NO302949B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av pyridoksylert hemoglobin - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et pyridoksylert, modifisert hemoglobin. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en slik fremgangsmåte som er enklere å utføre enn de tidligere kjente fremgangsmåter.

Hemoglobin er det oksygentransporterende protein i de røde blodlegemer og utgjør ca. 30% av cellen. Proteinet omfatter fire enheter, to a-enheter og to p-enheter, som er bundet sammen til en tetramer inne i cellen. Inne i det røde blodlegeme holdes hemoglobinet som en tetramer av to a-kjeder og to p-kjeder. Når det foreligger fritt i plasma, dissosierer hemoglobinet, og to dimerer (a og p) bindes til haptoglobin. Fritt hemoglobin i plasma vil straks tre ut av sirkulasjon, med en halveringstid på ca. 3 timer.

Affiniteten til oksygen moduleres av pH-verdien, C02-konsentrasjonen og forbindelsen 2,3-DPG (2,3-difosfoglyserat), som kun er tilgjengelig inne i det røde blodlegeme. Utenfor cellen er hemoglobinets affinitet for oksygen høy, og derfor er evnen til å overføre oksygen til vevet liten. Antigener som er bundet til celleveggen som omgir hemoglobinet, bestemmer slike faktorer som blodtype, Rh-faktor og andre faktorer. Cel-leveggrestene som fås etter lysis betegnes stroma.

Erstatninger for røde blodlegemer er under stadig utvikling for bruk som oksygentransporterende fluider. I "Blood substitutes", utgitt av Thomas M.S. Chang&Robert P. Geyer; Marcel Dekker Inc. NY 1989 (ISBN 0-847-8027-2) finnes en sammenfatning av situasjonen i dag.

Det har lenge vært kjent at hemoglobin utenfor cellen har oksygentransporterende egenskaper og kan gis til pasienter uansett hvilken blodtype de måtte ha. Imidlertid dissosierer hemoglobin i kroppen i to a-p-enheter, som gir opphav til funksjonsforstyrrelser i nyrene. Skjønt disse funksjonsforstyrrelser er reversible, kan de være meget alvorlige for pasienter som allerede befinner seg i en svekket tilstand. Også andre bivirkninger vites å forekomme.

W.R. Amberson (Biol. Rev. 12, p.48 (1937) benyttet hemolysater av røde blodlegemer som en bloderstatning. Denne var nefrotoksisk. Rabiner et al. (J. Exp. Med. 126, p. 1127

(1967)) antok at denne uheldige virkning skyldes tilstede- værelse av stromarester. Imidlertid hadde også stromafri hemo-globinoppløsning virkninger på nyrene og viste seg å gi en

forbigående minskning i creatininutskillelsen og i urinvolumet (G.S. Moss et al.; Surg Gynecol Obstet 142, p.357 (1976); DeVenuto et al.; J. Lab. Clin. Med. 89, p.509 (1977) og Savitsky et al.; Clin. Pharm. Ther. 23, p.73 (1978)).

Forskjellige typer modifikasjoner av hemoglobinmolekylet er blitt beskrevet i Methods in Enzymology vol. 76 (Hemoglobins); utgivere S.P. Colowick, N.O. Kaplan, Academic Press NY (1981). Benesch et al beskriver i Biochemistry vol. 11, nr. 19, p. 3576-3582 (1972) den modifikasjon som det er vanligst å benytte for å nedsette affiniteten til oksygen, nemlig innlemmelse av pyridoksal-5'-fosfat. Dette stabiliserer hemoglobinmolekylet i en konfigurasjon som ligner hemoglobin-DPG-komplekset (difosfoglyseratkomplekset) inne i det røde blodlegeme. I den senere tid er bis-pyridoksaltetrafosfat blitt benyttet for denne type modifikasjon (P.E. Keipert, A.J. Adenican, S. Kwong & R.E. Benesch, Transfusion 29, p.768-773

(1989)).

Også andre forbindelser, f.eks. inositol-heksafosfat kan benyttes for å modifisere hemoglobin for å oppnå et produkt med lavere affinitet til oksygen.

I US patentskrifter nr. 4.001.200, 4.001.401, 4.053.590 og 4.061.736 har Bonsen et al pekt på forskjellige metoder til å øke hemoglobinets molekylvekt og dermed ytterligere stabilisere strukturen for å øke den tilsynelatende halveringstid for bloderstatningen på basis av hemoglobin.

Et ytterligere problem ved administrering av hemoglo-binpreparater er knyttet til det absolutte krav om at disse preparater må være frie for mikroorganismer og vira. Spesielt har det vist seg at vira kan overføres fra blodgivere til mot-tagere .

For å inaktivere vira i hemoglobinet blir den i det vesentlige cellefrie hemoglobinoppløsning oppvarmet ved en temperatur fra 45 til 85°C, mens hemoglobinet holdes i sin deoksyform. Dette kan oppnås gjennom bruk av reduksjonsmidler eller ved at hemoglobinet holdes i sin deoksyform. Dette kan oppnås gjennom bruk av reduksjonsmidler eller ved at hemoglo-binoppløsningen gjennomblåses med en inert oksygenfri gass. Behandlingen av hemoglobinoppløsningen for inaktivering av vira utføres vanligvis etter fjerningen av stroma og før pyridoksyleringstrinnet utføres.

Polymeriseringen av stroma-fritt hemoglobin og inaktiveringen av vira ved oppvarmning beskrives nærmere i US patentskrifter nr. 4.826.811 og 4.831.012. Disse to patentskrifter gir en grundig oversikt over teknikkens stand og inneholder et stort antall henvisninger til den kjente teknikk på området.

Ved de kjente fremgangsmåter for fremstilling av pyridoksylert hemoglobin benyttes røde blodlegemer som utgangsmateriale. Disse blodlegemer blir først vasket og deretter lysert med vann eller en vandig buffer, og hemoglobinet befris for stroma. Deretter skilles stromaet fra hemoglobin-oppløsningen, f.eks. ved mikroporefiltrering.

Alle som tidligere har arbeidet på dette område, har startet sine prosedyrer med å vaske de røde blodlegemer med saltoppløsning, hypertoniske saltoppløsninger eller andre buf-fere for å oppnå så rene røde blodlegemer som mulig før cel-lene lyseres. Etter lysis er det blitt gjort store anstrengel-ser for å skille stroma og proteinrester fra hemoglobinet ved sentrifugering, ultrasentrifugering og/eller filtrering. I visse tilfeller er hemoglobinet sågar blitt krystallisert før det er blitt benyttet som råmateriale for en bloderstatning. Tapet av hemoglobin er vesentlig i hvert av de benyttede trinn.

Det stromafrie hemoglobin pyridoksyleres deretter med et pyridoksyleringsmiddel, som f.eks pyridoksal-5'-fosfat, fortrinnsvis i nærvær av en buffer og ved en temperatur under 10°C. Under prosessen må det sørges for at reaksjonssystemet er oksygenfritt, f.eks. ved at reaksjonsoppløsningen de-oksygeneres med en inert gass. Dessuten foretrekkes det å til-sette et reduksjonsmiddel, som f.eks. natriumborhydrid, til den deoksygenerte oppløsning etter reaksjonen. Det derved oppnådde stromafrie, pyridoksylerte hemoglobin kan så polymeriseres, f.eks. med glutaraldehyd.

Disse kjente fremgangsmåter for fremstilling av pyridoksylert hemoglobin er beheftet med en rekke ulemper. Det er nødvendig med flere separate reaksjonstrinn, hvilket nedsetter utbyttet og øker risikoen for bakterieforurensning. Et stort antall prosesstrinn øker også de totale kostnader ved fremgangsmåten. Således er det vanlig at det i det første trinn ved den kjente fremgangsmåte, dvs. vaskingen av de røde blodlegemer, oppstår produkttap på ca. 30%. Vasketrinnet er dessuten temmelig ømfintlig, da blodlegemene er meget følsomme, og dessuten er risikoen for bakterieforurensning meget stor, da blodet og de røde blodlegemer er et utmerket næringsmedium for mikroorganismer. Dette har gjort det nesten umulig å ut-føre vasketrinnet i industriell målestokk.

Det er således behov for en fremgangsmåte for fremstilling av et pyridoksylert hemoglobin som er i det vesentlige fritt for mikroorganismer og vira, hvilken fremgangsmåte er enkel å utføre og omfatter et lite antall prosesstrinn sam-menlignet med de tidligere kjente fremgangsmåter. Dette oppnås med fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Det har overraskende vist seg at ved den nedenfor beskrevne fremgangsmåte kan lysis, varmebehandling og pyridok-sylering kombineres til ett trinn med et godt totalutbytte. Det pyridoksylerte hemoglobin kan benyttes for fremstilling av en bloderstatning, f.eks. i henhold til US patentskrift nr. 4.826.811, som polymeriseres ved glutaraldehyd og renses slik at det bare inneholder en liten mengde tetramer (< 2%) eller for fremstilling av dimerisert eller polymerisert hemoglobin ved hjelp av andre kjente fremgangsmåter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av pyridoksylert hemoglobin i en ett-trinns, én-beholders prosess, kjennetegnet ved at det til en vandig suspensjon av røde blodlegemer tilsettes et kjemisk reduksjonsmiddel og pyridoksal-5'-fosfat, hvoretter den oppnådde reaksjonsblanding oppvarmes ved en temperatur mellom 60 og 80°C i 0,5-15 timer.

I henhold til en foretrukken utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig å benytte en suspensjon av røde blodlegemer direkte som utgangsmateriale, slik at vasketrinnet ifølge den tidligere kjente teknikk unngås. Den påfølgende tilsetning av et reduksjonsmiddel, pyridoksyleringen og varmebehandlingen kan alle utføres i den samme reaksjonsbeholder, uten noe innskutt separasjonstrinn eller andre opparbeidelsestrinn. Således er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i det vesentlige en ett-trinns én-beholders fremgangsmåte som representerer en vesentlig forenkling av fremgangsmåten og som gir en redusert risiko for produkttap og forurensning med mikroorganismer og vira.

Det er også mulig å benytte som utgangsmateriale blodlegemer som er blitt underkastet en lysis, og fra hvilke stromaet er blitt fjernet fullstendig eller delvis. I dette tilfelle kan blodlegemene være blitt vasket på forhånd, men de må ikke vaskes. De ovennevnte fordeler oppnås således også med denne utførelsesform av oppfinnelsen.

Skjønt det ikke ønskes å begrense oppfinnelsen ved å knytte den til noen bestemt teori, antas det at reaksjonspro-duktet som dannes under pyridoksyleringstrinnet er en Schiff-base, som normalt er ustabil. Ved den tidligere kjente fremgangsmåte er denne base blitt stabilisert ved den påfølgende tilsetning av natriumborhydrid. Ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse gjør imidlertid det først tilsatte reduksjonsmiddel reaksjonsmiljøet tilstrekkelig reduserende til å stabilisere Schiff-basen som er blitt dannet under pyridoksyleringstrinnet. Dessuten opprettholdes hemoglobinet i dets deoksyform, hvilken er nødvendig for pyridoksyleringsreaksjonen og også er tilstrekkelig stabil til ikke å denatureres under oppvarmningstrinnet. Etter pyridoksyleringen og oppvarmningen er det oppnådde produkt tilstrekkelig stabilt til å anvendes i polymeriseringstrinnet.

Når hemoglobinet i oppløsning og de røde blodlegemer som fortsatt er til stede underkastes oppvarmningstrinnet, blir de gjenværende celler lysert og pyridoksyleringsreaksjonen med det frie, reduserte hemoglobin full-ført, samtidig som tilstedeværende vira inaktiveres og andre ikke-hemoglobinproteiner denatureres og felles ut. Dette gjør det lett å fjerne slike proteiner, hvilket representerer en ytterligere fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det er også å merke at reduksjonsmidlet som er til stede under oppvarmningstrinnet, vanligvis har baktericide egenskaper og bidrar til inaktiveringen av mikroorganismer.

Pyridoksyleringen og oppvarmningen må utføres under reduserende betingelser for å sikre at hemoglobinet holdes i sin deoksyform. Tilstedeværelsen av reduksjonsmidlet i reaksjonsmediet sikrer at det reduserende miljø opprettholdes, og dette innebærer at atmosfæren over reaksjonsmediet ikke be-høver være strengt oksygenfri. Dette er en annen viktig fordel med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Så snart pyridoksyleringen og oppvarmningen er blitt foretatt, er kravet om reduserende betingelser ikke lenger så strengt i de påfølgende trinn.

Polymeriseringen av det pyridoksylerte hemoglobin kan utføres etter metoder som er kjent fra litteraturen, f.eks. det ovennevnte US patentskrift nr. 4.826.811. Før polymerisasjonen utføres kan det til reaksjonsblandingen fra oppvarmningstrinnet tilsettes et salt som danner en utfelning med reduksjonsmidlet, f.eks. et oppløselig kalsiumsalt, f.eks. kalsiumklorid, og eventuelt en buffer, for å felle ut slike salter som sulfitt, hvoretter utfelte materialer fjernes, f.eks. ved sentrifugering. Fra den gjenværende oppløsning fjernes oppløste salter, f.eks. ved gelfiltrering eller dialyse. En avsaltningsprosess kan også utføres som et alternativ til utfellingen. Polymerisasjonen utføres så på kjent måte under anvendelse av et kjent reagens, f.eks. glutaraldehyd, eller andre reagenser som er beskrevet i litteraturen, for dimerise-ring eller polymerisering av hemoglobin.

Et egnet utgangsmateriale for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er et friskt eller utdatert konsentrat av røde blodlegemer, dvs. røde blodlegemer som er blitt oppbevart for lenge til å tillates brukt for blodover-føring. Også friskt eller utdatert menneskeblod kan benyttes. De røde blodlegemer suspenderes i et kaldt vandig medium, som f.eks. pyrogenfritt vann, og temperaturen kan øke til rom-temperatur under behandlingen. Mengden av vandig medium er ikke av avgjørende betydning og kan være fra 1 til 20 volumdeler, fortrinnsvis ca. 5 volumdeler, pr. volumdel celle-oppslemning. Den vandige oppslemning bufres deretter til en pH på ca. 8, f.eks. ved tilsetning av dinatriumhydrogenfosfat til en konsentrasjon på ca. 0,03 M. Selvfølgelig er det også mulig å benytte en bufferoppløsning direkte som suspensjonsmedium for blodlegemene. I denne suspensjon blir blodlegemene delvis lysert.

Det kjemiske reduksjonsmiddel tilsettes deretter til den bufrede cellesuspensjon. Som reduksjonsmiddel kan et ditionitt, bisulfitt, metabisulfitt eller sulfitt av et alkalimetall eller av ammonium benyttes. Blant disse midler foretrekkes natriumditionitt. Reduksjonsmidlet tilsettes i en tilstrekkelig mengde til å sikre at alt hemoglobinet foreligger i deoksyformen og at reduserende betingelser vil bli opprett-holdt under hele prosessen. Det foretrukne reduksjonsmiddel, natriumditionitt, er så sterkt reduserende at det ikke krever noen oksygenfri atmosfære i reaksjonsbeholderen. Andre av de nevnte reduksjonsmidler kan behøve å få støtte sin reduserende evne ved at det sørges for en praktisk talt oksygenfri atmosfære i reaksjonsbeholderen. De nødvendige reaksjonsbetin-gelser i denne henseende vil lett kunne bestemmes av en fag-mann på området.

Vanligvis tilsettes reduksjonsmidlet i en mengde som svarer til et molforhold mellom hemoglobinet og reduksjonsmidlet på fra 1:5 til 1:100, fortrinnsvis fra 1:10 til 1:60. For natriumditionitt har en konsentrasjon på ca. 0,03 M vist seg å være velegnet.

For utførelse av pyridoksyleringen tilsettes et pyridoksyleringsmiddel, f.eks. pyridoksal-5'-fosfat, til cel-lesuspensjonen inneholdende reduksjonsmidlet. Pyridoksal-5'-fosfatet kan tilsettes som en oppløsning, vanligvis i en buffer, fortrinnsvis en TRIS-buffer. Vanligvis tilsettes pyridok-sal-5 ' -fosfatet i en mengde som svarer til et molforhold mellom hemoglobinet og pyridoksal-5'-fosfatet på fra 1:1 til 1:12, fortrinnsvis fra 1:4 til 1:8. Et molforhold mellom hemoglobin og pyridoksal-5'-fosfat på ca. 1:6 har vist seg å være velegnet.

Pyridoksyleringsprosessen fullføres under varmebehandlingen. Tiden pyridoksyleringsreaksjonen tar, kan være fra en halv time til 10 timer, avhengig av de nærmere enkelt-heter og apparatet benyttet for utførelse av fremgangsmåten.

Under pyridoksyleringen underkastes hemoglobinet en varmebehandling. Ved denne behandling inaktiveres vira og mikroorganismer i stor utstrekning, og ikke-hemoglobinproteiner felles også ut i stor utstrekning, hvilket letter den påføl-gende fjerning av disse. Også lysis av blodlegemene gjøres fullstendig. Under varmebehandlingen må hemoglobinet foreligge i deoksyformen, og dette sikres vanligvis gjennom tilstede-værelse av reduksjonsmidlet. Oppvarmningen må utføres ved en temperatur i området fra 60 til 80°C, fortrinnsvis ved ca. 70°C, i ca. 10 timer. Også kortere eller lengre tidsrom kan benyttes, og det vil falle inn under gjennomsnittsfagmannens kompetanse å bestemme en fast tid for behandlingen på grunnlag av enkle rutinetester for bestemmelse av tilstedeværelsen av mikroorganismer eller vira. Da reduksjonsmidlet fortsatt er til stede i reaksjonsmediet under oppvarmningstrinnet, vil dette bidra til å opprettholde reduserende betingelser under dette trinn. Videre kan det være til stede en atmosfære av en inert, oksygenfri gass, som f.eks. nitrogen eller argon, skjønt dette strengt tatt ikke alltid er nødvendig.

Det er også å merke at det foretrukne reduksjonsmiddel, natriumditionitt, har sterkt baktericide egenskaper. Dette bidrar til å inaktivere bakterier.

Etter oppvarmningstrinnet må reaksjonsblandingen be-handles for å fjerne slike materialer som uorganiske salter, inaktiverte mikroorganismer og denaturerte ikke-hemoglobinproteiner. For dette formål kan det tilsettes et salt som danner en utfeining med det benyttede reduksjonsmiddel, f.eks. et oppløselig kalsiumsalt, f.eks. kalsiumklorid. Det kan også eventuelt tilsettes en buffer. Dessuten, eller alternativt, kan reaksjonsblandingen avsaltes, f.eks. ved gelfiltrering eller dialyse.

Når det foretrukne reduksjonsmiddel, natriumditionitt, er blitt benyttet, kan kalsiumklorid tilsettes til en konsentrasjon på f.eks. ca. 0,03 M for utfelling av sulfitter dannet fra ditionittet, hvorpå det utføres en avsaltningsbehandling. Reaksjonsmediet sentrifugeres deretter for å fjerne utfelte organiske og uorganiske materialer. Deretter kan oppløste salter fjernes ved slike prosesser som gelfiltrering eller dialyse.

Etter pyridoksyleringen underkastes det således be-handlede hemoglobin en polymerisering. Denne polymerisering utføres på i og for seg kjent måte og er beskrevet f.eks. i US patentskrift nr. 4.826.811. Som polymerisasjonsmiddel benyttes et dialdehyd, fortrinnsvis glutaraldehyd, i en vandig oppløs- ning. En måte å utføre polymerisasjonen på er å anordne en oppløsning glutaraldehyd og en oppløsning av det pyridoksylerte hemoglobin på hver sin side av en semipermeabel mem-bran. Glutaraldehydet kan migrere gjennom membranen, mens de store hemoglobinmolekyler ikke kan, og på denne måte oppnås en regulert polymerisasjonsreaksjon. Reaksjonen fortsettes inntil en passende molekylvekt er blitt oppnådd for polymeren. Dette kan ta inntil 10 timer.

Hemoglobinpolymeren som fås etter rensning, er i det vesentlige fri for den uønskede hemoglobintetramer og inneholder høyst 2 vekt% av denne tetramer, beregnet på den totale mengde hemoglobin. Produktet er derfor praktisk talt fritt for de skadelige bivirkninger som er forbundet med tetrameren.

Etter polymeriseringen kan det oppnådde hemoglobinprodukt blandes ut til en egnet doseringsform for administrering til pasienter. Slike doseringsformer kan også inneholde additiver som er velkjente i faget.

Oppfinnelsen illustreres i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Til 100 g røde blodlegemer inneholdende ca. 30 g hemoglobin tilsettes 500 ml 0,03 M oppløsning av dinatriumhydrogenfosfat med pH 8,5. Deretter tilsettes natriumditionat i en mengde som gir en konsentrasjon på 0,03 M, hvilket svarer til et molforhold mellom hemoglobinet og natriumditionitten på ca. 1:32, samt pyridoksal-5'-fosfat oppløst i en TRIS-buffer innstilt på pH 8,5. Molforholdet mellom hemoglobinet og pyri-doksal-5 ' -fosfatet innstilles på 1:6. På dette trinn er hemo-globinkonsentrasjonen ca. 3,5 vekt%, og hemoglobinet inneholder ca. 1 vekt% methemoglobin og 97-99 vekt% deoksy-hemoglobin.

Den oppnådde reaksjonsblanding oppvarmes deretter ved ca. 70°C i ca. 10 timer i en lukket glassbeholder. Etter varmebehandlingen er konsentrasjonen av methemoglobin 1-2 vekt% og utbyttet av pyridoksylert ca. 96%.

De ovenfor omtalte reaksjoner utføres i en lukket beholder, og reduserende omgivelser sikres gjennom tilstedeværelsen av natriumditionitten. Etter varmebehandlingen kan imidlertid de følgende trinn utføres i åpen beholder, i nærvær

av luft, og fortrinnsvis ved en temperatur på ca. 5°C.

Etter oppvarmningstrinnet tilsettes det til reaksjonsblandingen kalsiumklorid til en konsentrasjon på 0,03 M. Dette feller ut sulfitten dannet fra natriumditionitten, sammen med ikke-hemoglobinproteiner som er blitt denaturert under varmebehandlingen. De utfelte materialer fjernes ved sentrifu-ger ing. Etter dette trinn er konsentrasjonen av methemoglobin ca. 2 vekt%, og 50-80% av hemoglobinet er blitt overført til oksyhemoglobin.

Hemoglobinoppløsningen avsaltes deretter i en kolonne av "Sephadex" G-25 (fra Pharamcia, Uppsala, Sverige), som er blitt ekvilibrert med 0,14 M NaCl.

Utbyttet som oppnås ved pyridoksyleringsreaksjonen, bestemt ved elektroforese, finnes å være 100%, og P50for 02er 22-25 torr. Hill-koeffisienten er 2,0-2,2. Dataene oppnådd ved en kromatografisk analyse av produktet stemmer overens med dataene for pyridoksylert hemoglobin som finnes i litteraturen.

Det oppnådde pyridoksylerte hemoglobin kan så polymeriseres med glutaraldehyd på i og for seg kjent måte, f.eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 4.826.811.

Eksempel 2

100 g røde blodlegemer ble vasket med 3 x 500 ml saltoppløsning. Etter sentrifugering ble de vaskede celler lysert ved tilsetning av 500 ml destillert vann, og stroma ble fjernet ved sentrifugering og filtrering.

Til oppløsningen ble det tilsatt dinatriumhydrogenfosfat og natriumditionitt, hvert av stoffene i en slik mengde at det ble oppnådd en konsentrasjon på 0,03 mol pr. liter. Deretter ble pyridoksal-5'-fosfat tilsatt i en slik mengde at det ble oppnådd et molforhold mellom hemoglobin og pyridoksal-5'-fosfat på ca. 1:6, og den resulterende oppløsning ble oppvarmet i en lukket beholder ved 70°C i 10 timer.

Kalsiumklorid ble tilsatt for å felle ut sulfater og sulfitter dannet under reaksjonen, og etter sentrifugering ble hemoglobinoppløsningen avsaltet ved ultrafiltrering eller kro-matograf ering .

P50for 02ble bestemt og ble funnet å være 25 torr.

Hill-koeffisienten var 2,0-2,2. Ved elektroforese viste det seg at innlemmelsen av pyridoksal-5'-fosfat var fullstendig.

Typiske verdier for oppløsningen var som følger:

Eksempel 3

Eksempel 2 ble gjentatt, med den forskjell at blodlegemene ble lysert i 10 volumdeler vann og at stroma ble fra-filtrert. Filtratet ble så bufret med dinatriumhydrogenfosfitt til en konsentrasjon på 0,03 M og en pH på 8,5.

pyridoksal-5'-fosfatet ble tilsatt som en vandig opp-løsning med pH-verdien innstilt på 8,5, men ingen TRIS-buffer ble tilsatt.

Det oppnådde hemoglobinprodukt hadde de samme egenskaper som det ifølge eksempel 2.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av pyridoksylert hemoglobin i en ett-trinns, én-beholders prosess,karakterisert vedat det til en vandig suspensjon av røde blodlegemer tilsettes et kjemisk reduksjonsmiddel og pyridoksal-5'-fosfat, hvoretter den oppnådde reaksjonsblanding oppvarmes ved en temperatur mellom 60 og 80°C i 0,5-15 timer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som reduksjonsmiddel anvendes en ditionitt, bisulfitt, metabisulfitt eller sulfitt av et alkalimetall eller av ammonium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det som reduksjonsmiddel anvendes natriumditionitt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3,karakterisert vedat reaksjonsblandingen oppvarmes ved en temperatur på fortrinnsvis ca. 70°C, i ca. 10 timer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det kjemiske reduksjonsmiddel tilsettes i en mengde som svarer til et molforhold mellom hemoglobinet og reduksjonsmidlet på fra 1:5 til 1:100, fortrinnsvis fra 1:10 til 1:60.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat pyridoksal-5'-fosfatet tilsettes i en mengde som svarer til et molforhold mellom hemoglobinet og pyridoksal-5'-fosfatet på fra 1:1 til 1:12, fortrinnsvis fra 1:4 til 1:8.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6,karakterisert vedat reduserende betingelser opprettholdes i reaksjonsmediet under reaksjonene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1-7,karakterisert veddet ytterligere trinn at det til reaksjonsblandingen tilsettes et salt som danner en utfeining med reduksjonsmidlet, fortrinnsvis kalsiumklorid, og eventuelt en buffer, og/eller at reaksjonsblandingen underkastes en avsaltningsbehandling, hvoretter de utfelte materialer fraskilles.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat hemoglobinet dimeriseres eller polymeriseres etter fraskillelsen av utfelte materialer og oppløste salter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat hemoglobinet dimeriseres eller polymeriseres med glutaraldehyd.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat det polymeriserte hemoglobin har et innhold av hemoglobintetramer som er mindre enn 2 vekt% av den totale mengde hemoglobin.