KR100371045B1 - 인간의 재조합 혈청 알부민 약제학적 제제의 멸균방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 두여단위중의 용기내에 패킹시킨, 유전자 조작기술로 수득한 rHSA의 약제학적 제제를 50 내지 80 °C에서 30분 또는 그이상 열처리 시킴으로써 재조합 사람혈정 알부민 (rHSA)의 약제학적 제제를 멸균처리하는것에 관한 것이다. 기술된 방법으로, rHSA 약제학적 제제중에 요염된 미생물이 본 발명의 멸균처리법에 의해 멸균되기 때문에 고도의 안전성을 갖는다.

Description

인간의 재조합 혈청 알부민 약제학적 제제의 멸균 방법

본 발명은 유전자 조작기술로 수득한 인간의 재조합 혈청 알부민의 약제학적 제제중에 오염된 여러가지 미생물의 멸균 방법에 관한 것이다.

혈액 혈장으로부터 유래된 인간의 혈청 알부민(이후 HSA: human serum albumin)제제의 경우, 바이러스 감염된 헌혈자로부터 채혈한 혈액재료를 사용하여 알부민 제제를 제조할 경우 바이러스 오염의 위험성은 극히 높다. 혈장-유래 약제학적 제제를 오염시키는 바이러스를 불활성화시키기 위해, 여러가지 방법이 제안된바 있으며, 이는, 예를들어, UV 조사와 함께 β-프로피오락톤과 같은 화합물을 사용하는 방법, 유기 용매 및 계면활성제의 혼합용액을 사용하는 방법 및 열처리가 사용되는 방법등이다.

그러나, 화합물과 UV조사의 병행 사용은 약제학적 제제의 정확한 항원성을 변화시킬가능성이 있으며, 유기 용매와 계면활성제의 혼합 용액의 사용상 결점은 이 방법이 지질-외피를 갖는 바이러스의 불활성화에 국한된다는 점이다.

열처리는 일반적으로 저온 살균(파스퇴르 처리: 이하 저온 살균)으로 수행하는데, 이것은 약제학적 제제의 품질을 떨어뜨리지 않으며 혈장-유래 HSA 약제학적제제 제조공정의 마지막 단계에서 사용된다. 약제학적 제제의 경우, 간염 바이러스는 60℃에서 10시간의 열처리 (저온살균)에 의해 불활성화시킬수 있으며, HSA를 변질시키는 프로테아제를 불활성화시키기 위한 열처리 동안의 알부민의 열 안정성은 안정화제, 예를들어, 나트륨 아세틸 트립토판, 지방산 염 등을 가하여 유지시킬 수 있다고 보고된바 있다[참조: 미합중국 특허 제 5,132,404호). 상기와 동일한 조건하에서 저온살균의 불활성화 효과는 혈액제제를 오염시킬 소지가 있는 다른 바이러스의 경우에서도 보고된 바 있다. 생물학적 제제 기준에서는 혈장-유래 HSA를 생산할때 저온살균을 60.0±0.5℃에서 10시간 이상 실시해야 한다고 명시하고 있다.

한편, 유전자 조작기술에 의해 수득된 재조합 사람 혈청 알부민 (이후"rHSA"로 기재)의 약제학적 제제는, 바이러스를 함유할 가능성이 있는 재료를 사용치 않기 때문에 바이러스 오염될 가능성은 극히 낮다. 약제학적 제제의 제조중에 미생물 오염을 일으킬 소지는 극히 낮은데, 이는 이 제제를 최종단계에서 무균여과한후 무균조건하에 조제하고 포장하기 때문이다. 그러나, 안전도를 더 증진시키기 위해서는 rHSA 약제학적 제제의 무균성을 보다 더 적극적으로 보장하기 위해 투여단위 용기중에 패킹한 rHSA를 최종 멸균처리하는 것이 유익하다. 열처리에 의해 재조합 HSA를 멸균시키는 기술은 공지되어 있지 않다.

본 발명의 목적은, rHSA를 투여단위 용기내에 패킹시킨 특정 조건하에서 rHSA 약제학적 제제의 멸균 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은, 유전자 조작기술로 수득한, rHSA의 약제학적 제제의 무균 포장후 오염물로서 존재할 가능성이 있는 여러가지 미생물을 가정하였으며,이들의 멸균 조건을 결정하기 위해, 60℃부근에서 실시되는 저온살균에 대한 시간길이를 변화시킴으로써 이들 미생물의 저온살균 불활성화에 대해 집중적인 연구를 수행하였다. 본 발명은 이들 노력을 토대로 완성되었다.

따라서, 본 발명은, 투여단위 용기내에 패킹시킨, 유전자 조작기술에 의해 수득한 rHSA의 약제학적 제제를 50 내지 80℃에서 30분 이상 열처리시키는 과정을 포함하는, rHSA 약제학적 제제의 멸균 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 실시예로부터 분명해질 것이다.

I. 유전자 조작 기술에 의해 수득되는 rHSA 약제학적 제제의 제조

(1) HSA생성 숙주 세포의 제조 및 배양, 및 HSA의 분리 및 수거

본 발명에 사용되는 출발 재조합 HSA의 기원은 제한되지 않으나, 가능하다면, HSA를 유전자 조작 기술로 제조한다. 본 발명에서 사용될 HSA-생산 숙주는, 제한되지 않으나, 가능하다면, 유전자 조작기술로 제조한다. 따라서, 숙주는 문헌에서 이미 보고된 숙주 및 장래에 개발될 수 있는 숙주로부터 선택할 수 있다. 예로들 수 있는 숙주로는 미생물 세포, 예를들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 여러가지 효모종, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 동물세포를 들 수 있으며 이는 HSA 생산자로서 제조된바 있다. 특히 바람직한 숙주는 효모종, 특히 사카로마이세스속(Saccharomyces)에 속하는 것들, 예를들어, 사카로마이세스세레비지애(Saccharomyces cerevisial), 피치아 속(Pichia), 예를들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 클루버로마이세스, 예를들면, 클루버로마이세스락티스가 있다. 특히 사카로마이세스 세레비지애 AH22(a, his 4, len 2, can 1), 피치아 파스토리스 GTS 115(his 4) 및 클루버로마이세스 락티스 MW-98-8c(α, uraA, arg, lyskt, pkD1°)가 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 HSA는 바람직하게는 이들 숙주를 사용하여 제조한다.

HSA-생산 숙주의 제조, 이 숙주의 배양에 의한 HSA의 생산 및 생성된 배양 브로쓰로부터 HSA의 분리 및 회수는 공지된 기술 또는 이의 변형시킨 방법으로 수행할 수 있다.

예를들어, HSA-생산숙주(또는 HSA-생산균주)의 제조는 인간의 천연 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법(EP-A-73646에 상응하는 JP-A-58-56684, EP-A-79739에 상응하는 JP-A-58-90515 및 EP-A-91527에 상응하는 JP-A-58-150517), 인간의 변형된 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법(EP-A-206733에 상응하는 JP-A-62-29985 및 JP-A-1-98486), 합성 시그날 서열을 사용하는 방법(EP-A-329127에 상응하는 JP-A-1-240191), 혈청 알부민 시그날 서열을 사용하는 방법(EP-A-319641에 상응하는 JP-A-2-167095), 염색체내로 재조합 플라스미드를 도입하는 방법(EP-A-399455에 상응하는 JP-A-3-72889), 숙주를 융합시키는 방법(EP-A-40915에 상응하는 JP-A-3-53877), 메탄올 함유 배지중에서 돌연변이를 발생시키는 방법, 돌연변이체 AOX2 프로모터를 사용하는 방법(EP-A-506040), HSA를 비. 서브틸리스(B. subtilis)중에서 발현시키는 방법(EP-A-229712에 상응하는 JP-A-62-215393), HSA를 효모내에서 발현시키는 방법(EP-A-123544에 상응하는 JP-A-60-41487, EP-A-248657에 상응하는 JP-A-63-39576 및 EP-A-251744에 상응하는 JP-A-63-74493) 및 HSA를 피치아내에서 발현시키는 방법(EP-A-344459에 상응하는 JP-A-2-104290)을 사용하여 실시할 수 있다.

HSA-생산 숙주의 배양(HSA 생산방법)을 상기-언급한 참조 문헌에 기술된 공지된 방법을 써서 수행하거나; JP-A-3-83595에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있으며(여기에서 HSA 생산자 세포의 고농도의 기질 억제는 페드(fed) 뱃치 발효법에 의해 고농도의 글루코스 용액을 배지에 서서히 가하여 방지할 수 있으며, 이렇게 함으로써 두 생산자 세포 모두와 고농도의 생성물을 생성할 수 있다.); 또는 EP-A-504823에 상응하는 JP-A-4-293495에 기술된 다른 방법에 따라 수행할 수 있으며, 여기에서 HSA의 생산성은 배지에 지방산을 가하여 개선시킨다.

HSA의 분리 및 회수는 상기-언급한 참조문헌에 기술된 공지된 방법을 사용하여 수행하거나 또는 프로테아제를 열처리하여 불활성화시키는, EP-A-420007에 상응하는 JP-A-3-103188에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있거나; 음이온 교환제, 소수성 담체 및 활성탄소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 흡착제를 사용하여 발색 성분으로부터 HSA를 분리시키는, 미합중국 특허 제5,132,404호 또는 EP-A-464590에 상응하는 JP-A-4-54198에 기술된 발색 억제법에 따라 수행한다.

(2) HSA의 초기정제

HSA는 처음에는, 분획화, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과, 밀도-구배 원심분리 또는 투석과 같은 공지된 방법으로 정제할 수 있다.

적절한 초기 정제 방법은 다음 단계를 포함한다:

(i) HSA를 발현하는 숙주의 배양 상등액을, 분자량 배제 한계 100,000 내지500,000을 갖는 제1 한외 여과막을 통해 통과시킨 후 분자량 배제 한계 1,000 내지 50,000을 갖는 제2 한외 여과막을 통해 통과시켜 제1 여과물을 수득하는 단계;

(ii) 제1 여과물을 50 내지 70℃에서 30분 내지 5시간 동안 열처리하여 가열된 샘플을 수득하는 단계;

(iii) pH 3 내지 5에서 가열된 샘플을 산-처리시켜 산-처리 샘플을 수득하는 단계;

(iV) 분자량 배제 한계 100,000 내지 500,000을 갖는 한외여과 막을 통해 산-처리한 샘플을 통과시켜 제2 여과물을 수득하는 단계;

(V) pH 3 내지 5에서 및 염 농도 0.01 내지 0.2M에서, 제2 여과물을 양이온 교환제에 노출시킨후, 노출시킨 상기 양이온 교환제를 pH 8 내지 10 및 염 농도 0.2 내지 0.5M에 다시 노출시켜 제1 용출물을 수득하는 단계;

(Vi) 제1 용출물을 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.5M에서 소수성 크로마토그래피용 담체와 접촉시키고 비흡착 분획을 수거하여 제2 용출물을 수득하는 단계 및

(Vii) 제2 용출물을 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.01 내지 0.1M에서 음이온 교환제와 접촉시키고, 비-흡착 분획을 수거하여 상기 알부민을 수득하는 단계.

달리는, 상기 언급한 단계(Vi)대신에, 상응하는 샘플을 pH 6 내지 8 및 염농도 1 내지 3M에서 소수성 크로마토그래피 담체와 접촉시키고 이어서 pH 6 내지 8 및 0.01 내지 0.5M의 염 농도를 용출시키는 다른 단계를 사용하거나; 상기 언급한 단계(Vii)대신에, 상응하는 샘플을 pH 6 내지 8 및 0.01 내지 0.05M의 염 농도에서음이온 교환제와 접촉시키고 이어서 pH 6 내지 8 및 염 농도 0.05 내지 1M에서 용출시키는 다른 단계를 사용하거나; 또는 pH 3 내지 및 염 농도 0.5 내지 3M에서 염석을 수행하고 침전된 분획은 회수하여 전술한 단계(V)와 (Vi), 또는 (Vi) 와 (Vii)사이 또는 (Vii)후에 도입시키는 추가의 단계가 사용될 수 있다.

(3) 고도의 정제

HSA를 고도로 정제하기 위해 다음의 처리를 수행할 수 있다.

(i) HSA의 탈색처리

상기 HSA 정제 단계는 바람직하게는 최종단계로서 추가로 탈색단계를 포함하며 이는 HSA를 특수화된 리간드 부분을 갖는 킬레이트 수지와 접촉시켜 수행한다. 바람직하게는 킬레이트 수지의 담체 부분의 예는 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체, 아크릴산 및 메타크릴산의 공중합체이다.

리간드 부분의 예로는 티오우레아 그룹 및 폴리아민 그룹(폴리알킬렌 폴리아민 그룹, 예를들어, 폴리에틸렌 폴리아민)이 포함되며, 이는 한분자내에 폴리올 그룹으로 구성된 다수의 아-그룹, 예를들어, N-메틸글루카인 그룹, 이미노 그룹, 아미노 그룹, 에틸렌이미노 그룹을 함유한다. 상기-기술한 담체 및 리간드 부위를 갖는 시판되는 바람직한 킬레이트 수지의 예로는 DIAION CRBO2(리간드 부위, N-메틸글루카민 그룹, 미쯔비시 카세이 코포레이션 제조), DIAION CR20 (리간드 부위, -NH(CH₂CH₂NH)nH, 미쯔비시 카세이 코포레이션 제조), LEWATIT TP214(리간드 부위, -NHCSNH₂, 바이엘 제조) 및 AMBERLITE CG4000이 있으며, 이들 모두는 담체 부분으로서 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체를 갖는다.

킬레이트 수지 처리에 바람직한 조건은 다음과 같다. pH: 산성 또는 중성(pH 3 내지 9, 바람직하게는 4 내지 7), 시간: 1시간 이상, 바람직하게는 6시간 또는 그 이상, 이온 강도: 50mmho 미만, 바람직하게는 1 내지 10mmho, 혼합비: HSA 250mg(습윤기준)을 기준으로 0.1 내지 100g, 바람직하게는 1 내지 10g의 수지.

(ii) 소수성 크로마토그래피

페놀-황산법으로 검출가능한 유리 비항원성 오염물은 상기-기술한 정제 단계(i) 내지 (vii) 및 킬레이트 수지 처리를 통해서 수득한 HSA로부터 완전하게 제거되지는 않는다.

상기-기술한 처리를 통해 수득한 HSA를 pH 2 내지 5, 바람직하게는 3 내지 4 및 염 농도 0.4 내지 1M, 바람직하게는 0.4 내지 0.7M에서 소수성 크로마토그래피용 담체와 접촉시킨다. 용출은 pH 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7 및 염 농도 0.01 내지 0.3M, 바람직하게는 0.05 내지 0.2M에서 수행할 수 있다. 상기-기술한 단계(vi)는 이 소수성 크로마토그래피 단계로 대체시킬 수도 있다. 따라서, 페놀-황산법으로 검출 가능한 유리 비항원성 오염물을 함유하지 않는 HSA가 회수될 수 있게된다.

본원에서 사용된 "페놀-황산 처리법"이란, 페놀 용액을 샘플 탄수화물 용액에 가하고, 여기에 농황산을 가하여 용해열을 이용하여 탄수화물로부터 유래된 푸르푸랄 유도체가 페놀과 반응하도록 혼합물을 진탕시키고 착색된 반응 생성물을 비색계적으로 측정함을 포함하는 탄수화물의 비색적 측정방법을 나타낸다. 이 페놀-황산법으로 측정가능한 유리 비항원성 오염물에는 중성 탄수화물, 예를들어, 5탄당 및 6탄당, 단일 탄수화물 글리코사이드, 예를들어 올리고당류(oligosaccharide), 복합 탄수화물 및 우론산 메틸레이트화 탄수화물등이 있다. 이들 오염물은 생산자 숙주-기원 물질에 대한 항체와의 항원-항체 반응을 유발시키지 않는다.

소수성 크로마토그래피용 담체는, 각 그룹이 탄소수 4 내지 18인 알킬 그룹(부틸 그룹, 옥틸 그룹, 옥틸데실 그룹 등)을 포함하는것 및 페닐 그룹을 함유하는 것들이다. 부틸 그룹-함유 담체의 예로는 부틸-아가로스, 부틸-폴리비닐(토소 코포레이션 제조의 상표명 부틸 토요펄; Butyl Toyopearl), 옥틸 그룹-함유 및 옥틸데실 그룹-함유 담체로는 각각, 옥틸-아가로스 및 옥틸데실-아가로스를 들수 있으며, 페닐 그룹-함유 담체로는 페닐-셀룰로스(상표명 페닐 셀룰로파인, 세이가가쿠코포레이션 제조)가 있다.

(iii) 붕산 또는 이의 염을 사용한 처리

HSA는 항원성 생산자 숙주-기원 오염물 뿐만 아니라, 페놀-황산법으로 검출 가능한 유리 비항원성 오염물을 제거하기 위해 붕산 또는 이의 염으로 처리할 수 있다.

붕산의 예로는 오르토붕산, 메타붕산, 테트라붕산 등이 있다. 이의 염으로는 알칼리 금속 염, 예를 들어, 나트륨 염 및 칼륨 염, 알칼리성 토금속 염, 예를 들어, 칼슘 염이 있다. 바람직하게는 사붕산칼슘이 사용된다. 붕산 또는 이의 염은 약 0.01 내지 1M, 약 0.05 내지 0.2M의 최종농도로 가한다. 이와 같은 처리는 pH 약 8 내지 11, 바람직하게는 약 9 내지 10에서 약 1 내지 10시간 수행할 수 있다.이 처리는 바람직하게는 저전류, 예를 들어, 1 mS이하에서 수행한다. HSA 농도는 바람직하게는, 예를 들어, 5% 이하, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 3%로 낮다.

붕산 또는 이의 염으로 처리한 후, 형성된 침전물을, 예를들어, 원심분리 또는 여과로 제거하고 상등액을 회수, 농축 및 제염 처리시킨다.

(iv) 한외여과

상기 정제단계 후 회수한 HSA를 바람직하게는 약 100,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외여과 막을 써서 한외여과 처리한다. 이 같은 한외여과 처리로 발열 인자를 제거할수 있다.

(v) 정제된 HSA(rHSA)의 특성

상기 단계를 통해 분리 및 정제한 HSA는 약 67,000의 분자량 및 4,6 내지 5.0의 등전점을 갖는 균질성 물질이다. 이 HSA는 단량체로 구성되어 있으며 실질적으로 아무런 이량체, 중합체 또는 분해된 생성물을 함유하지 않는다. 실제로, 이량체, 중합체 및 가수분해 산물의 총 함량은 대략 0.01%미만이다. 또한, 본 발명의 HSA는 단백질, 다당류와 같은 어떠한 생산자 숙주-기원 오염물을 실질적으로 함유하지 않는다. 즉, 항원성을 갖는 오염물이 전혀없다. 25w/v% HSA 용액의 경우, 오염물의 함량은 1ng/ml이하, 바람직하게는 0.1ng/ml미만 일수 있고, 다당류 함량은 1ng/ml미만, 바람직하게는 0.1ng/ml이하이다. 이런 경우, HSA의 순도는 99.999999% 또는 보다 바람직하게는 99.9999999% 이상으로 계산된다. 25w/v% HSA 용액의 발색도는 A₃₅₀/A₂₈₀비에 의해서는 0.01 내지 0.05, A₄₅₀/A₂₈₀비에 의해서는 0.001 내지0.02 및 A₅₀₀/A₂₈₀비에 의해서는 0.001 내지 0.005의 범위일 수 있다. 또한, HSA에 결합된 지방산의 양은 1 HSA 분자당 1몰 미만, 바람직하게는 0.1몰 미만이다.

특히, 본 발명의 HSA는, HSA 250mg당,

(a) 숙주-기원 항원성을 갖는 0.1mg 미만의 오염물,

(b) 페놀-황산법으로 검출가능한 1mg 미만의 비항원성 유리 오염물 및

(c) 0.1EU 미만의 발열 인자를 함유함을 특징으로 한다.

(4) 약제학적 제제

이로써 수득한 rHSA(또는 이를 함유하는 조성물)는 한외 여과, 무균 여과처리, 조제, 동결건조와 같은 공지된 기술로 약제학적 제제로 제형화할 수 있다. 또한, 이의 제조 과정중의 안정성 및 이의 제조 후의 보존 안정성을 보장하기 위해, 필요에 따라, 아세틸 트립토판 또는 이의 염(예를 들어 이의 나트륨 염) 및 나트륨 카프릴레이트를 안정화제로서 혼합시킬 수 있다. 이들 안정화제는 대략 0.01 내지 0.2M, 바람직하게는 0.02 내지 0.05M의 양으로 사용될 수 있다. 나트륨 함량은 3.7mg/ml 미만일 수 있다. 이들 안정화제는 한외 여과, 무균 여과처리, 조제 및 동결 건조처리 단계의 전후에 가할 수 있다.

한외 여과 및 무균 여과처리로 수득한 rHSA 약제학적 조성물은 무균하에 투여 단위 용기내에 패킹시킨다. 본원에서 사용된 "투여 단위 용기내에 패킹시키는"이란, rHSA 약제학적 제제의 투여 단위, 예를 들어 대략 6.4 내지 7.4의 pH 값 및 약 1의 삼투압 비를 갖는 25%의 rHSA를 함유하는 액체 제제 20 내지 50ml(5 내지12.5g의 rHSA) 분량을 용기내에 패킹시킴을 나타내거나, 또는 5%의 rHSA를 함유하는 액체 제제 100 내지 250ml(5 내지 12.5g rHSA) 분량을 용기내에 패킹시킴을 의미한다. rHSA 약제학적 제제를 패킹하는데 사용되는 용기의 예로는, 각각 10 내지 250ml의 용량을 갖는, 유리 용기, 폴리에틸렌 용기, 탈알칼리 처리한 연질 유리 용기(JP-A-4-210646)를 포함한다.

II. 열 처리(저온 살균: pasteurization)

상기 단계를 통해 수득된 rHSA 약제학적 제제는 극히 낮은 미생물 오염 가능성을 갖고 있으나, 제제의 무균성을 보다 확고히 보장하기 위한 한가지 수단으로서 이 제제를 무균적으로 패킹한 후 rHSA 제제를 저온살균 처리시킴으로써 오염성 미생물의 불활성화를 수행한다.

오염성 미생물은 예를 들어, 50 내지 80℃, 바람직하게는 60℃의 온도에서 조절되는 수욕 중에서 30분 이상, 바람직하게는 30분 내지 2시간 동안 상기 언급한 투여 단위 용기내에 패킹시킨 약제학적 제제를 항온처리하여 저온살균함으로써 완전히 불활성화시킬 수 있다. 특히 바람직한 저온살균은 60℃에서 30분 동안 또는 60℃에서 1시간 동안 수행한다.

이로써 제조된 rHSA 약제학적 제제는 혈장-기원 HSA 약제학적 제제의 경우와 동일한 방법으로 주사용으로 임상적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것은 쇼크, 순환 혈액량 보충, 저단백혈증 치료 및 콜로이드성 삼투압 유지시에 혈장량을 신속히 증가시키는 목적으로 사용될 수 있다. 이의 효용성 및 효과는, 예를 들어, 화상 또는 신장 질환으로 인한 알부민 손실로 발생되는 저알부민혈증 및 출혈 쇼크 및감소된 알부민 합성(간경변)을 치료하는데 유용하다.

이의 용도 및 용적 관점에서, 20 내지 50ml의 25% HSA 용액 또는 100 내지 250ml의 5% 용액(5 내지 12.5g HSA)을, 일반적으로 서서히 정맥주사 또는 정맥내 점적 주입으로 투여한다. 투여량은 각 환자의 연령, 증상 및 체중에 따라 증감시킬 수 있다.

투여 단위 용기내에 포장된, rHSA 약제학적 제제중의 오염 미생물이 본 발명의 무균처리법에 의해 멸균되기 때문에 현격하게 고도로 안정한 rHSA 약제학적 제제가 제공될 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되는 것이다. 그러나, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 한계를 규정하기 위한 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1

하기 기술한 바와 같이 참조 실시예에서 수득된 정제한 rHSA(또는 이를 함유하는 조성물)를 분자량 배제 한계가 약 30,000인 한외 여과막을 사용하는 한외 여과 및 무균 여과 처리하고 50ml 용적의 유리 자동용기 내에 무균적으로 패킹하고 이로써 제조한 약제학적 제제를 다음의 실시예에서 사용한다. 이런 경우, 아무런 무균 처리 없이 HSA를 정제시켜 대소용 약제학적 제제를 제조하고 무균 여과처리를 사용하지 않고 정제한 HSA를 비무균적으로 패킹시킨다.

(1) 세포 현탁액의 제조

무균처리 시험에 사용한 미생물 균주는 표 1에 나타내었다. IFO 번호를 갖는균주는 오사카 소재의 발효 연구소(Institute for Fermentation)로부터 입수했다.

표 1

사용된 미생물 균주

(a) 세포 현탁액의 제조

포자-형성 세포인 아스퍼질러스 나이거를 제외한, 상기 균주의 각 세포 한 루프 분량을 5ml의 SCD 배지 (니폰 세이야쿠 제조의 SCD 배지 "다이고(Daigo)")에 접종하고 진탕기(BR-30, TAITEC 제조) 상에서 24시간 배양했다. 이. 콜라이, 피치아 에루지노사, 스파필로코커스 아우레우스 및 바실러스 서브틸리스를 37℃에서 배양하고 칸디다 알비칸스를 20 내지 25℃(실온)에서 및 피치아 파스토리스를 30℃에서 배양했다. 배양시킨 후, 2ml의 배양 혼합물을 무균 원심분리 튜브에 옮기고 3,000rpm으로 10분간 원심분리했다. 이로써 수득한 세포 펠렛을 2ml의 생리식염수중에 현탁시켜 세척하고 이 현탁액을 원심분리했다. 이 세척 단계를 2회 반복한 후, 생성된 세포를 2ml의 생리 식염수 중에 현탁시켜 세포 현탁액을 제조했다.

저온 살균 시험을 위한 각 균주의 접종 크기를 측정하기 위해, 각 균주의 세포 현탁액을 연속 희석시켜 OD₆₁₀에서 희석물의 탁도를 측정하고 희석물을 또 SCD 한천 배지(니폰 세이야쿠 제조, SCD 한천 배지 "다이고")상에 접종하고 OD₆₁₀및 생활체 카운트(viable count) 사이의 상관성을 찾아냈다.

(b) 아스퍼질러스 나이거 포자 현탁물의 제조

아스퍼질러스 나이거의 포자와 균사를 SCD 한천 플레이트 배지상에 접종하고 20 내지 25℃(실온)에서 7일 이상 정체기에서 배양했다. 포자가 충분하게 형성된 다수의 플레이트를 제조하고, 0.05% 트윈 80을 함유하는 5 내지 10ml의 생리 식염수(ICI 제조한 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레에이트)를 각각의 플레이트에 부어 포자를 현탁시켜 피펫으로 수거했다.

포자 현탁액을 무균 유리 섬유 필터를 통해 흡입 통과시켜 현탁액으로부터 균사를 제거하고 OD₆₁₀과 포자수 사이의 관계를 단계(a)에서 기술한 것과 동일한 방법으로 계산했다.

상기 제조한 각각의 세포 현탁액 또는 포자 현탁액 중의 생활체 카운트 또는포자수와 OD₆₁₀간의 상관성은 표 2에 나타낸 바와 같다. OD₆₁₀값이 0.3 이하일 경우 세포 밀도(또는 포자수)와 OD₆₁₀간에 양호한 직선적 상관관계가 관찰되었다. 저온 살균 시험용의 각 균주의 접종 크기는 표 2에 나타낸 결과를 기준으로 측정했다.

표 2

OD₆₁₀과 생활체 카운트 또는 포자 간의 관계

(2) 열처리 시험(저온살균)

이 시험은 USP XXII(1990) 미생물 시험[참조: U.S. Pharmacopeia National Formulary XXII(51), 1478 (1990)]에 따라 수행했다. 상기 방법(1)에서 제조한 0.25ml 분획의 세포 현탁액 또는 포자 현탁액을 참조 실시예에서 무균적으로 제조한 50ml의 25% rHSA 약제학적 제제에 100,000 내지 1,000,000세포/ml rHSA 제제의 밀도로 접종하고 격렬하게 진탕시키고, 최초 생활체 카운트 측정에 사용하기 위해, 교차 오염을 막기 위한 접종에 사용되는 고무-스토퍼 달린 상부 입력단 대신에 샘플링 포트를 통해 1ml 분획의 생성된 혼합물을 샘플링했다. 그후, 용기를, 이의 상부 고무 스토퍼 부위를 제외하고, 60℃로 조절되는 뜨거운 수욕 중에 담가 열처리를 수행했다.

생활체 카운트를 측정하는데 사용하기 위해, 용기를 수욕으로부터 꺼낸 후, 완전히 교반하고, 샘플링하고, 용기를 신속히 뜨거운 수욕으로 되돌려 놓는 방식으로 rHSA 약제학적 제제를 1ml 분획으로 주기적으로 샘플링했다. 샘플을 10 내지 15℃로 유지시킨 수욕 중에서 신속히 냉각시켰다. 생활체 카운트를 측정하기 위해, 각 샘플을 생리 식염수로 적절한 세포 밀도까지 희석시키고, 이 희석물의 100ml 분획을 SCD 한천 플레이트 배지상에 접종하고 이를 (1)에서 기술한 바와 같이 각 균주에 상응하는 배양 온도에서 수일간 정체기 위치에서 배양한 후, 플레이트 배지상에 형성되는 콜로니의 수를 측정했다. 결과는 표3에 나타내었다. 대조군으로서, 세포의 접종후 가열시키지 않은 다른 rHSA 제제 역시 상기한 바와 동일한 방식으로 생활체 카운트의 변화를 측정하기 위해 주기적으로 샘플링하고, 결과는 표 4에 나타내었다. 이들 표에서, 뜨거운 수욕 중에서의 보유시간은 rHSA 약제학적 제제의중심 부분의 온도가 60℃에 달하게 되는 약 12분의 기간을 포함한다.

표 3

열처리 시험의 결과 - 1

열처리 시험의 결과 - 2

표 4

열처리하지 않은 시험의 결과 - 1

열처리하지 않은 시험의 결과 - 2

표 4에 나타낸 결과로부터 rHSA 약제학적 제제 자체는 시험된 각 균주에 대해 살균 활성이 없는 것이 확인되었다. 또한, 표 3의 결과로부터 분명한 바와 같이, rHSA 약제학적 제재내 접종된 각각의 균주는 이 접종된 제제를 60℃로 조절해 놓은 뜨거운 수욕 중에서 30분간 두었을 때 완전히 사멸하였다.

실시예 2

60℃에서 30분간 또는 1시간 동안 각각의 균주를 열처리한 후 불활성화를 보다 정확하게 확인하기 위해, 100ml 이하의 약제학적 제제에 무균성 시험(직접 방법, 생물학적 생성물 표준)에 따라 테스트를 수행했다. 결과는 표 5와 같다.

표 5

무균성 테스트의 결과

표 5에서 사용한 "비-살균 조건하에서 정제한 rHSA 제제"란, 각 정제 단계에서 사용된 장비로부터 기술에 이르기까지의 모든 조건의 무균성을 고려하지 않으며 이후의 무균 여과 처리 단계도 사용하지 않은, 참조 실시예에 나타낸 rHSA-제조 방법에 따라 제조한 제제를 의미한다. 이같은 시도는 주변 환경중에 존재하는 고유한 미생물로 오염된 rHSA 약제학적 제제를 수득하기 위한 목적으로 이루어졌다.

한편, 표 5에서 사용한 "무균-여과 및 무균 패킹시킨 rHSA 제제"란 각 정제단계에서 사용된 장비로부터 기술에 이르기 까지의 모든 조건의 무균성을 고려하고 무균 여과처리 및 이후의 무균성 패킹을 통상적인 방법으로 수행하는, 참조 실시예에 나타낸 rHSA-제조방법에 따라 제조한 제제를 나타낸다. 이 시험은 지금까지 시험된 6가지 균주(이. 콜라이, 슈도모나스 에루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 칸디다 알비칸스, 피치아 파스토리스 및 아스퍼질러스 나이거)의 혼합물로 접종시킨 제제 및 이들 균주중 어느 것으로도 접종시키지 않은 제제를 사용하여 수행하였다. 각 균주의 접종물 크기는 rHSA 제제 ml당 120,000 세포이다. 이런 경우, 가열시간은 rHSA 제제의 중심 부근의 온도가 60℃에 달하기 까지에 소요되는 시간(약 12분)을 고려하지 않고 rHSA 제제의 가열 개시로부터의 출발 시간의 기간을 의미한다.

이 실시예의 결과에 따르면, 정제하는 동안에 오염될 소지가 있을 것으로 여겨지는 주변 미생물 및 시험된 6가지 균주는 60℃에서 30분간의 열처리로 완전히 멸균시킬 수 있으며, 이같은 결과는 앞서 수행한 열처리의 결과와 잘 일치한다. 게다가, 가열 처리된 경우, 균주를 접종하지 않은 제제내에서 생활성 세포의 발생은 관찰되지 않았다.

참조 실시예

정제된 rHSA의 제조(또는 이를 함유하는 조성물)

I. HSA 생산 숙주의 배양 및 HSA의 제조

(1) 사용된 균주, 피치아 파스토리스 GCP101

EP-A-344459에 상응하는 JP-A-2-104290에 기술된 방법에 따라 수득한 피치아 파스토리스 균주 PC4130은, AOX1 프로모터의 조절하에서 HSA를 발현시키도륵 구성된 전사 단위를 함유하는 플라스미드 pPGP1을 NotI으로 분해시킨 후, 생성된 NotI-분해된 단편으로 피치아 파스토리스 균주 GTS115(his 4)(NRRL 기탁번호 Y-15851)의 AOX1 유전자 부위를 치환시켜 제조했다. 이 균주는 AOX1 유전자가 소실되었기 때문에 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 배지에서는 잘 증식할 수 없다(Hut^-균주).

이 균주 PC4130을 3ml의 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤 및 2% 글루코스)에 접종했다. 24시간 배양시킨 후, 세포를 50ml의 YPD 배지에 접종하여 세포 밀도가 최초 탁도 OD₅₄₀=0.1이 되도록 조정했다. 30℃에서 3일간 배양시킨 후, 생성된 세포를 다시 50ml의 YPD 배지중에 OD₅₄₀에서 0.1의 최초 세포 탁도로 접종했다. 그 후, 동일한 방법으로 3일마다 아배양을 반복했다. 아배양 후, 매번 세포를 멸균수로 희석시킨 후, 10⁷세포/플레이트의 접종 크기로 2% MeOH-YNBw/oa.a. 플레이트(0.7% 아미노산 없는 효모 질소 염기, 2% 메탄올 및 1.5% 한천 분말)에 붓고 30℃에서 5일간 배양하여 콜로니의 존재/부재를 판정했다. 연속 아배양 12일 후에 20개의 콜로니가 2% MeOH-YNBw/oa.a. 플레이트 상에서 발견되었다. Mut^-균주는 2% MeOH-YNBw/oa.a. 배지에서 거의 증식할 수 없으나 Mut⁺균주는 잘 증식할 수 있다. 즉, 콜로니 출현은 균주가 증가된 메탄올 동화능을 획득하였으며 따라서 Mut⁺균주가 수득되었음을 나타낸다. 이로써 수득된 콜로니 중의 하나를 무균수로 적절하게 희석시키고 2% MeOH-YNBw/oa.a. 플레이드 상에 도말시켜 단일 콜로니를 분리했다. 생성된 단일 콜로니 중의 하나를 GCP101로 명명했다.

(2) 균주 배양

(1차 시드 배양)

글리세롤 중에 동결시켜둔 1ml 분획의 균주를 200ml의 YPD 배지(표 6 참조)를 함유하는 1000ml의 삼각 플라스크에 접종시키고 30℃에서 24시간 동안 진탕하면서 배양했다.

표 6

YPD 배지의 조성

(2차 시드 배양)

1차 시드 배양 브로쓰를, 5ℓ의 YPD 배지를 함유하는 10ℓ 항아리 발효조에 접종시키고 교반과 함께 5ℓ/분의 통기 속도로 30℃에서 24시간 동안 2차 시드 배양을 수행했다. 시드 배양중, 배지의 pH는 조절하지 않았다.

(주 배양)

2차 시드 배양 브로쓰를, 250ℓ의 뱃치 배양 배지(표 7 참조)를 함유하는 1,200ℓ들이 발효기내로 옮기고 교반 및 통기와 함께 뱃치 배양을 실시했다. 교반 속도를 조절시켜 배지중의 용존 산소량을 포화 용존 산소 농도의 약 50 내지 30%로 유지시켰다. 뱃치 배양 배지중의 글리세롤이 고갈되는 경우, 영양공급 배지(표 8 참조)의 첨가를 개시했다. 배지의 공급 속도는 컴퓨터로 조절하여 메탄올이 배양배지중에 축적되지 않도록 했고, 이렇게 하여 고밀도의 배양이 성취되도록 했다. 배지의 pH를 5.85의 고정값으로 조절했다. 제포시키기 위해 배양 배지에 제포제를 가했다.

표 7

뱃치배양 배지의 조성

*1 비오틴 용액 : 0.2g/ℓ

*2 YTM 용액 :

표 8

영양공급 배지의 조성

상기 기술한 균주 GCP101로부터 분리시킨 AOX2 프로모터[프로모터의 최초 코돈으로부터 상류 255번째 염기가 T에서 C로 변화된, AOX2 천연 프로모터의 돌연변이체: 참조: YEAST, 5, 167-177, 1988; Mol, Cell Biol., 9, 1316-1323, 1989]를 사용하여 HSA 발현 플라스미드 pMM042를 작제했다. . 이렇게 작제된 플라스미드를 피치아 파스토리스 GTS115에 도입하여 형질전환체 UHG42-3(JP-A-4-299984 또는 EP-A-506040)을 수득했다. 그 후, 이로써 수득한 형질전환체를 상술한 방법에 따라 배양하고 형질전환체가 HSA를 생산하도록 했다.

II. HSA의 정제(고품질 정제)

(1) 배양 상등액의 분리-막분획(I) 및 (II)-

상기 방법에서 수득한 약 800ℓ 분획의 배양 브로쓰를 필터 압착시켜 배양 상등액을 분리시켰다. 이어서 생성된 상등액을 300,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외 여과막을 통과시켰다. 그후, 생성된 여과물을 30,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외 여과막을 써서 약 80ℓ 용적까지 농축시켰다(막 분획(I)).

그후, 막 분획(I)을, 5mM의 나트륨 카프릴레이트, 10mM의 시스테인 및 100mM의 아미노구아니딘의 존재하에 (pH7.5) 60℃에서 3시간 열 처리했다. 이렇게 열처리한 용액을 15℃까지 신속하게 냉각시키고 pH를 4.5로 조정한후 300,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외여과막으로 처리했다(막분획 (II)). 이후, 30,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외 여과막을 사용하여, 생성된 알부민 용액중의 완충액을 50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 대체시켰다.

(2) 양이온 교환체 처리

상기 단계(1)에서 수득한 알부민 용액을, 50mM의 염화나트륨을 함유하는50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형시킨 바 있는, S-세파로스로 패킹시킨 컬럼에 넣고, 이 컬럼을 상기 동일 완충액으로 완전히 세척한 후 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH 9)으로 용출했다.

(3) 소수성 크로마토그래피

S-세파로스 컬럼상에서 용출시킨 HSA 용액을, 0.15M 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 6.8)으로 미리 평형시킨 바 있는, 페닐 셀룰로파인으로 패킹시킨 컬럼에 적용시켰다. 이 조건하에서, HSA가 페닐 셀룰로파인에 흡착되지 않기 때문에, 컬럼을 통과해나간 HSA 분획물이 수거되게 된다. 이렇게 회수한 HSA 용액을 30,000의 분자량 배제 한계를 갖는 한외 여과막을 써서 약 50ℓ의 용적까지 농축시키고, 동시에, HSA 용액중의 완충액을 50mM 인산염 완충액(pH 6.8)으로 대체시켰다.

(4) 음이온 교환체 처리

소수성 크로마토그래피로 처리하고 농축 및 완충액 교환시킨 HSA 용액을, 미리 50mM 인산염 완충액(pH 6.8)으로 평형시킨 바 있는 EDAE-세파로스로 패킹시킨 컬럼에 적용시켰다. 이같은 조건하에서, HSA는 DEAE-세파로스에 흡착되지 않고 컬럼을 통과해버린다.

(5) 탈색처리

정제한 HSA의 25w/v% 용액 1ml 분획을 1g의 DIAION CRBO2(미쯔비시 카세이코포레이션 제조의, 담체 부분으로서 스티렌-디비닐벤젠 공중합체를 갖고 리간드부분으로서 N-메틸글루카민 그룹을 갖는 킬레이트 수지)와 혼합하고 생성된 혼합물을실온에서 pH6.8 및 이온강도 5mmho에서 24시간 동안 교반시켰다. 그후 수지를 증류수로 처리하여 비-흡착 HSA-함유 분획을 회수했다.

(6) 소수성 크로마토그래피

최종농도 0.5M까지 HSA-함유 용액에 염화나트륨을 가했다. 생성된 용액의 pH를 3.5로 조정하고 페닐-셀룰로파인으로 패킹시킨 컬럼에 적용시켰다. 이 컬럼을 0.5M 염화나트륨 용액(pH3.5)으로 세척하고 0.15M 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH6.8)을 써서 용출시켰다.

(7) 붕산염 처리

HSA-함유 용액의 HSA 농도를 2.5w/v%로 조정하여 전기전도성이 1mS 이하가 되도록 했다. 생성된 용액에 최종 농도 100mM 까지 사붕산칼슘을 가하고 pH를 9.5로 조정했다. 이 용액을 10시간 동안 정치시킨 후, 형성된 침전물을 제거하여 상등액을 수거하고, 이를 농축 및 탈염처리했다.

(8) 한외여과

상기-회수한 HSA-함유 용액을 분자량 배제한계가 약 100,000인 한외여과막을 통과시켰다.

III. 정제된 rHSA(또는 이를 함유하는 조성물)의 특성

(1) 정제 단계의 HPLC 분석

HSA를 HPLC 겔 여과로 분석했다. 이 겔 여과는 다음의 조건하에서 수행했다.

컬럼 : TSK 겔 G3000SW(토쇼 제조)

전개 용액 : 0.1M KH₂PO₄/0.3M NaCl 완충액

검출 : 280nm 파장에서의 흡광도

정제한 HSA-함유 조성물은 HSA 단량체의 단일 피크를 나타냈다.

(2) 효모-유래 성분의 분석

HSA 비-생산 효모의 배양 상등액을 상기한 바와 동일한 방법으로 부분적으로 정제하고 생성된 HSA-함유 조성물을 토끼 면역화에 사용했다. 이로써 수득한 항혈청을 사용하여, 정제한 HSA-함유 조성물중의 효모-기원한 성분을 효소 면역분석(EIA)으로 검출해냈다.

각 샘플에서 효모-유래된 성분의 검출결과는 표 9에 나타내었다. 측정은 각 샘플의 HSA 농도를 250mg/ml로 조정하여 수행했다.

(3) 분자량

상기 기술한 HPLC 겔 여과분석을 분자량 측정을 위해 사용했다. 본 발명의 정제된 HSA-함유 조성물중의 HSA의 분자량은 약 67,000인 것으로 밝혀졌으며, 이는 혈장-유래된 HSA와 거의 동일하다.

(4) 등전점

등전점은 박층 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 사용하여 문헌[참조: Allen et al; J. chromatog, 146, 1(1978)]에 따라 측정한다. 본 발명의 정제된 HSA-함유 조성물 중의 HSA의 등전점은 약 4.9인 것으로 밝혀졌으며, 이는 혈장-유래된 HSA와 거의 동일하다.

(5) 발색도

A₃₅₀/A₂₈₀, A₄₅₀/A₂₈₀및 A₅₀₀/A₂₈₀으로서 발색도를 계산하기 위해 280nm, 350nm, 450nm 및 500nm에서의 흡광도를 측정했다. 본 발명의 정제된 HSA-함유 조성물의 발색도는 A₃₅₀/A₂₈₀이 약 0.02, A₄₅₀/A₂₈₀이 약 0.01 및 A₅₀₀/A₂₈₀이 약 0.002인 것으로 밝혀졌으며, 이는 혈장-유래된 HSA와 거의 동일하다.

(6) 결합된 지방산 함량

NFEA-테스트 와코(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈 제조)를 측정에 사용했다. 킬레이트 수지 처리 전에 지방산 함량은 1.6mole(HSA 1몰당)이었으나, 처리 후에는 0.037mole(HSA 1몰당)로 급격히 감소했다.

(7) 페놀-황산법에 의한 유리 오염물의 함량 측정

각 HSA 분획물중의 유리 오염물의 함량은, 통상적인 방법으로 페놀-황산법으로 측정했다. 따라서, 각 HSA 분획물을 직접 페놀-황산법으로 시험하여 오염물의 총 함량(즉 유리 오염물 함량 및 비유리 오염물 함량의 합계)을 측정했다. 별도로, 상술한 바와 동일한 방법으로 각각의 HSA 분획물을 ConA-세파로스(파마시아 제조)로 처리하고 HSA를 함유하는 비-흡착 분획을 페놀-황산법으로 처리하여 비유리 오염물의 함량을 측정했다. 전자로부터 후자를 빼서 수득한 차이는 유리 오염물의 함량을 의미한다. 표준물질로서 만난을 사용하여 표준 곡선을 작성했다. 결과는 표 9와 같다.

(8) 발열물질의 측정

이 측정은 세이가가쿠 코포레이션 제조의 엔도스펙시를 써서 실시했다.

표 9

이로써 수득한 정제된 rHSA(또는 이를 함유하는 조성물)은, 배지 및 미생물(생산자 숙주)내에 함유되어 있었거나 분비된 물질 기원의 특정 오염물, 특히 항원성을 갖는 숙주-유래된 오염물, 페놀-황산법으로 검출가능한 비-항원성 유리 오염물 및 발열물질(발열성 물질)과 같은, HSA-함유 분획물로부터의 오염물 상당량을 성공적으로 제거하였기 때문에 고도로 높은 순도를 갖게 된다.

본 발명이 본 발명의 특정 양태를 참조로 상세히 기술되었으나, 당해 분야의 숙련가라면, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 본 발명에 여러가지 변화와 변형이 가해질 수 있음을 알 수 있을 것이다.

Claims (2)

1. 투여 단위 용기내에 패킹된, 인간의 재조합 혈청 알부민 약제학적 제제를 50 내지 80℃에서 30분 내지 2시간 동안 열처리시키는 단계를 포함하는, 인간의 재조합 혈청 알부민 약제학적 제제의 멸균 방법.
2. 제1항에 있어서, 인간의 재조합 혈청 알부민 약제학적 제제를 60℃에서 30분 내지 2시간 동안 열처리시키는 멸균 방법.