KR100381982B1 - 사람혈청알부민의탈색방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알부민을 환원제로 처리하여 재조합 사람 혈청 알부민을 탈색시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 알부민을 유리 폴리사카라이드를 제거하거나 양이온 교환제로 처리한 다음 열처리하여 재조합 사람 혈청 알부민을 탈색시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 원료 물질에 함유된 특정한 착색 성분 또는 미생물에 의해 분비되는 오염물질이 사람 혈청 알부민에 결합되어 사람 혈청 알부민의 착색이 야기되는 것을 완전히 억제하는 재조합 사람 혈청 알부민을 제공한다.

Description

사람 혈청 알부민의 탈색방법

본 발명은 유전자 조작 기술에 의해 수득된 재조합 사람 혈청 알부민의 탈색 방법에 관한 것이다.

알부민, 특히 사람 혈청 알부민(HSA)은 순환계의 중요한 단백질이다. 상기 단백질은 간에서 생성되고 체액(예: 혈액)의 정상 삼투압을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. 또한, 이는 각종 분자의 운반체로서의 역할을 한다. HSA는 다양한 임상 조건하에 투여된다. 예를 들면, 쇼크 또는 화상의 경우, 일반적으로 혈액량을 회복시키고 기타 손상과 관련된 증상을 경감시키기 위해 HSA를 자주 투여할 필요가 있다. 저단백혈증 및 치명적인 적아구증을 앓는 환자는 종종 HSA 치료가 필요하다.

바꿔 말하면, HSA 투여를 필요로 하는 통상적인 징후는 외과 수술동안의 체액의 손실, 쇼크, 화상 또는 부종을 야기시키는 저단백혈증이다.

현재, HSA는 주로 채혈된 혈액의 분획화된 생성물로서 제조된다. 그러나, 이러한 제조방법은 비경계적이고 혈액의 공급이 산발적이라는 단점이 있다. 또한, 채혈된 혈액은 종종 간염 바이러스와 같은 바람직하지 않은 물질을 함유한다. 결과적으로, 채혈된 혈액으로부터 수득한 HSA용 대용물로서 사용될 수 있는 물질의 개발이 필요하다.

최근 재조합 DNA기술이 진보되어 미생물을 이용한 다양한 유형의 유용한 폴리펩티드의 생산이 가능해지고, 그 결과 다양한 미생물로 부터 다수의 포유동물 폴리펩티드를 이미 제조하게 되었다. HSA에 대해, 재조합 방법 및 후속적인 고도의 정제에 의한 HSA의 대규모 생산을 위한 기술이 또한 진행되고 있다.

그러나, 유전자 조작 기술에 의한 HSA 생산의 경우, 원료 물질에 함유되거나, 숙주 미생물 배양시 미생물에 의해 분비되거나, 생성된 HSA를 정제하는 동안 도입되는 특정 착색 성분에 의해 관심 있는 HSA 제제가 오염되고, 이 오염물질이 HSA와 결합하여 HSA 자체를 착색시킬 가능성이 크다. 또한, 이러한 오염 물질은 혈장-유도된 HSA의 정제를 위한 어떠한 선행 기술 방법으로도 충분히 제거할 수 없다.

본 발명의 목적은 혈장-유도된 HSA의 정제를 위한 어떠한 선행 기술 방법으로도 완전히 제거되지 않는 상기한 착색 성분 및 오염물질을 제거함으로써 HSA의 착색이 충분히 억제될 수 있는, 유전자 조작 기술에 의해 수득된 사람 혈청 알부민을 제공하는 것이다.

상기한 상황하에서, 본 발명자들은 집중적인 연구를 수행한 결과 유전자 조작 기술에 의해 수득된 HSA를, HSA의 정제 과정동안 환원제로 처리하거나 열 처리함으로써 탈색시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명은 HSA를 정제 과정동안 환원제로 처리함을 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민의 탈색 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유리 폴리사카라이드를 제거하는 조건하에서 HSA를 열처리함을 포함하는, 보다 구체적으로는 HSA를 정제 과정동안 양이온 교환제로 처리한 후, 재조합 HSA를 열처리함을 포함하는 재조합 사람 혈청 알부민의 탈색 방법에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 출발 재조합 HSA는 세포외 발현 (분비성 발현)을 실행하기 위해 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 다양한 효모 종, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 동물 세포와 같은 HSA-생산 숙주 세포를 배양함으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 탈색 처리될 재조합 HSA는 후술하는 대로 분리하고 정제할 수 있다.

(1) HSA-생산 숙주 세포의 작제 및 배양, 및 HSA의 분리 및 회수

본 발명에 사용되는 출발 재조합 HSA의 기원은 제한되지 않으나, HSA는 유전자 조작 기술로 제조한다. 본 발명에 사용될 HSA-생산 숙주는 제한되지 않으나, 유전자 조작 기술로 제조한다. 그러므로, 숙주는 이미 문헌에 보고된 숙주 및 미래에 개발될 숙주중에서 선택할 수 있다. 숙주의 예에는 HSA 생산자로 작제된 미생물성 세포(예: 에스케리치아 콜라이), 다양한 효모 종, 바실러스 섭틸리스 및 동물 세포가 포함된다. 특히 바람직한 숙주는 효모 종, 특히 사카로마이세스속[예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)], 피치아속[예: 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)] 또는 클루이베로마이세스속 [예: 클루이베로마이세스락티스(Kluyveromyces lactis)]에 속하는 효모이다. 영양 요구성 균주 또는 항생제-민감성 균주도 또한 사용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애 AH 22 (a, his 4, leu 2, can 1), 피치아 파스토리스 GTS115(his 4) 및 클루이베로마이세스락티스 MW-98-8C(α, ura A, arg, lysK⁺, pKD1° )가 바람직하게 사용된다. 본 발명에 사용되는 HSA는 바람직하게는 이들 숙주를 사용하여 생산된다.

HSA-생산 숙주의 작제, 숙주의 배양에 의한 HSA의 생산, 및 생성된 배양액으로 부터의 HSA의 분리 및 회수는 공지된 기술 또는 이의 변형된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

예를 들면, HSA-생산 숙주(또는 HSA-생산 균주)의 작제는 고유의 사람 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법(EP-A 제73646호에 상응하는 JP-A 제58-56684호, EP-A 제79739호에 상응하는 JP-A 제58-90515호 및 EP-A 제91527호에 상응하는 JP-A 제58-150517호), 변형된 사람 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법(EP-A제206733호에 상응하는 JP-A 제62-29985호 및 제1-98486호), 합성 시그날 (signal) 서열을 사용하는 방법 (EP-A 제329127호에 상응하는 JP-A 제1-240191호), 혈청 알부민 시그날 서열을 사용하는 방법(EP-A 제319641호에 상응하는 JP-A 제2-167095), 재조합 플라스미드를 염색체로 도입시키는 방법(EP-A 제399455호에 상응하는 JP-A 제 3-72889호), 숙주를 융합시키는 방법(EP-A 제409156호에 상응하는 JP-A 제3-53877호), 메탄올-함유 배지중에서 돌연변이시키는 방법, 돌연변이체 AOX₂프로모터를 사용하는 방법(EP-A 제506040호), HSA를 바실러스 섭틸리스에서 발현시키는 방법(EP-A 제229712호에 상응하는 JP-A 제62-215393호), HSA를 효모에서 발현시키는 방법 (EP-A 제123544호에 상응하는 JP-A 제60-41487호, EP-A 제248657호에 상응하는 JP-A 제63-39576호, EP-A 제251744호에 상응하는 JP-A 제63-74493호) 및 HSA를 피치아에서 발현시키는 방법(EP-A 제344459호에 상응하는 JP-A 제2-104290호)을 사용하여 수행할 수 있다(본 명세서에서 사용되는 용어 "JP-A" 는 미심사 일본 공개 특허공보를 의미한다).

HSA-생산 숙주의 배양(HSA 생산방법)은 상기한 참조 문헌에 기술된 공지된 방법을 사용하거나; HSA 생산자 세포의 고농도 기질 억제를 방지하기 위해, 유가식 발효를 통해 배지에 고농도의 글루코스 용액을 점진적으로 첨가함으로써 생산자 세포 및 생성물 모두를 고농도로 생산할 수 있는 JP-A 제3-83595호에 기술된 방법에 따르거나; 또는 HSA의 생산성을, 지방산을 배지에 가함으로써 향상시키는 EP-A 제 504823호에 상응하는 JP-A 제4-293495호에 기술된 다른 방법에 따라 수행할 수 있다.

HSA의 분리 및 회수는 상기한 참조 문헌에 기술된 공지된 방법을 사용하거나; 프로테아제를 열처리하여 불활성화시키는 EP-A 제420007호에 상응하는 JP-A 제 3-103188호에 기술된 방법을 따르거나, 또는 HSA를 음이온 교환제, 소수성 캐리어(carrier) 및 활성탄으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 흡착제를 사용하여 착색 물질로부터 분리하는 USP 제5,132,404호 또는 EP-A 제46459호에 상응하는 JP-A 제4-54198호에 기술된 착색 억제방법에 따라 수행할 수 있다.

(2) HSA의 초기 정제

HSA는 분획화, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과, 밀도-구배 원심분리 또는 투석과 같은 공지된 방법에 의해 초기 정제할 수 있다.

적합한 초기 정제 방법은 다음 단계들을 포함한다:

(i) HSA를 발현시키는 숙주의 배양액 상층액을 분자량 배타적 한계가 100,000 내지 500,000인 제1 한외여과막을 통해, 이어서 분자량 배타적 한계가 1,000 내지 50,000인 제2 한외여과막을 통해 통과시켜 제1 여액을 수득하고;

(ii) 제1 여액을 50 내지 70℃에서 30분 내지 5시간 동안 열처리하여 가열된 샘플을 수득한 다음;

(iii) 가열된 샘플을 pH 3 내지 5에서 산 처리하여 산 처리된 샘플을 수득하고;

(iv) 산 처리된 샘플을 분자량 배타적 한계가 100,000 내지 500,000인 한외여과막을 통해 통과시켜 제2 여액을 수득한 다음;

(v) 제2 여액을 pH 3 내지 5 및 염 농도 0.01 내지 0.2 M에서 양이온 교환제에 노출시킨 다음 양이온 교환제를 pH 8 내지 10 및 염 농도 0.2 내지 0.5M에 노출시켜 제1 용출액을 수득하고;

(vi) 제1 용출액을 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.5M에서 소수성 크로마토그래피용 캐리어와 접촉시키고 비흡착된 분획을 회수하여 제2 용출액을 수득한 다음;

(vii) 제2 용출액을 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.1M에서 음이온 교환제와 접촉시키고 비흡착된 분획을 회수하여 알부민을 수득한다.

또는, 상기 단계(vi) 대신에 상응하는 샘플을 pH 6 내지 8 및 염 농도 1 내지 3M에서 소수성 크로마토그래피 캐리어와 접촉시킨 다음 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.5M에서 용출시키는 또 다른 단계를 사용할 수 있고; 상기단계(vii) 대신에 상응하는 샘플을 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.05M에서 음이온 교환제와 접촉시킨 다음 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.05 내지 1M에서 용출시키는 또 다른 단계를 사용할 수 있으며; 또는 염석을 pH 3 내지 5 및 염 농도 0.5 내지 3M에서 수행하고 침전된 분획물을 회수하는 추가의 단계를 상기 단계(v)와 (vi) 사이, 또는 (vi)과 (vii) 사이, 또는 (vii)후에 도입 할 수 있다.

(3) 고도의 정제

HSA를 고도로 정제하기 위해 하기 처리를 수행할 수 있다.

(i) 킬레이트 수지 처리

킬레이트 수지 처리는 HSA의 탈색을 위한 것이다. 이 처리는 상기 정제 과정의 일부, 바람직하게는 최종 단계일 수 있는데, 이는 HSA를 특이적 리간드 잔기를 갖는 킬레이트 수지와 접촉시키는 것이다. 바람직하게는, 킬레이트 수지의 캐리어 잔기는 소수성 특성을 갖는다. 이러한 유형의 캐리어 잔기의 예에는 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체, 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체가 포함된다.

리간드 잔기의 예에는 티오우레아 그룹, 및 한 분자에 폴리올 그룹으로 이루어진 다수의 아그룹(예: N-메틸글루카민 그룹, 이미노 그룹, 아미노 그룹, 에틸렌 이미노 그룹)을 함유하는 폴리아민 그룹(폴리에틸렌 폴리아민과 같은 폴리알킬렌 폴리아민 그룹 포함)이 포함된다. 상기한 캐리어 및 리간드 잔기를 갖는 시판중인 킬레이트 수지의 바람직한 예에는 DIAION CRBO2[미츠비시 가세이 코포레이션(Mitsubishi Kasei Corp.)이 시판중인 리간드 잔기, N-메틸글루카민 그룹], DIAION CR20 [미츠비시 가세이 코포레이션이 시판중인 리간드 잔기, -NH (CH₂CH₂NH)_nH], LEWATIT TP214[바이엘(Bayer)이 시판중인 리간드 잔기, -NHCSNH₂] 및 AMBERLITECG4000이 포함되며, 이는 모두 캐리어 잔기로서의 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체를 갖는다.

킬레이트 수지 처리를 위한 바람직한 조건은 다음과 같다. pH : 산성 또는 대략 중성(pH 3 내지 9, 바람직하게는 4 내지 7),

기간 : 1시간 이상, 바람직하게는 6시간 이상,

이온 강도 : 50mmho 이하, 바람직하게는 1 내지 10mmho,

혼합 비율 : HSA 250mg(습량 기준)을 기준으로 하여 수지 0.1 내지 100g, 바람직하게는 1 내지 10g.

(ii) 소수성 크로마토그래피

페놀-황산 방법에 의해 검출될 수 있는 유리 비항원성 오염물질은 상기한 정제 단계(i) 내지 (vii) 및 킬레이트 수지 처리를 통해 수득한 HSA로부터 완전히 제거되지 않는다.

상기한 처리를 통해 수득한 HSA를 pH 2 내지 5, 바람직 하게는 3 내지 4 및 염 농도 0.4 내지 1M, 바람직하게는 0.4 내지 0.7M에서 소수성 크로마토그래피용 캐리어와 접촉시킨다. 용출은 pH 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7 및 염 농도 0.01 내지 0.3M, 바람직하게는 0.05 내지 0.2M에서 수행할 수 있다. 상기한 단계 (vi)은 이러한 소수성 크로마토그래피 단계로 대체시킬 수 있다. 따라서, 페놀-황산 방법에 의해 검출될 수 있는 유리 비항원성 오염물질을 함유하지 않는 HSA를 회수할 수 있다.

본 원에 사용된 용어 "페놀-황산 처리"는 페놀 용액을 샘플인 탄수화물 용액에 가하고, 여기에 진한 황산을 가한 다음, 혼합물을 진탕하여 용해 열을 사용하여 탄수화물로부터 유도된 퍼푸랄 유도체가 페놀과 반응하도록하고 생성된 착색된 반응 생성물을 비색계로 측정함을 포함하는, 탄수화물의 비색계 측정을 의미한다. 페놀-황산 방법에 의해 검출될 수 있는 유리 비항원성 오염물질에는 중성 탄수화물(예: 펜토스, 헥소스, 일탄수화물 글리코사이드 및 올리고사카라이드), 복합 탄수화물 및 우론산, 메틸화 탄수화물이 포함된다. 이러한 오염물질은 생산자 숙주-유도된 물질에 대한 항체와 항원-항체 반응을 일으키지 않는다.

소수성 크로마토그래피에 사용되는 캐리어에는 각 그룹에 4 내지 18개의 탄소원자를 갖는 알킬 그룹(부틸 그룹, 옥틸 그룹, 옥틸데실 그룹등), 및 페닐 그룹을 함유하는 캐리어가 포함된다. 부틸 그룹-함유 캐리어의 예에는 부틸-아가로즈, 부틸-폴리바닐[토소 코포레이션(Tosoh Corp.)이 시판중인 상표명 부틸 토요펄]이 포함되고, 옥틸 그룹-함유 및 옥틸데실 그룹-함유 캐리어의 예에는 각각 옥틸-아가로즈 및 옥틸데실- 아가로즈가 포함되며 페닐 그룹-함유 캐리어의 예에는 페닐- 셀룰로즈[세이카가쿠 코포레이션(Seikagaku Corp.)이 시판중인 상표명 페닐 셀룰로핀]가 포함된다.

(iii) 붕산 또는 이의 염을 사용한 처리

HSA는 항원성 생산자 숙주-유도된 오염물질 및 페놀-황산 방법에 의해 검출될 수 있는 유리 비항원성 오염물질을 제거하기 위해 붕산 또는 이의 염을 사용하여 처리될 수 있다.

붕산의 예에는 오르토 붕산, 메타붕산, 테트라붕산이 포함된다. 이의 염에는 알칼리 금속염(예: 나트륨염 및 칼륨염) 및 알칼리 토금속염(예: 칼슘염)이 포함된다. 사붕산칼슘이 바람직하게 사용된다. 붕산 또는 이의 염은 최종농도 약 0.01 내지 1M, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.2M로 가한다. 이 처리는 pH 약 8 내지 11, 바람직하게는 약 9 내지 10에서 약 1 내지 10시간동안 수행할 수 있다. 이 처리는 바람직하게는, 예를 들면, 1mS이하와 같은 낮은 전기 전도율로 수행할 수 있다. HSA 농도는 바람직하게는, 예를 들면, 5%이하, 보다 바람직 하게는 약 0.1 내지 3%와 같이 낮다.

붕산 또는 이의 염을 사용하여 처리한 후, 생성된 침전물은, 예를 들면, 원심분리 또는 여과하여 제거하고, 상층액을 회수한 다음, 농축시키고 탈염한다.

(iv) 한외여과

상기 정제 단계후 회수한 HSA를 바람직하게는 분자량 배타적 한계가 약 100,000인 한외여과막을 사용하여 한외여과시킨다. 이 한외여과 처리로 피로겐이 제거될 수 있다.

(4) 탈색

(i) 환원제를 사용한 처리

환원제를 사용한 처리는 상기(2)의 정제 과정 동안 또는 상기(3)의 고도의 정제 과정 동안 수행할 수 있다. 또는, 이 처리를 상기한 정제 단계들과 함께 또는 이들중 하나의 단계 직후에 수행할 수 있다.

이 처리에 사용되는 환원제는 환원 활성이 있는한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는 SH 그룹을 함유하는 저분자량 화합물, 예를 들면, 시스테인, 시스테아민, 시스타민, 아미노 프로판티올, 메티오닌, 에티오닌 또는 글루타티온, 아황산, 차아황산, 피로아황산, 아인산-아황산, 아인산-피로아황산, 아황산-피로인산, 아스코르브산 또는 이의 염이 포함된다. 염에는 알칼리 금속염(예: 나트륨염 또는 칼륨염) 및 알칼리성 토금속염(예: 칼슘염)이 포함된다.

처리하는 동안의 HSA농도 범위는 0.01 내지 25w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 5w/v%이다. 환원제는 시스테인의 경우 약 1 내지 100mM로, 아황산의 경우 약 0.001 내지 10%의 양으로 사용한다. 처리는 10 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 80℃의 온도 범위에서 10분 내지 240시간 동안, 바람직하게는 30분 내지 120시간 동안 수행할 수 있다.

착색을 억제하는 것으로 공지된 아민 화합물(JP-A 제5-260980호)을 환원제와 배합하여 사용할 수 있다. 아민 화합물의 예에는 알킬아민, 디아민, 구아니딘, 벤즈아미딘, 염기성 아미노산 및 아미노페닐아세트산이 포함된다. 알킬아민은 바람직하게는 탄소원자 1 내지 6개를 함유한다. 이의 예에는 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민 및 부틸 아민이 포함된다. 디아민의 예에는 특히 탄소수 1 내지 6의 알킬렌디아민(예: 메틸렌디아민, 에틸렌디아민 또는 프로필렌 디아민), 각각 탄소수 1 내지 6의 알킬 잔기 및 알킬렌 잔기를 함유하는 N,N-디알킬알킬렌디아민(예: N,N-디메틸에틸렌디아민 또는 N,N-디에틸에틸렌디아민)이 포함된다. 구아니딘의 예에는 구아니딘, 아미노구아니딘 및 페닐구아니딘이 포함된다. 벤즈아미딘의 예에는 벤즈아미딘 및 p-아미노벤즈아미딘이 포함된다. 염기성 아미노산에는 리신 또는 아르기닌이 포함된다.

아민 화합물은 0.01 내지 10w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 1w/v%의 양으로 사용한다.

SH 화합물을 사용할 경우, 처리는 특히 50 내지 100℃에서의 열처리를 병행하여 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5 에서 수행할 수 있다. 열 처리를 병행하여 수행하지 않을 경우, 즉 처리가 40℃이하에서 수행되는 경우, pH는 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5 범위이다. 아스코르브산을 사용할 경우, pH값의 범위는 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5이다. 다른 환원제는 pH 6 내지 10, 바람직하게는 8 내지 9에서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 환원제를 사용한 탈색처리로 HSA의 착색도를 처리직전의 HSA와 비교하여 10 내지 70%까지 감소시킬 수 있다.

(ii) 양이온 교환제 처리후의 열처리

이 열처리는 정제 과정(2)동안, 고도의 정제 과정을 포함한 후속적인 정제 과정동안 양이온 교환제 처리(v)직후, 또는 유리 폴리사카라이드를 양이온 교환제 처리(v)에 의해 제거하는 조건하에서 최종 단계에서 수행할 수 있다. 구체적으로, 유리 폴리사카라이드의 함량은 HSA 농도가 250mg/ml 일때 약 5mg/ml 이하로 감소된다.

열 처리는 50 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 80℃에서 10분 내지 10시간, 바람직하게는 30분 내지 5시간 동안 수행할 수 있다. 처리 동안의 HSA 농도 범위는 0.01 내지 25w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 5w/v%이다. HSA를 완전히 안정화시키기 위해, 열 처리를 바람직하게는 아세틸트립토판 또는 이의 염(예: 나트륨 염), 탄소수 6 내지 20의 지방산 또는 이의 염(예: 나트륨염)과 같은 공지된 안정화제의 존재하에 수행한다(JP-A 제3-103188호).

열 처리는 바람직하게는 상기한 환원제의 존재하에 수행한다.

상기한 아민 화합물도 열처리중에 또한 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 열처리 직후, HSA의 착색도를 처리 직전과 비교하여 30 내지 70%까지 감소시킬 수 있다.

(5) 약제학적 제제

이렇게 수득한 rHSA(또는 이를 함유하는 조성물)를 한외여과, 살균 여과, 분산, 동결건조와 같은 공지된 기술에 따라 약제학적 제제로 만들 수 있다. 또한, 제조 단계동안의 안정성 및 제조후의 보존 안정성을 보장하기 위해 아세틸 트립토판 또는 이의 염(예를 들면, 나트륨염) 및 나트륨 카프릴레이트를 필요에 따라 안정화제로서 혼합할 수도 있다. 이들 안정화제는 약 0.01 내지 0.2M, 바람직하게는 0.02 내지 0.05M의 양으로 사용할 수 있다. 나트륨 함량은 3.7mg/ml 이하일 수 있다. 이들 안정화제는 한외여과, 살균 여과, 분산, 동결건조 단계전에 가할 수 있다.

한외여과 및 살균 여과에 의해 수득한 rHSA 약제학적 제제는 투여단위로 용기내에 무균 포장한다. 본원에 사용된 용어 "투여단위로 용기내에 포장"이라 함은 rHSA 약제학적 제제의 투여 단위, 예를 들면, pH값이 약 6.4 내지 7.4이고 삼투압 비율이 약 1인 rHSA 25%를 함유하는 액체 제제를 용기내에 20 내지 50ml(rHSA 5 내지 12.5g)씩 포장하는 것을 의미하고; 또는 rHSA 5%를 함유하는 액체 제제를 용기 내에 100 내지 250ml(rHSA 5 내지 12.5g)씩 포장하는 것을 의미한다. rHSA 약제학적 제제를 포장하는데 사용되는 용기의 예에는 각각 용량이 10 내지 250ml인 유리 용기, 폴리에틸렌 용기, 탈알칼리화 연질 유리 용기(JP-A 제4-210646호)가 포함된다.

본 발명은 원료 물질 또는 미생물에 의해 분비된 오염물질에 함유된 특정한 착색 성분이 HSA에 결합됨으로써 야기되는 착색이 없는 재조합 HSA를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다. 그러나, 이 실시예는 설명하기 위함이지 본 발명을 제한할 의도가 아님을 이해해야 한다.

참조 실시예 1

HSA-생산 숙주의 배양

(1) 사용된 균주, 피치아 파스토리스 GCP101

AOX₁프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키도록 구성된 전사 단위를 함유하는, EP-A 제344459호에 상응하는 JP-A 제2-104290호에 기술된 플라스미드 pHSA113으로부터 HSA 유전자의 5' 비암호 영역을 제거하여 HSA 발현 플라스미드 pPGP1을 제조한다. pPGP1은 정상 HSA의 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA를 함유한다(정상 HSA의 아미노산 서열 및 정상 HSA를 암호화하는 게놈 DNA의 염기 서열 모두 문헌[참조: J.Biol.Chem., 261, 6747-6757(1986)]에 기술되어 있다). 이어서, EP-A 제 344459호에 상응하는 JP-A 제2-104290호에 기술된 방법에 따라 HSA 발현 플라스미드 pPGP1을 NOtI로 분해시키고 생성된 NOt1-분해된 단편으로 피치아 파스토리스균주 GTS115(his 4)(NRRL 기탁번호 Y-15851)의 AOX₁유전자 영역을 대체시켜 형질전환체 PC4130을 작제한다. 균주는 AOX₁유전자의 결실로 인해 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 배지에서 잘 증식하지 못한다(Mut^-균주).

균주 PC4130을 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤 및 2% 글루코스) 3ml에 접종한다. 배양한지 24시간 후, 세포를 YPD 배지 50ml에 접종하여 세포 밀도를 초기 혼탁도 OD₅₄₀0.1로 조절해야 한다. 30℃에서 배양한지 3일후, 생성된 세포를 다시 초기 세포 혼탁도 OD₅₄₀0.1의 YPD 배지 50ml에 접종한다. 이후, 동일한 방법으로 3일마다 계대배양을 반복한다. 각각의 계대배양후, 세포를 살균수로 희석하고 2% MeoH-YNBw /oa.a. 플레이트(아미노산을 함유하지 않는 0.7% 효모 질소 기재, 2% 메탄올 및 1.5% 한천 분말)에 10⁷세포/플레이트의 접종 규모로 부은 다음, 30℃에서 5일 동안 배양한 후 콜로니의 존재 유무를 판단한다. 연속적인 계대배양을 한지 12일후 2% MeOH-YNBw/oa. a. 플레이트에서 20개의 콜로니가 관측된다. Mut^-균주는 2% MeoH-YNBw/oa. a. 배지에서 거의 증식할 수 없는 반면 Mut⁺균주는 잘 증식할 수 있다. 즉, 콜로니의 출현은 균주가 증가된 메탄올 동화 능력을 획득하여 Mut⁺균주가 수득되었음을 의미한다. 이렇게 수득된 콜로니중 하나를 살균수로 적합하게 희석하고 2% MeOH-YNBw/oa. a. 플레이트상에 도말하여 단일 콜로니를 분리한다. 생성된 단일 콜로니중 하나를 GCP101로 칭한다.

(2) 균주의 배양

[1차 씨드(seed) 배양]

글리세롤 중에 동결시킨 균주 1ml를, YPD 배지(표1 참조) 200ml를 함유하는 1,000ml들이 배플 삼각 플라스크속으로 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕하면서 배양한다.

[표 1]

(2차 씨드 배양)

1차 씨드 배양액을 YPD배지 5ℓ 를 함유하는 10ℓ 들이 소형 발효기속으로 접종하고, 2차 씨드 배양을 30℃에서 24시간 동안 진탕하면서 수행한다. 배지중의 용해된 산소량이 용해된 포화 산소 농도의 약 50%로 유지되도록 진탕 속도를 조절한다. 씨드 배양에서, 배지의 pH는 조절하지 않는다.

(본배양)

2차 씨드 배양액을 배치 배양 배지(표2 참조) 250ℓ 를 함유하는 1,200ℓ 들이 발효기로 이동시키고, 진탕 및 통기시키면서 배치 배양을 개시한다. 배지중에 용해된 산소량이 용해된 포화 산소 농도의 약 50 내지 30%로 유지되도록 진탕 속도를 조절한다. 배치 배양 배지중에서 글리세롤이 소모된 경우, 공급 배지(표3 참조)를 가한다. 배지 pH를 조절하여 5.85로 고정시킨다. 경우에 따라 거품을 방지하기 위해 소포제를 배양 배지에 가한다.

[표 2]

[표 3]

참조 실시예 2

HSA 발현 플라스미드 pMM042는 참조 실시예 1에서 수득한 균주 GCP101로부터 분리된 AOX₂프로모터(고유 AOX₂프로모터의 돌연변이체[참조: YEAST, 5, (167-177, 1988; Mol, Cell. Biol., 9, 1316-1323, 1989], 이 프로모터의 개시 코돈으로부터 상부 255번째 염기를 T에서 C로 바꾼 것이다)를 사용하여 작제한다. 이렇게 작제한 플라스미드를 피치아 파스토리스 GTS115속으로 도입하여 형질전환체 UHG42-3(JP-A 제4-299984호 또는 EP-A 제506040호)을 수득한다. 이후, 이렇게 수득한 형질전환체를 참조 실시예 1에 기술된 방법에 따라 배양하여 형질전환체가 HSA를 생산하도록 한다.

참조 실시예 3

(1) 배양 상층액의 분리-막 분획(I) 및 (II)

참조 실시예 1 또는 2에서 수득한 배양액 약 800ℓ를 가압 여과하여 배양액 상층액을 분리한다. 이어서, 수득한 상층액을 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외여과막을 통해 통과시킨다. 이어서, 수득한 여액을 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외여과막을 사용하여 약 80ℓ의 용적으로 농축시킨다[막 분획(I)]. 이어서, 막 분획(I)을 60℃에서 3시간 동안 5mM 나트륨 카프릴레이트, 10mM 시스테인 및 100mM 아미노구아니딘의 존재하에, pH7.5에서 열 처리한다. 이렇게 열 처리된 용액을 약 15℃로 급격히 냉각시키고, pH를 4.5로 조절한 다음 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외여과막을 사용하여 처리한다[막 분획(II)]. 이후, 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외여과막을 사용하여 생성된 알부민 용액중의 완충액을 50mM 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH4.5)으로 대체한다.

(2) 양이온 교환제 처리

상기 단계(1)에서 수득한 알부민 용액을 50mM 염화나트륨을 함유하는 50mM아세테이트 완충액(pH4.5)으로 미리 평형화시킨 S-세파로즈가 충전된 컬럼에 넣고, 컬럼을 동일한 완충액으로 완전히 세척한 다음 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH9)으로 용출시킨다.

(3) 소수성 크로마토그래피

S-세파로즈 컬럼으로부터 용출된 HSA 용액을 0.15M 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH6.8)으로 미리 평형화시킨 페닐 셀룰로핀이 충전된 컬럼에 넣는다. HSA가 이러한 조건하에서 페닐 셀룰로핀에 흡착되지 않기 때문에 컬럼을 통해 통과된 HSA 분획을 수집한다. 이렇게 회수된 HSA 용액을 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외여과막을 사용하여 약 501의 용적으로 농축시키고, 동시에 HSA 용액중의 완충액을 50mM 인산염 완충액(pH6.8)으로 대체한다.

(4) 음이온 교환제 처리

소수성 크로마토그래피 처리되고, 농축된 다음 완충액- 교환된 HSA 용액을 50mM 인산염 완충액(pH6.8)으로 미리 평형화 시킨 DEAE-세파로즈가 충전된 컬럼에 넣는다. 이러한 조건하에서, HSA는 DEAE-세파로즈에 흡착되지 않고 컬럼을 통해 통과한다.

(5) 킬레이트 수지 처리

정제된 HSA의 25w/v% 용액 1ml를 DIAION CRBO2(미츠비시 가세이 코포레이션이 제조하는, 캐리어 부분으로서 스티렌- 디비닐벤젠 공중합체를 갖고 리간드 부분으로서 N-메틸 글루카민 그룹을 갖는 킬레이트 수지)와 혼합하고, 생성된 혼합물을 24시간 동안 실온, pH6.8 및 이온 농도 5mmho에서 교반한다. 이어서, 수지를 증류수로 세척하여 비흡착된 HSA- 함유 분획을 회수한다.

(6) 붕산염 처리

HSA 농도는 전기 전도율이 1mS 이하가 되도록 2.5w/v%로 조절한다. 사붕산 칼슘을 생성된 용액에 가해 최종 농도를 100mM로 만들고 용액의 pH값은 9.5로 조절한다. 용액을 10시간 동안 정치시킨 후, 생성된 침전물을 제거하여 상층액을 회수하고, 이어서 농축시키고 탈염시킨다. 이어서, 생성된 용액을 분자량 배타적 한계가 약 100,000인 한외여과막을 통해 통과시킨다.

실시예 1

참조 실시예 1 또는 2에서 수득한 배양액 약 800ℓ 를 가압 여과하여 배양액 상층액을 분리한다. 이어서, 수득한 상층액을 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외여과막을 통해 통과시킨다. 이어서, 수득한 여액을 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외 여과막을 사용하여 약 80ℓ의 용적으로 농축시킨다[막 분획(I)].

이어서, 생성된 농축액을 60℃에서 3시간 동안 5mM 나트륨 카프릴레이트, 5mM 아세틸트립토판, 100mM 아미노구아니딘 및 10mm 시스테인의 존재하, pH7.5에서 열 처리한다. 시스테인으로 처리한 후 측정한 착색도 (280nm에서의 흡광도에 대한 350nm에서의 흡광도의 비, 이후 A₃₅₀/A₂₈₀으로 언급)는 처리전에 측정한 값과 비교하여 23%감소된 것이다.

실시예 2

참조 실시예 3의 음이온 교환제 처리(4)로 수득한 분획을 사용한다. 표 4에 열거한 바와 같은 환원제를 분획에 가해 최종 농도를 1%로 수득한다. HSA 농도는 0.5%로 조절하고 pH는 9로 조절한다. 이어서, 생성된 용액을 37℃에서 24시간 동안 정치시킨다. 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

표 4에서 알 수 있듯이, 착색도는 어떠한 환원제를 사용하는 경우든지 20 내지 30% 감소된다.

실시예 3

참조 실시예 3의 음이온 교환제 처리(4)로 수득한 분획을 사용한다. 아스코르브산을 분획에 가해 최종 농도를 1%로 수득한다. HSA 농도는 0.5%로 조절하고 pH는 4.5로 조절한다. 이어서, 생성된 용액을 15℃에서 24시간 동안 정치시킨다. 결과를 표 5로 나타낸다.

[표 5]

표 5로부터 알 수 있듯이, 착색도는 아스코르브산을 사용할 경우 20% 감소된다.

실시예 4

pH의 영향

참조 실시예 3의 음이온 교환제 처리(4)로 수득한 분획을 사용한다. 환원제(아황산나트륨)를 분획에 가해 최종 농도를 1%로 수득한다. HSA 농도는 0.5%로 조절하고 pH는 7,8,9 및 10으로 조절한다. 이어서, 생성된 용액을 37℃에서 12시간 동안 정치시킨다. 결과를 표 6으로 나타낸다.

[표 6]

표 6으로 알 수 있듯이, 착색도는 어떠한 pH(pH 7 내지 10)에서도 감소된다. 특히, 환원 처리의 우수한 효과를 pH 8 및 pH 9에서 수득할 수 있다. 이 경우, 착색도는 23 내지 24% 감소된다.

실시예 5

참조 실시예 3의 음이온 교환제 처리(4)로 수득한 분획을 사용한다. 환원제(아황산나트륨 및 아인산-피로아황산칼륨)를 1,2 및 3%의 농도로 분획에 가한다. HSA 농도는 0.3% 및 5%로 조절하고 pH는 9로 조절한다. 이어서, 생성된 용액을 15℃에서 2일 및 5일 동안 정치시킨다. 처리후, 용액을, 염화나트륨 0.3%를 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH6.5)에 대해 투석하여 환원제를 제거한다. 결과를 표 7로 나타낸다.

[표 7]

표 7로 알 수 있듯이, 착색도는 모든 시험에서 30 내지 45% 감소된다.

실시예 6

각각의 정제 단계에서 환원제를 사용한 처리의 효과

환원제를 사용한 처리의 효과를 각각의 정제 단계에서 검사한다. 참조 실시예 3의 양이온 교환제 처리(2), 소수성 크로마토그래피 처리(3) 및 음이온 교환제 처리(4)로 수득한 HSA 분획을 조절하여 HSA 농도가 0.3%가 되게한다. 환원제 (아인산-피로아황산칼륨)를 2% 농도로 각각의 분획에 가하고 pH를 9로 조절한다. 이어서, 생성된 용액을 15℃에서 5일 동안 정치시킨다. 처리후, 용액을, 염화나트륨 0.3%를 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH6.5)에 대해 투석하여 환원제를 제거한다. 결과를 표 8로 나타낸다.

[표 8]

표 8로 알 수 있듯이, 각각의 정제 단계에서 우수한 탈색 효과가 수득될 수 있다. 특히, 탈색 효과는 장파장 영역에서 뚜렷하다.

실시예 7

환원제 처리와 병행하는 정제 처리

정제 단계[참조 실시예 3의 음이온 교환제 처리(4)]를 환원제의 존재하에 수행할 경우 탈색 효과를 검사한다. 이어서, HSA 용액을, 환원제(아황산나트륨 및 아인산-피로아황산칼륨)를 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH9)을 사용하여 Q-세파로즈[파마시아(Pharmacia)]와 접촉시키고 실온에서 밤새 정치시킨다. 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH9) 으로 세척하여 환원제를 제거한 후, HSA를 1M 염화나트륨을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH9)으로 용출시킨다. 표 9는 이렇게 정제된 HSA의 착색도를 나타낸다.

[표 9]

음이온 교환제 처리를 환원제의 존재하에 수행할 경우, 우수한 탈색 효과를 0.1 내지 0.5%의 환원제의 농도 범위에서 수득할 수 있다.

실시예 8

참조 실시예 3(1)에서 60℃에서 3시간 동안 막 분획 (I)을 열처리하여 수득한 HSA 용액을 15℃에서 10mM 시스테인을 함유하는 완충액(pH4)에 대해 투석한 다음 16시간 동안 정치 시킨다. 그 결과, 열처리후의 착색도(A₃₅₀/A₂₈₀)는 0.1인 반면 환원제로 처리한 후 0.066으로 감소된다.

실시예 9

참조 실시예 1 또는 2에서 수득한 배양액 약 800ℓ를 가압 여과하여 배양액 상층액을 분리한다. 이어서, 수득한 상층액을 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외여과막을 통해 통과시킨다. 이어서, 수득한 여액을 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외여과막을 사용하여 약 80ℓ의 용적으로 농축시킨다[막 분획(I)].

생성된 농축액을 pH4.5로 조절한 다음 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외 여과막을 사용하여 처리한다[막 분획(II)]. 이후, 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외여과막을 사용하여, 생성된 알부민 용액중의 완충액을, 50mM 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH4.5)으로 대체시킨다. 이렇게 수득한 알부민 용액을, 50mM 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH4.5)으로 미리 평형화시킨 S-세파로즈가 충전된 컬럼에 넣고, 컬럼을 동일한 완충액으로 완전히 세척한 다음 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH9)으로 용출시킨다. S-세파로즈를 사용한 처리전 및 처리후, 페놀-황산 방법에 의한 유리 폴리사카라이드 함량에 대해 HSA 분획을 검사한다. 그 결과, 유리 폴리사카라이드 함량은 처리 후 1/20로 감소된다. S-세파로즈 컬럼으로부터 용출된 HSA 용액을 60℃에서 1시간동안 5mM 나트륨 카프릴레이트, 5mM 아세틸트립토판, 100mM 아미노구아니딘 및 10mM 시스테인의 존재하, pH7.5에서 열처리한다. 시스테인을 사용한 처리후 측정한 A₃₅₀/A₂₈₀값은 처리전과 비교하여 50% 감소한 값이다.

실시예 10

탈색 효과와 양이온 교환제 처리 및 열처리 순서간의 관계

참조 실시예 1 또는 2에서 수득한 배양액 약 800ℓ를 가압 여과하여 배양액 상층액을 분리한다. 이어서, 수득한 상층액을 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외여과막을 통해 통과시킨다. 이어서, 수득한 여액을 분자량 배타적 한계가 30,000인 한외 여과막을 사용하여 약 80ℓ의 용적으로 농축시킨다[막 분획(I)]. 생성된 농축액을 pH4.5로 조절한 다음 분자량 배타적 한계가 300,000인 한외 여과막을 사용하여 처리한다[막 분획(II)]. 이렇게 수득한 분획으로 다음 실험을 수행한다.

(1)분획을 실시예 9와 동일한 방법으로 양이온 교환제로 처리한 다음 열처리한다. HSA 농도가 250mg/ml일때 막 분획(II) 중의 유리 폴리사카라이드 함량은 약 110mg/ml이고 양이온 교환제 처리로부터 수득한 용출액중의 유리 폴리사카라이드 함량은 5mg/ml이다.

(2)열처리후 양이온 교환제 처리로 하는 것을 제외하고는 실시예 9의 방법을 반복한다.

각각의 실험에서, 각각의 단계에서 수득한 HSA 분획의 착색도를 측정하고 비교한다. 결과를 표 10에 나타낸다.

[표 10]

표 10에서 알 수 있듯이, 양이온 교환제 처리후 열처리할 경우, 처리전 착색도가 열 처리후 55% 감소된다. 반면, 열처리후 양이온 교환제 처리할 경우, 착색도는 36% 감소된다. 따라서, 전자의 방법이 후자의 방법에 비해 착색도를 더 억제할 수 있다. 이 차이는 양이온 교환제 처리에 의해 HSA 분획중의 상당한 양의 유리 폴리사카라이드가 제거되기 때문인 것으로 여겨진다.

실시예 11

탈색 효과의 정제 과정 동안의 열처리 시간간의 관계

참조 실시예 3에 따른 HSA의 정제 과정을 기초로 하여, 열처리시간과 탈색 효과간의 관계를 검사한다. 참조 실시예 3에서, 열처리는 양이온 교환제 처리 직전에 수행한다. 열처리를 최종 단계로서 수행한 경우, 열처리를 양이온 교환제 처리 직후에 수행한 경우 및 열처리를 최종 단계로서 추가로 수행한 경우에 대해 착색도를 비교한다. 실시예 9에서의 열처리 조건을 따른다. 결과를 표 11로 나타낸다.

[표 11]

(1) 가압여과

(2) 양이온 교환제 처리

(3) 소수성 크로마토그래피

(4) 음이온 교환제 처리

(5) 킬레이트 수지 처리

(6) 붕산칼슘 처리

o 열처리

본 발명을 이의 특정 양태를 참조로 상세히 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양하게 변화시키고 변형시킬 수 있음이 명백할 것이다.

Claims (19)

1. 재조합 사람 혈청 알부민을 환원제로 처리하는 것을 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민을 탈색시키는 방법.
2. 재조합 사람 혈청 알부민으로부터 유리 폴리사카라이드를 제거하고 이 알부민을 열처리하는 것을 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민을 탈색시키는 방법.
3. 재조합 사람 혈청 알부민을 양이온 교환제로 처리하고 이 알부민을 열처리하는 것을 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민을 탈색시키는 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 열처리를 환원제의 존재 하에서 수행하는 재조합 사람 혈청 알부민의 탈색방법.
5. 제1항에 있어서, 환원제가 SH 그룹을 함유하는 저분자량 화합물, 아황산, 차 아황산, 피로아황산, 아인산-아황산, 아인산-피로아황산, 아황산-피로인산, 아스코르브산 또는 이들의 염인 방법.
6. 제1항에 있어서, 환원제로 처리 동안의 재조합 사람 혈청 알부민 농도가 0.01 내지 25w/v%인 방법.
7. 제1항에 있어서, 환원제로 처리 동안의 재조합 사람 혈청 알부민 농도가 0.1 내지 5w/v%인 방법.
8. 제1항에 있어서, 환원제 처리를 10 내지 100℃ 온도에서 10분 내지 240시간 동안 수행하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 환원제 처리를 20 내지 80℃ 온도에서 30분 내지 120시간 동안 수행하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 사람 혈청 알부민의 착색을 억제하는 것으로 공지된 아민 화합물이 환원제 처리 동안 존재하는 방법.
11. 제2항에 있어서, HSA 농도가 250mg/ml인 경우에 열처리될 재조합 사람 혈청 알부민의 유리 폴리사카라이드 농도가 5mg/ml 이하인 방법.
12. 제3항에 있어서, HSA 농도가 250mg/ml인 경우에 열처리될 재조합 사람 혈청 알부민의 유리 폴리사카라이드 농도가 5mg/ml 이하인 방법.
13. 제4항에 있어서, HSA 농도가 250mg/ml인 경우에 열처리될 재조합 사람 혈청 알부민의 유리 폴리사카라이드 농도가 5mg/ml 이하인 방법.
14. 제2항에 있어서, 열처리를 안정화제 존재하에 수행하는 방법.
15. 제3항에 있어서, 열처리를 안정화제 존재하에 수행하는 방법.
16. 제4항에 있어서, 열처리를 안정화제 존재하에 수행하는 방법.
17. 제2항에 있어서, 사람 혈청 알부민의 착색을 억제하는 것으로 공지된 아민 화합물이 열 처리 동안 존재하는 방법.
18. 제3항에 있어서, 사람 혈청 알부민의 착색을 억제하는 것으로 공지된 아민 화합물이 열 처리 동안 존재하는 방법.
19. 제4항에 있어서, 사람 혈청 알부민의 착색을 억제하는 것으로 공지된 아민 화합물이 열 처리하는 동안 존재하는 방법.