ES2261487T3 - Metodo de monomerizacion de polimeros de albumina de suero humano. - Google Patents
Metodo de monomerizacion de polimeros de albumina de suero humano.Info
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Abstract
Un método para convertir un multímero de albúmina de suero de ser humano en sus monómeros, en el que el multímero se trata con una disolución alcalina de pH 8 a 9, 5.
Description
Método de monomerización de polímeros de
albúmina de suero humano.
La presente invención se refiere a un método
para convertir un multímero de albúmina de suero de ser humano en
sus monómeros. Más específicamente, la presente invención está
relacionada con un método para convertir, en monómeros, un
multímero de albúmina de suero de ser humano, el cual se genera
durante la producción de albúmina de suero de ser humano a partir
del plasma de ser humano como materia prima de la misma o durante
la producción de albúmina de suero de ser humano según la técnica de
recombinación de genes, método que comprende la etapa de tratar el
multímero con una disolución alcalina (en virtud de esto también
denominado como "tratamiento alcalino").
La presente invención también se refiere a un
método para impedir el plegamiento incorrecto de la albúmina de
suero de ser humano formada por medio del tratamiento precedente con
una disolución alcalina, el cual se provoca debido a la formación de
puentes disulfuro inter o intramoleculares incorrectos, método que
comprende la etapa de adicción de un compuesto que contiene un
grupo SH.
La albúmina de suero de ser humano (de aquí en
adelante también denominada "HSA") es un componente proteico
principal presente en el plasma que consiste en un polipéptido de
una única cadena que comprende 585 residuos aminoácidos y tiene un
peso molecular igual a aproximadamente 66.000 Dalton (véase
Minghetti, P.P. et al. (1986), Molecular structure of the
human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within
11-22 of chromosome 4. J. Biol. Chem. 261, pp.
6747-6757). Se sabe que el papel principal de la HSA
no es sólo mantener la presión osmótica normal de la sangre, sino
también enlazarse con una variedad de sustancias tales como los
iones calcio, ácidos grasos, bilirrubina, triptófano y fármacos
posiblemente presentes en la sangre, jugando de este modo un papel
de vehículo para transportar estas sustancias. Por ejemplo, la HSA
purificada se ha usado en el tratamiento postoperatorio después de
operaciones quirúrgicas y en el tratamiento de la hipoalbuminemia
provocada debido a la pérdida de albúmina tal como en el choque
hemorrágico, quemaduras y síndromes nefróticos.
Convencionalmente, la HSA se ha preparado
sometiendo el plasma de ser humano al método de fraccionamiento con
etanol a baja temperatura de Cone o a cualquier otro método similar
al mismo, para dar fracciones que contienen HSA (la HSA se
fracciona en la fracción V) y a continuación purificando la fracción
por medio del uso de una variedad de técnicas de purificación. Por
otra parte, recientemente se ha desarrollado un método en el que no
se usa plasma de ser humano como materia prima, por ejemplo una
técnica para producir albúmina de suero de ser humano usando
células de levaduras, Escherichia coli o Bacillus
subtilis, aunque haciendo uso de la técnica de recombinación de
genes.
Estas técnicas de recombinación de genes se
detallan en: (1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from
Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et al.
Biotechnology and Applied Biochemistry, 1989, 11:
273-287, (2) Secretory Expression of the Human
Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae,
Ken Okabayashi et al. J. Biochemistry, 1991, 110:
103-110, (3) Yeast Systems for the Commercial
Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz y Martin
A.G. Gleeson, Bio/Technology, 1991, 9: 1067-1072
para la levadura, (4) Construction of DNA sequences and their use
for microbial production of proteins, in particular, human serum
albumin; Lawn, R.M. Publicación de Patente Europea nº 0073646A
(1983), (5) Synthesis and Purification of mature human serum
albumin from E. coli; Latta, L. et al. Biotechnique,
1987, 5: 1309-1314 para Escherichia coli
(E. coli), (6) Secretion of human serum albumin from
Bacillus subtilis; Saunders, C.W. et al. J. Bacteriol.
1987, 169:2917-2925, para el Bacillus
subtilis.
Los métodos para purificar la albúmina de suero
de ser humano utilizables en la presente memoria incluyen los
actualmente usados en la química de proteínas tales como el método
de precipitación por efecto salino, el método de ultrafiltración,
el método de precipitación isoeléctrica, el método de
electroforesis, la técnica de cromatografía de intercambio de
iones, la técnica de cromatografía por filtración a través de un gel
y/o la técnica de cromatografía de afinidad. Realmente, la fracción
que contiene albúmina de suero de ser humano incluye varias clases
de contaminantes originados de, por ejemplo, tejidos biológicos,
células y sangre y, por lo tanto, la albúmina de suero de ser
humano se ha purificado mediante una complicada combinación de los
métodos precedentes.
En la producción industrial de albúmina de suero
de ser humano es inevitable tratar la misma en varias condiciones
diferentes en las condiciones medioambientales observadas en el
cuerpo humano y, por consiguiente, que se formen multímeros de
albúmina de suero de ser humano. Todavía no se ha conocido ningún
informe tal que estos multímeros afecten adversamente al cuerpo
humano en la aplicación clínica de albúmina de suero de ser humano,
pero existe la sospecha de que estos multímeros puedan desarrollar
una nueva antigenicidad. Por esta razón, en el ensayo de
estandarización de "albúmina de suero de ser humano"como agente
farmacéutico se prescribe un límite superior de la contaminación
con estos multímeros desde el punto de vista de su seguridad como
medicina y, por lo tanto, en la producción de una preparación
farmacéutica que contenga la misma llega ser un problema importante
reducir el contenido de tales multímeros en la preparación.
Se ha informado de varios métodos para separar
los multímeros generados durante el procedimiento de producción de
albúmina de suero de ser humano. Por ejemplo, el Journal of Applied
Biochemistry, 1983, 5: 282-292 describe que se
obtuvo HSA que tenía una pureza de 99% y un contenido de agregados
(sinónimo de "ultímero" de no más que 1% sometiendo la
fracción V, preparada según el método de fraccionamiento del plasma
con etanol, a una combinación de una variedad de técnicas
cromatográficas (tales como Sephadex G-25, DEAE- y
CE-Sepharose CL-6B y Sephacryl
S-200); y la solicitud serial de Ptente Jponesa nº
Sho 63-265025 y la publicación de Ptente Jponesa no
examinada nº Hei 2-111728 describen un método que
comprende las etapas de añadir un agente estabilizante a la
fracción V, tratar térmicamente la mezcla resultante (a una
temperatura que varíe de 50 a 70ºC durante 1 a 10 horas) y a
continuación someter la mezcla a la técnica de precipitación con
sulfato de amonio, la técnica de fraccionamiento con
polietilenglicol o la técnica de precipitación isoeléctrica para,
así, separar cualquier contaminante y multímero de la HSA.
Todos estos métodos se refieren a métodos para
preparar HSA exenta de cualquiera de sus multímeros, pero los
métodos comprenden la etapa de separar tales multímeros de HSA
generados durante el procedimiento de producción de la misma de una
disolución que contenga los multímeros. Por esta razón, los métodos
precedentes sufren inevitablemente de una reducción del rendimiento
de monómeros de HSA ya que separan y desechan los multímeros de HSA
capaces de convertirse en sus monómeros y, asimismo, sufren de una
disminución del rendimiento de monómeros acompañantes mediante los
procedimientos precedentes para separar los multímeros. La
preparación farmacéutica que contiene HSA es una que se administra
a un paciente en gran cantidad y, por consiguiente, debe
suministrarse en una cantidad sustancialmente mayor en comparación
con otras preparaciones farmacéuticas que contienen proteínas.
Consecuentemente, desde un punto de vista industrial se ha deseado
desarrollar un método para preparar HSA con alto rendimiento, cuyo
contenido de multímeros se reduzca hasta una concentración tan baja
como sea posible.
Por consiguiente, un primer objeto de la
presente invención es proporcionar un método para preparar albúmina
de suero de ser humano, que permita la conversión eficiente de los
multímeros de albúmina de suero de ser humano, que se separan y
desechan en los métodos convencionales, en sus monómeros.
Es un segundo objeto de la presente invención
proporcionar un método para impedir cualquier plegamiento
intramolecular incorrecto de una molécula de albúmina de suero de
ser humano o cualquier plegamiento intermolecular incorrecto entre
moléculas de albúmina de suero de ser humano o entre una molécula de
albúmina de suero de ser humano y otros contaminantes, formados
durante un tratamiento con una disolución alcalina (que incluye, por
ejemplo, la cromatografía) en el procedimiento para preparar la
albúmina de suero de ser humano.
Es un tercer objeto de la presente invención
proporcionar un producto de albúmina de suero de ser humano que
tenga seguridad como medicina.
Los inventores de esta invención han llevado a
cabo varios estudios, mientras se tenía en consideración el estatus
presente precedente de la técnica y han encontrado que si se permite
que una disolución acuosa de HSA o rHSA (HSA obtenida por genes
recombinantes) que contiene multímeros repose durante un período de
tiempo apropiado en condiciones alcalinas, los multímeros pueden
convertirse en los monómeros de HSA. Los inventores han encontrado
además que en el tratamiento precedente con una disolución alcalina,
la adición de un compuesto que contiene un grupo SH, tal como
cisteína, al líquido de procesado permitiría la inhibición de la
formación de cualquier plegamiento incorrecto intra y/o
intermolecular de HSA.
La presente invención se ha finalizado sobre la
base de los hallazgos precedentes.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un método par convertir un multímero de
albúmina de suero de ser humano en sus monómeros, en el que el
multímero se trata con una disolución alcalina de pH 8 a 9,5.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un método par convertir un multímero de
albúmina de suero de ser humano en sus monómeros, en el que el
multímero se trata con una disolución alcalina de pH 8 a 9,5 en
presencia de un compuesto que tiene un grupo SH.
Según un tercer aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para impedir el plegamiento
incorrecto de albúmina de suero de ser humano durante un
procedimiento para convertir un multímero de albúmina de suero de
ser humano en sus monómeros tratando el multímero con una disolución
alcalina de pH 8 a 9,5, en el que la disolución que contiene la
albúmina de suero de ser humano se trata con una disolución alcalina
en presencia de un compuesto que contiene un grupo SH.
Según un cuarto aspecto de la presente
invención, se proporciona un producto de HSA cuyo contenido de
multímeros se reduce hasta una concentración tan baja como sea
posible y el cual se prepara por método para convertir el multímero
de HSA en sus monómeros según el primer aspecto de la presente
invención.
Según un quinto aspecto de la presente
invención, se proporciona un producto de HSA exento de cualquiera de
tales complejos y el cual se prepara por un método según el segundo
o tercer aspecto de la presente invención.
La Fig. 1 es una fotografía que muestra los
resultados obtenidos sometiendo al ensayo SDS-PAGE
muestras de una disolución que contiene albúmina de suero de ser
humano, preparada en el Ejemplo de Preparación 1, antes y después
del tratamiento con una disolución alcalina y, a continuación,
analizando las muestras según la técnica de inmunotransferencia de
Western ("Western blot"). En esta fotografía, el resultado
\ding{192} corresponde a la muestra antes del tratamiento con una
disolución alcalina y el resultado \ding{193} corresponde a la
muestra después del tratamiento.
El método según el primer aspecto de la presente
invención se caracteriza porque comprende las etapas de, por
ejemplo, añadir con agitación una sustancia alcalina a una
disolución acuosa que contenga multímeros de albúmina de suero de
ser humano para sí alcalinizar la disolución acuosa, y a
continuación permitir que la disolución acuosa alcalina que
contiene los multímeros repose durante un cierto período de tiempo y
así convertir los multímeros en los monómeros de la albúmina de
suero de ser humano. Este método puede ponerse apropiadamente en
práctica una o varias veces para producir así eficientemente
albúmina de suero de ser humano de alta pureza cuyo contenido de
multímeros se reduzca hasta una concentración tan baja como sea
posible.
El método según el segundo aspecto de la
presente invención se caracteriza porque comprende las etapas de
hacer que, en el procedimiento para preparar la albúmina de suero de
ser humano, coexista un compuesto que contenga un grupo SH en la
disolución alcalina usada para convertir el multímero de albúmina de
suero de ser humano en sus monómeros.
En general, si se alcaliniza una disolución de
proteínas los grupos SH presentes en una molécula de proteína
pueden formar algunas veces un puente disulfuro inter o
intramolecular (incluyendo reacciones de intercambio de puentes
disulfuro). En esta etapa, con frecuencia se forman puentes
disulfuro incorrectos y esto puede resultar en la formación de una
proteína que tenga una estructura tridimensional diferente de la de
la proteína original. La formación de este puente disulfuro
incorrecto puede ocurrir inter o intramolecularmente. Por lo tanto,
si coexisten una variedad de contaminantes, tales puentes disulfuro
pueden formarse entre la molécula de proteína y los contaminantes
para así formar nuevas sustancias. La formación de tal puente
disulfuro incorrecto se denomina "plegamiento incorrecto". Si
se forma una nueva sustancia debido a este plegamiento incorrecto
es bastante difícil y problemático separarla. La nueva sustancia
puede provocar efectos secundarios desfavorables en un paciente que
reciba la administración de la sustancia, tales como reacciones
alérgicas debido a la expresión de una nueva inmunogenicidad y a
otras causas. Sin embargo, el segundo método de la presente
invención permitiría la inhibición efectiva de la ocurrencia de
cualquier plegamiento intra o intermolecular incorrecto de albúmina
de suero de ser humano, el cual puede ser provocado cuando se
alcaliniza una disolución que contenga albúmina de suero de ser
humano, y a su vez permite la producción de albúmina de suero de ser
humano que tiene una mayor pureza.
Las fuentes de multímeros de albúmina de suero
de ser humano utilizables en la presente invención no están
limitadas a unas específicas y, por ejemplo, pueden ser las
producidas a partir de la HSA derivada del plasma o de la HSA
producida mediante la técnica de recombinación de genes (en virtud
de esto también denominada como "rHSA"), las cuales pueden
someterse al tratamiento alcalino de la presente invención. De aquí
en adelante, a los multímeros de HSA y rHSA simplemente se les
denominará "multímeros".
Cuando se prepara HSA a partir de plasma sería
predecible que el multímero podría formarse en cada etapa, pero en
la invención pueden usarse disoluciones acuosas que contienen
multímeros obtenidas en cada una de tales etapas. Ejemplos de tales
disoluciones acuosas son una disolución acuosa de la fracción V
obtenida por medio del fraccionamiento en un alcohol a baja
temperatura y las disoluciones acuosas que contienen multímeros
generadas en las diversas etapas de purificación subsiguientes
(tales como la cromatografía y el tratamiento térmico) de la
fracción V.
fracción V.
En la presente invención pueden asimismo usarse
las disoluciones acuosas que contienen multímeros generadas en las
diversas etapas para preparar rHSA. Ejemplos específicos de las
mismas son un caldo de cultivo de células huésped que producen rHSA
y las disoluciones acuosas que contienen multímeros generadas en las
diversas etapas de purificación subsiguientes (tales como la
cromatografía y el tratamiento térmico) del caldo de cultivo. A este
respecto, la expresión "caldo de cultivo" usada en la presente
memoria incluye el caldo de cultivo en el que se cultivan las
células huésped precedentes, y líquidos que contienen células
huésped trituradas en los que las células huésped se trituran
mediante cualquier método actualmente usado.
Las células huésped usadas para la producción de
rHSA no están restringidas a unas específicas en tanto y cuanto
puedan producir rHSA y ejemplos de las mismas incluyen células de
levaduras, células bacterianas, células animales y células de
plantas, siendo las células de levaduras las preferiblemente usadas
en la presente memoria.
Cuando los multímeros presentes en una
disolución que contenga HSA o rHSA se tratan con una disolución
alcalina en el procedimiento para la producción de albúmina de
suero de ser humano, la concentración de HSA o rHSA no está
limitada a ninguna específica en tanto y cuanto esté en estado
disuelto, pero su concentración no es preferiblemente mayor que 100
mg/mL.
El valor del pH de la disolución alcalina usada
para convertir los multímeros de HSA o rHSA en sus monómeros varía
de 8 a 9,5, más preferiblemente 8,5 a 9,5 y mucho más
preferiblemente 9,0.
Las sustancias químicas usadas para la
alcalinización del valor del pH del líquido usado para el
tratamiento alcalino no están restringidas a unas específicas.
Ejemplos de las mismas incluyen uno o al menos dos miembros
seleccionados del grupo consistente en compuestos orgánicos
alcalinos y compuestos inorgánicos alcalinos. Ejemplos específicos
de los mismos son amoníaco, sales de amonio, hidróxidos metálicos
básicos (tales como hidróxido de sodio e hidróxido de potasio),
boratos, fosfatos, acetatos, oxalatos, citratos,
tris-hidroxiaminometano y mezclas de al menos dos
de estas sustancias.
Tales sustancias químicas se usan en una
concentración que nunca provoque ninguna modificación de HSA o rHSA
y que puede variar dependiendo de la concentración de la disolución
acuosa que contiene multímeros.
Los multímeros de albúmina de suero de ser
humano se convierten en sus monómeros por alcalinización de la
disolución acuosa que contiene multímeros y permitiendo a
continuación que la disolución repose durante un período de tiempo
predeterminado, preferiblemente no menos que 15 minutos y más
preferiblemente no menos que 3 horas. En este método, el tiempo
requerido para permitir que la disolución repose no tiene ningún
límite superior particular.
La temperatura de este tratamiento alcalino no
está asimismo restringida a ninguna específica en tanto y cuanto
nunca provoque ninguna modificación o desnaturalización de la HSA o
rHSA y varía, por ejemplo, de 0 a 65ºC, preferiblemente 10 a 40ºC y
más preferiblemente temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC).
Los compuestos que contienen un grupo SH a
añadir a la disolución de HSA o rHSA tras su tratamiento alcalino
no están restringidos a unos en particular en tanto y cuanto sean
compuestos que cada uno tengan un grupo SH, pero se prefieren los
compuestos de bajo peso molecular que tengan cada uno un grupo SH.
Ejemplos específicos de los mismos incluyen cisteína, cisteamina,
cistamina y metionina, siendo la cisteína preferiblemente usada en
la presente memoria. El compuesto que contiene un grupo SH se añade
a la disolución de HSA o rHSA en una concentración final que
preferiblemente varía de 0,1 a 50 mM, más preferiblemente 0,2 a 15
mM y mucho más preferiblemente 0,5 a 5 mM, con respecto a la
concentración de HSA o rHSA que varía de 1 a 100 mg/mL.
En el caso de la producción de albúmina de suero
de ser humano según la técnica de recombinación de genes, se
centrifuga a una baja velocidad de rotación un caldo de cultivo en
el que se cultivan células huésped que secretan rHSA o un líquido
que contiene células huésped trituradas obtenido inmediatamente
después de triturar las células huésped que producen rHSA, y a
continuación se purifica muy bien la rHSA en el producto
centrifugado mediante una variedad de métodos de purificación tales
como las técnicas de intercambio de cationes, intercambio de
aniones, filtración por gel, precipitación por efecto salino,
cromatografía con resinas quelantes, cromatografía hidrófoba o
cromatografía de adsorción, o cualquiera de sus combinaciones.
Alternativamente, la HSA derivada del plasma se
purifica, por ejemplo, sometiendo el plasma de ser humano a un
fraccionamiento con etanol a baja temperatura, para dar una fracción
V que contiene aproximadamente 90% de HSA, y tratando a
continuación la fracción V mientras se hace uso de los métodos de
purificación precedentes. Algunas veces, con el fin de impedir
cualquier descomposición por la acción de una proteasa, el plasma se
somete a un tratamiento térmico antes del fraccionamiento con etanol
a baja temperatura.
El primer método de la presente invención puede
usarse en cualquier etapa del procedimiento precedente para
preparar HSA o rHSA. Preferiblemente, es efectivo tratar sus
multímeros generados después de la etapa de tratamiento de una
disolución de albúmina de suero de ser humano a un valor de pH no
mayor que 5, por ejemplo, mediante etapas de cromatografía de
intercambio de cationes y/o cromatografía de intercambio de aniones,
para así convertirlos en los monómeros de albúmina de suero de ser
humano.
El segundo método de la presente invención puede
asimismo usarse en cualquier etapa del procedimiento precedente
para preparar HSA o rHSA. Preferiblemente, es efectivo el uso del
segundo método cuando se tratan, con una disolución alcalina, los
multímeros generados después de la etapa de tratamiento de una
disolución de albúmina de suero de ser humano a un valor de pH no
mayor que 5, por ejemplo, mediante etapas de cromatografía de
intercambio de cationes y/o cromatografía de intercambio de
aniones, para así convertirlos en los monómeros de la albúmina de
suero de ser humano.
Ejemplo de Preparación
1
Se produjo rHSA según el método descrito en el
documento TOKUHYO Hei 11-509525 usando células de
levadura (Saccharomyces cerevisiae). Este caldo de cultivo
que contenía rHSA se diluyó con agua purificada hasta un volumen
total de aproximadamente dos veces el del caldo de cultivo original
y a continuación el valor del pH de la disolución diluida se ajustó
a 4,5 usando una disolución acuosa de ácido acético. A continuación,
la disolución se cargó en una columna STREAMLINE SP (disponible en
Amersham Pharmacia Biotech Company, diámetro 60 cm x 16 cm), que
había sido equilibrada con una disolución amortiguadora de pH de
acetato de sodio 50 mM (pH 4,5) que contenía cloruro de sodio 50
mM. Seguidamente, la columna se lavó con una disolución
amortiguadora de pH idéntica a la usada para equilibrar la columna,
seguido por paso a través de la columna de una disolución
amortiguadora de pH de fosfato 50 mM (pH 9,0) que contenía cloruro
de sodio 300 mM para dar fracciones que contenían rHSA.
A 10 mL de una disolución acuosa de rHSA al 10%
que contenía 14,90% de multímeros preparada según los procedimientos
usados en el Ejemplo de Preparación 1 se añadieron 15 mL de una
disolución de tetraborato de dipotasio al 5%(p/v) y la
concentración final del último se ajustó a 3% (pH a aproximadamente
9,0). Subsiguientemente, se permitió que la disolución resultante
reposara a temperatura ambiente durante 3 horas, mientras se
recogían muestras a intervalos apropiados y a continuación se
sometieron a cromatografía de líquidos de alta resolución usando
una columna de filtración por gel TSKgel G3000SW (disponible en
Tosoh Corporation), que había sido equilibrada con una disolución
amortiguadora de pH de KH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,3 M. A
continuación, el contenido de los multímeros de albúmina presentes
en la disolución se calculó sobre la base de los resultados así
obtenidos. La conversión de los multímeros en los monómeros
transcurrió a lo largo del tratamiento alcalino durante 3 horas.
Esto demuestra claramente que este método es bastante efectivo para
la conversión de los multímeros de rHSA en sus monómeros (véase la
Tabla 1 dada más adelante).
| 0 h | 1 h | 2 h | 3 h | |
| Monómeros (%) | 85,10 | 96,00 | 96,50 | 97,00 |
| Multímeros (%) | 14,90 | 4,00 | 3,50 | 3,00 |
A 50 mL de una disolución acuosa de rHSA al 10%
que contenía un 26,10% de multímeros, preparada según los
procedimientos usados en el Ejemplo de Preparación 1 se añadieron
2,8 mL de una disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,5 M y a
continuación el valor de pH de la mezcla se ajustó a aproximadamente
9. Subsiguientemente, se permitió que la disolución resultante
reposara a temperatura ambiente durante 3 horas, mientras se
recogían muestras a intervalos apropiados y a continuación se
sometieron a cromatografía de líquidos de alta resolución usando
una columna de filtración por gel TSKgel G3000SW (disponible en
Tosoh Corporation), que había sido equilibrada con una disolución
amortiguadora de pH de KH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,3 M. A
continuación, el contenido de los multímeros de albúmina presentes
en la disolución se calculó sobre la base de los resultados así
obtenidos. La conversión de los multímeros en monómeros transcurrió
a lo largo del tratamiento alcalino durante 5 horas. Esto demuestra
claramente que este método es bastante efectivo para la conversión
de los multímeros de rHSA en sus monómeros (véase la Tabla 2 dada
más adelante).
| 0 h | 0,25 h | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 5 h | |
| Monómeros (%) | 73,90 | 84,70 | 85,00 | 86,50 | 86,60 | 86,80 | 87,00 |
| Multímeros (%) | 26,10 | 15,30 | 15,00 | 13,50 | 13,40 | 13,20 | 13,00 |
A 50 mL de una fracción que contenía rHSA
preparada según los procedimientos usados en el Ejemplo de
Preparación 1 se añadieron cisteína hasta una concentración final
que variaba de 0 a 15 mM y 2,8 mL de una disolución de hidróxido de
sodio 0,5 N y para regular el pH de la disolución resultante a
aproximadamente 9, seguido por permitir que la disolución
resultante reposara a temperatura ambiente durante 5 horas. A
continuación, se añadió una disolución acuosa de ácido acético a la
disolución para ajustar su valor de pH a 7,0 y para completar el
tratamiento con la disolución alcalina. A continuación, la
disolución se sometió a los ensayos SDS-PAGE (gel
en gradiente 10-20%) y de inmunotransferencia de
Western según los métodos usuales. Seguidamente, como anticuerpo
primario y anticuerpo secundario se usaron, respectivamente,
albúmina de suero de cabra anti-humana y conjugado
IgG-HRP anti-cabra, y los productos
separados por medio de electroforesis se trataron mediante la
técnica de quimioluminiscencia para así emitir luz, transferirla a
una película y a continuación desarrollarla. La Fig. 1 muestra los
resultados obtenidos analizando las muestras de la disolución que
contenía albúmina de suero de ser humano exenta de cisteína añadida
según la técnica de inmunotransferencia de Western antes y después
del tratamiento con una disolución alcalina. En la muestra -, que
había sido tratada con una disolución alcalina, se observó una banda
atribuida a un plegamiento intramolecular incorrecto de rHSA, con un
peso molecular de aproximadamente 68.000. Esta banda observada para
cada muestra obtenida después del tratamiento con una disolución
alcalina en presencia de cisteína a una diversidad de
concentraciones se tiñó con Coomassie y la densidad de cada banda
se determinó usando un paquete informático para análisis (Collage
Ver. 3). Los resultados así obtenidos se sumarizan en la siguiente
Tabla 3. Cada valor numérico representa un valor relativo a la
densidad observada para una muestra exenta de cisteína, la cual se
define que es 100%.
| Concentración de cisteína (mM) | Tasa de multímeros formados (relación de densidades de banda) |
| 0 | 100 |
| 0,2 | 15 |
| 1 | 4 |
| 5 | 4 |
| 15 | 0 |
Los resultados listados en la Tabla 3 muestran
claramente que el plegamiento intramolecular incorrecto de la
albúmina de suero de ser humano se puede controlar efectivamente
llevando a cabo el tratamiento alcalino en coexistencia con
cisteína.
Según el primer método de la presente invención,
el tratamiento alcalino, bastante simple y que ahorra costes,
permitiría la conversión eficiente de multímeros de albúmina de
suero de ser humano, los cuales son separados y descartados en las
técnicas convencionales, en sus monómeros. Como resultado, el
contenido de multímeros en las preparaciones farmacéuticas puede
reducirse hasta una concentración idéntica a o menor que las
conseguidas mediante las técnicas convencionales, y la presente
invención puede así proporcionar una preparación farmacéutica
altamente segura que contenga albúmina de suero de ser humano.
Según el primer método de la presente invención,
los multímeros de albúmina de suero de ser humano pueden
convertirse en sus monómeros y los monómeros pueden recuperarse
simplemente sometiendo a los multímeros a un tratamiento alcalino
y, por lo tanto, el método nunca sufre de ninguna pérdida de
albúmina de suero de ser humano al contrario que en los métodos
convencionales en los que los multímeros son separados. Esto indica
que el método de la invención permite la recuperación de monómeros
de albúmina de suero de ser humano con un alto rendimiento. Por
consiguiente, el método de la presente invención permitiría la
reducción sustancial del coste de producción de albúmina de suero de
ser humano.
El segundo método de la presente invención
permite la inhibición eficiente de cualquier plegamiento intra o
intermolecular incorrecto de albúmina de suero de ser humano, el
cual es específicamente provocado en una atmósfera oxidante durante
el procedimiento para preparar HSA a partir del plasma o el
procedimiento para preparar rHSA según la técnica de recombinación
de genes.
Por otra parte, el método de la presente
invención permite la preparación de albúmina de suero de ser humano
de alta pureza que tiene un contendido reducido de una nueva
sustancia, la cual se forma a través del plegamiento incorrecto de
albúmina de suero de ser humano y cuando se administra a un paciente
llega a ser una causa de efectos secundarios tales como la alergia
observada.
Claims (11)
1. Un método para convertir un multímero
de albúmina de suero de ser humano en sus monómeros, en el que el
multímero se trata con una disolución alcalina de pH 8 a 9,5.
2. Un método según la reivindicación 1,
en el que el multímero se trata con una disolución alcalina de pH 8
a 9,5 en presencia de un compuesto que contiene un grupo SH.
3. Un método para impedir el plegamiento
incorrecto de albúmina de suero de ser humano durante un
procedimiento para convertir un multímero de albúmina de suero de
ser humano en sus monómeros tratando el multímero con una
disolución alcalina de pH 8 a 9,5, en el que la disolución que
contiene la albúmina de suero de ser humano se trata con una
disolución alcalina en presencia de un compuesto que contiene un
grupo SH.
4. Un método según la reivindicación 2 ó
3, en el que la concentración del compuesto que contiene un grupo
SH es de 0,1 a 50 mM o de 0,2 a 15 mM o de 0,5 a 5 mM.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que el compuesto que contiene un
grupo SH se selecciona de compuestos de bajo peso molecular que
incluyen la cisteína, cisteamina, cistamina y metionina.
6. Un método según cualquier
reivindicación precedente, en el que la albúmina de suero de ser
humano es albúmina de suero de ser humano recombinante producida
por recombinación de genes.
7. Un método según cualquier
reivindicación precedente, en el que el valor del pH de la
disolución alcalina es de 8 a 9,5 ó de 8,5 a 9,5 ó es 9,0.
8. Un método según cualquier
reivindicación precedente, en el que el tratamiento con la
disolución alcalina se lleva a cabo durante no menos que 15 minutos
o de 2 a 8 horas o de 3 a 4 horas.
9. Un método según cualquier
reivindicación precedente, en el que el tratamiento con la
disolución alcalina se lleva a cabo a una temperatura de 0 a 65ºC o
a temperatura ambiente.
10. Un método según cualquier
reivindicación precedente, en el que la disolución alcalina se
prepara a partir de una sustancia seleccionada de compuestos
orgánicos alcalinos y compuestos inorgánicos alcalinos que incluyen
amoníaco, sales de amonio, hidróxidos metálicos básicos, boratos,
fosfatos, acetatos, oxalatos, citratos,
tris-hidroxiaminometano y mezclas de al menos dos de
estas sustancias.
11. Un método según la reivindicación 10,
en el que la disolución alcalina se prepara a partir de una
sustancia seleccionada de amoníaco, hidróxido de sodio, hidróxido de
potasio, ácido bórico, boratos,
tris-hidroxiaminometano y mezclas de al menos dos de
estas sustancias.
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