JP2009017847A - 細胞培養培地の製造方法及び細胞培養培地 - Google Patents
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Abstract
【課題】
細胞増殖支持能のよい組換え血清アルブミンを含有する細胞培養培地の製造方法、及び、当該製造方法により得られた細胞培養培地を提供することを課題とする。
【解決手段】
本発明は、複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液であることを特徴とする細胞培養培地の製造方法、及び、当該製造方法により製造された細胞培養培地を提供する。
本発明の製造方法により製造された細胞培養培地は、高い細胞増殖支持能を示す上に、組換え血清アルブミンを含有するので、ウイルス感染の恐れがない。このため、組換え血清アルブミンとして、組換えヒト血清アルブミンを用いる場合は、例えば、培養皮膚、培養骨、培養角膜、造血管細胞移植及び活性リンパ球療法などヒトの治療に利用する場合に特に有効である。
【選択図】 なし
細胞増殖支持能のよい組換え血清アルブミンを含有する細胞培養培地の製造方法、及び、当該製造方法により得られた細胞培養培地を提供することを課題とする。
【解決手段】
本発明は、複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液であることを特徴とする細胞培養培地の製造方法、及び、当該製造方法により製造された細胞培養培地を提供する。
本発明の製造方法により製造された細胞培養培地は、高い細胞増殖支持能を示す上に、組換え血清アルブミンを含有するので、ウイルス感染の恐れがない。このため、組換え血清アルブミンとして、組換えヒト血清アルブミンを用いる場合は、例えば、培養皮膚、培養骨、培養角膜、造血管細胞移植及び活性リンパ球療法などヒトの治療に利用する場合に特に有効である。
【選択図】 なし
Description
本発明は、組換えヒト血清アルブミンを含有した細胞培養培地の製造方法及び当該製造方法により製造された細胞培養培地に関する。
細胞培養分野においては、細胞の細胞増殖能の向上を目的として、細胞培養培地に血清アルブミンを添加することが慣行されている。
しかしながら、添加する血清アルブミンは、通常、生体由来のものを選択するため、原材料にウイルスが存在すると、当該血清アルブミンを用いた細胞培養系にもウイルスが混入する虞がある。上述の細胞培養は、例えば、培養皮膚、培養骨、培養角膜、造血管細胞移植及び活性リンパ球療法などヒトの治療に利用する場合があり、当該ウイルスの混入はより大きな問題となる。
係る事情を鑑みて、遺伝子操作により得られる組換え血清アルブミンを、従来の血清アルブミンと代替する試みがなされている(特許文献1〜4参照)。
しかしながら、組換え血清アルブミンを含む培地を以て細胞を培養しても、従来の血清アルブミンを用いた細胞増殖能と比較して、その細胞増殖能が下がるという問題があった。血清アルブミンは、上述したように、細胞の増殖能を向上させることを目的として添加されるものであるので、これではむしろ価値が下がるだけである。
本発明者は、組換え血清アルブミンが、夾雑物質をほとんど含まないため、培地の成分のひとつである脂肪酸が不足しているのではないかと考え、脂肪酸を添加して培養を試みた。しかしながら、その細胞増殖能は、むしろ低下した。
本発明は、細胞増殖支持能が高い、組換え血清アルブミンを含有する細胞培養培地の製造方法、及び、当該製造方法により得られた細胞培養培地を提供することを課題とする。
本発明は、
[1] 複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地の製造方法、
[2] 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである[1]に記載の細胞培養培地の製造方法、
[3] 組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む細胞培養培地であって、
前記培地は、
複数のストック溶液を混合することにより製造されたものであり、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地、及び、
[4] 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである[3]に記載の細胞培養培地
に関する。
[1] 複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地の製造方法、
[2] 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである[1]に記載の細胞培養培地の製造方法、
[3] 組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む細胞培養培地であって、
前記培地は、
複数のストック溶液を混合することにより製造されたものであり、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地、及び、
[4] 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである[3]に記載の細胞培養培地
に関する。
本発明の製造方法により製造された細胞培養培地は、高い細胞増殖支持能を有する。
本発明の細胞培養培地の製造方法は、複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液であることを特徴とする。
上記細胞培養培地とは、糖類、アミノ酸、ビタミン類及び無機塩類等を含有した細胞培養に用いられる溶液であって、さらに組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液をいう。
上記糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、サッカロース及びラクトースなどが挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンなどが挙げられる。
上記ビタミン類としては、例えば、アスコルビン酸(ビタミンC)、ビオチン、ビタミンB12、チアミン、ニコチン酸、塩酸チアミン、p−アミノ安息香酸及びリボフラビンなどが挙げられる。
上記無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸水素カリウムなどが挙げられる。
また、必要に応じて、pH指示薬、亜セレン酸ナトリウム、インターロイキン、インターフェロン、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン及びHEPESなどを添加してもよい。
一般に、細胞培養培地の製造は、予め準備した複数のストック溶液を、細胞培養培地を製造するための容器に、予め定められた順番に従って添加する。ストック溶液の組成及び当該ストック溶液を添加する順番は、完成した細胞培養培地において、当該細胞培養培地の全ての組成が溶媒に溶解又は分散していることを目標に、当業者により適宜設計されるものである。主に、各ストック溶液における成分が、細胞培養培地を製造するための容器内に収容した細胞培養培地の中間生成物に対して、溶解するか否かによって、ストック溶液の組成及び当該ストック溶液を決定する。本発明は、このストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液であることを特徴とするのである。
上記組換え血清アルブミンは、遺伝子組換え法により産生した後、精製されたものをいう。組換え血清アルブミンの基本となるアミノ酸配列は、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ及びマウスのいずれでもあってよい。但し、ヒトに対しての治療に利用することを考慮すれば、上記組換え血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンを基本とするアミノ酸配列を有することが好ましいことは言うまでもない。
上述の組換え血清アルブミンは、例えば、当該組み替え血清アルブミンが組み替えヒト血清アルブミンである場合、従来公知の方法により製造されるものが選択できる。詳細は、特許文献1〜4を参照されたい。
また、上記脂肪酸は、いわゆるカルボキシル基を1個有する鎖式構造をもつものの総称をいい、直鎖構造のものも、分岐側鎖を有するものも含む。例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、カプロン酸、エナント酸、アクリル酸、クロトン酸、ウンデシレン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸などが挙げられる。後述するが、本発明では、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の4種類の脂肪酸をそれぞれ添加した実施例に加え、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸からなる7種類の脂肪酸の混合物を添加した実施例についても検討している。その結果、いずれも格別な効果が確認できたことから、本発明の脂肪酸の種類は、特に限定されるものではないものと推測される。
ここで、従来の技術にも記載するように、組み換え血清アルブミンと、脂肪酸をそれぞれ独立して添加したのでは、むしろ細胞増殖支持能が低下することが確認されている。この点については後述する比較例からも明らかである。
しかしながら、本発明のように、ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液とした上で製造された細胞培養培地は、その細胞増殖支持能が向上したことが明らかとなった。後述する各比較例でも実証されているが、組換え血清アルブミン含有の細胞培養培地に脂肪酸を添加することは、細胞増殖支持能をむしろ低下させるものであると思われていた。このため、ストック溶液の1つを組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液にすることが、細胞増殖支持能の向上に相関するとは、例え当業者であっても考えつかないことであった。そして、上記の結果は、当業者が予測し得ない格別な効果を奏したものである言える。
ストック溶液における溶媒は、上記組換え血清アルブミン及び上記脂肪酸を溶解又は分散するものであれば特に限定されるものではない。例えば、水、生理食塩水及びリン酸緩衝液などが挙げられる。
ストック溶液における上記組換え血清アルブミン及び上記脂肪酸の濃度は、目標とする最終的な培地の濃度に応じて適宜設定することができる。但し、細胞培養培地の製造は、複数のストック溶液を添加、言い換えれば、各ストック溶液を希釈する形で行われるので、当該ストック溶液における組換え血清アルブミン及び上記脂肪酸の濃度が高いのが当然である。つまり、ストック溶液における組換え血清アルブミン及び上記脂肪酸の濃度は、沈殿が生じない程度の範囲で設定されることになる。例えば、ストック溶液における組換え血清アルブミンの濃度は10〜500mg/mL(1%〜50%)、好ましくは100〜300mg/mL(10%〜30%)である。また、上記脂肪酸の濃度は0.005〜10mg/mL、好ましくは0.05〜5mg/mLである。
上述したように、細胞培養培地の製造は、予め準備した複数のストック溶液を、細胞培養培地を製造するための容器に、予め定められた順番に従って添加する。ストック溶液の組成及び当該ストック溶液を添加する順番は、完成した細胞培養培地において、当該細胞培養培地の全ての組成が溶媒に溶解又は分散していることを目標に、当業者により適宜設計されるものであるから、特に限定されるものではない。言い換えれば、最終的に細胞培養培地が調製できるのであれば、どのタイミングで添加しても問題ないということである。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
株式会社細胞科学研究所(URL:http://www.cstimedia.com/)の培地製造委託サービスを利用した。細胞培養培地の組成は、同社製品のTリンパ球用無血清培地(ALyS505N)を基本とするが、その製造において、組換えヒト血清アルブミン(三菱ウェルファーマ社提供)250mg/mL及びパルミチン酸(シグマ社製)0.5mg/mLのストック溶液を、培地を調製する容器に添加することを指示することにより、本発明の細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における組換えヒト血清アルブミンの最終濃度は500mg/Lであり、パルミチン酸の最終濃度は1000ng/mLとなる。尚、製造委託の際には、同社に秘密保持を義務付けており、本発明は、本実施例に係る細胞培養培地の製造時に公然知られた状態ではないことを付記しておく。
株式会社細胞科学研究所(URL:http://www.cstimedia.com/)の培地製造委託サービスを利用した。細胞培養培地の組成は、同社製品のTリンパ球用無血清培地(ALyS505N)を基本とするが、その製造において、組換えヒト血清アルブミン(三菱ウェルファーマ社提供)250mg/mL及びパルミチン酸(シグマ社製)0.5mg/mLのストック溶液を、培地を調製する容器に添加することを指示することにより、本発明の細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における組換えヒト血清アルブミンの最終濃度は500mg/Lであり、パルミチン酸の最終濃度は1000ng/mLとなる。尚、製造委託の際には、同社に秘密保持を義務付けており、本発明は、本実施例に係る細胞培養培地の製造時に公然知られた状態ではないことを付記しておく。
[実施例2]
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにミリスチン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにミリスチン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
[実施例3]
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにステアリン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにステアリン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
[実施例4]
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにオレイン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
実施例1におけるパルミチン酸の代わりにオレイン酸(シグマ社製)を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。
[実施例5]
実施例1におけるパルミチン酸に加えて、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における前記7種の脂肪酸の最終濃度は各々1000ng/mlとなる。
実施例1におけるパルミチン酸に加えて、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を用いたこと以外は、全て実施例1に準じて細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における前記7種の脂肪酸の最終濃度は各々1000ng/mlとなる。
[比較例1]
実施例1において、組換えヒト血清アルブミン(三菱ウェルファーマ社製)250mg/mLを含むストック溶液と、パルミチン酸(シグマ社製)0.5mg/mLのストック溶液をそれぞれ調製して、それぞれ独立して細胞培養培地を調製する容器に添加することを指示することにより、つまり、従来と同様の製造方法により、細胞培養培地を得たこと以外は実施例1と同様に行った。
実施例1において、組換えヒト血清アルブミン(三菱ウェルファーマ社製)250mg/mLを含むストック溶液と、パルミチン酸(シグマ社製)0.5mg/mLのストック溶液をそれぞれ調製して、それぞれ独立して細胞培養培地を調製する容器に添加することを指示することにより、つまり、従来と同様の製造方法により、細胞培養培地を得たこと以外は実施例1と同様に行った。
[比較例2]
比較例1におけるパルミチン酸に加えて、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を用いたこと以外は、全て比較例1に準じて細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における前記7種の脂肪酸の最終濃度は各々1000ng/mlとなる。
比較例1におけるパルミチン酸に加えて、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を用いたこと以外は、全て比較例1に準じて細胞培養培地を得た。当該細胞培養培地における前記7種の脂肪酸の最終濃度は各々1000ng/mlとなる。
[参考例]
実施例1において、パルミチン酸(シグマ社製)250mg/mLを添加しないことを指示することにより、細胞培養培地を得た。
実施例1において、パルミチン酸(シグマ社製)250mg/mLを添加しないことを指示することにより、細胞培養培地を得た。
以上の実施例、比較例及び参考例を表1にまとめた。
[実験例]
実施例1〜5、比較例1〜2及び参考例の細胞培養培地を用いて細胞の培養を行った。培養は24穴の培養プレートを用いて、同プレートに実施例1〜5,比較例1〜2及び参考例の細胞培養培地を0.5mL/well加え、これにILT−Mat細胞(細胞科学研究所提供)を初期播種濃度が7.0×104cells/mlとなるように播種した。そして、インキュベーター内において、大気圧、37度、5%のCO2雰囲気下で、4日間培養を行った。培養後の細胞を回収した後、フローサイトメーターにて細胞数をカウントした。
実施例1〜5、比較例1〜2及び参考例の細胞培養培地を用いて細胞の培養を行った。培養は24穴の培養プレートを用いて、同プレートに実施例1〜5,比較例1〜2及び参考例の細胞培養培地を0.5mL/well加え、これにILT−Mat細胞(細胞科学研究所提供)を初期播種濃度が7.0×104cells/mlとなるように播種した。そして、インキュベーター内において、大気圧、37度、5%のCO2雰囲気下で、4日間培養を行った。培養後の細胞を回収した後、フローサイトメーターにて細胞数をカウントした。
表2は、参考例における培養後の細胞数を1とした場合における各実施例の細胞数の比率(細胞増殖比)を示す。全ての実施例において、細胞増殖支持能が向上していることが明らかとなった。
一方、表3は、参考例における培養後の細胞数を1とした場合における各比較例の細胞増殖比を示している。全ての比較例において、細胞増殖支持能が低下していることが明らかとなった。
本発明の製造方法により製造された細胞培養培地は、高い細胞増殖支持能を示す上に、組換え血清アルブミンを含有するので、ウイルス感染の恐れがない。このため、組換え血清アルブミンとして、組換えヒト血清アルブミンを用いる場合は、例えば、培養皮膚、培養骨、培養角膜、造血管細胞移植及び活性リンパ球療法などヒトの治療に利用する場合に特に有効である。
Claims (4)
- 複数のストック溶液を混合することにより細胞培養培地を製造する方法であって、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地の製造方法。 - 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである請求項1に記載の細胞培養培地の製造方法。
- 組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む細胞培養培地であって、
前記培地は、
複数のストック溶液を混合することにより製造されたものであり、
前記ストック溶液の1つが組換え血清アルブミン及び脂肪酸を含む溶液である
ことを特徴とする細胞培養培地。 - 前記組換え血清アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである請求項3に記載の細胞培養培地。
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JP2007184376A JP2009017847A (ja) | 2007-07-13 | 2007-07-13 | 細胞培養培地の製造方法及び細胞培養培地 |
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2007
- 2007-07-13 JP JP2007184376A patent/JP2009017847A/ja active Pending
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