JPS63502427A

JPS63502427A - ナイセリア・ゴノロエアエの主要鉄調整タンパクおよびワクチンとしてのその用途

Info

Publication number: JPS63502427A
Application number: JP61506124A
Authority: JP
Inventors: ミエッツナー、チモニー　エイ; モース，スチーブン　エイ
Original assignee: オレゴン州
Priority date: 1985-10-24
Filing date: 1986-10-24
Publication date: 1988-09-14
Also published as: US4681761A; AU594400B2; KR870700638A; EP0245433A1; EP0245433A4; AU6623286A; WO1987002678A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ナイセリア・ゴノロエアエの主要鉄調整タンパクおよびワクチンとしてのその用途本主班夏丘！本発明は、単離された免疫特異性の抗原的に実質上純粋な形のＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　（ナイセリア・ゴノロエアエ）の主要鉄調整タンパク、およびワクチンとしてのその用途に関する。

鉄制限下に成育した時Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　（淋菌）によって発現される膜タンパクが研究された。Ｎｏｒｑｕｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　ＴＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｌｅｔｔｅｒｓ　４　：　７１−７５　（１９７８）は、いくつかの高分子ｉｔ　（７０，０００ないし１００，０００）膜鉄調整タンパクの存在を記載した。

その後の研究は、これら高分子量鉄閣整タンパクと、同様に見掛は分子量約３７．０００を有する以前未同定の鉄調整タンパクの存在を確認した。Ｍｉｅｔｚｎｅｒ　ｅｔａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｎ＋ｕｎ、　４５　：　４１０−４１６　（１９８４）　；　ＷｅｓｔおよびＳｐａｒｌ−０ｉｎｇ、同誌、　４７　：　３８８−３９４　（１９８５）。このタンパクを純粋な形で単離する試みはなされなかったが、感光性銀染色で可視化したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、このタンパクは鉄制限条件下に成育した淋菌からのザルコシル不溶性膜調製物の主要成分であることを示した。この理由で、このタンパクは主要鉄弱整タンパク（ＭＩＲＰ）と呼ばれる。Ｍｉｅｔｚｎｅｒ　ｅｔ　ａＬ前出。

今日まで調べたすべての淋菌は鉄制限条件下このクンバクを表現し、そしてベプタイドマップはこのタンパクの構造は二つの関連のない淋菌株中に高度に保存されることを示す。−ｅｓｔ　ｅｔ　ａＬ同誌、４７：３８Ｂ−３９４（１９８５）は淋菌鉄調節タンパクの発現を調べ、それらは整合的に調整されないことを決定した。鉄源として種々の鉄含有タンパクの存在下、異なる淋菌株は鉄調整タンパクの異なる組合せを発現した。ＭＩＲＰは試験した鉄含有分子のすべての存在下に発現された。すべての鉄制限条件下このタンパクの一貫した発現およびその淋菌内の保存は淋菌による鉄獲得に中心的役割を果たしているとの推測を促したが、鉄摂取における直接の機能の今日の認識はＭＩＲＰに帰せられている。

これまてＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの多数の株に対して有効性を有する成功的ワクチンは提供されていない。ワクチン製造を妨げている主な問題の一つはＮ、ｇ、微生物の抗原不均一である。

抗原不均一のこの問題に対する報告されている解決法は淋菌ピリンからの共通ペプタイド域の使用である。そのようなペプタイド域はＭＩ　ＲＰには発見されていない。それ故、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ属の種々の種からのＭＩＲＰはそれにもかかわらず抗原的に均質であることを発見したことは驚くべきである。

Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＭＩＲＰの理解を容易にするため、このタンパクを合理的な量で精製する方法が開発された。これは精製したＭＩＲＰが淋菌微生物に対するモノクロナール抗体の産生を刺激する能力の発見と、そして感受性宿主における淋菌感染に対し保護するワクチンとしての用途を可能にした。

本衾肌■槻翌組成物面において、本発明は単離した、免疫特異性の抗原的に実質上純粋な形における、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ属の病原性種のＭＩＲＰに関する。

他の組成物面において、本発明は感受性宿主中に該病原性種に対する抗体の免疫レベルの産生を刺激するのに有効なそのタンパク性抗原成分として含む、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ属の病原性種による感染に対するワクチンに関する。

他の組成物面において、本発明はＭＩＲＰタンパクに対する単離されたモノクロナール抗体に関する。

方法面において、本発明は感受性宿主へ、単離された免疫特異性の抗原的に実質上純粋な形のＭＩＲＰの該宿主を免疫するのに有効な量を投与することよりなる、感受性宿主をＮｅ１ｓｓｅｒｉａ属の病原性種による感染に対し免疫するための方法に関する。

他の方法面において、本発明は主要鉄調整タンパクを実質上純粋な形で単離するための方法に関する。

祥組星星亀免疫学的に純粋な形における淋菌ＭＩＲＰの単離は、このタンパクはイオン交換および／またはゲルクロマトグラフィーによってそれから区別できないタンパクから、かなり特異的な界面活性剤対総タンパク重量比において陽イオン界面活性剤で淋菌細胞からＭＩＲＰの選択的抽出によって分離することができるという発見の結果である。めいめいの特定界面活性剤についての最適比は、例えば全細胞または粗膜分画の種々の事前の界面活性剤対タンパク比における抽出と、そしてＭＩＲＰの実質上すべてを抽出する最小比率をゲル電気泳動によって決定することだけで、全細胞またはその可溶性もしくは粗膜分画についての日常的な実験によって決定することができる。通常、約０．２５ないし０．７５．好ましくは約０．５の界面活性剤対総タンパク比が必要である。淋菌ＭＩＲＰは有利にはカチオン界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＢ）　で選択的に可溶化される。

反対に、余計な可溶性物質は同じ界面活性剤により、実質上同じ条件で破壊した細胞の可溶分から選択的に沈澱することができる。

ＭＩＲＰは高度に精製された形で上清中に保持される。最高収率のため、ＭＩＲＰは粗膜がらおよび破壊した細胞の可溶性分画がら別々に選択的に単離される。

この技術において良く知られているように、陽イオン界面活性剤は、水性媒体に熔解した時そのアミノもしくは４級窒素上に正の電荷を持っている。増加した水溶性のため、追加の１級、２級もしくは３級アミン基が一般に分子中に存在し、またはアミノ窒素はメチルもしくはヒドロキシエチルのような低分子量アルキル基で４級化することができる。

陽イオン界面活性剤は一般に三つの広いクラス、すなわちｆａｌアミン類、即ちＣ＋ｇアルキルもしくはアルケニル鎮を有する第３級モノアミンを含む酸素を含まないアミン、例えば脂肪酸およびロジン酸から誘導された脂肪族モノ−、ジーおよびポリアミンの＠酸、ナフテン酸およびオレイン酸塩と、そしてアミンオキシド、エトキシ化アルキルアミン、Ｉ−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダシリンおよびエチレンジアミンのアルコキシレートを含む、酸素含有アミンの両者ｉ　（ｂ）　２−アルキル−１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン界面活性剤１例えばエトキシ化誘導体、例えば塩化ベンジル、ジメチル硫酸および他のハロゲン化アルキルとの４級化誘導体；およびアミンオキシド誘導体；（Ｃ）第４級アンモニウム塩に属する。

前記界面活性剤のクラスのうち、第４級アンモニウム塩、特に脂肪アルキルトリ低級アルキルアンモニウムハライドが好ましい。

アミノ酸分析によれば、　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＭＩＲＰは、後記表Ｉに述べたプロフィルを大体において有する３４０個のアミノ酸よりなる。それらアミノ酸のうち２１６は中性（そのうちの１９は芳香族、４は合イオウおよび１７はイミノ酸／プロチンである。）であり、７６はジカルボキシル酸であり、そして４８は塩基性酸である。後記表■は淋菌ＭＩＲＰの６３個のアミノ末端残基を述べている。比較目的のためその表には、株ＲＩＯからのタンパク１（ＰＩ）（前出Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４）および株ＲＩＯ（ａ）およびＭＳＩＨｂｌ（前出Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２）からのタンパクＩｌ　（ｐＨ）分子のＮ−末端アミノ酸配列が含まれている。アミノ酸分析は、Ｎ−末端残基についてアスパラギン酸対リジン２．２：１の比を検出した。従ってアスパラギン酸はこのアミノ酸として挙げである。すべての他の残基は純粋化合物として検出された。Ｍ　Ｉ　ＲＰおよびタンパクＩの最初の５個の残基は大きな同族性を示す。カッコ中のアミノ酸は、それらの同定はＨＰＬＣ分析によって決定されたがしかしＧＬＣまたはＴＬＣのどちらによっても確認されなかったことを示している。

星印（＊）は残基がシスチンかまたはシスティンのどちらかであることを示している。

淋菌ＭＩＲＰと免疫学的に実質上同一であるＭＩＲＰはＮｅ１ｓｓｅｒｉａの他の病原仕種Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより、そして非病原性メンバーＮ、　ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ、　ｃｉｎｅｒｅａにより、鉄制限環境において成育するとき発現され、そして淋菌ＭＩＲＰを単離するために採用されるのと同じ方法によって純粋形に単離することができる。種々のＭＩＲＰ同族体のアミノ酸プロフィルおよび配列はい（らが変化し得るけれども、種々のＭＩＲＰ同族体の化学構造におけるこれらの小さな変動は感受性宿主中の種々のＮｅ１ｓｓｅｒｉａの病原仕種に対する抗体の産生を刺激するそれらの能力には影響しない。

−２ｊ］二Ｚその医薬組成物面において、本発明は、ＭＩＲＰの高度に保存された抗原構造により、好ましくはヒトであるさもなければ感受性の哺乳類宿主を淋菌および関連する髄膜炎菌感染から保護する淋菌ワクチンに関する。これらワクチンは以下の形で存在し得る。

１、ＭＩＲＰのみに基づく淋菌ワクチン。そのようなワクチンは該タンパクに対する免疫レスポンスを増強するため、アジュバント、例えば水酸化アルミニウムゲルを含んでもよい。

２、他の精製タンパク成分、例えばＭＩＲＰに加え、タンパクＩｓおよび毛を含んでいる淋菌ワクチン、そのようなワクチンはアジュバント、例えば水酸化アルミニウムゲルを含んでもよい。

３、ＭＩＲＰは担体であり、それへそれ自体は免疫原であるがまたは弱い免疫原であるペプタイドの免疫原性を増強するため、区切られたベプタイドが化学的に結合した淋菌ワクチン、ＭＩＲＰへ化学的に結合したベプタイドの結合はＭＩＲＰの免疫原性を増強し、また抗ＭＩＲＰ抗体の産生を刺激する。

本発明のワクチンは、本発明の抗原的に実質上純粋なＭＩＲＰから貯蔵安定性の、例えば凍結乾燥した形に国製される。臨床用途のため適当な形の製剤は、ワクチンについて慣用な態様で、例えば静菌剤、例えばチメロサルを含有するその溶液を慣用の無菌バイアル中へ滅菌口過し、その中の無菌溶液を凍結乾燥し、皮下刺通し得るゴム膜を有するゴムストッパーをカバーする除去し得る蓋を持った慣用のアルミニウムひだシールキャンプでバイアルをキャンプすることによって実施し得る。代わりに、ＭＩＲＰ約２５μｇ／−を含有する無菌溶液は破り得るネックを有する例えば２威容量のガラスバイアル中に熱熔閉し得る。凍結乾燥製品は単位投与量当たり、約１０μｇないし１００μｇ、好ましくは約５０μｇを与えるようにパイロ−ジエン不含無菌水で復元することができるや本発明によるワクチンは、腹腔内、皮肉、脈管内および静脈内注射、および潜在的感染部位への局所注射もしくは外用塗布を含む、慣用の技術によって投与することができる。

筋肉内および皮下注射が特にヒトに対し該ワクチンを投与する最も効果的な投与方法を提供するものと信じられる。ワクチンを上記の好ましい方法によって投与する時、投与量は水酸化アルミニウムゲルのようなアジュバントありもしくはなしで、タンパク約１０ないし１００／Ｊｇである。

感受性宿主に産生される抗体はｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含むＮｅ１ｓｓｅｒｉａの病原仕種による後からの感染を防止する。

ＭＩＲＰワクチンを製造するため、免疫特異性の抗原的に実質上純粋な形の凍結乾燥したＭＩＲＰはＭＩＲＰ２５μｇ／ｄを含む溶液を得るように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）Ｉ）Ｈ７，０中に熔解される。ＭＩＲＰ熔液は０．２２μミリポアフィルタ−を通して膜口過によって滅菌される。無菌ワクチンは必要な時まで４℃で貯蔵される。

本発明のＭＩＲＰは、例えばＮｅｗ　Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉ’ｔｙ　２８　：　７８５−７９１　（１９８０）の操作に従って、三官能カンプリング剤、例えばジメチルアジピイミデートジＨＣｉまたはジメチルビメリイミデートジＨＣ１によって慣用の態様で、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａの同じもしくは他の病原性種からの他の抗原性ポリペブタイドとカップリングすることができる。前記文献をここに参照として取り入れる。

前に述べたように、Ｎ９ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの主要な鉄調整タンパクは、粗膜およびザルコスキー不溶膜分画に結合するものとして先行技術に以前記載された。鉄制限条件下で生育させた淋菌からの膜タンパクの銀染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、タンパクＩに匹敵する量でこのタンパクが存在することを示す。細胞超音波破壊物の可溶性分画の分析は、ＭＴＲＰは淋菌膜のそれに大体等しい割合で存在することを示す。可溶性ＭＩＲＰは膜を通常ベレ７）化するカにおいては遠心に対して抵抗する。これら条件においては、殆どすべてのタンパク ■　（約９５％）はペレフトに付属する。膜結合および遊離の両者のタンパクはＥ、　ｃｏｌｉ中に観察されている。これらタンパクは結合性タンパクに分類され、生物性質スペースＬｏ内に見出される。Ｔ、Ｃ，Ｙ、、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７　：　２８９−３０１　（１９７９）　、　浸透圧ショックを用いる淋菌性質タンパクの分析は、淋菌ＭＩ　ＲＰは浸透圧ショック液中に見出されないことを示す（未発表データ）。

従ってこのタンパクが外資に局在する可能性は明らかでない。他の可能性は、ＭＩＲＰは膜とゆる（結合し、超音波処理によって離れることである。これは精製したタンパクに結合しているＬＰＳについて何故証拠が発見されないかを説明し得るかも知れない。その代わりに、ＭＩＲＰは可溶性細胞タンパクであり、その高度に電荷した性質のため、粒状物と可溶性分画との分離の間膜と結合するとの可能性は排除できない。しかしながら、このタンパクの実質量が低鉄分培地で生育した淋菌からの外膜水庖の調製物と結合して観察さ溶離された。この分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析後主要バンドれる。さらに広汎の洗浄による膜からのＭＩＲＰの除去不能とそのザルニスキー不溶性性質はその膜結合を説得させる。

驚くべきことに、ＭＩＲＰはカチオン洗浄剤セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＢ）を使用して淋菌膜から選択的に可溶化できることが発見された。前出のＢｌａｋｅ　ｅｔ　ａｔ　（１９８２）は以前にこの洗剤を低イオン強度において全淋菌からタンパクＩに富んだ分画を沈澱するために使用した。殆ど全部のＭＩＲＰはこれら条件を使用して可溶化できた。厳重な条件において、ＭＩＲＰに冨む分画がＣＴＢ対タンパク比０．５　（Ｗ／Ｗ）において得られた。

トリトンＸ−１００およびサルコシルのような他のタイプの洗剤の低濃度はＭＩＲＰを膜から選択的に可溶化しなった。同様な洗剤対タンパク比において、ＣＴＢは淋菌膜リン脂質を効果的に可溶化し、これがＭＩＲＰが淋菌膜から遊離されるメカニズムであろう。

上に記載したのと同じ条件における可溶性全細胞超音波処理物へのＣＴＢの添加は沈澱の生成をもたらした。ＭＩＲＰは清澄化した上清中に残っている支配的タンパク種である。ＣＴＢは低イオン強度条件下において酸性多糖類を沈澱することが既知である。おそらく、超音波処理全細胞の可溶性分画中に発見される核酸、炭水化物および結合タンパクを沈澱するのはこの性質である。ＣＴＢ水熔水中液中ＩＲＰの高溶解性は、このタンパクを清澄化した上清中に保持することをもたらす。

粗製品からのＭＩＲＰはＣＭ−セファロースへ結合し、そしてＮａＣＪ！の勾配を使用してｆ４離することができた。陽イオン交換樹脂へのＭＩＲＰの結合は要イオン洗剤ＣＴＢの存在下においてさえも発生した。該タンパクは約１５０ｍＭＮａＣｅにおける単一ピークとして９．０ないし１０．０のｐＩを持つタンパク ■のそれに類似であった。

の境界により実質上富化されているように見えた。しかしながら見Ｈ）け分子量２０．０００ないし３２，０００を持った少量の夾雑タンパクがＭＩ　ＲＰ含有分画に付属する。これらタンパクの存在は調製物毎に変化する。Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８４前出）は、ＭＩＲＰの精製に使用したのと同じカラムマトリックスを使用してタンパク■を単離した。

タンパク■は分子量２４　、０００ないし３０，０００を持つと報告されている。Ｓｗａｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉａ＋ｍｕｎ、　２１　：　２９２−３０２　（１９８５）　、従って夾雑タンパク■は本発明に従ったＭＩＲＰの精製に問題を提供する。

従ってできる限り、タンパク■分子による汚染はもとの接種菌に透明な微生物を使用して避けるべきである。しかしながら、夾雑タンパクは分子ふるいクロマトグラフィーによって通常除去することができる。さらに、ゲル口過分析はＭＩＲＰがモノマーとして溶離されることを示す。タンパクＩは洗剤ミセルと相互作用するトリマーとして存在することが以前報告された。前出Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２゜タンパク■も洗剤ミセルと相互作用するが、しかしモノマーとして溶離する（Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ＋前出、　１９８４）　、淋菌ＭＩＲＰは洗剤ＣＴＢまたはツビフクージエント３−１４のどちらのミセルとも相互作用するようには見えない。

ＭＩＲＰの高度に電荷した性質は等電集束法によって分析された。

塩基性タンパクについての等電点決定における困難性は良く文献に出ている。われわれの系においては、ＭＩＲＰは９．３５より少し大きいｐｒを持っていた。

しかしながら正確な等電点は決定されなかった。ＭＩＲＰの塩基性性質の他の証拠はｐ　Ｈ８，０におけるＣＭ−セファロースとのその相互作用であった。加えて、アミノ酸組成はＭＩＲＰの最初の５個のアミノ酸はタンパク■の最初の５個の残基と類似である。ＭＩＲＰの６３個のＮ−末端アミノ酸残基の水和分析は、それは比較的親水性セグメントであることを示した。Ｎ−末端の主要疎水性セグメントは、残基１５と３０の間にあるように見える。アミノ酸組成からのデータは、このタンパクはタンパクＩおよびタンパク■の両者よりも、芳香族アミノ酸の比率が低いことを示す。

Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＭＩＲＰは先行技術において検査したすべての株に共通であると報告されている。

ＭＩＲＰ特異性ウサギ抗血清およびネズミモノクロナール抗体が調製され、そしてＮｅ１ｓｓｅｒｉａｌｉのメンバーの中のＭＩＲＰの抗原性保存の分析に使用された。結果は、似た見掛は分子量を持った抗原的に関連した鉄調整タンパクがＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、　Ｎ、　ｂａｃｔａｍｔｃａおよびＮ、　ｃｉｎｅｒｅａのすべての株にσ在することを示す。しかしながら、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ属の残りの非病原性種は同様なタンパクを発現しない。特に病原菌Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓにＭＩＲＰの存在は、このタンパクは病原性と関連していることを強く示唆する。ＭＩＲＰは環境中に利用し得る鉄の欠乏に応答して淋菌によって明らかに産生されるので、このタンパクは淋菌鉄摂取系の機能的成分であると予想することはもっともらしい。

Ｓｉ＋ｎｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３６　：　１０７−１１３　（１９８２）は、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる鉄摂取の研究において、鉄欠乏髄膜炎菌からの膜を５９Ｆｅクエン酸塩とインキュベートする時、鉄の大きない割合が見掛は分子１ｉ３６，５００を持つタンパク複合体と結合して残ることを決定した。抗原的に淋菌ＭＩＲＰに関連する髄膜炎菌の鉄調整タンパクがこの結合に関与するかどうかは分析されていない。反対にＳｉｍｏｎｓｏｎによって実施されたのと類似の実験は淋菌について試みられていない。しかしながら、淋菌および髄膜炎菌の両者は、ＭＩＲＰのような保存されたタンパクが役割を果たすことができる似た鉄摂取系を有するかも知れない。ＭＩＲＰの本発明の精製品の入手可能性はこの可能性のそれ以上の追求を容易にするであろう。

実質上純粋な形における淋菌ＭＩＲＰの単離は、感染したヒトにおけるＭＩＲＰ特異性免疫グロブリンを測定する免疫学的アッセイにおいて純粋のＭＩＲＰを使用するため、このタンパクは感受性宿主にＮｅ１ｓｓｅｒｉａの病原性種に対する抗体の産生を刺激するとの決定を可能にした。非感染のヒトはＭＩＲＰ特異性免疫グロブリンを欠き、それによってＭＩＲＰの免疫原性を確認させる。

ＭＩＲＰがそのような抗体産生を刺激するとの発見は、感受性宿主がそれからＭＩＲＰが単離された特定の病原性種ばかりでなく、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａの他の病原性種による感染に対しても免疫化できるとの発見を可能にした。

さらに考究することなく、当業者は以上の説明を用いて本発明をその全範囲において利用することができるものと信じられる。それ故以下の好ましい特定の実施例は単に例証であり、開示の残部の限定ではないと解すべきである。

以上のテキストおよび以下の実施例において、すべての温度は見禎正の摂氏で述べられ、そしてすべての部およびパーセントは特記しない限り重量による。

訓二−−−製ｘｇ、ｈｖ−−１％（ｖ　／　ｖ　）　Ｉｓｏ　Ｖｉｔａｌｅ−Ｘ　（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）および０．５％（Ｗ／Ｖ）グルコースを補強したＧＣ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ。

Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を淋菌の日常的保存のために使用した。培養物は００２４％を含む給温した雰囲気中３７℃で発育させた。以前に記載した基本的液体培地を生物の発育のために使用した。Ｍｉｅｔｚｎｅｒ　ｅｔ　ａＬ　（１９８４）前出。原子吸光分光分析は、この培地は約８．０μＭ鉄を含有することを示した。

培地中の遊離鉄を減らすため、デスフエラルメシレート２５μＭ（チバガイギー社）を添加した。淋菌はこのキレータ−へ結合した鉄を除去することができず、このため理論上はこの生育培地中の遊離鉄は過剰のデスフエラルのため制限される。この培地を低鉄分培地と呼ぶ。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アクリルアミド、２−メルカプトエタノール、尿素、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのための分子量標準、およびブロモフェニルブルーはカリフォルニア州すッチモンドのＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩基（トリスバッファー）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＢ）、）リドンＸ −１００，フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）はミズリー州セントルイスのシグマケミカル社から、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＰＥＳバッファー）はオハイオ州クリーブランドのリサーチ、オーガエックス社から、ＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲ−２５０（ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー）はメリーランド州ベセスダのベセスダ、リサーチ、ラボラトリーズから、ツビソクタージェント３−１４はカリフォルニア州うホヤのカルビオケム社から、カルボキシメチル（ＣＭ）−セファロースＣＬ−６Ｂ、セ、フアクリルＳ −３０００，ゲル口過分子量標準、およびｐｉ積標準ニューシャーシー州ビス力タウエイのファルマシア社から入手した。他のすべので薬品は試薬級であった。

バ　−１７および　すべての精製操作および後の実験は、ＭＩＲＰ源として、ｌｉ、Ｐ、　Ｗｉｌｌｉａｎ＋ｓ　（Ｂａｙｌｏｒ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

Ｈｏｕｓｔｏｎ、　Ｔｅｘａｓ）によって提供されたＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　Ｆ６２株を使用した。この株の透明（Ｏｐ”−）、非毛化＜ｐ−＞変異株を選択し、接種菌をＧＣＣ寒天培地上２詩からの淋菌を収穫し、そして低鉄分培地中に懸濁した。この懸濁液を同じ培地５０献を含む３　０　０ｄネフエロメーターフラスコにュージャージー州パインランドのベルコ、グラス社）を約２　５　Ｋｌｅｔｔ単位（隘５４フィルターを備えたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ　比色針を用いてモニターする時）の密度へ接種するために使用した。濁度は旋回シェーカー中３７℃でのインキュベーションの間間隔を置いて測定した。中期対数フェーズに達した時、これら懸濁液は低鉄分培地に１：ｌＯに希釈された。培養は培養物が後期対数フェーズ（１００ないし１　２　０　Ｋｌｅｔｔ単位）に達するまで継続され、その時細胞が遠心（１０．０ＯＯｘ　ｇ，　１　０分間．４℃）によって収穫された。

′−゛シル、ト１ウムーポＩアク１ルアミ゛ル°　°（ＳＤＳ二Ｐ人ｌ　５ＤＳ −ＰＡＧＥは前記ゲルと、Ｌａｅｍｍｌｉ．　Ｕ．に、＋Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−５　（１９７０）記載のバッファー処方を使用して実施した。解像ゲルは１０％アクリルアミド（Ｗ／Ｖ）よりなり、そしてＭｉｅｔｚｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ＋　（１９８４）前出に記載されているようにＮａＣｌ２７０１を含有していた。すべてのタンパク測定はＭａｒｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．　８７　：２１０　（１’９７８）の方法を用いて実施した。

タンパク濃度は６２．５ｍＭ）リスバッファ＋，ｐＨ６．８．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。

１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェニルブルー、および５％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノールよりなる最終サンプルバッファー中１■／献へ調節された。希釈後、サンプルは１００℃へ加熱され、５分間保持された。電気泳動は長さ１４０鶴および厚さ２１のスラブゲルを用いて実施された。一定した電流（１６ｍＡ）が−夜室温でゲルへ印加され、そして電気泳動は染料先端がゲルの底へ達した時に打ち切られた。ゲルは水：メタノール：酢酸（５　：　５　：　２）中Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー０．１％（Ｗ／Ｖ）溶液中２〜１２時間で染色された。１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸溶液がゲルの脱色に使用された。代わりに、ゲルはＴｓａｉ　ａｎｄ　Ｆｒａｓｃｈ，　Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１９：　１１５−６　（１９８２）の銀染色法により、過ヨウ素酸塩酸化工程を省くことによって修飾して染色された。染色の発色はエタノール１０％（Ｖ／Ｖ）および酢酸５％（　ｖ　／　ｖ　）を含有する溶液を用いて打ち切られた。

ｍ　培地１！から採取したバクテリアはデービスＡ規定培地（Ｄｉｒｃｏ　）で１回洗浄した。細胞ペレットは０．　１％（Ｖ／Ｖ）プロテアーゼ阻害剤（１　０　ｍＭ　ＰＭＳＦイソプロパツール中）を含有する１　０　ｍＭ　ＰＥＰＥ５バフフアーｐＨ　７．　４の１００献中に懸濁した。５減の部分標本を高強度ソニファイア−（コネチカット州スタムフォードのプランソン、インスツルメンツ社）を用いて全部で１分間超音波処理にかけた。この懸濁液を４８．０００　Ｘ　ｇで６０分間遠心した。ベレットは細胞膜について富化され、上清は主として可溶性タンパクを含んでいた。膜および上清分画はそれぞれに含まれるＭＩＲＰの割合について５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。

゛　かＭＩＲＰの゛　・可°パ膜分画に結合しているＭＩＲＰは洗剤ＣＴＢを使用して選択的に可溶化された。

洗剤対膜タンパクの最適比は以下のようにして決定された。粗製膜をプロテアーゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７，４（７）１０戚で１回洗い、遠心（４８，０００ｘ　ｇ、６０分、４℃）によってペレット化した。ベレットは１０ｍＭ）リスバッファーｐＨ８，０中に最終相細胞膜濃度１■／淑に懸濁した。

この粗膜懸濁液のＩｄ部分標本へ最終濃度０．８％（ｗ／ｖ）までの増加するＣＴＢの量を加えた。洗剤／膜混合物を室温で２０分間インキュベートし、４８．０ＯＯＸ　ｇで６０分間（室温）遠心によって不溶分を除去した。上清の等量を可溶化ＭＩＲＰについて５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。洗剤対クンバクの最適比は、すべての膜へ結合したＭＩＲＰを可溶化するＣＴＢの最低濃度として定義された。

ＭＩＲＰ−ｖ　の　超音波処理した全細胞からのベレットを最終タンパク濃度１ ■／ばへ希釈し、ＣＴＢを最適洗剤対タンパク比へ加えた。室温において２０分間インキュベーション後、可溶化タンパクを遠心（４８，０ＯＯＸ　ｇ　、６０分、室温）によって分離した。

上清はＭＩ　ＲＰが富化され、膜結合ＭＩＲＰの粗調製物と呼ばれた。

同様な方法が超音波処理された全細胞の上滑分画と結合したＭＩＲＰに富む調製物を得るために使用された。上清分画は１０＋ｎＭ）リスバッファー、ｐＨａ、ｏ中に最終タンパク濃度１■／献へ希釈された。この懸濁液へ、ＣＴＢ　（最終濃度Ｏ，ＯＳ％）が加えられ、これは白色沈澱の生成を生じた。この混合物を室温で２０分間インキュベートし、そして沈澱を４８，０ＯＯＸ　ｇにおいて６０分間（室温）遠心によって除去した。得られた上清はＭＩＲＰが富化され、そして可溶性ＭＩＲＰの粗調製物と呼ばれた。

イオン六　クロマトグーフィー　イオン交換クロマトグラフィーによるタンパクの分離は陽イオン交換ゲルマトリックスＣＭ−セファロース６Ｂ−ＣＬを使用して実施された。２５０ｘｍＸ２０璽璽のカラムは、ＣＭ−セファロース６Ｂ−ＣＬを０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨの２ベツド容積で、そして次に０．０５％（Ｗ／Ｖ）ＣＴＢを含有する１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８，０）中のＩＭＮａαの２ベツド容積で洗浄することによって準備された。カラムは次に０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＴＢを含有する１０ｍＭ）リスバッファーの５ベツド容積で平衡化された。粗ＭＩＲＰｉ製物をカラムへ適用し、カラムと相互作用しないすべての物質が溶離するまで最終平衡化バッファーで洗浄した。最終平衡化バッフブーの総容積５００減中のＯないしＩＭのＮａ便勾配がカラムからタンパクを溶離するために使用された。カラム流量は２０ｍ１／時に維持され、溶離プロフィルはインラインＵＶ−２モニター（ファルマシア）を用いて２８０ｎｍにおける吸収によって追跡された。

４献の分画が集められた。

ふるいクロマトブーツ　−　セファクリルＳ−３００がゲル口過クロマトグラフィーに使用された。８５０１１ｍＸ２０ｍのカラムが平衡化され、そしてタンパクは０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＴＢおよび０．３Ｍ　Ｎａαを含有する１０ｍＭ）リス、ｐＨ８，０で溶離された。代わりに：ゲルロ過は前出Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）に記載されたツビッタ−ジエン）　３−１４含有バツフアー中に用いられた。分子ふるいクロマトグライー用のサンプルはそれぞれの溶離バッファー中で一夜透析された。２献容積中の透析したタンパクはカラムへ適用され、そして流量は３０献／時に維持された。２．　ＯｖＪｌＯ分画が集められ、２８０ｎｍにおけるタンパク吸収が追跡された。使用した分子量標準はフェリチン（４４０，０００ダルトン）、カタラーゼ（２３２’、　０００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６７、ＱＯＯダルトン）、卵アルブミン（４３，０００ダルトン）、キモトリプシノーゲンＡ　Ｃ２５，０００ダルトン）、およびリボヌクレアーゼＡ　（１３，７０００ダルトン）であった。Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのタンパクＩはＢｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）前出によって以前記載されたように精製された。

（したＭＩＲＰと±＾した　の　精製したＭＩＲＰはガス液体クロマトグラフィー（Ｇ　Ｌ　Ｃ）によって共有結合した脂肪酸またはしっかり会合したりポポリサンカライド（ＬＰＳ）の存在について分析された。使用した方法はＪａｒｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　Ｐａｒｉｓｉｔｏｌ、　２　：　１８７−９６　（１９８１）によって記載された操作の改良法であった。精製ＭＩＲＰ調製物は総タンパク１■／ｄへ希釈され、１０１トリス、ｐＨｓ、ｏ中の０．０５％ＣＴＧＢに対して透析され、凍結乾燥された。調製物（タンパク２５０μｇ）を蒸留水２００ｐｌ中に再水性化し、クンバクを氷冷したアセトンｌｄの添加によって沈澱した。−２０℃において１５分間インキュベーション後、懸濁液を４８，０００　Ｘ　ｇにおいて２０分間遠心にかけた。上清を除き、沈澱を窒素気流下乾燥した。加水分解はベレットを４ＮＩ（Ｃｉに懸濁し、１００℃で５時間加熱することによって実施された。加水分解物を窒素気流下蒸発した。残渣をＢＦ３　／メタノール１献を加えるこ後懸濁液をヘキサン：クロロホルム（４：　１）　１．０ｍ２で２回抽出した。相分離後へキサン：クロロホルムを除去し、合体し、そして窒素下蒸発した。クロロホルム（１０μｍ）を残渣を再懸濁するために用いた。サンプルは前出のＪａｒｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌにより記載されたように、火焔イオン化検出器およびＳＰ　２１００ガラスカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ。

ペイシルベニア州ベルフォンテ）を備えたヒユーレットパフカード５８４０Ａ　レボ−ティングガスクロマトグラフを用い、ＧＬＣによって分析された。バフファーによって寄与する脂肪酸をコントロールするため、タンパクを欠く同じ調製物が分析された。

ＩＦ５束　等電集束はＬａａｓ　ｅＬ　ａｌ、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　１０１　：　４４９−４６１　（１９８０）によって記載された方法を用いて実施された。タンパクサンプルは６Ｍ尿素および０．０１％トリトンＸ− １００を含有する、１０ｍＭ）−リスバッファ−、ｐＨ７，２に対して透析された。３．５ないし９．５のアンフォリン混合物（Ｌ　Ｋ　Ｂ、スウェーデン国ブロマ）を含有するあらかじめ注いだそのままのボアクリルアミドゲルが使用された。等電点の決定は既知ｐｌ値を有する標準タンパクの混合物を用いることによってなされた。

アミノ　およびＮ−１アミノ酸組成およびＮ末端配列分析に使用するためのサンプルは、ＭＩＲＰの膜結合分画から調製された。ゲル口過カラムからの精製調製物は濃縮され、そして蒸留水の２回交換に対して４℃において４８時間透析された。この工程は沈澱の形成を生じ、それは遠心によって除去された。上清分画はもとのサンプル中の総タンパクの６０％を保持した。ＭＩＲＰのアミノ酸組成は、排気したシールしたチューブ中１１５″Ｃにおいて２２．４８．７２および９６時間４Ｎメタノール−スルホン酸中の加水分解（Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５１　：　１９３６−１９４０　）によって決定された。セリンおよびスレオニンに対する値は０時間への補性法によって加水分解中の分解について修正された。ロイシン、イソロイシンおよびバリンについての値は無限時間への補性法によってペブタイド結合の遅い加水分解について修正された。半分のシスチンおよびメチオニンは過ギ酸酸化の後、システィン酸およびメチオニンスルホンとしてそれぞれ測定された。

自動化されたＥｄｍａｎ分解は、ポリプレンと組合わせたベックマン、インスツルメンツの改良したＱｕａｄｒｏｌプログラム（ｍｏｏ１１５７６　）を用いて、ベックマン８９０Ｃシーケンサ−（カリフォルニア州パロアルト、ベックマン、インスッルメンツ社）で実施した。アミノ酸のチアゾリノン誘導体は８０℃で１０分間１．ＯＮ　ＨＣｌ２でＰ番目誘導体へ変換された。Ｐ番目アミノ酸はＨＰＬＣで同定され、そしてガスクロマトグラフィーおよび／または薄層クロマトグラフィーで確認車止■上ＭＩＲＰの　および　離低鉄分培地中に発育させた淋菌を超音波処理によって破壊した。

遠心後ペレットおよび上清分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＭＩＲＰの存在について分析した。

銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を淋菌ＭＩＲＰの単離に使用した精製工程の生成物について、すなわち全細胞超音波処理物の５μｌから得られたクンバクプロフィル、超音波処理した全細胞からのそれぞれ５μｌの粒状物および可溶性分画のタンパクプロフィル（遠心から得られたペレットを可溶性分画と同じ容積に懸濁した）、それぞれ膜結合および可溶性ＭＩＲＰからの粗調製物のタンパクプロフィル（これら調製物は超音波処理した全細胞からの可溶性および粒状分画を抽出バフファー（トリス、ｐＨ８，０中０．０５％ＣＴＢ）へ１■／ｄに希釈した後得られた。両袖出物３０μ！容積が分析された）、およびイオン交換クロマトグラフィー後（タンパク濃度１５μｇが各ウェルへ負荷された）粗膜結合ＭＩＲＰおよび粗可溶性ＭＩＲＰそれぞれのプールした分画について行われた。

記載した条件において、超音波処理した細胞中に存在するＭＩＲＰの有意割合は上清分画中に見出され、そして６０．０００　Ｘ　ｇにおける９０分の遠心に対して抵抗した（データは示さない）。粒状物分画と結合したＭＩＲＰは、ペレットのその後の洗浄は該タンパクのＭＩＲＰは、超音波処理した全細胞の粒状物分画へセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＢ）２％（Ｗ／Ｖ）の添加によって完全に可溶化された。この粗膜分画中の他のタンパクはこのＣＴＢ濃度では部分的にだけ可溶化された。それ故、粒状物分画からＭＩＲＰを選択的に可溶化するＣＴＢの低濃度の能力が、ＭＩＲＰの可溶化に際しＣＴＢの増大する濃度（０％ないし０．８％、ｗ／ｖ）を使用して検討された。ＭＴＲＰの殆ど全部がＣＴＢ濃度０．０５％（Ｗ／Ｖ）において可溶化された。従って、０．５　（Ｗ／Ｗ）の洗剤対タンパク比が粗膜結合ＭＩＲＰの製造に使用された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥがＣＴ　Ｂ　（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色）による淋菌ＭＩＲＰの選択的可溶化になされた。粗膜は前記のようにＣＴＢの存在下濃度（％ｗ／ｖ）０．００１２５，０．０２５．０．０５．０．１゜０．２，０．４および０．８においてインキュベートされた。遠心により不溶物の分離後、等容積（５０μｌ）が分析された。ＣＴＢ＃ｊ度０゜０１２５％および０．０２５％において、ＭＩＲＰは選択的に可溶化されるように見えた。ＣＴＢｆＭ度０．０５％（Ｗ／Ｖ）において、膜結合ＭＩＲＰの殆どすべてが可溶化された。使用した条件において、この濃度は洗剤対タンパク比０．５　（Ｗ／Ｗ）に相当した。後の精製工程はこの比を使用した。

同じ洗剤対タンパク比を使用して、超音波処理全細胞の可溶性分画から似た粗調製物が得られた。洗剤の添加は白色沈澱を生成し、それは遠心によって除去された。得られた上清はＭＩＲＰが富化された。

粗調製物はＣＭ−セファロース６Ｂ−ＣＬを使用するイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製された。このサンプルはＭＩＲＰを抽出するために使用されたバッファー（０，０５％ＣＴＢを含有する１０ｍＭ）リスバフファー、ｐＨ８，０）に適用することができた。

ｐＨ８，０において、このタンパクの大部分はカラムマトリックスに結合せず、そして空容積中に溶離された。

粗調製物からＭＩＲＰを精製するために使用されたＣＭ−セファロースカラムの溶離像は、サンプルを適用後、カラムを総バッファー容積５００ｍｔ’中０ないしＩＭのＮａＣ１２勾配で溶離することによって得られた。分画（４減）が勾配の最初の半分を通過した後に集められた。溶離バッファーの導電率が追跡された。ＭＩＲＰは導電率１１　ｍＭｈｏにおいて単一ピークとして溶離され、これはＮａＣｌ１濃度１５０１に相当した。０ないしＩＭのＮａＣＪｌ勾配をカラムへ適用する時一つの主要ピークが解像された。ピンク色がこの主要ピークを含む分画に付属した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、感光性銀染色によって可視化する時、このピークはいくつかの少量の夾雑タンパクと共に、単一の主要バンドとしてＭＩＲＰを含むことを示した。ＭＩＲＰ含有ピークをプールし、バッファー（トリス、ｐＨｓ、ｏ中０．０５％ＣＴＢ）に対し透析し、そて凍結乾燥によって濃縮した。このバフファーに対する透析はサンプルに付属したピンク色を除去もしくは減らさなかった。全細胞超音波処理物の可溶性または粒状物分画から単離されたＭＩＲＰ間に溶離像の差は観察されなかった（データは示さない）。

後の単離において、両方の全細胞超音波処理物からの粗抽出物はイオン交換クロマトグラフィ一工程のためにプールされた。ＣＴＢの成分゛に関連した拡散ピークは勾配中にもっと後で解像された（データを示さない）。それ故、分画はＮａ（Ｊ２勾配の最初の半分を通って集められた。

夾雑タンパクを除去するため、プールしたＭＩＲＰ含有分画をセファクリルＳ− ３００を使用するゲル口過へかげた。このサンプルを凍（ｐＨ８，０）、０．０５％ＣＴＢ、および３００ｍＭＮａＣｅよりなる溶離パンファーに対して透析した。透析した調製物をセファクリルＳ−３００カラムに適用し、テキストに記載されているようにクロマトグラフした。カラムの較正のために以下の分子量標準が使用された。

フェリチア、　４４０，０００ダルトン（４４０Ｋ　）　：カタラーゼ、　２３８．０００ダルトン（２３２Ｋ）：ウシ血清７）Ｌ／ブミ７．６７．０００ダル）　：／　（６７）［）；卵アルブミン、　４３，０００ダルトン（４３Ｋ）；キモトリプシノーゲンＡ、　２５’、ＯＯＯダルトン（２５Ｋ）；およびＩＪポｌＬ、？−ゼＡ、　１３，０００ダルトン（１３Ｋ）。ＶｏおよびＶｔはそれぞれブルーデキストランおよびビタミンＢ１２を使用して決定された。ＭＩＲＰ含有ピークは、溶削バッファーが１０ｍＭ１−リス（ｐＨ８，０）、０．０５％ＣＴＢおよび３００＋＋＋ＭＮａＣ１からなる時０．６のＫａｖを持っていた。このＫａｖは２６，０００と３２．０００ダルトンの間の分子量に相当した。ゲル口過後、ＭＩＲＰ含有分画は、ＳＤＳ、−ＰＡＧＥによって分析し、そして感光性銀染色を使用して可視化する時、単一バンドの境界によって純粋であるように見えた。ゲル口過後の精製したＭＴＲＰ含有分画の１０μｇサンプルの銀染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを調製し、ＭＩＲＰの単離のために使用した出発原料である、全淋菌のタンパク像と比較した。夾雑タンパクは前者の調製物中に検出されなかった。タンパクＩは、５０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）　、０．０５％ツビソタージェント３−１４．１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および２００ｍＦＮａ便よりなる溶離バフファーを使用する時、洗剤ミセルと結合したトリマーとして溶離することが報告されている。Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）前出。

比較のため、ＭＩＲＰ含有分画をこのバッファーに対して透析し、ゲル口過によって分析した。これら条件におけるＭＩＲＰ含有分画のＫａｖはＣＴＢ含有バッファーを使用して得たものと同じであった（データは示さない）。タンパク■はこれらの条件において、Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）前出によって報告された値にイ以て、分子量１８８，０００に相当するＫａｖで溶離された。この操作を使用するＭＩＲＰの最終収率はＮｏｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによるこのタンパクの発現の程度に依存した。典型的には、低鉄分培地中に発育させた微生物１０１からＭＩＲＰＩＯないし２０■を単離することができた。これは総細胞タンパクの１ないし３％を表す。

等点集束　精製したＭＩＲＰ調製物を３．５ないし９．５の両性電解質勾配を用いる等点集束法によって分析した。

超音波処理した全細胞の可溶性および粒状物分画から単離した精製ＭＩＲＰの等電集束は、陰極近くの同じ位置へ移動するように見えた。この分析のため、めいめいの精製したタンパク調製物２０μｇを集束した。使用した条件において、ＭＩＲＰはｐｒ標準トリプシノーゲン（９，３５）よりも陰極の近くへ移動するように見えた。

胆肱佼分捉　最近、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ中のプロテオリビフドの存在の証拠が報告された。Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ″＾ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｗａｓｈ、　Ｄ、Ｃ，（印刷中）。われわれは精製したＭＩＲＰ加水分解物を脂肪酸の存在について分析した。使用した条件では、この分析においてβ−ヒドロキシ脂肪酸の不存在は、ＬＰＳの検出し得るレベルは精製したタンパクに結合していないことを示唆した。このアッセイにおける感度レベルは、理論的には脂肪酸の１００％回収を仮定してタンパク１分子当たり脂肪酸１分子を検出することができた。

ヱ土込敗組戒　淋菌ＭＩＲＰの推定アミノ酸組成を表１に示す。

表Ｉは二つの異なるタンパク１分子およびタンパク■分子の公表されたアミノ酸組成を含んでいる。ＭＩＲＰのアミノ酸組成は性質上タンパクＩおよびタンパク ■の組成に似ている。しかしながら、個々のアミノ酸の分布は独特である。特に、ＭＩ　ＲＰは、タンパク■およびタンパク■よりも、比較的少ない芳香族アミノ酸と多数のプロリン残基を含んでいる。さらに、ＭＩＲＰはタンパクＩよりも高いがタンパク■よりも低い塩基性アミノ酸の割合を含んでいる。

Ｎ−アミノ　１　淋菌ＭＩＲＰのＮ−末端アミノ酸配列を表■に示す。この配列は表■において他の公表された淋菌外膜タンパクのＮ−末端アミノ酸配列と比較される。淋菌ＭＩＲＰからのＮ−末端残基の分析はアスパラギン酸およびリジンをそれぞれ２．２：１のモル比で検出した。すべてのその後の残基は単一アミノ酸として検出した。ＭＩＲＰおよびタンパク■のＮ−末端からの最初の５個の残基は殆ど同一であった。５個のうち３個は同じで、二つのミスマツチしたアミノ酸はＤＮＡコードにおける保存変化を表した。

淋菌ＭＩＲＰ、タンパクＩまたはタンパク■との間には他の明らかな同族性は観察されなかった。

実施例２精製したＭＩＲＰ１００■を５０＋＋＋Ｍ）リスエタノールアミン。

５　ｍＭ　Ｍｇ（ｊ！ｚおよび１００　ｍＭ　ＫＣＪｌ、ｐ　Ｈ８，５中に懸濁せよ。同じバッファー中の選択した抗原性ポリペブタイド、例えば淋菌ビリンタンパクの残基４８ないし６０に相当するペプタイドの等モル量を加えよ。５ｃｈｏｏｌｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５９　：　１３５１　（１９８５）およびＲｏｔｈｂａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０　：　２０８−２２１　（１９８４）を見よ。

同じバソファーヘジメチルアジビイミデート２０■／献を加えることによって架橋が開始される。２３℃において３０分インキュベートし、０．１Ｍ塩化アンモニウムの存在下追加の１５分間インキュベーションによって停止せよ。結合した生成物をゲルクロマトグラフィーにより、例えばＭＩＲＰの精製に使用したそれによって単離せよ。

実施例３本発明のＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから単離した凍結乾燥したＭＩＲＰ５０ μｇを無菌のパイロ−ジエン不含水２ｒｌに溶解し、感受性の成人に筋肉内注射せよ。１月後のＭＩＲＰに対する抗体の測定は、Ｎ。

ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染に対する免疫レベルを示すであろう。

（以下余白）以上の実施例は、以上の実施例に使用したものを、一般的にまた特定的に記載された本発明の反応剤および／または作業条件で置することによって類似の成功度をもって繰り返すことができる。

以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることがき、そしてその精神および範囲を逸脱することなく、本発明を種の用途および条件に適応させるため種々の変更および修飾をするとかできる。

補正書のほん訳文提出書昭和６２年　６月７２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．単離された免疫特異性の抗原的に純粋な形にある、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性種の主要鉄調整タンパクであって、該タンパク（ＭＩＲＰ）の淋菌同族体は約３７，０００ダルトンの分子量を有し、かつ明細書の表ＩおよびＩＩに述べた像とそして最初のアミノ酸配列を持つ約３４０のアミノ酸より構成されていることを特徴とする前記タンパク．
２．前記種はＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである第１項記載のタンパク。
３．薬剤学的に許容し得る担体との混合物中に、そのタンパク性抗原成分として、第１項のタンパクを含有することを特徴とする感受性宿主に病原性種に対する抗体の保護レベルの産生を刺激するのに有効なＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性種に対するワクチン。
４．ＭＩＲＰはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ種からのものてある第１項のワクチン。
５．前記タンパクによって感受性宿主に刺激された抗体産生を増強するのに有効な薬剤学的に許容し得るアジュバントをさらに含んでいる第１項のワクチン。
６．前記アジュバントは水酸化アルミニウムゲルである第１項のワクチン。
７．前記ＭＩＲＰは淋菌ピリン分子のまたは淋菌タンパクＩの共通抗原性域を含むポリペプチドアミノ酸配列へ化学的に結合している第１項のワクチン。
８．第１項のワクチンの免疫学的に有効量を感受性哺乳類へ投与することよりなる、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性種による感染に対して感受性哺乳類を免疫化する方法。
９．哺乳類はヒトである第８項の方法。
１０．ワクチンのＭＩＲＰはＮｅｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのものである第８項の方法。
１１．ワクチンのＭＩＲＰはｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ種からのものである第８項の方法。
１２．ワクチンは筋肉内投与される第８項の方法。
１３．ワクチンは皮下投与される第８項の方法。
１４．哺乳類はヒトであり、ワクチンのＭＩＲＰはＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ種からのものであり、そしてワクチンは注射によって投与される第８項の方法。
１５．ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性種の細胞を鉄欠乏バクテリア培地に培養し、ｂ）そのように発育させた細胞を収穫し、ｃ）細胞を破壊し、ｄ）細胞の可溶分を不溶分から分離する諸工程を含む前記病原性種のＭＩＲＰを製造する方法において、ｉ）破壊した細胞の不溶分からＭＩＲＰを陽イオン界面活性剤水性媒体で可溶化することと、ｉｉ）残存する夾雑物をクロマトグラフィー分画によって除去し、それによってＭＩＲＰを免疫特異性の抗原的に実質上純粋な形に単離することを特徴とする改良。
１６．界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロマイドである第１５項の方法。
１７．界面活性剤は界面活性剤対タンパク重量比約０．２５ないし０．７５において使用される第１５項の方法。
１８．クロマトグラフィー分画はカチオン交換クロマトグラフィーにより、続いてゲルロ過によって実施される第１５項の方法。
１９．ＭＩＲＰは破壊した細胞の可溶分から、該可溶分のバッファー溶液から余分の物質をｐＨ約８においてそして界面活性剤対総タンパク重量比約０．２５ないし０．７５においてカチオン界面活性剤で選択的に沈澱することによって単離される第１５項の方法。