JP2006070044A

JP2006070044A - 組換えヒト血清アルブミン製剤

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Publication number: JP2006070044A
Application number: JP2005326978A
Authority: JP
Inventors: Tomosuke Ooya; 智資大屋; Toyoo Ouda; 豊雄應田; Shinobu Kuwae; 忍桑江; Kenji Tomomitsu; 賢治友光; Kaoru Kobayashi; 薫小林; Takao Omura; 孝男大村
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2005-11-11
Publication date: 2006-03-16

Abstract

【課題】無菌性が極度に高く、安全性に優れるｒＨＳＡ製剤を提供する。
【解決手段】投与単位あたり容器に無菌充填した遺伝子操作により得られる組換えヒト血清アルブミン製剤を５０〜７０℃、３０分間以上２．５時間以内で加熱処理し、無菌充填後に夾雑する微生物を滅菌することによって得られる、組換えヒト血清アルブミン製剤。
【選択図】なし

Description

この発明は、遺伝子操作により得られる組換えヒト血清アルブミン製剤中に夾雑する各種微生物の滅菌方法とその方法によって得られる組換えヒト血清アルブミン製剤に関する。

血漿由来のヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）製剤は血液提供者がウィルスに感染している場合、その血液を原料として製造された製剤がウィルスに汚染される危険性は極めて高くなる。血漿由来の製剤中に混在しているウィルスを不活化する手段としては、β−プロピオラクトンのような化合物とＵＶ照射とを併用する方法、有機溶媒と界面活性剤との混合溶液を使用する方法、加熱処理を実施する方法等が提案されてきた。

しかし、化合物とＵＶ照射とを使用すれば製剤の正しい抗原性に変化を与える可能性があり、また、有機溶媒と界面活性剤を用いる方法は脂質をエンベロープとしているウィルスの不活化に限定されるという短所がある。

加熱処理は、製剤の品質を劣化させない低温での殺菌（パストリゼーション）が一般的であり、血漿由来のＨＳＡ製剤でもその製造の最終工程で行われている。ＨＳＡ製剤に対しては、６０℃、１０時間の加熱処理（パストリゼーション）により肝炎ウィルスが不活化され、アセチルトリプトファンナトリウムや脂肪酸塩のような安定化剤を添加することによって、加熱処理に対するアルブミンの熱安定性が保証されること、さらに、血液中に存在しうる他のウィルスが血液製剤中に混入していた場合における、該条件下のパストリゼーションの不活化効果についても報告されている。また、生物学的製剤基準においては、血漿由来のＨＳＡを製造する際に６０．０±０．５℃で１０時間以上のパストリゼーションを行うように規定されている。

他方、遺伝子操作により得られる組換えヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡ）製剤については、ウィルスが存在する可能性を持つ原材料を使用しないことから、ウィルスの混入の危険性は元来極めて低いと考えられる。また製剤化工程においても、その最終工程で除菌濾過した後に無菌分注、無菌充填されるため、雑菌に汚染されている可能性も極めて低いと考えられる。
しかし、更なる安全性を期す上で、ｒＨＳＡ製剤の無菌性をより積極的に確保するために、投与単位あたりに容器に充填したｒＨＳＡについて最終的に滅菌処理を施すことが有利であろうと考えた。そこで、本発明が解決しようとする課題は、投与単位あたりに容器に充填したｒＨＳＡという特別の条件下に置かれたｒＨＳＡ製剤を滅菌し、安全性がさらに高められたｒＨＳＡ製剤を提供にある。

本発明者らは、かかる実情下に鋭意研究を進めた結果、ｒＨＳＡ製剤の無菌充填後のパストリゼーションによる不活化を検討し、そこに夾雑する可能性の或る微生物を想定し、且つその滅菌条件を決定するため、ｒＨＳＡ製剤におけるパストリゼーションに関して、６０℃付近における加熱時間と各種微生物に対する不活化効果を検討し、本発明を完成した。
本発明は、以下のとおり、投与単位あたり容器に充填したｒＨＳＡ製剤を５０〜７０℃、３０分間以上加熱処理することによって得られるｒＨＳＡ製剤をその要旨とするものである。
（１）投与単位あたり容器に無菌充填した遺伝子操作により得られる組換えヒト血清アルブミン製剤を５０〜７０℃、３０分間以上２．５時間以内で加熱処理し、無菌充填後に夾雑する微生物を滅菌することによって得られる、組換えヒト血清アルブミン製剤。
（２）加熱処理時間が３０分間である（１）に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。
（３）滅菌対象の微生物がエシェリキア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)、環境菌（常在菌）から選ばれる１種以上である、（１）又は（２）に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。
（４）容器がガラス製容器、ポリエチレン製容器又は脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器である（１）〜（３）のいずれか１に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。

本発明の滅菌方法により、投与単位あたり容器に充填したｒＨＳＡ製剤中に夾雑する微生物は死滅し、極めて安全性の高いｒＨＳＡ製剤が供給される。

Ｉ．遺伝子操作により得られるｒＨＳＡ製剤の調製方法
（１）ＨＳＡ産生宿主の調製、培養ならびにＨＳＡの分離採取
本発明における遺伝子操作により得られるＨＳＡは、遺伝子操作によって得られるものであれば、その由来に特に制限はない。従って、当該ＨＳＡを産生させるための宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。当該宿主としては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）〕を使用されることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（a, his 4, leu2, can 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4 ）等が好適に使用される。

本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。

例えば、ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ₂プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが例示される。

また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースあるいはメタノール等を適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報）などが例示される。

さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分とを分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１９８号公報）などが例示される。

（２）ＨＳＡの精製
ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用される。

当該精製工程としては、例えば以下の（ｉ）〜（vii）を含む工程が好適に挙げられる。
（ｉ）ＨＳＡの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜５０万、および１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理する。
（ii）５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。
（iii）ｐＨ３〜５で酸処理する。
（iv）分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処理する。
（v）ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。
（vi）ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収する。そして、（vii）ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。

また、前記工程（vi）の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程（vii）の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程（v）と（vi）の間、（vi）と（vii）の間、または（vii）の後に、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈殿画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。

（３）高度精製
さらに、ＨＳＡを高度精製するために以下のような処理を行うことができる。
（ｉ）ＨＳＡの脱色
ＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳＡとを接触させることにより行われる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体などが挙げられる。

一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRBO2（リガンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAION CR20 （リガンド部；−ＮＨ（CH₂CH₂NH) _nＨ、三菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ₂、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００などが好適に使用される。

当該キレート樹脂による処理条件は、好適には次の通りである。
ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７）
時間：１時間以上、好ましくは６時間以上
イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍｍｈｏ
混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）

（ii）疎水性クロマト処理
上記精製工程（（ｉ）〜（vii）およびキレート樹脂処理を含む）を経て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去されていない。

そこで、これらの処理終了後に得られるＨＳＡを、ｐＨ２〜５（好ましくは、ｐＨ３〜４）、塩濃度０．４〜１Ｍ（好ましくは、０．４〜０．７Ｍ）の条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８（好ましくは、ｐＨ６．５〜７）、塩濃度０．０１〜０．３Ｍ（好ましくは、０．０５〜０．２Ｍ）の条件下で溶出する工程を組み合わせる。または、前記の工程（vi）の代わりに当該疎水性クロマト処理工程を組み合わせる。こうして、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを回収することができる。

ここにフェノール硫酸法とは、一般的には糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液にフェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成されるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オリゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体反応を起こさない夾雑物質を言う。

疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基型（例：ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル基型など）、フェニル基型などが例示される。ブチル基型としては、ブチル−アガロース、ブチル−ポリビニル（商品名ブチル−トヨパール、東ソー社製）などが、オクチル基型としては、オクチル−アガロースなどが、オクチルデシル基型としては、オクチルデシル−アガロースなどが、フェニル基型としては、フェニル−セルロース（商品名フェニルセロファイン、生化学工業社製）などが例示される。

（iii) ホウ酸またはその塩による処理
ＨＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによって、宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質を除去することができる。

使用されるホウ酸としては、例えばオルトホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。またその塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩など）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であることが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さらに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示される。

ホウ酸またはその塩による処理終了後、例えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩する。

（iv）限外濾過処理
上記精製工程を経て、回収されたＨＳＡは限外濾過処理することが望ましく、分画分子量約１０万の限外濾過膜が好適に使用される。限外濾過処理によりパイロジェン（発熱性物質）を除去することができる。

（v) 精製されたＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の性状
上記の各操作を経て、分離精製されたＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６〜５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量体のみからなり、二量体、重合体または分解物を実質的に含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有量は０．０１％以下程度である。また、産生宿主に由来する夾雑成分（例えば、蛋白質、多糖成分など）を実質的に含まない。より詳細には（正確には）産生宿主由来の夾雑成分のうち、抗原性を有するものを実質的に含まない。具体的には、当該ＨＳＡとしては、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、夾雑成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示される。また、当該ＨＳＡとしては、多糖成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示される。結果的にＨＳＡの純度としては９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上のものが例示される。当該ＨＳＡの着色度としてはＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ₃₅₀／Ａ₂₈₀が０．０１〜０．０５、Ａ₄₅₀／Ａ₂₈₀が０．００１〜０．０２、Ａ₅₀₀／Ａ₂₈₀が０．００１〜０．００５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分子以下のものが例示される。

特に当該ＨＳＡは、ＨＳＡ２５０mg当たり、
（ａ）宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満であり、
（ｂ）フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ
（ｃ）パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴とする。

（４）製剤化
上記で得られたｒＨＳＡ（含有組成物）は、公知の手法（限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。また、製剤化工程での安定性及び製剤化した後での保存安定性を確保するため、必要に応じて安定化剤としてアセチルトリプトファンまたはその塩（例えば、ナトリウム塩）およびカプリル酸ナトリウムが配合される。安定化剤の添加量としては、0.01〜0.2 Ｍ、好ましくは0.02〜0.05Ｍ程度が例示される。また、ナトリウム含量は3.7mg/ml以下が例示される。当該安定化剤の添加時期は、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理前である。

かくの如き限外濾過、除菌濾過されたｒＨＳＡ製剤は、投与単位あたりに容器に無菌充填される。ここで、投与単位あたりに容器に充填するとは、ｒＨＳＡ製剤の投与量、例えば、ｒＨＳＡを25％含有し、ｐＨは 6.4〜7.4 程度、浸透圧比は１程度の液状製剤を、20〜50ml（ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ）ごとに容器に充填することを意味する。あるいはｒＨＳＡを５％含有し、100 〜250ml ( ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ) ごとに容器に充填することを意味する。ｒＨＳＡ製剤を充填する容器としては、10〜250ml 容のガラス製容器、ポリエチレン製容器、脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器（特開平４−２１０６４６号公報）等が挙げられる。

II. 加熱処理（パストリゼーション）
上記工程を経て得られたｒＨＳＡ製剤は、各種微生物に汚染されている可能性は極めて低いと考えられるが、製剤の無菌性をより積極的に確保するための手段として、無菌充填後のｒＨＳＡ製剤のパストリゼーションによる夾雑微生物の不活化を行う。

パストリゼーションは、投与単位あたりに容器に充填された製剤が、上記のいずれの容器に充填されたものであっても、５０〜７０℃（好ましくは６０℃）の、例えば湯浴中に３０分間以上保持することにより十分に夾雑微生物が不活化される。加熱時間は、好ましくは３０分間〜２時間である。

このようにして調製されたｒＨＳＡ製剤は、注射剤として血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることができる。例えば、主としてショック時の急速な血漿の増量、循環血液量の補充、低蛋白血症の改善、膠質浸透圧の維持等の目的に使用される。具体的な効能・効果としては、アルブミンの損失（熱傷、ネフローゼ症候群等）およびアルブミン合成低下（肝硬変等）による低アルブミン血症、出血性ショック等に有効である。用法・容量としては、通常成人１回、ＨＳＡ２５％溶液で２０〜５０ml、あるいは５％溶液で１００〜２５０ｍｌ（ＨＳＡとして５〜12.5ｇ）を緩徐に静脈内注射または点滴静脈内投与する。年齢、症状、体重により適宜増減する。

以下に実施例、参考例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

後記参考例で得られる精製ｒＨＳＡ（含有組成物）を、限外濾過、除菌濾過し、５０ｍｌ容のガラス製の自動瓶に無菌的に充填した製剤を、以下の実施例に供した。尚、非無菌的に精製し、除菌濾過を行わず、非無菌的に充填した製剤も用意した。

(1) 菌体懸濁液の調製
滅菌試験に用いた菌株を表１に示した。ＩＦＯ No．の記された菌株は、財団法人醗酵研究所より譲渡されたものである。

（ｉ）菌体懸濁液の調製
Asp. nigerの胞子を有する菌体を除く表１の各菌株を、ＳＣＤ培地（ＳＣＤ培地「ダイゴ」、日本製薬製）5ml に１白金耳接種して、振盪培養器（BR-30 型、TAITEC社製) により２４時間振盪培養して調製した。E.coli, Ps.aeruginosa, Staph.aureus, B.subtilis は37℃で、C.albicansは20〜25℃（室温）で、P.pastorisは30℃で培養した。培養後の培養液2ml を滅菌した遠心管に移し、3000rpmにて10分間遠心分離した。得られた菌体ペレットを2ml の生理食塩水にて懸濁した後、再び遠心分離することにより菌体を洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返し、得られた菌体を2ml の生理食塩水に懸濁して、菌体懸濁液を調製した。

パストリゼーションを実施する際の各菌株の接種濃度を決定するため、各菌株についてその菌体懸濁液を数段階に希釈してＯＤ₆₁₀を測定すると同時にＳＣＤ寒天培地（ＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」、日本製薬製）に塗布し、ＯＤ₆₁₀と生菌数との関係を求めた。

（ii） Asp.niger の胞子懸濁液の調製
Asp.niger の胞子及び菌糸をＳＣＤ寒天培地に塗布し、20〜25℃（室温）にて７日間以上静置培養した。充分に胞子が形成されたプレートを数枚準備し、0.05％ Tween 80 [Polyoxyethlene(20) Sorbitan Monooleate, ICI社製] 含有生理食塩水5 〜10mlをプレートに注ぎ、ピペットで胞子を懸濁し回収した。さらに、この胞子懸濁液を滅菌したガラスフィルターで吸引濾過することにより、胞子懸濁液中に混入している菌糸を除去した後、上記（ｉ）と同様の方法によりＯＤ₆₁₀と胞子数との関係を求めた。

上記方法により調製した各菌体懸濁液あるいは胞子懸濁液について、ＯＤ₆₁₀と生菌数あるいは胞子数との関係を表２に示した。ＯＤ₆₁₀が０．３以下の領域では菌体濃度（あるいは胞子数）とＯＤ₆₁₀との間に良好な直線関係が認められた。表２に基づいて、パストリゼーション試験時の各菌株の接種濃度を決定した。

(2) 加熱処理試験（パストリゼーション）
USP XX II (1990) Microbiological Test [U.S.Pharmacopeia National Formulary XX II <51>,1478(1990)]に準拠して実施した。(1) に示した方法で調製された菌体懸濁液あるいは胞子懸濁液0.25mlを、参考例で無菌的に製造した25％ｒＨＳＡ製剤50mlに10〜100 万cells/ml-rHSA 製剤となるように接種し充分に攪拌した後、クロスコンタミネーションを防ぐため、植菌した上部ゴム栓の穴とは別の所から初発生菌数を計測するために1ml サンプリングした。その後、60℃の湯浴に上部ゴム栓以下を水没させて加熱処理を行った。

生菌数の計測のためのサンプリングは、経時的に湯浴からｒＨＳＡ製剤を取り出してよく攪拌し、1ml サンプリングした後湯浴内に速やかに戻した。サンプルは直ちに10〜15℃の水浴で冷却した。生菌数を計測するため適当な倍率まで生理食塩水で希釈し 100μl をＳＣＤ寒天平板培地に塗布し、(1) に示した各菌株の培養温度で数日間静置培養した後コロニー数の計測を行い、その結果を表３に示した。対照として、菌体を接種後加熱しない場合についても経時的にサンプリングし、上記と同様の方法にて生菌数の変化を測定し、その結果を表４に示した。表中の湯浴中での保持時間は、ｒＨＳＡ製剤の中心部の温度が60℃に達するまでの時間( 約12分）を含んでの保持時間である。

表４の結果から、いずれの菌株に対しても、ｒＨＳＡ製剤自身には殺菌作用がないことが確認された。また、表３の結果から、各種菌株を植菌したｒＨＳＡ製剤を60℃の湯浴中に30分間保持することにより、いずれの菌株も完全に死滅することが明らかになった。

本実施例は60℃にて30分間あるいは１時間の加熱処理による各菌株の不活化をより精度よく確認するため、100ml 以下の製剤に対して適用される無菌試験法（直接法、生物学的製剤基準）に基づき実施し、その結果を表５に示した。

表５中で、非無菌的な条件下で精製したｒＨＳＡ製剤とは、参考例に示したｒＨＳＡの調製において、使用器具から手法に至るまで無菌性を意識せずに精製し、その後の除菌濾過工程も経ずに製剤化した製剤である。これは、現在の環境下に存在する常在菌に汚染されたｒＨＳＡ製剤を得ることを意図したものである。

一方、表５中でｒＨＳＡ製剤とは、参考例に示したｒＨＳＡの調製において、使用器具から手法に至るまで無菌的に精製したものであり、通常通り除菌濾過後、無菌充填を実施した製剤である。これまで検討した６種類の菌株（E.coli, Ps.aeruginosa, Staph.aureus, C.albicans, P.pastoris, Asp.niger）全てを混合して接種したものと、菌の接種の無いものについて試験した。各菌株の接種量は各々12万cells/ml- rHSA製剤とした。尚、ここでの加熱処理時間もｒＨＳＡ製剤の加熱を開始してからの時間であり、ｒＨＳＡ製剤の中心部の温度が60℃に達するまでの時間（約12分）を考慮していない。

本実施例の結果、精製現場で混入したと思われる環境菌および使用した６種類の菌株については60℃、30分間の加熱処理により完全に死滅させることが可能であり、この結果は先に行った加熱処理試験の結果とよく一致した。また、菌の接種の無いものについては、加熱処理したものには生菌の発生をみなかった。

参考例精製ｒＨＳＡ（含有組成物）の調製
[I] ＨＳＡ産生宿主の培養ならびにＨＳＡの産生
(1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株
特開平２−１０４２９０号公報に記載の方法により、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ₁遺伝子領域に、ＡＯＸ₁プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られる。この株はＡＯＸ₁遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０⁷cells/plate になるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ（メタノール）−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げ、シングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。

(2) 菌株の培養
（前々培養）
グリセロール凍結ストック菌株１mlを２００mlのＹＰＤ培地（表６）を含むバッフル付１，０００ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。

（前培養）
ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施しなかった。

（本培養）
バッチ培養用培地（表７）２５０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンターを用いて通気攪拌培養した。槽内圧を０．５kg／cm²、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地（表８）の添加を開始した。このフィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加することにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加することで実施した。

また、上記のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター [変異型、天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST, 5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, 1316-1323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特開平４−２９９９８４号公報）。上記に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生させた。

[II] ＨＳＡの（高度）精製
(1) 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ）
上記で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。

(2) 陽イオン交換体処理
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにＨＳＡを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９でＨＳＡの溶出を行った。

(3) 疎水性クロマト処理
Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたＨＳＡ溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラムを通過した。カラムを通過したＨＳＡは、分画分子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮するとともに、ＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。

(4) 陰イオン交換体処理
疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったＨＳＡ溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはＤＥＡＥ−セファロースに吸着することなく、カラムを通過した。

(5) 脱色処理
２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮＣＲＢ０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキレート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして回収した。

(6) 疎水性クロマト処理
ＨＳＡ含有水溶液に塩化ナトリウムを最終濃度０．５Ｍとなるように添加し、ｐＨを３．５に調整してフェニルセルロファイン充填カラムにアプライした。０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ３．５）で洗浄後に０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。

(7) ホウ酸塩処理
ＨＳＡ含有水溶液をＨＳＡ濃度２．５％に調製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とした。四ホウ酸カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ｐＨを９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩した。

(8) 限外濾過
回収されたＨＳＡ含有水溶液を、分画分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理した。

[III] 精製ｒＨＳＡ（含有組成物）の性状
(1) 精製工程のＨＰＬＣ分析
ＨＳＡをＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記の条件で行った。
（ｉ）カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）
（ii）展開液：0.1M KH ₂PO₄/0.3M NaCl 緩衝液
（iii）検出：波長２８０ｎｍでの吸光度精製ＨＳＡ含有組成物はＨＳＡモノマーのシングルピークとなった。

(2) 酵母由来成分分析
ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ＨＳＡ含有組成物中に存在する酵母由来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。各サンプルについての酵母由来成分の検出結果を示す。サンプルはＨＳＡ濃度として250 mg／mlに調整したものを用いて測定した。

(3) 分子量
分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の精製ＨＳＡ含有組成物中のＨＳＡの分子量は約６７０００であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。

(4) 等電点
等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Allen らの方法 [J. Chromatog., 146, 1 (1978)] に準じて測定した。本発明の精製ＨＳＡ含有組成物中のＨＳＡの等電点は約４．９であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。

(5) 着色度
着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ₃₅₀／Ａ₂₈₀、Ａ₄₅₀／Ａ₂₈₀、Ａ₅₀₀／Ａ₂₈₀を算出した。本発明の精製ＨＳＡ含有組成物の着色度はＡ₃₅₀／Ａ₂₈₀は約０．０２、Ａ₄₅₀／Ａ₂₈₀は約０．０１、Ａ₅₀₀／Ａ₂₈₀は約０．００２であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。

(6) 結合脂肪酸量
測定には、ＮＦＥＡ−テストワコー（和光純薬社製）を用いた。その結果、キレート樹脂処理前は１．６モル（ＨＳＡ１モル当たり）であったが、処理後は０．０３７モル（ＨＳＡ１モル当たり）と大幅に減少した。

(7) フェノール硫酸法による遊離の夾雑物質量の測定
各検体のＨＳＡ中の遊離の夾雑物質量を、公知の手法に従ってフェノール硫酸法で測定した。まず、各ＨＳＡを直接フェノール硫酸法で測定して、夾雑物質の総量（すなわち、遊離状態のものおよび非遊離状態のものの合計量）を算出した。一方、同じく各ＨＳＡをＣｏｎＡ−セファロース（ファルマシア社製）で処理して、パス画分であるＨＳＡをフェノール硫酸法で測定し、夾雑物質量（非遊離状態のもの）を算出した。両者の測定量の差が、遊離状態の夾雑物質量を意味する。標準曲線はマンナンを標準品として用いて作成した。以上の結果を表９に示す。

(8) パイロジェンの測定
生化学工業のエンドスペシーを用いて測定した。

かくして得られた精製ｒＨＳＡ（含有組成物）は、培地中の或種の夾雑物質、微生物（産生宿主）が含有または分泌する物質などのＨＳＡ含有画分中に存在する夾雑物質、特に宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質、およびパイロジェン（発熱性物質）を充分に除去できた極めて高純度なものである。

Claims

投与単位あたり容器に無菌充填した遺伝子操作により得られる組換えヒト血清アルブミン製剤を５０〜７０℃、３０分間以上２．５時間以内で加熱処理し、無菌充填後に夾雑する微生物を滅菌することによって得られる、組換えヒト血清アルブミン製剤。
加熱処理時間が３０分間である請求項１に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。
滅菌対象の微生物がエシェリキア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)、環境菌（常在菌）から選ばれる１種以上である、請求項１又は２に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。
容器がガラス製容器、ポリエチレン製容器又は脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン製剤。