoglobine (SFH) en voor het produkt volgens de uitvinding. Een gram per kilogram lichaamsgewicht aan hetzij SFH hetzij een oplossing van wezenlijk tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd, 30 gepyridoxyleerd hemoglobine in gelactateerde Ringer's oplossing met een hemoglobineconcentratie van ongeveer 7 tot ongeveer 14 g/dl, werd intraveneus aan zes volwassen mannelijke bavianen toegediend. De gehalten aan plasma-hemoglobine werden bepaald met de IL 282, co-oximeter met tussenpozen van 2 uur in het geval van SFH of met tussenpozen van 6 uur 35 in het geval van het produkt volgens de uitvinding. De metingen werden voortgezet totdat alle hemoglobine uit het plasma van het proeflichaam was verdwenen.

In het voorgaande is een uitvoerige beschrijving van de voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding gegeven ten behoeve van een illus-40 tratie en niet ter beperking. Het spreekt vanzelf dat alle andere wij- . 872 0‘ίΒό > 24 zigingen, afleidingen en equivalenten die voor de deskundige op basis van deze onthulling voor de hand liggen, bedoeld zijn binnen de strekking van de gepretendeerde uitvinding te vallen.

. 87 2 0 2 8 3

Claims (39)

1. Een ace!lui afr vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes dat een in wezen tetrameervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeri-seerd, gepyridoxyleerd hemoglobine en een niet-giftige, farmaceutisch 5 aanvaardbare drager omvat.

2. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, met' het kenmerk, dat het hemoglobine een normaal zuurstof dragend vermogen van ongeveer 9,7 vol.% tot ongeveer 25 vol.% heeft.

3. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens 10 conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine nagenoeg vrij is van vaatvernauwende werking.

4. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine nagenoeg vrij is van ziektekiemen, virale anti genen en mierobiële anti genen.

5. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine geen waarneembare vermindering in urineproduktie veroorzaakt.

6. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine geen waarneembare 20 vermindering in glomerulaire filtratiesnelheid veroorzaakt.

7. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine geen waarneembare ex-travasatie in de buikvüesholte veroorzaakt.

8. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens 25 conclusie 1, met het kenmerk, dat het hemoglobine geen waarneembare verandering in de kleur van de geproduceerde urine veroorzaakt.

9. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, waarbij het hemoglobine wordt gekenmerkt door een gemiddeld molecuul gewicht van ongeveer 120.000 dalton.

10. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes vol gens conclusie 1, waarbij het hemoglobine wordt gekenmerkt door een Pjq van ongeveer 14 torr tot ongeveer 22 torr.

11. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, waarbij het hemoglobine wordt gekenmerkt door een 35 colloïde osmotische druk van ongeveer 7 torr tot ongeveer 30 torr.

12. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1, waarbij het hemoglobine wordt gekenmerkt door een osmol ariteit van ongeveer 290 mOsM tot ongeveer 310 mOsM.

13. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes vol- 40 gens conclusie 1, waarbij het hemoglobine wordt gekenmerkt door een he- .8720283 moglobinegehalte van ongeveer 7 g/dl tot ongeveer 18 g/dl.

14. Werkwijze voor de behandeling van trauma, omvattende het intraveneus aan een aan trauma lijdend zoogdier toedienen van een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van een in wezen tetrameervrij, na- 5 genoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager.

15. Werkwijze voor de behandeling van acute anemie, omvattende het intraveneus aan een aan acute anemie lijdend zoogdier toedienen van een 10 farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van een in wezen tetrameervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager.

16. Werkwijze voor de behandeling van een aandoening of geneeskun- 15 dige omstandigheid waarbij een ream'matievloei stof of een intravascu- lair volume vergrotend middel nodig is, omvattende het intraveneus aan een aan de aandoening of de geneeskundige omstandigheid lijdend zoogdier toedienen van een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van een in wezen tetrameervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeri- 20 seerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager.

17. Werkwijze voor de behandeling van een aandoening of geneeskundige omstandigheid waarbij een uitwisselingstransfusie of een acelΙοί air vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes nodig is, omvattende 25 het intraveneus aan een aan de aandoening of de geneeskundige omstandigheid lijdend zoogdier toedienen van een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van een in wezen tetrameervrij. nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager en het vervangen 30 van het bloed van het zoogdier door het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes.

18. Werkwijze voor de behandeling van een storing door zuurstofgebrek, omvattende het intraveneus aan een aan het zuurstofgebrek lijdend zoogdier toedienen van een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van 35 een in wezen tetrameervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager.

19 Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de storing door zuurstofgebrek hypoxie of hypoxemie is.

20. Werkwijze voor de bereiding van een in wezen tetrameervrij, . 87 2 028 3 * nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemo globine, waarbij men het stroma van de rode bloedlichaampjes uit het bloed afscheidt, pyridoxyleert, polymeriseert en in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men pyri- doxyleert door toevoeging van een oplossing die pyridoxal-5'-fosfaat bevat aan geëxtraheerd hemoglobine, deoxygenering, toevoeging van een oplossing die een reductiemiddel bevat, menging totdat een opbrengst van ongeveer 70¾ tot ongeveer 90% aan gepyridoxyleerd, gedeoxygeneerd 10 hemoglobine is verkregen en verwijdering van de overmaat reagentia.

22. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men pyri-doxyleert door toevoeging van een oplossing die pyridoxal-5'-fosfaat bevat aan geëxtraheerd hemoglobine, deoxygenering, toevoeging van een oplossing die een reductiemiddel bevat en menging gedurende ongeveer 30 15 minuten tot ongeveer 10 uur.

23. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men pyri-doxyleert door toevoeging van een oplossing die pyridoxal-5'-fosfaat bevat aan geëxtraheerd hemoglobine, deoxygenering, continu verpompen van een oplossing die een reductiemiddel bevat van een eerste reservoir 20 aan een eerste zijde van een halfdoorlatend membraan, continu verpompen van de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing die pyridoxal-5'-fosfaat bevat van een tweede reservoir naar een tweede zijde van het membraan, diffusie van een gedeelte van het reductiemiddel door het membraan, py-ridoxylering van het hemoglobine aan de tweede zijde, terugleiden van 25 een niet-gediffundeerd gedeelte van de oplossing die een reductiemiddel bevat naar het eerste reservoir en terugleiden van de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing die gepyridoxyleerd, gedeoxygeneerd hemoglobine bevat naar het tweede reservoir.

24. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men poly-30 meriseert door onderwerping van het gepyridoxyleerde, gedeoxygeneerde hemoglobine aan een polymerisatie-oplossing totdat de colloïde osmotische druk ongeveer 40 torr bereikt en verwijdering van de overmaat reagentia.

25. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men poly-35 meriseert door onderwerping van het gepyridoxyleerde, gedeoxygeneerde hemoglobine gedurende ongeveer 2 uur tot ongeveer 7 uur aan een polyme-risatie-oplossing.

26. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat men tevens ieder uur een polymerisatiemiddel aan de polymerisatie-oplossing 40 toevoegt respectievelijk in hoeveelheden van ongeveer 70 ml tot onge- .8720283 ' veer 80 ml na het eerste uur, ongeveer 45 ml tot ongeveer 55 ml na het tweede uur, ongeveer 45 ml tot ongeveer 55 ml na het derde uur, ongeveer 45 ml tot ongeveer 55 ml na het vierde uur, ongeveer 45 ml tot ongeveer 55 ml na het vijfde uur, ongeveer 20 ml tot ongeveer 30 ml na 5 het zesde uur en ongeveer 5 ml tot ongeveer 15 ml na het zevende uur en na het achtste uur de overmaat reagentia verwijdert.

27. Werkwijze volgens conclusie 21, 24 of 26, met het kenmerk, dat men de overmaat reagentia verwijdert door middel van dialyse.

28. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men poly- 10 meriseert door continu verpompen van een polymerisatie-oplossing van een eerste reservoir naar een eerste zijde van een halfdoorlatend membraan, continu verpompen van de oplossing van gepyridoxyleerd, gedeoxy-geneerd hemoglobine van een tweede reservoir naar een tweede zijde van het membraan, diffusie van een gedeelte van de polymerisatie-oplossing 15 door het membraan, polymerisatie van het gepyridoxyleerde hemoglobine aan de tweede zijde, terugleiden van een niet-gediffundeerd gedeelte van de polymerisatie-oplossing naar het eerste reservoir en terugleiden van de hemoglobine-oplossing die gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine bevat naar het tweede reservoir.

29. Werkwijze volgens conclusie 23 of 28, met het kenmerk, dat het halfdoorlatende membraan een nierdialysefilter omvat.

30. Werkwijze volgens conclusie 24, 25 of 28, met het kenmerk, dat de polymerisatie-oplossing ongeveer 14,8 mol tot ongeveer 18,1 mol glu-taaraldehyd per mol hemoglobine bevat.

31. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert door filtratie en zuivering.

32. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert 30 door een gepolymeriseerde oplossing door ultrafiltratiepatronen met holle vezels te pompen, door middel van gelchromatografie te zuiveren en met haptoglobine te behandelen.

33. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert 35 door een gepolymeriseerde oplossing door ultrafiltratiepatronen met holle vezels te pompen en door middel van gelchromatografie te zuiveren.

34. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert 40 door een gepolymeriseerde oplossing door ultrafiltratiepatronen met . 872 028 3 holle vezels te pompen en met haptglobine te behandelen. ?

35. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert door zuivering met gelchromatografie en behandeling met haptoglobine.

36. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert door zuivering met gelchromatografie.

37. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men in wezen al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer verwijdert 10 door behandeling met haptoglobine.

38. Werkwijze volgens conclusie 32, 34, 35 of 37, met het kenmerk, dat men met haptoglobine behandelt door toevoeging van het haptoglobine of door reactie met aan gel gebonden haptoglobine.

39 Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat de werk-15 wijze het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 1 in wezen vrij van ziektekiemen, microbiële anti genen en virale antigenen oplevert. +++++++++++++++ . 872 02S 3