인체 혈청알부민 다량체의 단량체화 방법{METHOD FOR CONVERTING MULTIMERS OF HUMAN SERUM ALBUMIN INTO MONOMERS THEREOF}
본 발명은 인체 혈청알부민의 다량체를 단량체로 전환하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인체혈장을 원료로 한 인체 혈청알부민의 제조공정 중 또는 유전자 조작 기술을 이용한 인체 혈청알부민의 제조공정 중에 발생하는 인체 혈청알부민 다량체를 알칼리성 용액처리 (이하, 알칼리처리라고 하기도 함)하므로써 단량체로 전환하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 알칼리성 용액처리에 의해 형성된 인체 혈청알부민의 분자내 또는 분자간의 이황화물(disulfide) 결합의 미스홀딩을 SH기 함유 화합물을 첨가하므로써 억제하는 방법에 관한 것이다.
인체 혈청알부민 (이하, HSA라 하기도 함)는 혈장 중의 주요한 단백질 성분으로, 585개의 아미노산의 단사슬 폴리펩티드로 구성, 약 66,000 달톤의 분자량을 갖는다 (Minghetti, P.P. et al. (1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J. Biol. Chem. 261, 6747-6757). HSA는 주로 혈액의 정상적인 침투압의 유지 및 혈중 칼슘이온, 지방산, 빌리루빈 (bilirubin), 트리토판, 약물 등과 결합하여, 이들을 운반하는 캐리어로서의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 순화한 HSA는 예를 들어 외과수술, 출혈성 쇼크 또는 화상 및 신 증후군 (nephrotic syndromes) 등 알부민의 상실에 의한 저알부민 혈증의 치료에 사용된다.
종래, HSA는 인체 혈장으로부터 콘 (Cone)의 저온 (低溫) 에탄올분획법 또는 그 방법에 준하는 방법으로, HSA함유 분획물 (HAS는 분획물 V에서 분획된다)을 얻은 후, 각종 정제방법을 통해 제조된다. 또한 최근, 원료를 인체혈장에 의존하지 않는 방법으로 유전자 조작기술을 응용하여 효모 및 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtilis)을 이용하여 인체 혈장알부민을 제조하는 방법이 개발되었다.
효모에 대해서는 (1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry 11, 273-287(1989), (2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken. Okabayashi et. al. J. Biochemistry, 110, 103-110(1991), (3) Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1072(1991), 대장균에 대해서는 (4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin; Lawn, R. M., European Patent Appl. 73, 646 (1983), (5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al. Biotechnique 5, 1309-1314(1897), 고초균에 대해서는 (6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et al., J. Bacteriol. 169, 2917-2925(1987) 참조
인체 혈청알부민의 정제방법으로는, 일반적으로 단백질화학에서 통상 사용되는 정제방법, 예를 들어, 염석법 (salting out method), 한외여과법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환크로마토그래피법, 겔여과크로마토그래피법, 아피니티(affinity)크로마토그래피법 등을 사용할 수 있다. 실제로는 생체조직, 세포, 혈액 등으로부터 유래하는 많은 종류의 오염물질이 혼재하여 있기 때문에 인체 혈청알부민의 정제는 상기방법을 조합하여 사용한다.
인체 혈청알부민의 공업적 생산에서는, 인체의 체내 환경과 모든 다른 조건에서 처리할 필요가 있으며, 그 때문에 인체 혈청알부민의 다량체가 생성된다. 인체 혈청알부민의 임상응용에서 이들 다량체가 인체에 악영향을 미친다는 보고는 아직 없지만, 이들 다량체에 의한 새로운 항원성의 발현 등의 우려가 있다. 이러한 의약품으로서의 안전성의 관점에서 [인체 혈청알부민]의 의약품으로서의 규격시험에서 다량체의 혼입한도가 규정되어 있으며, 제제중의 다량체 함량을 충분히 저하시키는 것은 제조상의 매우 중요한 과제이다.
제조공정중에 발생한 다량체를 제거하기 위한 방법으로는 몇가지 보고된 것이 있으며, 예를 들어, 혈장을 에탄올 분획한 분획물 V로 부터 각종 크로마토그래피 (SepHadex G-25, DEAE- 및 CE-SepHarose CL-6B, SepHacryl S-200 등)를 조합하 므로써, 순도 99%, 응집체 (다량체와 동의어) 1% 이하의 HSA를 얻는 방법 (JOURNAL OF APPLIED BIOCHEMISTRY 5, 282-292, 1983), 또는 분획물 V에 안정제를 가하여 가열처리 (50 ∼ 70 ℃, 1 ∼ 10 시간)한 후, 황산암모늄 (ammonium sulfate) 침전법, 폴리에틸렌글리콜 증류법, 또는 등전점침전법에 의해 오염물질과 HSA 응집체를 제거하는 방법 (일본 특허출원 소 63-265025) (일본 특개평 2-111728) 등이 보고되어 있다.
그러나, 이들 방법들은 HSA의 제조공정에서 발생하는 HSA의 다량체를 함유하는 용액으로부터 다량체를 제거하는 방법으로 구성된, 다량체를 함유하지 않는 HSA의 제조방법이다. 따라서, 상기 방법에 의하면, 단량체로 변환할 수 있는 다량체를 제거, 폐기할 뿐 아니라, 제거작업에 수반되는 단량체의 수량의 손실도 불가피하다. HSA 제제는 환자에 대해 매우 대량으로 투여되는 성질의 제제이며, 다른 단백질 제제와 비교하여 방대한 생산량이 필요하기 때문에 공업적으로는 다량체 함량을 충분히 저감시킨 HSA를 보다 고수율로 생산할 수 있는 제조방법이 요구된다.
따라서 본 발명의 제 1 목적은, 인체 혈청알부민의 제조공정에 있어서, 종래의 방법으로는 제거·폐기되었던 인체 혈청알부민의 다량체를 효율적으로 단량체화하는 인체 혈청알부민의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 제 2 목적은, 인체 혈청알부민의 제조공정중 알칼리성 용액처리( 크로마토그래피 등을 포함) 공정에서 형성된 인체 혈청알부민의 분자내 미스홀딩 또는 HSA 자체 혹은 HSA와 다른 오염물질과의 분자간 미스홀딩을 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 제 3 목적은, 의약품으로서 안전성이 높은 인체 혈청알부민을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기 목적 달성을 위해 연구를 거듭한 결과, 다량체를 함유하는 HSA 또는 rHSA의 수용액을 알칼리성 조건하에서 적당한 시간동안 방치하므로써 다량체가 단량체로 변환되는 사실을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 상기 알칼리성 수용액 처리에서 처리액 중에 시스테인과 같은 SH기를 함유하는 화합물을 첨가하면 HSA의 분자내 및/또는 분자간 미스홀딩이 억제되는 사실을 발견하고, 이들 발견에 근거하여 본 발명을 완성하게되었다.
본 발명의 제 1 목적은, 인체 혈청알부민의 다량체를 알칼리성 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 인체 혈청알부민 다량체의 단량체화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2 목적은, 인체 혈청알부민의 다량체를 SH기 함유 화합물의 존재하에서, 알칼리성 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 인체 혈청알부민 다량체의 단량체화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3 목적은, 인체 혈청알부민의 다량체를 알칼리성 용액으로 처리하여 단량체화할 때, 인체 혈청알부민의 미스홀딩을 억제하는 방법으로, 인체 혈청알부민 용액을 SH기 함유 화합물 존재하에서 알칼리성 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 4 목적은, 제 1의 단량체화 방법에 의해 얻어진, 다량체 함량을 충분히 저감시킨 HSA를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 5 목적은, 제 2 또는 제 3의 방법에 의해 얻어진 복합체를 함유하지 않는 HSA를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1 방법은, 인체 혈청알부민의 다량체를 함유하는 수용액에 알칼리성 물질을 첨가, 혼합하여 pH를 알칼리성으로 조정한 다음, 잠시 방치하여, 다량체를 단량체화하는 공정을 특징으로 한다. 이 방법을 적절한 제조공정에서 1회 또는 복수회 실시하므로써, 다량체 함유량이 충분히 저하한 고순도의 인체 혈청알부민이 효율적으로 제조된다.
본 발명의 제 2 방법은, 인체 혈청알부민의 제조공정 중에서 인체 혈청알부민 다량체를 단량체화할 때 사용되는 알칼리성 용액에 SH기 함유 화합물을 존재하게 하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로, 단백질 용액을 알칼리성으로 하면, 단백질 분자내 시스테인 잔기의 SH기는 단백질 분자내 또는 단백질 분자간 디설파이드 (disulfide) 결합을 형성하는 (디설파이드 결합교환 반응 포함) 경우가 있다. 이 때, 디설파이드 결합이 잘못 발생하여, 본래의 단백질과는 다른 입체구조를 갖는 단백질을 생기게 하는 경우가 있다. 이 디설파이드 결합의 잘못된 결합은 분자내 및 분자간에서 일어날 수 있다. 따라서 각종 오염물질이 혼재하면, 오염물질과의 디설파이드 결합이 형성되어, 신규 물질을 생성하는 경우가 있다. 이러한 잘못된 디설파이 드 결합의 형성을 미스홀딩이라 한다. 일단, 미스홀딩에 의해 신규물질이 형성되면, 이것을 제거하는 것은 어렵고 힘들다. 이러한 신규물질은 새로운 항원성의 발현 및 다른 원인으로 인해, 투여받은 환자가 알러지 등의 부작용을 일으킬 가능성이 있다. 본 발명의 제 2 방법에 따르면, 알칼리성으로 하므로써 일어날 수 있는 인체 혈청알부민의 분자내 또는 분자간 미스홀딩을 효과적으로 억제하고, 보다 순도가 높은 인체 혈청알부민의 제조가 가능하게 된다.
본 발명에 사용되는 인체 혈청알부민 다량체의 유래에 대해서는 특별한 제한은 없으며, 혈장유래 HSA 또는 유전자 조작 기술에 의해 생산된 HSA (이하, 이를 rHSA라 하기도 함)로부터 발생한 것을 알칼리 처리에 제공할 수 있다. 이하, HSA 및 rHSA의 다량체를 단순히 다량체로 칭하기도 한다.
혈장으로부터 HSA 제조시, 각 제조공정에서 다량체가 발생하는 것이 예측되나, 어떤 공정에서 발생한 다량체 함유 수용액이라도 사용가능하다. 예를 들면, 저온알콜 분획의 분획물 V의 수용액, 분획물 V를 정제공정 (크로마토그래피, 열처리 등) 처리할 때 생긴 각 정제단계에서의 다량체 함유 수용액 등이 있다.
rHSA 제조시 발생한 각 제조공정의 다량체 함유 수용액도 마찬가지로 사용가능하다. 예를 들면, rHSA 생산숙주의 배양물, 그 배양물을 정제공정 (크로마토그래피, 열처리등) 처리할 때 발생한 각 정제단계에서의 다량체 함유 수용액들이 있다. 여기서 배양물이란, 상기 숙주를 배양한 배양액 및 숙주를 통상 사용되는 방법으로 파쇄한 숙주 파쇄액을 포함한 것이다.
rHSA의 생산에서 사용되는 숙주로서는, rHSA을 생산할 수 있는 숙주일 경우 특별한 제한없이 가능하며, 예를 들면, 효모, 세균, 동물세포, 식물세포 등이 있으며, 효모가 바람직하다.
제조공정에서 HSA 또는 rHSA중에 함유된 다량체를 알칼리성 용액처리할 때의 HSA 또는 rHSA의 농도는, HSA 또는 rHSA가 용해하는 농도일 경우, 특별한 제한없이 가능하며, 바람직하게는 100 ㎎/㎖ 이하의 농도가 좋다.
HSA는 rHSA의 다량체를 단량체화할 때의 알칼리성 용액의 pH는, 바람직하게는 8 ∼ 11, 더욱 바람직하게는 pH 8.5 ∼ 9.5, 가장 바람직하게는 9.0이다.
알칼리 처리액의 pH를 알칼리성으로 할 때 사용되는 화학물질은, 특별히 한정하지는 않으며, 예를 들면, 알칼리성 유기화합물, 알칼리성 무기화합물, 구체적으로는 암모니아, 암모늄염, 염기성 금속 수산화물 (예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 붕산염, 인산염, 아세트산염, 수산염, 구연산염, 트리스 하이드록시 아미노메탄(tris-hydroxyaminomethane) 및 이들의 2종 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 사용할 수 있다.
이러한 화학물질은 다량체를 함유하는 수용액의 농도에 따라 다르나, HSA 또는 rHSA을 변성시키지 않는 농도범위에서 사용된다.
인체 혈청알부민의 다량체의 단량체화는, 다량체를 함유하는 수용액을 알칼리성으로 한 후, 소정의 시간, 바람직하게는 15분 이상, 더욱 바람직하게는 3시간 이상 방치하므로써 이루어진다. 방치시간의 상한치에 대해서는 특별히 한정하지 않는다.
알칼리 처리할 때 온도는, HSA 및 rHSA을 변성시키지 않는 온도이하라면 가 능하고, 예를 들면, 0 ∼ 65 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 40 ℃, 더욱 바람직하게는 실온 (약 25 ℃)이 좋다.
알칼리성 용액처리시 HSA 또는 rHSA 용액중에 존재되는 SH기 함유 화합물로서는, 관능기 SH기를 함유하는 화합물이면 특별히 한정없이 사용가능하며, SH기를 갖는 저분자 화합물이 바람직하다. 구체적으로는 시스테인, 시스테아민, 시스타민, 메티오닌 등이 있으며, 그 중 시스테인이 바람직하다. SH기 함유 화합물은, 1 ∼ 100 ㎎/㎖의 HSA 또는 rHSA 농도에 대하여 0.1 ∼ 50 mM이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.2 ∼ 15 mM, 가장 바람직하게는 0.5 ∼ 5 mM의 최종농도가 되도록 첨가한다.
유전자 조작기술을 응용한 제조에서는, rHSA를 분비하는 숙주의 배양액 또는 rHSA 생산 숙주를 파쇄한 직후의 파쇄물을 저속원심분리한 후, 양이온교환, 음이온교환, 겔여과, 염석, 킬레이트크로마토그래피, 소수성 (疏水性) 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피 등의 각종 정제방법 또는 이들을 조합한 방법에 의해 고순도로 정제한다.
또한 혈장유래 HSA는 예를 들어, 인체 유래 혈장을 저온에탄올 분획하고, 약 90%의 HSA를 함유하는 분획물 V를 얻은 후, 상기 정제방법을 구사하여 정제한다. 저온에탄올 분획전에 프로테아제에 의한 분해를 막기 위해 가열처리하는 경우도 있다.
본 발명의 제 1 방법은, 상기 HSA 또는 rHSA의 제조공정중 어떠한 공정에서 사용해도 좋다. 바람직하게는 pH가 5 이하의 조건에서 인체 혈청알부민 용액 을 처리하는 공정, 예를 들어, 양이온교환크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피 후에 발생한 다량체를 단량체화하는 것이 효과적이다.
본 발명의 제 2 방법은, 상기 HSA 또는 rHSA의 제조공정중 어떠한 공정에서 사용해도 좋다. 바람직하게는 pH가 5 이하인 조건하에서 인체 혈청알부민 용액을 처리하는 공정, 예를 들면, 양이온교환크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피 후에 발생한 다량체를 알칼리성 용액으로 처리하여 단량체화할 때 사용하는 것이 효과적이다.
도 1은 제조예 1에서 제조된 인체 혈청알부민 용액의 알칼리성 용액 처리전후의 시료를 SDS-PAGE 후, 웨스턴 블럿 (Western Blot) 시킨 결과를 나타낸 사진이다. ①은 알칼리성 용액 처리전, ②는 알칼리성 용액 처리후의 시료를 나타낸다
제조예 1 : 다량체를 함유하는 인체 혈청알부민 용액의 제조
일본 특표평 11-509525에 기술된 방법에 따라, 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 의해 rHSA를 생산하였다. 이 rHSA를 함유하는 배양액을 정제수로 약 2배 용량이 되도록 희석한 후, 아세트산 수용액을 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 50mM 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)로 평형화한 스트림라인 (streamline) SP컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech사 제조) (직경 60㎝×16㎝)에 전개시키고, 칼럼의 평형화에 이용한 완충액과 같은 완충액으로 세정하고, 300mM 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산완충용액 (pH 9.0)을 흘려보내 rHSA함유 분획물을 얻었다.
실시예 1 : 붕산염을 이용한 rHSA 다량체의 단량체화
제조예 1에서 제조한, 14.90% 다량체를 함유하는 rHSA의 10% 수용액 (10㎖)에 5% (W/V) 사붕산이칼륨액 (15 ㎖)를 첨가하고, 최종농도 3% (pH 약 9.0)으로 조정하였다. 실온에서 3시간 방치한 다음, 적당하게 샘플링하고, 그것을 미리 0.1M KH2PO4/0.3M NaCl 완충액으로 평형화한 TSKgel 300SW (Tosoh사 제조) 겔여과 칼럼의 고속액체 크로마토그래피에 제공하였다. 그 결과에 근거하여 해당 용액중의 알부민 다량체의 함량을 산출하였다. 3시간의 알칼리 처리로, 다량체의 단량체로의 변환이 진행하여, 양호한 rHSA 다량체의 단량체화 효과가 확인되었다 (표 1)
|
0hr |
1hr |
2hr |
3hr |
단량체(%) |
85.10 |
96.00 |
96.50 |
97.00 |
다량체(%) |
14.90 |
4.00 |
3.50 |
3.00 |
실시예 2 : 0.5M 수산화나트륨을 이용한 rHSA 다량체의 단량체화
제조예 1에서 제조한, 26.10% 다량체를 함유하는 rHSA 10% 수용액 (50㎖)에 0.5M 수산화나트륨 수용액 (2.8 ㎖)를 첨가하고, pH를 약 9로 조정하였다. 그 후, 실온에서 5시간 방치하고, 적당하게 샘플링한 다음, 그것을 미리 0.1M KH2PO4/0.3M NaCl 완충액으로 평형화한 TSKgel G300SW (Tosoh사 제조) 겔여과 칼럼의 고속액체 크로마토그래피에 제공하였다. 그 결과에 근거하여 해당 용액중의 알부민 다량체의 함량을 산출하였다. 5 시간의 알칼리 처리로, 다량체의 단량체로의 변환이 진행하여, 양호한 rHSA 다량체의 단량체화 효과가 확인되었다 (표 2)
|
0hr |
0.25hr |
1hr |
2hr |
3hr |
4hr |
5hr |
단량체(%) |
73.90 |
84.70 |
85.00 |
86.50 |
86.60 |
86.80 |
87.00 |
다량체(%) |
26.10 |
15.30 |
15.00 |
13.50 |
13.40 |
13.20 |
13.00 |
실시예 3
제조예 1에서 제조한 rHSA 함유 분획물 50 ㎖에 최종농도 0 ∼ 15 mM이 되도록 시스테인을 첨가하고, 0.5 N 수산화나트륨액 (2.8 ㎖)을 첨가하여 pH를 약 9.0 으로 조정하고 실온에서 5시간 방치하였다. 용액에 아세트산 수용액을 가하여, pH 7.0 으로 조정하고, 알칼리성 용액으로 처리를 종료하였다. 정법에 따라, 용액의 SDS-PAGE (10-20% 그라디언트겔)에 이어, 웨스턴블롯을 수행하였다. 1차 항체에는, 염소항-인체 혈청알부민, 2차 항체에는, 항-염소IgG-HRP 콘쥬게이트를 사용하여, 화학발광에 의해 발생시켜 필름에 전사후 현상하였다. 도 1은 시스테인 비첨가시 알칼리성 용액으로 처리전후의 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸다. 알칼리성 용액으로 처리후의 시료 ②에서는 분자량 약 68,000에 분자내 미스홀딩에 의한 rHSA의 결합(band)가 보인다. 각종 농도의 시스테인을 첨가하고, 알칼리성 처리하여 얻어진 시료에 대하여 해당 결합을 쿠마시 (Coomassie)로 염색하고, 해석 소프트 (Collage Ver. 3)를 이용하여 각 결합의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈으며, 각 수치는 시스테인 비첨가시의 결합의 농도를 100%로 한 상대치이다.
시스테인 농도 (mM) |
형성된 복합체의 비율 (결합농도비) |
0 |
100 |
0.2 |
15 |
1 |
4 |
5 |
4 |
15 |
0 |
알칼리성 처리시 시스테인을 존재시키므로써, 인체 혈청알부민의 분자내 미스홀딩이 효과적으로 억제되었다는 사실을 알 수 있다.
본 발명의 제 1 방법에 의하면, 인체 혈청알부민의 제조공정에 있어서, 종래의 기술로는 제거·폐기되었던 인체 혈청알부민 다량체를 매우 간단하고 저고스트한 방법인 알칼리성 용액 처리법을 실시하므로써, 효과적으로 단량체로 변환시킬 수 있다. 그 결과, 제제 중의 다량체 함량은 종래 기술과 동등이상으로 저감시킬수 있으며, 안전성이 높은 일체 혈청알부민 제제의 공급이 가능하다. 또한 본 발명의 제 1 방법에 의하면, 알칼리 처리하는 것만으로 인체 혈청알부민의 다량체를 단량체로 변환하여 회수할 수 있기 때문에 종래의 방법과 같이 다량체를 배제하므로써 발생하는 인체 혈청알부민의 손실이 적어, 고수율로 인체 혈청알부민의 단량체를 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 인체 혈청알부민의 제조 에서 대폭으로 코스트 저감이 가능하다.
본 발명의 제 2 방법에 의하면, 혈장중의 HSA 또는 유전자 조작 기술을 응용하여 얻은 rHSA의 제조공정중의 산화분위기에서, 특이적으로 발생하는 인체 혈청알부민의 분자내 또는 분자간 미스홀딩을 효과적으로 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 인체에 투여된 경우 알러지 등의 부작용의 원인이 될 수 있는 미스홀딩에 따라 발생한 신규 물질이 저감된 고순도의 인체 혈청알부민을 얻을 수 있다.