CN114341174B - 硫代琥珀酰基交联的血红蛋白类似物及其使用和制备方法 - Google Patents

硫代琥珀酰基交联的血红蛋白类似物及其使用和制备方法 Download PDF

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Abstract

本文提供硫代琥珀酰基交联的血红蛋白类似物、包含它们的药物组合物及其使用和制备方法。

Description

硫代琥珀酰基交联的血红蛋白类似物及其使用和制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月29日提交的美国临时申请第62/893,220号的优先权的权益，该美国临时申请在此以引用方式整体并入。
技术领域
本公开大体涉及硫代琥珀酰基交联的血红蛋白类似物、包含它们的药物组合物及其使用和制备方法。
背景技术
血红蛋白是存在于几乎所有脊椎动物的红细胞以及一些无脊椎动物的组织中的含铁的氧运输金属蛋白质。红细胞中的血红蛋白负责将氧从肺部运送到身体的其他部位，然后使二氧化碳从身体细胞返回到肺部，从而呼出二氧化碳。由于血红蛋白具有这种氧运输特征，因此，如果来自人或动物来源的红细胞的纯化血红蛋白可在离体下稳定并在体内和离体下使用，则其是用于开发强效氧治疗剂的理想材料。
天然存在的血红蛋白是由2个α和2个β珠蛋白亚基构成的非共价连接的异四聚体。当存在于红细胞内时，它通常是稳定的。然而，当从红细胞中去除天然存在的血红蛋白时，它会变得不稳定并在血液循环中分裂成2种二聚体(αβ珠蛋白链)。二聚体血红蛋白由于其较低分子量(大约32kDa)而从肾脏经由肾小球过滤(Bunn,H.F.等，1969,J Exp Med,129:909-23)，或从肝脏经由触珠蛋白-CD 163途径(Kristiansen,M.等，2001,Nature,409:198-201)快速清除。四聚体连接的断裂不仅在通过肾脏过滤并排出解离的血红蛋白时引起肾损伤，而且对功能性血红蛋白在血液循环中的可持续性产生负面影响。
为了克服这些问题，研究人员已尝试开发具有稳定的四聚体构型或增加分子量的各种的修饰血红蛋白(血红蛋白氧载体，HBOC)。这些HBOC从人或动物来源的红细胞纯化的血红蛋白发展而来，并通过分子内或分子间交联、聚合、聚乙二醇化(PEGylation)或封装而进一步被修饰(Keipert,P.E.等，1992,Biomater Artif Cells Immobil Biotechnol,20:737-45)。与无基质的血红蛋白相比，这些HBOC可具有更长的血液保留时间，并基于所用的血红蛋白修饰策略而具有不同的氧运输能力。
尽管在临床前和临床试验中评估了这些HBOC的安全性、功效和药物代谢动力学(Jahr,J.S.等，2012,Curr Drug Discov Technol,9:158-65；Kim,H.W.和Greenburg,A.G,2004,Artif Organs,28:813-28)，但美国食品和药物管理局(United States Food andDrug Administration,FDA)尚未批准用于人的任何HBOC。人血红蛋白产品自1993年开始开发并在III期试验中进行了评估，但其临床应用开发由于临床试验研究中报告的不被期望副作用而暂停(Hess,J.等，1991,Blood 78:356A；Jahr,J.S.等，2012,Curr DrugDiscovTechnol,9:158-65；Winslow,R.M.,2000,Vox Sang,79:1-20；Cheng,D.C.等，2004,JThorac Cardiovasc Surg,127:79-86；Greenburg,A.G.等，2004,J Am Coll Surg,198:373-383；Hill,S.E.等，2002,J Cardiothorac Vasc Anesth,16:695-702)。
尽管据报道，使用无细胞的人HBOC产品的失败与其相比于对照溶液显著增加死亡和心肌梗塞的风险相关，但来自Hemopure的牛血红蛋白Glutamer-250(HBOC-201)自2001年起在南非被批准用于治疗贫血症以及供手术期间使用(Lok,C.,2001,Nature,410:855；Mer,M.等，2016,Transfusion(Paris),56:2631-36)，并且自2014年起在美国它还被提供给有生命威胁并不能选择同种异体输血的贫血症患者(Lundy,J.B.等，2014,Int J BurnsTrauma,4:45-8；Posluszny,J.A.和Napolitano,L.M.,2016,Archives of TraumaResearch,5:e30610；Resar,L.M.等，2016,Transfusion,56:2637-47)。
即使通过防止血红蛋白的解离解决了其肾毒性问题，施用后的血管收缩也是HBOC产品的另一安全担忧。已经表明，相对于红细胞内的血红蛋白，无细胞血红蛋白更快速地清除血液中的一氧化氮(NO)，这导致施用HBOC时观察到的血管收缩和血压升高(Mozzarelli,A.等，2010,Blood Transfus,8(S3):s59-s68)。平均动脉血压在HBOC输注后立即增加，且这种增加经常与心输出减少和总外周阻力增加相关(Hess,J.R.等，1993,JAppl Physiol,74(4):1769-78)。血管收缩限制组织灌流和氧合，并且对于遭受失血和血液稀释的患者来说是严重的不良作用。
尽管HBOC清除NO被认为是导致血管收缩的主要机制，但也考虑了其他可能的因素，诸如毛细血管前微动脉中的氧分压(Winslow,R.M.,2003,J Intern Med,253(5):508-17；Tsai,A.G.等，2003,Am J Physiol Heart Circ Physiol,284(4):H1411-9)和溶液粘度(Gaucher-Di,S.C.等，2009,Biomaterials,30(4):445-51)。除了NO清除之外，还提出了HBOC毒性的其他机制，包括氧的过度供应(Winslow,R.M.,2008,Biochim Biophys Acta,2008,1784:1382-86)和血红素介导的氧化副反应(Alayash,A.I.,1999,Nat Biotechnol,17:545-9；Alayash,A.I.,2004,Nat Rev Drug Discov,3:152-9)。
尽管已经设计了对NO反应性和过度供应氧能力较低的一些新HBOC以防止氧化副反应的发生，但在临床前研究中仍然观察到一些与这些新设计HBOC相关无法解释的毒性。这些结果揭示，不同化学性质的修饰和其对HBOC毒性的影响尚未得到完全理解，并且HBOC副作用的情况根据其化学和/或基因修饰的性质而有所变化。
血红蛋白氧疗法的最新发展已经结合了各种化学方法，诸如聚合、聚乙二醇化、交联和封装，以改善稳定后多聚体血红蛋白的副作用情况，使其可在红细胞外发挥作用。现有技术教导，通过裂解动物红细胞，之后进行伴有热处理的不同纯化策略可获得高度纯化的无基质血红蛋白(Sakai,H.等，1994,Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol,22(3):651-6)、水相提取(Lee,C.J.和Kan,P.,1993，美国专利5,407,579)、切向流过滤((Palmer,A.F.等，2009,Biotechnol Prog,25(6):1803-9；Elmer,J.等，2009,BiotechnolProg,25(5):1402-10)和/或阴离子交换色谱(Sun,G.和Palmer,A.F.,2008,JChromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci,867(1):1-7；Houtchens,R.A.和Rausch,C.W.,2000，美国专利6,150,507；Pliura,D.H.等，1996，美国专利5,545,328)。高度纯化的无基质血红蛋白可用于通过不同的化学方法，生成具有指定氧亲和力性质的血红蛋白产品。在这些方法中，化学交联是通过四聚体内的分子内键以及稳定四聚体之间的分子间键，形成稳定的多聚体血红蛋白的一种常见方法。这种化学稳定的血红蛋白可经进一步修饰以形成具有指定性质的HBOC。
富马酸双-3,5-二溴水杨基酯(DBSF)(用于血红蛋白处理的化学交联剂)不仅通过分子内交联使血红蛋白稳定，而且还影响血红蛋白的氧亲和力(Beanna,J.N.等，美国专利5,248,766；Wong B.L.等，美国专利8,106,011B1)。为了降低无基质血红蛋白的副作用并增加血红蛋白的循环半衰期，稳定的多聚体血红蛋白是优选的形式。然而，本发明人确定交联的血红蛋白上的富马酰基基团在体外和体内与硫醇反应。常规血红蛋白产品通常与含硫醇的赋形剂(诸如N-乙酰基半胱氨酸(NAC)或半胱氨酸(Cys))一起配制，目的在于降低药物组合物中功能失调的高铁血红蛋白的水平(Beanna,J.N.等，美国专利5,248,766；Timothy,E.E.美国专利5,281,579；Wong B.L.等，美国专利8,106,011B1)。然而，含硫醇的赋形剂与交联血红蛋白的富马酰基基团的反应降低了它们还原高铁血红蛋白的能力，这可能影响产品储存期间HBOC产品的稳定性。
在人类，血浆中的氧化还原状态受到低分子量硫醇(诸如谷胱甘肽、半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸)所严格调控。发现血浆氧化还原状态的失衡与心血管疾病相关(Brunelli,E等，Oxid Med Cell Longev,1-11,2017)。因此，现有技术教导的具有含富马酰基基团的交联剂稳定的多聚体血红蛋白可引起药物组合物的体外不稳定性和体内氧化还原系统失衡是一个问题。因此，本领域需要一种技术来产生稳定的多聚体血红蛋白，所述多聚体血红蛋白不仅具有改进产品安全特征和期望的携氧性质，而且还含有在体外和体内不与硫醇反应的交联基团。取决于不同的医疗应用，此类稳定的交联血红蛋白可用于众多种期望不同水平氧亲和力的医学应用。
发明内容
本公开大体涉及硫代琥珀酰基交联的血红蛋白、包含它的药物组合物及其使用和制备方法。至少一个本文所述的硫代琥珀酰基交联基团可用于血红蛋白稳定。形成硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的示意图示于图1中。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可通过硫醇与交联的血红蛋白β-β的分子间至少一个富马酰基交联基团进行1,4-加成反应来产生。
本文提供硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其通过避免稳定的血红蛋白与硫醇之间在体外和体内的反应，克服了以往用含富马酰基的交联基团的稳定化血红蛋白的相关稳定性问题。令人惊讶的是，硫醇与交联的血红蛋白的富马酰基基团的缀合改善了体内组织氧合，并且有利地不改变其p50值。
在第一方面，本文提供硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其包含四聚体血红蛋白和至少一个式1的硫代琥珀酰基交联基团：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中
每一N*均独立地表示选自由以下组成的组的氮：四聚体血红蛋白中的赖氨酸残基侧链中的氮和四聚体血红蛋白中的N-末端的氮；并且
R1是烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或-(CR2)nY，其中n是选自0-10的整数；R在每种情况下均独立地为氢、烷基、芳烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或两个R一起形成3-6元环烷基或含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的杂环烷基；并且Y选自由以下组成的组：OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2OR4和-(CRR2R3)，其中R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；并且R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；或R1是选自由以下组成的组的基团：
和
N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，R1是式2的基团：
其中n是选自由0、1、2、3和4组成的组的整数；
R在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-N(R4)2、-NH(C＝O)R4或-NH(C＝O)N(R4)2；
R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2；并且
R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
或R1是选自由以下组成的组的基团：
和
N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，n是1或2；R是氢；R2是-NHR4、-NH(C＝O)R4或-NH(C＝O)R4N(R4)2；并且R3是氢、-OR4、-CO2R4或-(C＝O)NHR4，其中R4在每种情况下均独立地选自由氢和烷基组成的组。
在某些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，每一N*均独立地表示选自由以下组成的组的氮：四聚体血红蛋白的β珠蛋白链中赖氨酸残基侧链中的氮和四聚体血红蛋白的β珠蛋白链中N-末端的氮。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白基本上是纯净的。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白包含1、2或3个式1的硫代琥珀酰基交联基团。
在某些实施方案中，至少一个硫代琥珀酰基交联基团使四聚体血红蛋白的两条β珠蛋白链交联。
在某些实施方案中，四聚体血红蛋白是人血红蛋白、牛血红蛋白或猪血红蛋白。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白基本上不含基质。
在第二方面，本文提供药物组合物，其包含至少一种如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白以10-90％的重量百分比存在于药物组合物中。
在某些实施方案中，药物组合物包含硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白包含1、2或3个式1的硫代琥珀酰基交联基团；或其组合。
在第三方面，本文提供用于制备如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法，其包括以下步骤：
使四聚体血红蛋白与富马酰基交联剂接触，由此形成富马酰基交联的血红蛋白；使富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触，由此形成如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在某些实施方案中，富马酰基交联剂选自由以下组成的组：富马酸双-3,5-二溴水杨基酯(DBSF)、富马酰基氯和富马酸双(水杨基)酯。
在某些实施方案中，硫醇具有式R1SH或其药学上可接受的盐或两性离子，其中R1是烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或-(CR2)nY，其中n是选自0-10的整数；R在每种情况下均独立地为氢、烷基、芳烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或两个R一起形成3-6元环烷基或含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的杂环烷基；并且Y选自由以下组成的组：R1是烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或-(CR2)nY，其中n是选自0-10的整数；R在每种情况下均独立地为氢、烷基、芳烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或两个R一起形成3-6元环烷基或含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的杂环烷基；并且Y选自由以下组成的组：OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2OR4和-(CRR2R3)，其中R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；并且R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；或R1是选自由以下组成的组的基团：
和
N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，硫醇具有式3：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中
n是选自由0、1、2、3和4组成的组的整数；
R在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；
R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2；并且
R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；或所述硫醇选自由以下组成的组：二硫苏糖醇、HS(CH2CH2O)mCH3、HS(CH2CH2O)mH、谷胱甘肽或其药学上可接受的盐，其中m是在1-1000之间选择的整数。
在某些实施方案中，n是1或2；R是氢；R2是-NHR4、-NH(C＝O)R4或-NH(C＝O)(NR4)2；并且R3是氢、-OR4、-CO2R4或-(C＝O)NHR4，其中R4在每种情况下均独立地选自由氢和烷基组成的组。
在某些实施方案中，硫醇选自由以下组成的组：
二硫苏糖醇、HS(CH2CH2O)mCH3及HS(CH2CH2O)mH或其药学上可接受的盐或两性离子，其中m是在1-1000之间选择的整数。
在某些实施方案中，使富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触的步骤，富马酰基交联的血红蛋白和硫醇以至少1:1、1:2或1:3摩尔比存在。
在某些实施方案中，富马酰基交联的血红蛋白和硫醇以大于1:3的摩尔比存在。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白呈分离和基本上纯净的形式。
在第四方面，本文提供用于增加有需要的受试者的血液循环系统体积的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在第五方面，本文提供用于治疗有需要的受试者的休克的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在第六方面，本文提供向有需要的受试者的组织和器官供应氧的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在第七方面，本文提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中癌症是三阴性乳腺癌或结直肠癌。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白基本上是纯净的。
本公开涉及通过硫醇对富马酰基交联的血红蛋白的修饰。在某些实施方案中，硫醇对富马酰基交联的血红蛋白的修饰使富马酰基交联的血红蛋白的p50值改变不大于10％。在下文的实施例中，输注650mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白(其通过半胱氨酸与富马酰基交联的血红蛋白的富马酰基基团缀合产生)在休克大鼠模型中显示肝组织氧合有显著增加。此外，其在整个实验中，与富马酰基交联的血红蛋白相比，于外周动脉疾病小鼠模型中血流恢复的改善进一步证实了其功效增强。
本公开还提供制备硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)将含有富马酰基交联的血红蛋白的溶液的溶解氧水平降低到0.1mg/L；2)在低氧条件下将富马酰基交联的血红蛋白溶液与硫醇混合，以在至少95％的富马酰基桥与硫醇试剂反应以及将硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的高铁血红蛋白水平降低到小于2％的条件下形成硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；和3)任选地将任何残余的硫醇去除到小于0.03％(w/w)。添加大约0.05-0.2％N-乙酰基半胱氨酸(NAC)的浓度，以进一步降低由生产工艺产生的高铁血红蛋白，并且还防止其在储存期间形成。本公开还提供通过例如调整用于偶联反应中的硫醇试剂的当量、pH值和反应持续时间来制备高产率和纯度的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法。
本公开的方法可用于制备在37℃和pH 7.4下测量的p50在约5-70mmHg范围的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。取决于预期化学修饰和医学应用，血红蛋白期望具有不同水平的氧亲和力。在这些实施方案中，用于与交联的血红蛋白的富马酰基基团缀合的含硫醇试剂可包括例如半胱氨酸、NAC、β-巯基乙醇和如本文所述的其他硫醇化合物。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可以是分子量为约65kDa的四聚体血红蛋白，其在β珠蛋白链之间含有至少一个(1XL)、两个(2XL)或三个(3XL)烷基硫醇交联基团。
在下文的实施例中，通过将半胱氨酸与富马酰基交联的牛血红蛋白的富马酰基基团缀合来产生含有半胱氨酰基-琥珀酰基交联的牛血红蛋白的溶液。在修饰步骤中，将pH8.0-8.3的40-80mM半胱氨酸与四聚体血红蛋白(tHb＝7-10g/dL)在10-30℃于脱氧条件(例如，溶解氧(DO)水平维持低于0.1mg/L)下孵育15-30小时的时段。这可实现半胱氨酸对富马酰基交联的血红蛋白中富马酰基基团的修饰高达95％，且修饰后可将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的高铁血红蛋白水平降低到小于2％。可通过使用30kDa NMWCO膜的过滤步骤去除反应混合物中的残余半胱氨酸/胱氨酸，该过滤步骤可利用乙酸盐缓冲液(99mMNaCl，46mM乙酸钠)使反应混合物滤过10-16渗滤体积(DV)，以使半胱氨酸和胱氨酸水平低于0.03％(w/w)。
包含半胱氨酰基-琥珀酰基交联的牛血红蛋白的药物组合物可存在0.2％(w/w)NAC的情况下并在氮气下保持以下产品特征：tHb＝9.5-10.5g/dL、pH 7.4-8.4、O2Hb≤10％、MetHb(高铁血红蛋白)≤5％、内毒素≤0.25EU/mL和在95-100％纯度范围内的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白。
本公开还提供包含硫代琥珀酰基交联的血红蛋白(诸如半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白)的药物组合物。此类组合物可用于改善氧的递送以及针对全局和局部缺血/缺氧病况的治疗，所述病况包括出血性休克、心肌缺血再灌注损伤、外周动脉疾病和外伤性脑损伤。另外，此类组合物还用于治疗自身免疫疾病和癌症治疗。
附图简要说明
当结合附图考虑时，根据本公开的以下描述，本公开的上述和其他目的和特征将变得显而易见。
图1是硫代琥珀酰基交联的血红蛋白形成的示意图。
图2是描绘半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白形成方法的流程图。
图3描绘(A)非交联的牛血红蛋白和(B)通过DBSF反应产生的富马酰基交联的血红蛋白的尺寸排阻色谱图。
图4描绘(A)通过DBSF反应产生的富马酰基交联的血红蛋白和(B)半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的解卷积ESI-MS谱。
图5描绘半胱氨酰基-琥珀酰基肽的ESI-MS/MS谱，证实半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白中富马酰基双键上的半胱氨酸修饰的确认。
图6描绘富马酰基双键对不同含硫醇试剂(半胱氨酸、β-巯基乙醇和高半胱氨酸)的反应性的解卷积ESI-MS谱。
图7描绘在第2天和第9天与琥珀酸双3,5-二溴水杨基酯(DBSS)交联的血红蛋白对半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸(NAC)的反应性的解卷积ESI-MS谱。
图8表示富马酰胺(a)BocLysF与β-巯基乙醇得到烷基硫代琥珀酰胺(b)BocLysF-BME以及与半胱氨酸得到烷基硫代琥珀酰胺(c)BocLysF-Cys的转化方案。
图9描绘NAC和NAC2分别在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白溶液中的稳定性。
图10描绘(A)半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和(B)富马酰基交联的血红蛋白的解卷积ESI-MS谱，证实血红蛋白在血液循环中的体内稳定性。
图11显示在大鼠严重出血性休克中，与富马酰基交联的血红蛋白溶液相比，注射650mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液导致肝组织氧水平显著增加。数据报告为平均值±SD。通过双向方差分析(ANOVA)进行统计分析。相对于富马酰基交联的血红蛋白溶液，***p<0.001。
图12显示在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白治疗后，缺血性肢体中Oxy-Hb水平的增加。在诱导肢体缺血之前和之后，以及在治疗后最长达21天的不同时间点，通过具有Oxygen Mapper的TiVi 700组织活力成像仪(TissueViability Imager)来测量Oxy-Hb。对于半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗，在输注后30分钟内以及治疗后最长达21天观察到Oxy-Hb的显著增加，而富马酰基交联的血红蛋白在治疗后14天和治疗后21天显示显著增加。将Oxy-Hb水平表示为同一小鼠在同一时间点在结扎肢体中测量的通量密度除以对照肢体(无结扎)中测量的通量密度。数据报告为平均值±SD。相对于对照组，*p<0.05，**p<0.01。
图13显示在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白治疗后缺血性肢体中灌注的恢复。在诱导肢体缺血之前和之后，以及在治疗后最长达21天的不同时间点，通过Moor串行激光多普勒成像仪(Moor Serial Laser Doppler Imager)测量血液灌注。在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白治疗后最长达21天，观察到灌注显著恢复。数据报告为平均值±SD。相对于对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图14显示在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白治疗后，肢体缺血中间充质干细胞(MSC)群体的维持。在诱导肢体缺血后观察到循环CD45-CD29+、CD45-CD105+、CD45-CD106+MSC群体的增加，并且与对照相比持续更长时段。在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗后观察到MSC群体的更显著改善。数据报告为平均值±SD。相对于对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图15显示在严重出血性休克的非人灵长类动物(食蟹猴)模型中，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白恢复肌肉组织(三头肌)中的氧合。当与自体血浆治疗(对照)相比时，500mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的输注导致肌肉组织氧合的增加。数据报告为平均值±SD。
图16显示在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗后严重出血性休克的非人灵长类动物模型中平均动脉压的恢复。与自体血浆治疗相比，在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗后最长达3小时维持更高的平均动脉压。数据报告为平均值±SD。
图17显示在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后缺血性肢体中Oxy-Hb水平的剂量依赖性增加。在诱导肢体缺血之前和之后，以及在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后最长达21天的不同时间点(每组n＝8)，通过具有OxygenMapper的TiVi 700组织活力成像仪测量Oxy-Hb。在输注后1小时内以及治疗后最长达21天，观察到Oxy-Hb的显著的剂量依赖性增加。将Oxy-Hb水平表示为同一小鼠在同一时间点在结扎肢体中测量的通量密度除以对照肢体(无结扎)中测量的通量密度。将数据报告为平均值±SD。相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图18显示在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后缺血性肢体中灌注的剂量依赖性恢复。在诱导肢体缺血之前和之后，以及在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后最长达21天的不同时间点，通过Moor串行激光多普勒成像仪测量血液灌注。在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后最长达21天(每组n＝8)，观察到灌注的显著的剂量依赖性恢复。将数据报告为平均值±SD。相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19描绘在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后肢体缺血中间充质干细胞(MSC)群体的选择性活化。在诱导肢体缺血后观察到循环CD45-CD29+、CD45-CD105+、CD45-CD106+MSC群体的显著的剂量依赖性增加，并且与阴性对照相比持续更长时段。将数据报告为平均值±SD。相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图20显示用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗后心肌梗塞面积的显著减小。组织学分析揭示，在LAD结扎后，在对照组与治疗组之间诱导了相当的风险面积(左图)。在接受用100mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗的组中观察到梗塞面积的显著减小(右图)。
图21是C57小鼠模型中狼疮诱导和治疗的示意图。通过以下方式诱导狼疮性肾炎：每两周注射具有弗氏佐剂(Freud’s adjuvant)的凋亡细胞核提取物，总共3次，同时每周两次给予治疗(800mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白)，持续2周。疾病进展从第一次诱导起持续12周用于病理分析。
图22显示肾脏中肾小球上的免疫球蛋白(Ig，评分：0-3)同种型M(IgM)和同种型G(IgG)沉积减少。*p<0.05，***p<0.001。
图23显示肾脏中较低的肾小球活动性指数与显著减少的细胞增殖、白细胞浸润、纤维蛋白样坏死/核破裂、细胞性新月体和玻璃样血栓、铁丝环(wire loop)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图24显示用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白进行的急性治疗改善了TBI后的神经学评分。使用在TBI后4小时、1天、3天和7天的一组8次神经学评估来获得复合神经评分(neuroscore)。图形描绘用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗对不同时间点的神经评分的作用。半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗的TBI动物在治疗后24小时显示出神经评分的显著增加(*p<0.05)。双向重复测量ANOVA，之后是Sidak事后检验；数据表示为平均值±SEM。
图25显示用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白进行的急性治疗改善了TBI后的运动恢复。使用水平楼梯实验和圆筒实验来评估用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗对TBI后1小时的运动功能的功效。左图表示用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗对梯测试的误差评分的作用。与对照组相比，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在第3天显著改善TBI大鼠的梯测试性能(*p<0.05)，但在第7天则不然。只有对照组在第7天的误差评分显著低于第3天的误差评分(**p<0.01)，而治疗组在第3天达到相同的恢复水平。右图显示在TBI后第3天和第7天进行的圆筒实验期间不对称爪的使用程度。未发现对照组与治疗组之间受累爪(affected paw)的显著使用差异(p>0.05)。数据表示为平均值±SEM。
图26显示用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗对TBI诱导的星形胶质细胞增生的减少。通过在TBI后7天的脑组织中进行的GFAP免疫荧光来评估用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液单次急性治疗对星形胶质细胞活化的作用。(A)图形显示同侧(Ipsi)和对侧(Contra)海马和丘脑中GFAP阳性星形胶质细胞的平均细胞面积。(*p<0.05)，双尾t检验；数据表示为平均值±SEM。(B)来自对照组(上图)和治疗组(下图)的同侧海马(齿状回和CA区域)、同侧丘脑和对侧海马(CA区域)的活化星形胶质细胞的使用ImageJ减去背景阈值后的代表性200×放大图像。DG：齿状回，CA：海马CA区，Thal：丘脑，i：相对于损伤部位的同侧，c：相对于损伤部位的对侧。
详细描述
定义
以下术语将用于描述本发明。在不存在本文所陈述的具体定义的情况下，用于描述本发明的术语将被赋予本领域普通技术人员所理解的它们的普遍含义。
在本申请通篇中，当组合物被描述为具有、包含或包括特定组分时，或者当方法被描述为具有、包含或包括特定方法步骤时，预期本教导的组合物还可基本上由或者由所叙述的组分组成，并且本教导的方法还可基本上由或者由所叙述的方法步骤组成。
在本申请中，当说明要素或组分被包括于和/或选自所叙述的要素或组分的清单中时，应当理解所述要素或组分可以是任何一种所叙述的要素或组分，或者所述要素或组分可选自由两种或更多种所叙述的要素或组分组成的组。此外，应当理解，无论在本文中是明确的还是隐含的，本文所述的组合物或方法的要素和/或特征均可在不脱离本教导的精神和范围的前提下以多种方式组合。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减少或改善病症/疾病和/或与其相关的症状。应当了解，尽管没有排除，但治疗疾病或病况不要求完全消除该疾病、病况或与其相关的症状。在某些实施方案中，治疗包括预防病症或病状和/或与其相关的症状。如本文所用的术语“预防(prevention)”或“预防(prevent)”是指抑制或至少延迟病症、病况或与其相关的症状的发展的任何作用。预防可包括一级、二级和三级预防水平，其中：a)一级预防避免疾病的发展；b)二级预防活动旨在早期治疗疾病，从而增加干预的机会，以防止疾病的进展和症状的出现；并且c)三级预防通过恢复功能和减少与疾病相关的并发症来减少已经确定的疾病的负面影响。
如本文所用的术语“受试者”是指将成为或已成为治疗、观察和/或实验对象的动物，通常是哺乳动物或人。当该术语与本文所述化合物的施用结合使用时，则受试者已成为本文所述化合物的治疗、观察和/或施用的对象。
如本文所用的术语“治疗有效量”意指在研究人员、兽医、临床医生或医师正在寻找的在细胞培养物、组织系统、受试者、动物或人中诱发生物学和/或医学反应(其包括正在治疗的疾病、病况或病症的症状的缓解)的化合物或药剂的量。
术语“组合物”意在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及由指定量的指定成分的组合直接或间接产生的任何产品。
术语“药学上可接受的载体”是指用于制备化合物的期望剂型的介质。药学上可接受的载体可包括一种或多种溶剂、稀释剂或其他液体媒介物；分散或悬浮助剂；表面活性剂；等渗剂；稠化或乳化剂；防腐剂；固体粘结剂；润滑剂等。雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)，第十五版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1975)和药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第三版，A.H.Kibbe编辑(American Pharmaceutical Assoc.2000)公开了用于配制药物组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“卤代(halo)”或“卤素(halide)”包括氟、氯、溴或碘。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，1-甲基丁基、2-甲基丁基、异戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、新戊基和1-乙基丙基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1到40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如，1-30个碳原子(即，C1-30烷基)。在某些实施方案中，烷基可具有1到6个碳原子，并且可被称为“低级烷基”。低级烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)和丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在某些实施方案中，烷基可如本文所述任选地被取代。烷基通常不被另一烷基、烯基或炔基取代。
如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的示例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯中)或末端的(诸如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，烯基可具有2到40个碳原子(即，C2-40烯基)，例如，2到20个碳原子(即，C2-20烯基)。在某些实施方案中，烯基可如本文所述被取代。烯基通常不被另一烯基、烷基或炔基取代。
如本文所用，除非另有说明，否则“环烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指在环系中具有3-12个碳原子的单环烃，并且包括氢、直链、支链和/或环状取代基。示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。
如本文所用，“稠环”或“稠环基团”是指具有至少两个环的多环环系，其中至少一个环是芳族的，并且此类芳族环(碳环或杂环)具有与至少一个其他环共用的键，所述其他环可以是芳族或非芳族的，以及碳环或杂环的。这些多环环系可以是高度p-共轭的，并且如本文所述任选地被取代。
如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括例如氮、氧、硅、硫、磷和硒。
如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系或多环环系，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共用的键)在一起，或至少一个芳族单环烃环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环。芳基在其环系中可具有6到24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包含多个稠环。在某些实施方案中，多环芳基可具有8到24个碳原子。芳基的任何适合的环位置均可共价连接到所定义的化学结构。仅具有芳族碳环的芳基的示例包括苯基、1-萘基(二环)、2-萘基(二环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、稠五苯基(五环)和类似基团。其中至少一个芳族碳环稠合到一个或多个环烷基环和/或环杂烷基环的多环环系的示例尤其包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-二环环烷基/芳族环系)、环己烷(即，四氢萘基，其为6,6-二环环烷基/芳族环系)、咪唑啉(即，苯并咪唑啉基，其为5,6-二环环杂烷基/芳族环系)和吡喃(即，色烯基，其为6,6-二环环杂烷基/芳族环系)。芳基的其他示例包括苯并二噁烷基(benzodioxanyl)、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、色满基(chromanyl)、吲哚啉基等。在某些实施方案中，芳基可任选地被取代。在某些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可被称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤代芳基，即，其中所有氢原子均被卤素原子替代的芳基(例如，-C6F5)。在某些实施方案中，芳基被另一芳基取代并且可被称为联芳基。联芳基中的每个芳基均可任选地被取代。
术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的环杂原子的芳族单环环系、或其中环系中存在的至少一个环为芳族并且含有至少一个环杂原子的多环环系。多环杂芳基包括具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的那些，以及具有至少一个与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的单环杂芳基环的那些。杂芳基整体上可具有例如5到24个环原子并且含有1-5个环杂原子(即5-20元杂芳基)。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接到所限定的化学结构，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含有O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的示例包括例如以下所示的5-或6-元单环和5-6二环环系：其中T为O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2或Si(烷基)(芳基烷基)。此类杂芳基环的示例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基(quinoxalyl)、喹唑啉基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基(cinnolinyl)、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲嗪基(indolizinyl)、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他示例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在某些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。在某些实施方案中，杂芳基可任选地被取代。
术语“任选取代的”是指诸如烷基、环烷基、芳基等的化学基团，其中一个或多个氢可被如本文所述的取代基替代，所述取代基例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基(amido)、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族基团、-CF3、-CN等。
术语“碳环”是本领域公认的并且是指其中环的每个原子都是碳的芳族或非芳族环。
术语“硝基”是本领域公认的并且是指-NO2；术语“卤素”是本领域公认的并且是指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”是本领域公认的并且是指-SH；术语“羟基”意指-OH；并且术语“磺酰基”和“砜”是本领域公认的并且是指-SO2 -。“卤离子”表示卤素的对应阴离子。
术语“烷硫基”是指连接有硫基的烃基。在某些实施方案中，“烷硫基”基团由-S-烷基、-S-烯基或-S-炔基中的一种表示。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。
如本文所用的术语“烃基”是指通过碳原子键合的基团，其不具有＝O或＝S取代基，并且通常具有至少一个碳-氢键和主要的碳主链，但可任选地包含杂原子。因此，出于本申请的目的，像甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基和三氟甲基这样的基团被认为是烃基，但诸如乙酰基(其在连接碳上具有＝O取代基)和乙氧基(其通过氧而不是碳来连接)的取代基则不是。烃基包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基和其组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适用于与受试者的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，Berge等在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述了药学上可接受的盐。本文所提供的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自适合的无机和有机的酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的示例是用无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或用有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域所用的其他方法(诸如离子交换)形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天门冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate,besylate)、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、已酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐(pivalate)、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐(valerate salts)等。在某些实施方案中，可衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
衍生自适当碱的药学上可接受的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等。在适当时，其他药学上可接受的盐包括无毒铵、季铵和胺阳离子，它们其是使用诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根的抗衡离子形成的。可衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺、碱性离子交换树脂等，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在某些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐选自铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
如本文所用，与本文所述化合物相关的术语“分离的”意指该化合物不在细胞或生物体中，并且该化合物与在细胞或生物体中通常伴随它的一些或所有组分分离。
如本文所用的术语“基本上纯净”结合本文所述化合物的样品意指样品含有至少60重量％的化合物。在某些实施方案中，样品含有至少70重量％的化合物；至少75重量％的化合物；至少80重量％的化合物；至少85重量％的化合物；至少90重量％的化合物；至少95重量％的化合物；或至少98重量％的化合物。
如本文所用的术语“基本上不含基质”结合本文所述化合物的样品意指样品含有小于5重量％的基质。在某些实施方案中，样品含有小于4重量％的基质；小于3重量％的基质；小于2重量％的基质；小于1重量％的基质；小于0.5重量％的基质；小于0.1重量％的基质；小于0.05重量％的基质；或小于0.01重量％的基质。
本公开提供硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其包含四聚体血红蛋白和至少一个式1的硫代琥珀酰基交联基团：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中每一N*均独立地表示选自由以下组成的组的氮：四聚体血红蛋白中的赖氨酸残基侧链中的氮和四聚体血红蛋白中的N-末端的氮；并且
R1是烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或-(CR2)nY，其中n是选自0-10的整数；R在每种情况下均独立地为氢、烷基、芳烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或两个R一起形成3-6元环烷基或含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的杂环烷基；并且Y选自由以下组成的组：OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2OR4和-(CRR2R3)，其中R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR4、SR4、N(R4)2、-(C＝O)R4、-(C＝O)OR4、-O(C＝O)R4、-O(C＝O)OR4、-(C＝O)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)R4、-(NR4)(C＝O)OR4、-O(C＝O)N(R4)2、-O(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝O)N(R4)2、-(C＝NR4)N(R4)2、-(NR4)(C＝NR4)N(R4)2、-(S＝O)R4、-S(O)2R4、-S(O)2OR4、-S(O)2N(R4)2、-OS(O)2R4、-(NR4)S(O)2R4、-OS(O)2OR4、-OS(O)2N(R4)2、-(NR4)S(O)2N(R4)2或-(NR4)S(O)2OR4；并且R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；或R1是选自由以下组成的组的基团：
和
N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-1000的整数。
虽然下文的示例大体涉及包含α2β2四聚体血红蛋白的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，但本公开也涵盖血红蛋白的其他形式，诸如其他四聚体血红蛋白，例如，α2γ2；三聚体血红蛋白，例如，αβ2、α2β、αγ2和α2γ；二聚体血红蛋白，例如，αβ和αγ等；以及血红蛋白的聚合形式，其包含血红蛋白的一种或多种单体形式；和已经受其他化学修饰方法的血红蛋白衍生物，包括但不限于用于以下的方法：与聚亚烷基氧偶联、与磷酸吡哆醛反应、与二醛反应、与双-联阿司匹灵(diaspirin)酯反应、与碘乙酰胺或其他硫醇封闭试剂反应或在诸如2,3-二磷酸甘油酸酯(2,3-DPG)或化学类似化合物的试剂存在下反应；或基因交联的血红蛋白衍生物，诸如2αβ2(二αβ血红蛋白)，其中二α部分包含两条α链，这两条α链与例如共价连接每条α链的N末端和C末端的甘氨酸接头在基因上交联。
四聚体血红蛋白可包含天然存在的和/或非天然存在的α、β和γ珠蛋白链多肽序列。
四聚体血红蛋白可以是人血红蛋白、牛血红蛋白、猪血红蛋白、羊血红蛋白、马血红蛋白或来自其他无脊椎动物的血液，以及重组和/或转基因产生的血红蛋白。
在四聚体血红蛋白为人血红蛋白[例如，包含两条α珠蛋白链(UniProt保藏号：P69905)；和两条β珠蛋白链(UniProt保藏号：P68871)]的情况下，每一N*均可独立地表示存在于α珠蛋白链的1位、8位、12位、17位、41位、57位、61位、62位、91位、100位、128位和140位处；或β珠蛋白链的1位、9位、18位、60位、62位、66位、67位、83位、96位、121位、133位和145位处的任一个或多个氨基酸残基中的氮。在某些实施方案中，每一N*均独立地表示存在于α珠蛋白链的100位处的氨基酸残基中的氮。
在四聚体血红蛋白为牛血红蛋白[例如，包含两条α珠蛋白链(UniProt保藏号：P01966)；和两条β珠蛋白链(UniProt保藏号：P02070)]的情况下，每一N*均可独立地表示存在于α珠蛋白链的1位、8位、12位、17位、41位、57位、62位、69位、91位、100位、128位和140位处；或β珠蛋白链的1位、7位、16位、18位、58位、60位、64位、65位、75位、81位、94位、103位、119位和131位处的任一个或多个氨基酸残基中的氮。在某些实施方案中，每一N*均独立地表示存在于β珠蛋白链的1位和81位处的任一个或多个氨基酸残基中的氮。
在四聚体血红蛋白为猪血红蛋白[例如，包含两条α珠蛋白链(UniProt保藏号：P01965)；和两条β珠蛋白链(UniProt保藏号：P02067)]的情况下，每一N*均可独立地表示存在于α珠蛋白链的1位、7位、11位、16位、40位、56位、61位、68位、90位、99位、127位和139位处；或β珠蛋白链的1位、9位、18位、60位、62位、66位、67位、77位、83位、88位、133位和145位处的任一个或多个氨基酸残基中的氮。还已知交联反应中氧的存在影响所得交联的血红蛋白的p50值。取决于富马酰基交联反应中的氧含量，所得富马酰基交联的血红蛋白以及硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的p50值可具有5-70mmHg范围的值。
在某些实施方案中，使血红蛋白在氧合条件下交联，得到p50值为5-20mmHg或10-20mmHg的富马酰基交联的血红蛋白，以及其硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，使血红蛋白在脱氧条件下交联，得到p50值为20-70mmHg、20-70mmHg、30-70mmHg、40-70mmHg、40-60mmHg、38-50mmHg、45-65mmHg或55-65mmHg的富马酰基交联的血红蛋白，以及其硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在血红蛋白首先通过血红蛋白与碘乙酰胺反应而被硫基封闭(thioblock)，由此形成硫基封闭的血红蛋白；使由此形成的硫基封闭的血红蛋白与富马酰基交联剂交联，由此形成富马酰基交联的硫基封闭的血红蛋白；且使富马酰基交联的硫基封闭的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触，由此形成硫代琥珀酰基交联的硫基封闭的血红蛋白的情况下，在脱氧条件下交联的所得硫代琥珀酰基交联的硫基封闭的血红蛋白的p50值可在15-50mmHg、25-50mmHg或35-50mmHg范围，而在氧合条件下交联的所得硫代琥珀酰基交联的硫基封闭的血红蛋白的p50值可在5-20mmHg、5-15mmHg、5-10mmHg或10-15mmHg范围。
在某些实施方案中，R1是烷基或-(CR2)nY；或R1是选自由以下组成的组的基团：
和
N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-1000的整数。
在R1是以下基团的情况下：
m可以是1-1000、1-900、1-800、1-700、1-600、1-500、1-400、1-300、1-200、1-100、1-50、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5。
在R1是-(CR2)nY的情况下，n可以是0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2。在某些实施方案中，每个R独立地为氢或烷基。在某些实施方案中，R1是-(CH2)nY。
在某些实施方案中，Y是-(CRR2R3)，其中R在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2；并且R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。在某些实施方案中，R是氢。在某些实施方案中，R2是-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；并且R3是-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2。
在某些实施方案中，Y是-(CRR2R3)，其中R是氢；R2是氢、-N(R4)2、-NH(C＝O)R4或-NH(C＝O)N(R4)2；并且R3是-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2。
在某些实施方案中，R1是-(CH2)n(CHR2R3)，其中n是1、2、3或4；R2是-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；R3是-CO2R4或-(C＝O)NHR4；并且每一R4独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基和杂芳基。
在某些实施方案中，R1是-(CH2)n(CHR2R3)，其中n是1、2、3或4；R2是-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；R3是-CO2H；并且每一R4独立地选自由氢或烷基组成的组。
在某些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白包括α2β2四聚体牛血红蛋白，其包含两条α珠蛋白链(UniProt保藏号：P01966)和两条β珠蛋白链(UniProt保藏号：P02070)，其中β珠蛋白链与式1的至少一个硫代琥珀酰基交联基团缀合，其中R1选自由以下组成的组：
/>
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中至少一个N*表示β珠蛋白链的N-末端的氮，并且至少一个N*表示β珠蛋白链的81位的赖氨酸侧链中的氮。
在替代实施方案中，本公开还提供了其中式1中描绘的硫被硒、二硫化物和二硒化物替换的类似物，其中R1和每一N*均如本文所述的任何一个或多个实施方案中所定义。
在替代实施方案中，本公开还提供硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其包含四聚体血红蛋白和至少一个式1a的硫代琥珀酰基交联基团：
或其共轭盐或两性离子，其中每一N*均独立地表示选自由以下组成的组的氮：血红蛋白中的赖氨酸残基侧链中的氮和血红蛋白中的N-末端的氮；并且R1是烷硫基。
在某些实施方案中，烷硫基是式2a的基团：
其中n是选自由0、1、2、3和4组成的组的整数；其中R在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；R2是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；R3是氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-CO2R4、-(C＝O)NHR4、-OR4或-N(R4)2；并且R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；或烷硫基是选自由以下组成的组的基团：
或其共轭盐，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，n是1或2；R是氢；R2是-NHR4或-NH(C＝O)R4；并且R3是氢、-OR4、-CO2R4或-(C＝O)NHR4，其中R4在每种情况下均独立地选自由氢和烷基组成的组。
在某些实施方案中，烷硫基选自由以下组成的组：
/>
及/>
或其共轭盐或两性离子，其中m是选自1-1000的整数。
在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白是分离的和/或基本上纯净的。在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白基本上不含基质。
本公开还提供一种药物组合物，其包含本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的载体。
本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和它们的药学上可接受的盐可单独或在药物组合物中与药学上可接受的载体或稀释剂根据标准药学实践组合施用于受试者。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可在胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下和局部，优选的方法是静脉内施用。
因此，本公开提供药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。本公开的药物组合物可特别配制成以液体形式施用，包括适于以下的那些形式：(1)胃肠外施用，例如作为例如无菌溶液或悬浮液通过静脉内施用。
如本文所述，本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的某些实施方案可含有碱性官能团，诸如氨基，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离碱形式的本发明纯化的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白与适合的有机酸或无机酸反应并且在随后的纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括溴化物、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。
本公开的化合物的药学上可接受的盐包括例如来自无毒有机酸或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规的无毒盐包括衍生自诸如以下的无机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由诸如以下的有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic)等。
在其他情况下，本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的相对无毒的无机碱加成盐和有机碱加成盐。这些盐同样可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离酸形式的纯化化合物与适合的碱(诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
在组合物中还可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂以及抗氧化剂。
制备包含硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的药物的方法包括使本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白与载体和任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过如下方式制备所述制剂：均匀地且紧密地使本文所述的化合物与液体载体(液体制剂)、液体载体(之后冻干)(用于用无菌水等复原的粉末制剂)或微细的固体载体或两者缔合，然后如有必要，使产品成形或包装产品。
适于胃肠外施用的本公开的药物组合物包含一种或多种本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白与以下中的一种或多种的组合：药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液、在使用之前即可被重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，它们可含有糖(诸如蔗糖)、醇、非离子型表面活性剂(诸如Tween 20)、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、螯合剂、使所述制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
本公开的药物组合物中可采用的适合的水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣材料、在分散体的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物对本公开的化合物的作用。还可能期望在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
药物组合物可包含3-15g/dL硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含4-15g/dL；5-15g/dL；5-14g/dL；6-14g/dL；7-13g/dL；8-12g/dL；9-11g/dL；或9.5-10.5g/dL硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含分离的和基本上纯净的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白：包含一个、两个和三个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。可通过改变交联反应的反应条件和/或通过借助纯化来分离不期望的富马酰基交联的血红蛋白交联和/或硫代琥珀酰基交联的血红蛋白硫醇加成产物来容易地控制存在于药物组合物中的不同硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的数目和它们的相对量。在某些实施方案中，药物组合物包含具有一个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；具有两个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；和具有三个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含具有一个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；具有两个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；和具有三个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其质量比分别为2.8-3.4:5.6-6.2:0.7-1.3、2.9-3.3:5.7-6.1:0.8-1.2、3.0-3.2:5.8-6.0:0.9-1.1或3.1:5.9:1.0。
在某些实施方案中，药物组合物包含具有一个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，所述血红蛋白相对于存在于药物组合物中的所有硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的总重量(例如，相对于存在于药物组合物中的具有一个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；具有两个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白；和具有三个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的总重量)为0.1-99％wt/wt、0.1-95％wt/wt、0.1-90％wt/wt、0.1-80％wt/wt、0.1-70％wt/wt、0.1-60％wt/wt、0.1-50％wt/wt、10-50％wt/wt、20-50％wt/wt、20-40％wt/wt、25-45％wt/wt或25-35％wt/wt。
在某些实施方案中，药物组合物包含具有两个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，所述血红蛋白相对于存在于药物组合物中的所有硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的总重量为0.1-99％wt/wt、0.1-95％wt/wt、0.1-90％wt/wt、10-90％wt/wt、20-90％wt/wt、20-80％wt/wt、20-70％wt/wt、30-70％wt/wt、40-70％wt/wt、50-70％wt/wt、50-60％wt/wt或55-65％wt/wt。
在某些实施方案中，药物组合物包含具有三个式1的硫代琥珀酰基交联基团的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，所述血红蛋白相对于存在于药物组合物中的所有硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的总重量为0.1-99％wt/wt、0.1-95％wt/wt、0.1-90％wt/wt、0.1-80％wt/wt、0.1-70％wt/wt、0.1-60％wt/wt、0.1-50％wt/wt、0.1-40％wt/wt、0.1-30％wt/wt、0.1-20％wt/wt、5-20％wt/wt或5-15％wt/wt。
药物组合物可包含小于10重量％、小于9重量％、小于8重量％、小于7重量％、小于6重量％、小于5重量％、小于4重量％、小于3重量％、小于2重量％、小于1重量％、小于0.5重量％或小于0.1重量％的富马酰基交联的血红蛋白；或基本上不含富马酰基交联的血红蛋白。
硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白可以90:10到99.99:0.01的质量比存在于药物组合物中。在某些实施方案中，硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和富马酰基交联的血红蛋白可分别以91:9到99.99:0.01、92:8到99.99:0.01、93:7到99.99:0.01、94:6到99.99:0.01、95:5到99.99:0.01、96:4到99.99:0.01、97:3到99.99:0.01、98:2到99.99:0.01、99:1到99.99:0.01、99.5:0.5到99.99:0.01或99.9:0.1到99.99:0.01的质量比存在于药物组合物中。在某些实施方案中，药物组合物基本上不包含富马酰基交联的血红蛋白。
在某些实施方案中，药物组合物还包含抗氧化剂。示例性的抗氧化剂包括但不限于半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基-半胱氨酸、谷胱甘肽、2,3-二巯基-l-丙醇、1,4-丁烷二硫醇、连二亚硫酸钠、其他生物相容性硫醇和抗坏血酸盐。抗氧化剂可抑制或逆转高铁血红蛋白的形成。
在某些实施方案中，药物组合物包含5％(w/w)或更少的抗氧化剂。在某些实施方案中，药物组合物包含4.5％(w/w)或更少；4.0％(w/w)或更少；3.5％(w/w)或更少；3.0％(w/w)或更少；2.5％(w/w)或更少；2.0％(w/w)或更少；1.5％(w/w)或更少；1.0％(w/w)或更少；0.9％(w/w)或更少；0.8％(w/w)或更少；0.7％(w/w)或更少；0.6％(w/w)或更少；0.5％(w/w)或更少；0.4％(w/w)或更少；0.3％(w/w)或更少；0.2％(w/w)或更少；或0.1％(w/w)或更少的抗氧化剂。在某些实施方案中，药物组合物包含0.001到1％(w/w)；0.01到1％(w/w)；0.01到1％(w/w)；0.01到0.9％(w/w)；0.01到0.8％(w/w)；0.01到0.7％(w/w)；0.01到0.6％(w/w)；0.01到0.5％(w/w)；0.01到0.4％(w/w)；0.01到0.3％(w/w)；0.05到0.3％(w/w)；0.1到0.3％(w/w)；或0.15到0.25％(w/w)的抗氧化剂。
在某些实施方案中，药物组合物包含小于约10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、5重量％、4重量％、3重量％、2重量％、1重量％、0.5重量％或0.1重量％的高铁血红蛋白。
在某些实施方案中，本文提供一种固体药物组合物，其包含如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白、NAC、蔗糖和Tween 20。
在某些实施方案中，本文提供一种药物组合物，其包含如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白、NAC、NaCl和乙酸钠。在某些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白、NAC、NaCl、乙酸钠、蔗糖和Tween 20。
本公开还提供制备本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可通过本领域普通技术人员已知的任何数目的熟知方法容易地制备。
在某些实施方案中，用于制备硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法包括：使四聚体血红蛋白与富马酰基交联剂接触，由此形成富马酰基交联的血红蛋白；使富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触，由此形成硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
本领域已知的能够分子内交联血红蛋白的任何富马酰基交联剂均可用于本文所述的方法中。在某些实施方案中，富马酰基交联基团可由式4化合物表示：
其中每一LG可独立地为本领域中的任何离去基团。示例性离去基团包括但不限于Cl、Br、I、3,5-二溴水杨酸根或水杨酸根等。
在某些实施方案中，LG选自由以下组成的组：
式4化合物可原位进行或形成，例如通过富马酸与羰基活化剂和任选的偶联添加剂的反应。
示例性羰基活化剂包括但不限于碳化二亚胺，诸如DCC、DIC、EDC、CIC、BMC、CPC、BDDC、PIC、PEC和BEM、脲阳离子盐(uronium salt)/铵盐(aminium salt)，诸如HATU、HBTU、TATU、TBTU、HAPyU、TAPipU、HAPipU、HBPipU、HAMBU、HBMDU、HAMTU、5,6-B(HATU)、4,5-B(HATU)、HCTU、TCTU和ACTU，鏻盐，诸如AOP、BOP、PyAOP、PyBOP、PyOxm、PyNOP、PyFOP、NOP和PyClock，亚胺盐(immonium salts)，诸如BOMI、BDMP、BMMP、BPMP和AOMP。
示例性的偶联添加剂包括但不限于HOBt、6-NO2-HOBt、6-Cl-HOBt、6-CF3-HOBt、HOAt、HODhbt、HODhat、HOSu和Oxyma。
在某些实施方案中，交联剂是富马酸水杨基酯类似物，其中每一水杨基的芳基环均独立地任选地被取代。
在某些实施方案中，交联剂选自由以下组成的组：富马酸双-3,5-二溴水杨基酯(DBSF)、富马酰基氯和富马酸双(水杨基)酯。
在使交联剂与四聚体血红蛋白接触的步骤中，交联剂与四聚体血红蛋白的摩尔比可分别为0.8:1到20:1。在某些实施方案中，交联剂和四聚体血红蛋白分别以0.8:1到19:1、0.8:1到18:1、0.8:1到17:1、0.8:1到16:1、0.8:1到15:1、0.8:1到14:1、0.8:1到13:1、0.8:1到12:1、0.8:1到11:1、0.8:1到10:1、0.8:1到9:1、0.8:1到8:1、0.8:1到7:1、0.8:1到6:1、0.8:1到5:1、0.8:1到4:1、0.8:1到3.5:1、0.8:1到3:1、0.8:1到2.5:1、0.8:1到2:1、0.8:1到1.5:1、1:1到3:1、1.1:1到3:1、1.5:1到3:1、2:1到3:1或2.25:1到2.75:1的摩尔比存在。
在使交联剂与四聚体血红蛋白接触的步骤中，四聚体血红蛋白的浓度可以是5–25g/dL。在某些实施方案中，使交联剂与四聚体血红蛋白接触的步骤中四聚体血红蛋白的浓度可以是5–20g/dL、10–20g/dL、10–18g/dL、10–16g/dL、10–15g/dL、11–15g/dL、12–15g/dL或13–15g/dL。
四聚体血红蛋白可与交联剂在极性质子溶剂中(诸如在水溶液中)反应。在某些实施方案中，交联反应在水中发生。
为了促进交联反应，可将反应溶剂的pH维持在大于7的pH。在某些实施方案中，交联反应溶剂的pH具有7-10、8-10、8.5-9.5、8.7-9.3或8.9-9.1的pH。
由此形成的富马酰基交联的血红蛋白可任选地使用本领域技术人员已知的任何方法(诸如通过过滤、热诱导沉淀、离心、色谱等)纯化。
然后可使富马酰基交联的血红蛋白与硫醇反应，由此形成硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
硫醇可由如本文所述的任何实施方案中所定义的式R1SH表示。
富马酰基交联的血红蛋白可以5-20g/dL的浓度存在于与硫醇的反应中。在某些实施方案中，富马酰基交联的血红蛋白以5-18g/dL、5-16g/dL、5-14g/dL、5-12g/dL、7-12g/dL、8-12g/dL或9-11g/dL的浓度存在于与硫醇的反应中。
硫醇可以1-500mM的浓度存在于与富马酰基交联的血红蛋白的反应中。在某些实施方案中，硫醇可以1-450mM、1-400mM、1-350mM、1-300mM、1-250mM、1-200mM、1-180mM、1-160mM、1-140mM、1-120mM、1-100mM、10-100mM、20-100mM、30-100mM、30-90mM、40-80mM、77.5-310mM、174-3110mM、9.7-77.5mM、19.4-77.5mM或38.8-77.5mM的浓度存在于与富马酰基交联的血红蛋白的反应中。
硫醇和富马酰基交联的血红蛋白的反应可在7-11的pH下进行。在某些实施方案中，硫醇和富马酰基交联的血红蛋白的反应在7-11、7-10、7.4-10、7.4-9、7.4-8.2或8.2-9的pH下进行。通过使用期望范围内的pH缓冲液或根据需要向反应混合物中添加布朗斯特碱(base)，可将硫醇加成反应溶剂的pH维持在期望的pH。适当的布朗斯特碱和pH缓冲液的选择完全在本领域普通技术人员的技能范围内。有用的布朗斯特碱包括但不限于I族和II族的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐；有机胺等。
富马酰基交联的血红蛋白可与硫醇在极性质子溶剂中(诸如在水溶液中)反应。在某些实施方案中，硫醇加成反应在水中发生。
通常可进行硫醇与富马酰基交联的血红蛋白的反应，直到所有富马酰基交联的血红蛋白起始材料均转化为期望的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，富马酰基交联的血红蛋白不再转化为期望的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，和/或杂质和/或副产物的浓度增加超过期望的量。取决于反应条件，硫醇与富马酰基交联的血红蛋白的反应可能需要1-72hr、6-72hr、12-72hr、24-72hr、36-72hr、48-72hr、60-72hr、12-48hr或24-48hr。在硫醇与富马酰基交联的血红蛋白的反应速率非常慢的情况下(例如，诸如在某些高分子量聚乙二醇化硫醇的情况下)，硫醇与富马酰基交联的血红蛋白的反应可能需要长达一个月。
由此形成的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可任选地使用本领域技术人员已知的任何方法(诸如通过过滤、热诱导沉淀、离心、色谱等)纯化。
本公开还提供使用本文所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的治疗性方法。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可用于可使用血红蛋白的氧载体的任何治疗性方法中。
本公开提供用于增加有需要的受试者的血液循环系统体积的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，受试者罹患出血性休克。
本公开提供向有需要的受试者的组织和器官供应氧的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。在某些实施方案中，受试者罹患缺血，包括例如心肌缺血-再灌注损伤。缺血可以是全局性的或局部性的。
本公开提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。硫代琥珀酰基交联的血红蛋白可单独或与一种或多种癌症治疗剂和/或放射疗法组合施用以治疗癌症。
在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：白血病、头颈癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌和脑癌。在某些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌或结直肠癌。
癌症治疗剂可以是硼替佐米(bortezomib)、5-氟尿嘧啶、多柔比星(doxorubicin)或顺铂。
本公开还提供治疗有需要的受试者的系统性红斑狼疮的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
本公开还提供治疗有需要的受试者的外周动脉疾病的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
本公开还提供治疗有需要的受试者的创伤性脑损伤的方法，其中所述方法包括向受试者的系统中输注治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案组合的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
实施例
实施例1：方法概述
制备半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的方法的示例性示意性流程图示于图2中。对从屠宰场收集的牛全血进行处理、裂解并通过超滤步骤和柱色谱加以纯化，以产生高度纯化的血红蛋白溶液(PHS)。为了防止血红蛋白解离成异型二聚体，通过与DBSF的交联反应使四聚体血红蛋白稳定，同时通过超滤步骤去除残余的DBSF和其水解衍生物，以使DBSF和3-5,二溴水杨酸(DBSA)水平低于0.03％(w/w)。通过富马酰基桥交联的血红蛋白(富马酰基交联的血红蛋白)通过以下方式而修饰：半胱氨酸与存在于富马酰基交联的血红蛋白中的富马酰基基团在脱氧条件下进行1,4-加成反应，以形成高铁血红蛋白水平<2％的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白，之后是超滤纯化步骤，以使半胱氨酸和胱氨酸水平低于0.03％(w/w)。为了降低高铁血红蛋白的水平，将浓度为0.05％到0.2％的N-乙酰基半胱氨酸添加到含有上述半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的溶液中。
实施例2：高度纯化的牛血红蛋白溶液的制备
通过离心从全牛血中分离血细胞，并且对收集的血细胞进行细胞洗涤步骤(Lima,M.C.,2007,Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol,35(4):431-47)。在某些实施方案中，文献中所述用于从血细胞中分离和纯化血红蛋白的方法可用于制备当前方法中的血红蛋白(Houtchens,R.A.和Rausch,C.W.,2000，美国专利6,150,507；Wong,B.L.和Kwok,S.Y.,2011，美国专利7,989,593B1)。通过中空纤维过滤步骤进一步从收集的血细胞中去除残余量的血浆。将低渗溶液与经洗涤的血细胞混合，以通过严格控制的过程释放细胞内血红蛋白。经由0.2μm过滤步骤从细胞裂解物中去除细胞碎片，之后进行额外的超滤步骤以去除部分杂质，以形成部分纯化的血红蛋白溶液。为了进一步纯化血红蛋白溶液，在负模式阴离子柱色谱步骤之前，对血红蛋白溶液进行缓冲液交换，以使其盐浓度降至最低。收集含有高度纯化血红蛋白的流过级分，调整其pH、tHb和盐浓度，无菌过滤并在下游工艺之前储存在2-8℃。在对无基质血红蛋白的制备进行严格工艺控制的情况下，对高度纯化的血红蛋白的质量和纯度进行分析，并将其汇总于表1中。
表1：高度纯化的血红蛋白溶液中污染物和杂质的水平。
LOD：检测极限；BLOD：低于检测极限
实施例3：富马酰基交联的四聚体血红蛋白的制备
在脱氧条件(即0.9％w/v NaCl水溶液中小于0.1mg/L的溶解氧水平)下进行交联反应。将DBSF添加到高度纯化的牛血红蛋白溶液中以形成富马酰基交联的血红蛋白。该稳定化程序使四聚体形式的血红蛋白(约65kDa)稳定，防止解离成二聚体形式并通过肾脏排泄。四聚体血红蛋白的稳定化是在10-30℃于惰性氮气气氛(溶解氧水平维持在小于0.1mg/L)下,通过高度纯化的血红蛋白(tHb＝13-15g/dL)与2.5摩尔当量的DBSF在pH 9.0下进行4小时反应而发生,以防止血红蛋白氧化而形成在生理学上无活性的高铁血红蛋白。在反应期间，通过添加脱氧的0.1-0.5M NaOH溶液维持反应pH。然后通过使用30kDa标称分子量截止(NMWCO)膜进行切向流过滤来纯化反应混合物。在纯化过程中，通过将乙酸盐缓冲液(99mM NaCl，46mM乙酸钠)连续进给到反应罐中，将血红蛋白溶液的浓度维持在9.5-10.5g/dL。在经历10–16渗滤体积后完成纯化。通过尺寸排阻色谱(SEC)确定所获得的富马酰基交联的四聚体血红蛋白的纯度。
实施例4：使用尺寸排阻色谱确定血红蛋白稳定化
将装配有PDA检测器和尺寸排阻柱(ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱，1.7μm，4.6mm×300mm)的UPLC系统(ACQUITY UPLC H级系统)用Tris-MgCl2缓冲液(50mMTris、750mM MgCl2和0.116mM EDTA-Na2，pH 6.5)以0.25mL/min的流动速率平衡400分钟。将样品(3mg/mL)用水新鲜制备并通过SEC分析，检测波长设置为280nm。在该柱条件下，所有非交联的牛血红蛋白均解离成二聚体形式，如图3A中所示，而交联的血红蛋白显示为四聚体并具有少量的八聚体，如图3B中所示。从SEC色谱图中，在9.4min、10.8min和11.5min的保留时间内观察到的洗脱峰分别是血红蛋白的八聚体、四聚体和二聚体形式的蛋白质信号。通过对应峰的积分强度来定量不同形式血红蛋白的百分比。在完成交联反应后，反应混合物含有至少85重量％交联的四聚体牛血红蛋白(65kDa)、小于10重量％交联的八聚体血红蛋白和小于5重量％二聚体血红蛋白，如图3B中所示。牛富马酰基交联的血红蛋白分子的四聚体结构在β珠蛋白链(β-β交联)之间含有至少1到3个交联基团，如图4A中所示。
实施例5含硫醇试剂对β-β交联的修饰
使用含硫醇的分子(诸如半胱氨酸、高半胱氨酸、NAC和2-巯基乙醇(BME))实现富马酰基交联的血红蛋白中富马酰基交联基团的选择性修饰。有利地，β珠蛋白链的92位的半胱氨酸残基不与富马酰基基团反应。
实施例5A：半胱氨酸对β-β交联的修饰
在该实施方案中，β链之间的富马酰基交联基团被半胱氨酸修饰。在修饰步骤中，将pH 8.0-8.3的40-80mM半胱氨酸与富马酰基交联的血红蛋白(tHb＝7-10g/dL)在乙酸盐缓冲液(99mM NaCl，46mM乙酸钠，pH8.2-8.4)中在10-30℃于溶解氧(DO)水平维持低于0.1mg/L的脱氧条件下孵育15-30小时。通过过滤步骤去除反应混合物中的残余半胱氨酸/胱氨酸，该过滤步骤使用30kDa NMWCO膜，利用乙酸盐缓冲液使反应混合物通过10-16渗滤体积(DV)，以使半胱氨酸/胱氨酸水平低于0.03％(w/w)，如表2中所示。除了半胱氨酸/胱氨酸水平外，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白中DBSF和其水解衍生物(DBSA)的水平也低于0.03％(w/w)。
表2：过滤步骤后半胱氨酰基-琥珀酰基交联的牛血红蛋白中半胱氨酸和胱氨酸的水平。
批号 半胱氨酸％(w/w) 胱氨酸％(w/w)
C8002 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
C8003 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
C8005 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
BLOQ：低于定量极限
通过ESI-MS分析评估富马酰基交联的血红蛋白经半胱氨酸修饰的完成情况。将装配有电喷雾电离三重四极质谱仪和C3柱(Agilent,Poroshell 300SB-C3,5μm,1.0mm×75mm)的UPLC系统(Agilent 6460)用含0.1％甲酸的乙腈以0.2mL/min的流动速率平衡30分钟。将样品(0.3mg/mL)用水新鲜制备，并通过ESI-MS系统使用正离子模式进行分析。通过对应的TIC色谱图的去卷积来获得样品的ESI-MS质谱。在饱和时发现半胱氨酸以1:1化学计量加成到β-β交联珠蛋白链，如图4B中所示。如图4A中所示，DBSF经由β珠蛋白链之间的交联使血红蛋白稳定，产生3个主要种类，其分别含有1、2和3个交联桥且具有约31988Da、32068Da和32148Da的分子量。半胱氨酸氨基酸(121Da)共价键合到这些β-β交联的珠蛋白链的富马酰基基团，产生如图4B中所示的分别为32,109Da、32,310Da和32,511Da的种类。
通过ESI-MS/MS分析进一步分析样品，以确认富马酰基交联的血红蛋白的β-β交联的富马酰基基团被半胱氨酸氨基酸修饰。通过10％SDS-PAGE分析样品，并使用0.1％考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250、20％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸使其显现。将对应于约32kDa的主要交联珠蛋白链的蛋白质条带从SDS-PAGE凝胶切离，切割成立方体(1×1mm)，并且用50％乙腈/20％50mM碳酸氢铵溶液脱色。将脱色的凝胶立方体在37℃利用在50mM碳酸氢铵中的10ng/μL测序级胰蛋白酶进行凝胶内消化。在被胰蛋白酶消化后，通过利用50％(v/v)乙腈和1％(v/v)三氟乙酸中来提取胰蛋白酶消化肽。收集上清液并且在45℃通过SpeedVac去除溶剂。将胰蛋白酶消化肽溶解于0.1％(v/v)甲酸中，通过反相C18柱分离并使用Orbitrap-Velos质谱仪加以分析。将ESI-MS/MS数据输入pLink搜索引擎中用于交联位点分析。如图5中所示，鉴定出在β珠蛋白链的1位的N末端氮和第81位的赖氨酸侧链氮处交联的肽。重要的是，交联肽的分子量为201Da而不是80Da(富马酰基基团的分子量)，确认半胱氨酸氨基酸(MW＝121Da)共价偶联到β-β交联肽的富马酰基基团中，而不是β珠蛋白的92位处的半胱氨酸的硫醇基团中。
通过上述方法产生包含半胱氨酰基-琥珀酰基化交联基团的新型血红蛋白类似物。所产生的含有半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的药物组合物在存在0.2％(w/w)NAC的情况下在氮气下保存并具有以下产品特征：tHb＝9.5-10.5g/dL、pH 7.4-8.4、O2Hb≤10％、MetHb≤5％、内毒素≤0.25EU/mL和在90-100％范围的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白。
实施例5B：含硫醇试剂对β-β交联的修饰的比较
当使富马酰基基团与其他含硫醇试剂(诸如半胱氨酸、高半胱氨酸和2-巯基乙醇)于pH 8.2下反应时，观察到富马酰基基团与硫醇试剂之间不同程度的修饰。基于空间和电子效应(pKaSH值)的考虑来选择含硫醇试剂作初步研究(其包括但不限于半胱氨酸、β-巯基乙醇和高半胱氨酸)。
将不同浓度(111μL；1000mM、775mM、258mM和86mM，在RA-缓冲液中，pH＝8.2)的脱气硫醇试剂(包括半胱氨酸(pKaSH＝8.35)、β-巯基乙醇(pKaSH＝8.87)和高半胱氨酸(pKaSH＝9.6))添加到1mL脱氧富马酰基交联的血红蛋白溶液(9.0g/dL,pH＝8.2)中(Pitman,I.H.和Morris,I.J.,1979,Aust J Chem,32:1567-73)。在第3、6和24小时，收集样品并使用脱盐柱(150μL到Bio-Spin P6；2次)去除过量的硫醇。如图6中所示，使用ESI-MS对样品进行分析，且将结果汇总于表3中。
表3：富马酰基交联的血红蛋白与不同硫醇的反应性。
x：富马酰基-硫醇偶联反应的不完全饱和
√：富马酰基-硫醇偶联反应的饱和
富马酰基交联的血红蛋白与硫醇之间的富马酰基-硫醇反应的程度以时间和浓度依赖性方式进行。在与不同浓度的硫醇孵育3小时和6小时后，未修饰的富马酰基交联的血红蛋白仍可被检测到。在24小时时，与77.5mM半胱氨酸和100mMβ-巯基乙醇的反应完全修饰了富马酰基交联的血红蛋白中β-β交联的所有富马酰基基团，而在与更低浓度的半胱氨酸、β-巯基乙醇和高半胱氨酸孵育的血红蛋白,血红蛋白混合物中仍可检测到未修饰的富马酰基交联的β-β珠蛋白链。
这些结果表明，β-β交联的富马酰基基团经历了与硫醇的高效的迈克尔加成(Michael addition)(1,4-加成)反应。优化诸如pH、盐浓度、硫醇的当量和反应持续时间的反应条件，从而实现把90-100％的富马酰基交联的血红蛋白转化为硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
值得注意的是，交联的血红蛋白的交联基团与硫醇(诸如半胱氨酸或NAC)之间的此类修饰如所预期的不会发生在琥珀酸双3,5-二溴水杨基酯(DBSS)交联的血红蛋白中，如图7中所示。
实施例6：富马酰胺与烷基硫醇在水性条件下的反应研究
使用模型分子N,N’-双(1-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(羧基)戊基)富马酰胺(BocLysF；图8a)进行富马酰胺与烷基硫醇在水性条件下的反应的确认。在BocLysF(15mM)与模型烷基硫醇(77.5mM)(包括β-巯基乙醇和半胱氨酸)在水性条件(0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝8.2，脱氧)下反应7天后，反应混合物的MS谱清楚地显示起始材料BocLysF的完全消耗和硫醇加成产物的预期质量峰的出现(M+H+；分别为649Da和692Da)。如从反应混合物的NMR分析所示，发现富马酰胺双键信号丢失、伴随成对质子耦合峰的在C2碳上琥珀酰胺的形成和胺信号的分离。这些观察结果可通过富马酰胺与烷基硫醇之间通过硫醇-迈克尔加成途径发生的加成反应引入一对成对质子到所得琥珀酰胺的C2碳中来合理解释。重要的是，在NMR谱中观察到预期的琥珀酰胺和残余烷基硫醇，并且反应混合物是纯净的，表明富马酰基和烷基硫醇的完全反应。因此，它是富马酰基交联的蛋白质(包括血红蛋白)的交联后修饰和功能化的理想反应。富马酰胺BocLysF和所得琥珀酰胺(包括N,N’-双(1-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(羧基)戊基)-1-(2-羟基乙硫基)-琥珀酰胺(BocLysF-BME)；图8b)和N,N’-双(1-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(羧基)戊基)-1-(S-半胱氨酰基)琥珀酰胺(BocLysF-Cys；图8c))的完整表征数据示于表4-6中。
表4：d6-DMSO中BocLysF的1H和13C信号的完全归属。
表5.d6-DMSO中BocLysF-BME的1H和13C信号的完全归属。
表6.d6-DMSO中BocLysF-Cys的1H和13C信号的完全归属。
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实施例7：药物组合物中半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的纯度
如实施例5中所述，通过半胱氨酸与富马酰基交联的血红蛋白的β-β交联的富马酰基基团的反应产生含有半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的药物组合物。
通过ESI-MS分析评估由上述实施方案产生的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的纯度。通过在连接到带有C3柱(Agilent Poroshell 300SB-C3,5μm,1.0mm×75mm)的液相色谱系统(Agilent 6460)的Agilent 6540电喷雾电离四极飞行时间质谱仪上进行LC-MS来分析样品，并使用Agilent MassHunter定性分析软件中的最大熵算法对质谱图进行解卷积。通过将来自解卷积的MS数据的分子质量与理论数值进行匹配来鉴别交联的种类。使用解卷积谱的曲线下面积估计分子种类的相对丰度。
基于ESI-MS谱的分析，发现富马酰基交联的血红蛋白含有分别以28％、58％和15％摩尔比存在的一个(1XL)、两个(2XL)或三个(3XL)富马酰基交联，而其中至少有1个富马酰基桥在β珠蛋白链之间交联。在用所述半胱氨酸修饰后，在ESI-MS谱中检测不到对应于未修饰的富马酰基交联的β-β珠蛋白链的质量的峰。相反，发现峰以相似的比例存在，但分子量偏移121Da、242Da和363Da，其分别对应于1个(1XL+1Cys)、2个(2XL+2Cys)和3个半胱氨酸氨基酸(3XL+3Cys)的化学计量添加。表7显示每一组分在半胱氨酸修饰之前和之后的β-β交联的分子量。结果支持半胱氨酸与富马酰基交联的血红蛋白之间的富马酰基硫醇偶联反应完全完成，并且在测试反应条件下用半胱氨酸修饰后实现至少95％或更高转化率的观点。
表7：半胱氨酸修饰之前和之后富马酰基交联的血红蛋白中β-β珠蛋白链(β-β)的比例。
NA：不适用
实施例8：pH和反应介质对富马酰基-硫醇偶联反应的反应速率的作用
对富马酰基-硫醇偶联反应在其他反应参数(包括pH和反应介质)下的反应速率进行测试。将脱气的β-巯基乙醇溶液(111μL；775mM，于RA-或具有额外0.9％NaCl的RA-中)添加到1mL脱氧的富马酰基交联的血红蛋白溶液(8.7g/dL，pH＝7.4、8.2或9.0；于RA-或具有额外0.9％NaCl的RA-中)中。在第6小时和24小时，收集样品并使用脱盐柱(150μL到Bio-SpinP6；2次)去除过量的硫醇。使用ESI-MS分析对样品进行分析，且将结果示于表8中。在6小时收集的样品中未检测到富马酰基桥的完全饱和。在不同pH值和盐浓度的反应条件中，在pH7.4或pH 9.0下，～77.5mMβ-巯基乙醇对富马酰基桥的修饰在24小时内完成。尽管在pH 8.2下用77.5mM半胱氨酸实现了完全修饰，但在pH 8.2下即使用77.5mMβ-巯基乙醇孵育24小时后仍检测到未修饰的富马酰基桥的存在，显示修饰仍不完全。结果还揭示，当反应介质的盐度增加时，对偶联反应的反应速率没有可观察到的作用。
表8：pH和反应介质对富马酰基交联的血红蛋白与β-巯基乙醇之间的富马酰基-硫醇偶联反应的反应速率的作用。
x：富马酰基-硫醇偶联反应的不完全饱和
√：富马酰基-硫醇偶联反应的饱和
*不含林格氏乙酸盐的缓冲液(Ringer’s Acetate Minus Buffer)(RA-缓冲液)
实施例9：含硫醇试剂浓度和反应时间对富马酰基-硫醇偶联反应的反应速率的作 用
将β-巯基乙醇(111μL；于RA-中的775mM、388mM、194mM、97mM和48mM，pH 9.0)或半胱氨酸(111μL；于RA-中的775mM、388mM、194mM和97mM，pH＝9.0)的脱气溶液添加到1.0mL脱氧富马酰基交联的血红蛋白溶液(9.0g/dL,pH＝9.0)中。在第6、24、48和72小时，收集样品并使用脱盐柱(150μL到Bio-Spin P6；2次)去除过量的硫醇。使用ESI-MS对所有样品进行分析，且将结果汇总于表9中。富马酰基-硫醇反应速率以浓度依赖性方式增加，而半胱氨酸和β-巯基乙醇浓度从19.4mM增加到38.8mM，可使其与富马酰基基团的偶联速率加倍。在24小时内实现了半胱氨酸或β-巯基乙醇对富马酰基基团的完全修饰。尽管反应速率在低硫醇试剂浓度(诸如9.7mM)下显著降低，但通过将反应时间延长到72小时实现了富马酰基桥的饱和。
表9：硫醇浓度和反应时间对富马酰基交联的血红蛋白与硫醇(半胱氨酸和β-巯基乙醇)之间的富马酰基-硫醇偶联反应的反应速率的作用。
x：富马酰基-硫醇偶联反应的不完全饱和
√：富马酰基-硫醇偶联反应的饱和
富马酰基基团的完全修饰可能受到硫醇试剂的物理化学性质和次优偶联条件限制。由于导致富马酰基基团饱和的反应条件在不同的硫醇试剂之间有所不同，因此固有的分子性质(诸如空间效应和电子效应)和反应条件(至少与硫醇试剂的当量，反应pH和反应时间起组合作用)不仅影响修饰速率，而且还影响偶联反应的总体转化率。例如，将77.5mM、174mM和310mM N-乙酰基半胱氨酸(NAC)与富马酰基交联的血红蛋白在pH 8.2下孵育，通过ESI-MS对在24小时和48小时收集的样品进行分析。结果显示，对于所有浓度，富马酰基-硫醇偶联反应的转化率在24小时时均低于95％。仅当使用310mM NAC将孵育时间延长到48小时时，才观察到95％的富马酰基-硫醇偶联反应。当与使用半胱氨酸的富马酰基-硫醇反应相比，使富马酰基桥饱和所需的NAC浓度较半胱氨酸高4倍，且孵育时间加倍。这些结果表明，可能需要更高的NAC浓度和更长的孵育时间才能实现NAC对交联血红蛋白的富马酰基基团>95％的转化。这些结果表明，除非本领域普通技术人员有意尝试进行富马酰基-硫醇偶联反应并努力优化反应条件以确保完全反应，否则用作赋形剂以减少或抑制高铁血红蛋白形成的典型硫醇试剂浓度不会导致硫代琥珀酰基交联的血红蛋白以高转化水平形成(表10)。
表10：NAC浓度和反应时间对富马酰基-硫醇偶联反应的反应速率的作用。
x：富马酰基-硫醇偶联反应的不完全饱和
√：富马酰基-硫醇偶联反应的饱和
实施例10：含硫醇试剂修饰后富马酰基交联的血红蛋白的p50值的变化
血红蛋白的氧亲和力性质可通过其由氧解离曲线测量的p50值来描述。血红蛋白的氧解离曲线显示不同氧张力下血红蛋白饱和度之间的关系，并且p50是血红蛋白50％饱和时的氧张力。
对富马酰基交联的血红蛋白与不同含硫醇试剂之间完全反应产生的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的p50值进行测量。使用Hemox分析仪(TCS Scientific,New Hope,PA)获得血红蛋白溶液的氧解离曲线。用克拉克(Clark)氧电极测量氧张力，并且使用内置双波长分光光度计测量血红蛋白饱和度。在最终血红蛋白浓度为0.05g/dL的Hemox溶液(135mMNaCl，5mM KCl和30mM TES，pH 7.4)中进行测量，并且在整个测量中将温度保持在37℃。进行基于计算机的氧解离曲线分析，得到氧结合的p50。通过Hemox分析仪软件(TCS HemoxDAQ系统，2.0版)中包含的非线性最小二乘程序，将Adair方程拟合到每条氧解离曲线，而推导出氧解离参数。
结果揭示，通过将富马酰基交联的血红蛋白在310mM NAC下孵育48小时，超过95％的富马酰基交联的血红蛋白转化为硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，且其p50值增加了11％。相比之下，与未修饰的富马酰基交联的血红蛋白相比，通过与77.5mM半胱氨酸或100mMβ-巯基乙醇孵育制备的纯度超过95％的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白溶液显示出可比的p50值，如表11中所示。
表11：用不同硫醇试剂修饰后的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的p50值。
结果还揭示，根据如实施例5A中所述的制备程序，通过将半胱氨酸与硫醇封闭的富马酰基交联的血红蛋白(血红蛋白中β球蛋白的92位半胱氨酸残基在与富马酰基交联剂交联反应之前与碘乙酰胺反应而被封闭(烷基化))缀合，实现了完全修饰。该半胱氨酰基-琥珀酰基交联的硫醇封闭的血红蛋白的p50值，对于p50值为约36mmHg(脱氧条件下交联)或约9mmHg(氧合条件下交联)，在修饰后也保持不变，如表12中所示。这揭示半胱氨酸与具有不同携氧能力的富马酰基交联的血红蛋白的偶联令人惊讶地并未改变它们的p50值。
表12：由在脱氧或氧合条件下交联的硫醇封闭的富马酰基交联的血红蛋白产生的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的p50值。
实施例11：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的体外稳定性
在诸如半胱氨酸、NAC或谷胱甘肽(GSH)的小分子硫醇存在下，测试半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白中半胱氨酰基-琥珀酰基化基团的稳定性。这些小分子硫醇通常在血红蛋白的治疗药物制剂中用作赋形剂，例如以降低高铁血红蛋白水平。
在缺氧环境下，将富马酰基交联的血红蛋白和半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白与NAC、半胱氨酸或GSH以1:4或1:8摩尔比(100mg/mL血红蛋白)孵育。通过连接到带有C3柱(Agilent Poroshell 300SB-C3,5μm,1.0mm×75mm)的液相色谱系统(Agilent 6460)的Agilent 6540电喷雾电离四极飞行时间质谱仪上进行ESI-MS来分析在不同时间点采集的样品。使用Agilent MassHunter软件中的最大熵算法对质谱进行解卷积。通过将来自解卷积的MS数据的分子质量与理论数值进行匹配来鉴别交联的珠蛋白种类。使用解卷积谱的曲线下面积估计分子种类的相对丰度。
表13显示于8倍摩尔过量的NAC存在下，从12个月内的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的ESI-MS数据推导的不同交联β-β种类的相对丰度的估计值。曲线下面积(AUC)的主要交联种类在至少12个月后保持稳定，显示交联种类的丰度随时间稳定。
表13：于NAC存在下的半胱氨酰基-琥珀酰基交联血红蛋白中β-β珠蛋白链的12个月稳定性。
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百分比是如由解卷积LC-MS谱所估计的不同交联种类的相对丰度。“XL”——交联，“Cys”——半胱氨酸。
相比之下，富马酰基交联的血红蛋白的富马酰基基团在9周监测期内连续与NAC反应，NAC共价连接到血红蛋白分子的β-β交联(表14)。半胱氨酸和GSH的类似反应也很明显(表15和表16)。
表14：于0.2％NAC存在下的富马酰基交联血红蛋白中β-β珠蛋白链的9周稳定性。
百分比是如由解卷积LC-MS谱所估计的不同交联种类的相对丰度。XL”——交联，“NAC”——N-乙酰基半胱氨酸。
表15：于4倍摩尔过量半胱氨酸下的富马酰基交联血红蛋白中β-β珠蛋白链的4小时稳定性。
表16：于4倍摩尔过量谷胱甘肽下的富马酰基交联血红蛋白中β-β珠蛋白链的4小时稳定性。
百分比是如由解卷积LC-MS谱所估计的不同交联种类的相对丰度。“XL”——交联，“GSH”——谷胱甘肽。
实施例12：作为赋形剂的NAC在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液中的稳 定性
含硫醇的化合物通常作为赋形剂用于血红蛋白的氧疗法中，用作转化和预防功能失调的高铁血红蛋白。在该实验中，NAC作为赋形剂用于半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液中，并且NAC在将功能失调的高铁血红蛋白还原为功能性血红蛋白形式时，被氧化为N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(NAC2)。在储存期内的不同时间点取样，并通过反相液相色谱测量半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液中的NAC和其氧化产物NAC2的水平。对于测量，用5％偏磷酸处理样品以使蛋白质沉淀，分离上清液，并在XBridged C18柱(5μm，4.6mm×250mm)上，使用含有100mM磷酸钠(pH 2.3)、5.7mM 1-辛烷磺酸钠:甲醇91:9(v/v)的缓冲液中的等度洗脱。NAC和NAC2使用它们各自在9.375μg/mL到300μg/mL范围的校准曲线进行定量。
与富马酰基交联的血红蛋白溶液中NAC和NAC2的总水平(图9A)形成对比，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在长时段内具有稳定的硫醇赋形剂NAC水平，如图9B中所示。
实施例13：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的功能稳定性
使用Hemox分析仪(TCS Scientific公司)测量在0.2％NAC(w/v)存在下富马酰基交联的血红蛋白和半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液的p50值。通过氧气鼓泡30min使Hemox缓冲液(pH 7.4)中的0.5mg/mL的血红蛋白产物样品氧合，然后通过氮气鼓泡将其脱氧，直到pO2达至1.9mmHg。使用TCS软件，使用Adair方程调整被测量样品的不完全氧合，来分析所得氧平衡曲线。
半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在产生后至少3个月内具有稳定的p50值。相比之下，在10周内，富马酰基交联的血红蛋白的p50值增加了12％，这可能归因于NAC与交联血红蛋白分子的β-β交联的共价结合，如表17中所示。
表17：于0.2％NAC存在下的富马酰基交联血红蛋白和半胱氨酰基-琥珀酰基交联血红蛋白的p50稳定性。
实施例14：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的体内稳定性
为了评估血红蛋白产品的体内稳定性，将雄性Sprague Dawley大鼠用异氟烷(5％用于诱导，1-2％用于维持)麻醉，并经由股静脉以每小时0.8-2.0mL以620mg/kg的剂量水平静脉内输注富马酰基交联的血红蛋白或半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白。在输注后2小时，从股动脉收集0.5-1mL血液样品到肝素管中。通过强阴离子交换色谱从血浆样品中富集血红蛋白产物。将血浆样品在20mM Tris-HCl pH 8.9中稀释80000倍，并加载到在20mMTris-HCl pH 8.9中平衡的HiTrap Q HP柱(GE Healthcare)上。使用HiTrap Q HP柱(GEHealthcare)以20mM Tris-HCl pH8.9中的0-400mM NaCl的梯度洗脱血红蛋白产物。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳评估血红蛋白产物的富集。汇集的级分通过使用Agilent 6540电喷雾电离四极飞行时间质谱仪进行ESI-MS分析。
如图10A中所示，与输注前相比，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的β-β交联在体内没有经过硫醇的进一步修饰。相比之下，富马酰基交联的血红蛋白产物的β-β交联在体内经半胱氨酸和NAC修饰(图10B)。半胱氨酸是血浆中重要的氧化还原调控物，并且NAC是血红蛋白产品制剂中的赋形剂。这些结果显示了半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的体内稳定性。
实施例15：出血性休克中组织氧合的恢复(富马酰基交联的血红蛋白相对于半胱 氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白)
如下在Sprague Dawley大鼠的严重出血性休克模型中评估肝组织氧合：
第1组：富马酰基交联的血红蛋白溶液(650mg Hb/kg体重)；和
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(650mg Hb/kg体重)。
将Sprague Dawley大鼠麻醉并布置用于外科手术的仪器。通过大的中间切口进行剖腹术以暴露肝脏。将大面积氧传感器(LAS,Oxford Optronix,UK)插入大鼠肝脏的右叶和三角叶之间并使其稳定。在收集基线氧张力水平后，通过出血使大鼠出现低血压，以触发氧供给/需求失衡，其如通过升高的动脉乳酸盐水平(8到11mM/L)和<-12mM/L的动脉碱过量所反映的。在诱导休克并满足准入标准后，向大鼠输注650mg/kg富马酰基交联的血红蛋白溶液(第1组)或半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(第2组)。监测并比较这两种血红蛋白分子的肝氧张力水平，直到输注后1小时。
如图11中所示，结果表明，在整个实验中，与富马酰基交联的血红蛋白溶液(第1组)相比，650mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(第2组)的输注显示肝组织氧合的显著增加。
这揭示与常规的富马酰基交联的血红蛋白相比，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在缺血/缺氧条件下具有更佳的氧卸载能力。
实施例16：缺血性肢体中血液灌注的恢复(富马酰基交联的血红蛋白相对于半胱 氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白)
通过模拟外周动脉疾病进行股动脉结扎，在小鼠中评估缺血性肢体中血流的恢复。
第1组：阴性对照(体积匹配的RA-缓冲液，n＝8)
第2组：富马酰基交联的血红蛋白溶液(1600mg/kg，n＝2)
第3组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(1600mg/kg，n＝3)
为了诱导危重肢体缺血，将ICR(CD-1)小鼠麻醉以进行外科手术。将股动脉结扎到远端点，其在此处分叉为隐动脉和腘动脉。在24小时动脉结扎后，经由推注尾静脉注射向小鼠施以不同的治疗。进行串行激光多普勒成像分析(Moor instruments,Devon,UK)以监测基线、恰在结扎后、治疗后第7天、治疗后第14天和治疗后第21天的血流量，并且对从膝盖到脚趾的平均血流量进行定量和计算。执行用Tivi106 Oxygen Mapper分析仪(WheelsBridgeAB,Sweden)调节的Tivi600组织活力成像仪，以监测基线、恰在结扎后、治疗后30分钟、治疗后60分钟、治疗后第7天、治疗后第14天和治疗后第21天时氧合血红蛋白的变化。对从膝盖到脚趾的氧合Hb(Oxy-Hb)的平均变化进行定量和计算。
如图12中所示，在治疗后30分钟，接受半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗的小鼠的组中的Oxy-Hb与RA-缓冲液组(阴性对照)相比有显著增加(p<0.05)，而富马酰基交联的血红蛋白治疗与RA-缓冲液组相比，未显示Oxy-Hb的显著增加。在治疗后第21天，用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(110.5±7.8％，相对于对照，p<0.01)和富马酰基交联的血红蛋白溶液(106.0±2.6％，相对于对照，p<0.05)两者治疗的小鼠均显示出显著更高于RA-缓冲液(74.6±12.7％)的Oxy-Hb水平。
如图13中所示，与RA-缓冲液组(阴性对照)相比，在治疗后第7天，接受半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(34.9±3.0％,p<0.001)和富马酰基交联的血红蛋白溶液(29.3±2.0％,p<0.05)的小鼠的组中的缺血性肢体血流量有显著改善，从第7天开始，观察到用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗的灌注显著增加的类似趋势。在治疗后第21天，与稳定的富马酰基交联的血红蛋白溶液(41.6±4.3％，相对于对照，p<0.05)和RA-缓冲液(23.5±9.7％)相比，用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(56.5±9.6％，相对于对照，p<0.001)治疗的小鼠获得血液灌注的更显著改善。
为了深入了解第21天Oxy-Hb和灌注的“持续”改善的机制，在治疗后的不同时间点通过流式细胞术分析循环间充质干细胞群体。如图14中所示，结果表明在诱导肢体缺血后观察到CD45-CD29+、CD45-CD105+、CD45-CD106+MSC群体的增加，并且直到第21天与对照相比持续更长的时段。与灌注的恢复一致，在半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白治疗后观察到MSC群体的更显著增加。
总之，在外周动脉疾病模型中，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在氧合血红蛋白、血流量和循环间充质干细胞群体方面显示出比常规富马酰基交联的血红蛋白更好的治疗效果。
实施例17：使用稳定化的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的方法
将本公开的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液用于改善氧的递送以及针对全局和局部缺血/缺氧病况的治疗，所述全局和局部缺血/缺氧病况包括出血性休克、心肌缺血再灌注损伤、外周动脉疾病和外伤性脑损伤。另外，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液还用于如下治疗自身免疫性疾病和癌症治疗：
出血性休克：出血性休克中组织氧合和平均动脉压的恢复；
外周动脉疾病：危重肢体缺血中血流量的显著恢复和Oxy-Hb水平的增加；
心肌缺血再灌注损伤：心脏心肌梗塞的显著减小；
系统性红斑狼疮：组织/器官中免疫复合物形成的显著减少和组织/器官损伤的改善；
外伤性脑损伤：在受控皮质撞击(CCI)诱导的外伤性脑损伤中，神经和运动功能两者的显著改善，以及TBI诱导的星形胶质细胞活化的减少；和
癌症治疗：分别在三阴性乳腺癌(TNBC)和结直肠癌异种移植模型中的肿瘤生长的显著抑制。
半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白的剂量为大约100-1600mg/kg。
实施例18：食蟹猴的严重出血性休克的治疗
将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白用于治疗食蟹猴的严重出血性休克。
如下在食蟹猴的严重出血性休克模型中评估肌肉组织氧合和平均动脉压：
第1组：自体血浆(阳性对照，施用当量体积的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白)(n＝2)
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(500mg/kg体重)(n＝2)
将食蟹猴麻醉并布置用于外科手术的仪器。将针包裹的氧传感器(OxfordOptronix,UK)插入三头肌中并使其稳定。将血压传感器(Biopac Systems Inc,US)插入左股动脉中并使其稳定。在收集基线氧张力水平和平均动脉压后，通过出血使猴处于低血压状态，以将平均动脉压降低到20mmHg，并保持维持20-24mmHg范围的平均动脉压60分钟。在诱导休克并满足标准后，向猴输注自体血浆(阳性对照)或半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液。测量并比较这两组的肌肉氧合张力水平和平均动脉压，直到输注后3小时。
如图15中所示，结果表明500mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液的输注导致复苏后肌肉组织氧合的增加，并且在3小时复苏后保持较好的恢复。对于平均动脉压恢复，在3小时复苏时间点后，输注半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液产生比自体血浆治疗更好的平均动脉压恢复，如图16中所示。
这揭示半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白增加了有严重出血性休克的食蟹猴的组织氧合，并维持了平均动脉压的更好恢复。
实施例19：小鼠的外周动脉疾病的治疗
将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白用于小鼠的减弱性危重肢体缺血中的血液灌注和氧递送。
通过模拟外周动脉疾病进行股动脉结扎，在小鼠中评估缺血性肢体中血流的恢复。在本研究中，将32只小鼠随机分配为4组，每组8只小鼠。
第1组：RA-缓冲液(阴性对照，与第4组体积匹配)；
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(400mg Hb/kg体重)；
第3组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(800mg Hb/kg体重)；和
第4组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白(1600mg Hb/kg体重)。
为了诱导危重肢体缺血，将ICR(CD-1)小鼠麻醉以进行外科手术。将股动脉结扎到远端点，其在此处分叉为隐动脉和腘动脉。在24小时动脉结扎后，经由推注尾静脉注射向小鼠施以不同的治疗。进行串行激光多普勒成像分析(Moor instruments,Devon,UK)以监测基线、恰在结扎后、治疗后第7天、治疗后第14天和治疗后第21天的血流量，并且对从膝盖到脚趾的平均血流量进行定量和计算。运行用Tivi106 Oxygen Mapper分析仪(WheelsBridgeAB,Sweden)调节的Tivi600组织活力成像仪，以监测基线、恰在结扎后、治疗后30分钟、治疗后60分钟、治疗后第7天、治疗后第14天和治疗后第21天时氧合血红蛋白的变化。对从膝盖到脚趾的氧合Hb的平均变化进行定量和计算。
如图17中所示，在治疗后30分钟，与RA-缓冲液组(第1组)相比，接受半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白(Hb)的所有小鼠组中的Oxy-Hb均有显著的剂量依赖性增加(800mg/kg Hb,*p<0.05；1600mg/kg Hb,*p<0.05)。在治疗后第21天，用400mg/kg Hb(102.3±4.0％,p***<0.001)、800mg/kg Hb(125.7±32.3％,**p<0.01)和1600mg/kg Hb(128.0±30.5％,**p<0.01)治疗的小鼠显示出显著更高于RA-缓冲液(74.6±12.7％)的氧合Hb水平。
如图18中所示，从治疗后第7天开始，与RA-缓冲液组(第1组)相比，接受半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液的所有小鼠组(第2-4组)中的缺血性肢体血流量均有显著改善(400mg/kg Hb,**p<0.01；800mg/kg Hb,p<**0.01；1600mg/kg Hb,***p<0.001)。在治疗后第21天，用400mg/kg Hb(36.5±8.5％,*p<0.05)、800mg/kg Hb(45.7±14.7％,**p<0.01)和1600mg/kg Hb(61.0±15.2％,***p<0.001)治疗的小鼠显示出比RA-缓冲液(23.5±9.7％)更高的显著血流量。
为了深入了解第21天Oxy-Hb和灌注的“持续”改善的机制，在治疗后的不同时间点通过流式细胞术分析循环间充质干细胞群体。如图19中所示，结果表明在诱导肢体缺血后观察到CD45-CD29+、CD45-CD105+、CD45-CD106+MSC群体的增加，并且直到第21天与阴性对照组相比持续更长时段。这与治疗后第21天Oxy-Hb和灌注显著增加的观察结果一致。
总之，实验数据证实，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白在小鼠的减弱性危重肢体缺血中活化了循环间充质干细胞，并导致灌注和氧递送的功能恢复。
实施例20：大鼠的心肌缺血-再灌注损伤的治疗
将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白用作心脏保护剂，以减小急性心肌缺血-再灌注大鼠模型中的心肌梗塞大小。将12只大鼠随机划分为如下2组：
第1组：乳酸化林格氏溶液(对照组)；和
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(100mg Hb/kg体重)。
在标准大鼠模型中建立心肌缺血和再灌注。简单地说，使用异氟烷在Wistar大鼠中诱导麻醉。然后将动物置于加热的啮齿动物手术台上，并用直肠探针连续监测内部温度。动物经历膀胱导管插入术以监测排尿量，右颈插管以允许输液，左颈动脉插管以进行连续动脉压监测和抽血，以及气管造口术。在通过锁孔剖腹术插入腹膜导管后，经重复推注5mg/kg硫喷妥钠(thiopental sodium)维持麻醉，并且经皮下给予0.1mg/kg丁丙诺啡(buprenorphine)确保镇痛。在诱导机械通气(潮气量12ml/kg，PEEP 3cmH2O，RR 80bpm)之前提供10ml/kg的流体推注，并将乳酸化林格氏溶液+葡萄糖2.5％的50-50混合物(10ml/kg/h)的连续输注用作维持。
在手术阶段结束时，在植入后60min的恢复期后，在第四肋骨与第五肋骨之间进行左侧胸廓切开术。在含有左前降支(LAD)冠状动脉的心肌区域周围放置圈套器，并通过拉紧圈套器诱导缺血。缺血期持续40min的短期结扎，之后是120min的再灌注。在缺血后20min输注100mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液或乳酸化林格氏溶液，并以1.5ml/kg/h的速率持续到再灌注后20min。连续测量心率、平均动脉血压和温度，并且将心肌梗塞/损伤的程度在组织学上评估为作为风险面积的比例的梗塞大小。
如图20中所示，当与对照组相比时，100mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液的输注证实心肌梗塞大小的显著减小。重要的是，在本研究中，当向动物静脉内施用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液时，在整个实验中，无论是在缺血期还是再灌注期期间，都没有对血压和血液动力学产生不利作用。
实施例21：系统性红斑狼疮小鼠模型中的肾脏保护作用
将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白用于治疗小鼠的系统性红斑狼疮(SLE)。
将染色质免疫的狼疮小鼠模型用于检查半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液对狼疮性肾炎的治疗作用。从分选纯化的凋亡免疫细胞制备活化的淋巴细胞来源的DNA(ALD-DNA)。如图21中所示，在第1天用溶解于弗氏完全佐剂(Freund’s compete adjuvant)中的ALD-DNA(100g/小鼠)免疫的C57BL/6小鼠中诱导鼠科狼疮性肾炎。在第14天和第28天用弗氏不完全佐剂对ALD-DNA(50g/小鼠)进行加强乳化。在2周的治疗期内，在第1、4、8和11天以800mg/kg静脉内施用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白。
在12周的疾病进展后，将小鼠划破并收获肾脏，将其固定并切片。通过用苏木精和伊红(H&E)将肾脏组织玻片染色来进行肾损伤评估，同时通过使用荧光染料标记的抗体对免疫复合物沉积(IgM和IgG)进行免疫荧光染色来进行肾小球免疫复合物沉积评估。评分系统如下所示：
0＝正常/无信号
1＝小于25％的肾小球中出现轻度细胞破坏/弱信号
2＝大于50％的肾小球中有中度细胞破坏以及出现气球状细胞和空泡形成/中等信号
3＝大于50％的肾小球中出现广泛的细胞破坏和空泡形成/广泛的强信号。用以下参数以0-15的总评分来评估肾小球活动性指数。
a)细胞增殖(0-3)
b)白细胞浸润(0-3)
c)纤维蛋白样坏死或核破裂(0-3)
d)细胞性新月体(0-3)
e)玻璃样血栓，铁丝环(0-3)
当与对照相比时，在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗时观察到肾小球IgG和IgM沉积的显著减少(图22)。此外，观察到显著低于对照的总肾小球活动性指数，显示在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗的肾脏中较少的细胞增殖、纤维蛋白样坏死和细胞性新月体(图23)。
总之，半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白显著改善了小鼠狼疮性肾炎的发展。
实施例22：大鼠严重外伤性脑损伤的治疗
将半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白用于治疗大鼠模型中受控皮质撞击产生的外伤性脑损伤(TBI)。评估作为单剂量施用的半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液的治疗对TBI后功能和组织病理学结果的作用。在本研究中，将21只Sprague Dawley大鼠随机分配为如下2组：
第1组：盐水缓冲液(阴性对照)；和
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(620mg Hb/kg体重)。
在实验开始前约14天，向每只大鼠植入带有BUTONVAB95BS(Instech)按钮的股静脉导管，并以12:12小时光/暗周期将其成对圈养在Opti-Rat笼中，随意提供食物和水，持续至少7天。为了通过开颅受控皮质撞击(CCI)诱导严重外伤性脑损伤，大鼠经皮下接受1.2mg/kg缓释丁丙诺啡(丁丙诺啡SRTM Lab)加0.03mg/kg常规丁丙诺啡(Vetergesic)或1.2mg/kg缓释丁丙诺啡30分钟或24小时，然后被麻醉以进行外科手术。通过使用无菌解剖刀刀片沿中线形成的单个切口来暴露颅骨，然后，使用微型钻孔装置(Harvard Apparatus,72-6065)在左顶骨中在用作最外部边界的冠状缝、矢状缝和人字缝的中心处执行6mm的圆形颅骨切开术，以暴露完整的硬脑膜。然后用无菌盐水填充环钻部位，直到准备好撞击。使具有完整硬脑膜的暴露皮质受到受控皮质撞击损伤。通过安装在Leica Impact OneTM装置上的撞击器致动器对暴露的皮质产生受控的皮质撞击，该装置具有5.0mm直径的撞击器杆尖，以4.0m/s的速度撞击皮质，并且皮质变形的深度设置为3.00mm，停留时间为200ms，以在左顶叶皮层内产生损伤。
在CCI手术结束时，使用无菌盐水清洁伤口，然后使用单次间断缝合使皮肤伤口闭合，并使大鼠恢复。在TBI后未给予补充氧。在CCI后一小时，大鼠接受620mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(第2组，n＝10)或当量体积的盐水(第1组，n＝11)的单次输注。
在TBI后4小时和第1、3和7天使用21点神经评分来评估神经功能，并且还在第3天和第7天分别通过圆筒和水平梯测试评估感觉运动功能。在TBI后第7天收获脑并处理用于组织化学分析。
在治疗组(第2组)和盐水对照组(第1组)两者中，单次严重TBI均在1-3天内诱导神经和运动缺陷，之后是到TBI后第7天的自发恢复。有趣的是，与盐水对照组相比，用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗将神经和运动功能两者改善到显著程度。结果显示，CCI后1小时，单剂量的620mg/kg半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液在第1天产生较好的神经学评分(神经评分改善26％，*p<0.05)，如图24中所示。同时，与第3天的盐水对照组相比，CCI后1小时用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗也显著改善了通过水平楼梯实验测量的TBI动物的表现(梯误差评分降低18％，*p<0.05)。相比之下，盐水对照组仅在第7天达到相同的恢复水平(*p<0.05，与同一组的该天相比)，表明半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白对加速TBI后功能恢复的作用(图25A)。然而，在圆筒实验(图25B)中未见此类改善，该测试通过攀爬触碰圆柱的光滑边缘的探索行为，以评估前爪的自发性活动能力。
除了在TBI诱导的大鼠模型中观察到的神经和运动功能两者的显著改善外，根据GFAP免疫荧光分析，用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗的大鼠还显示出TBI诱导的星形胶质细胞活化的显著降低(*p<0.05；t检验)，如图26中所示。
实施例23：癌症治疗研究：三阴性乳腺癌和结直肠癌的肿瘤抑制
三阴性乳腺癌和结直肠癌两者都由于实体瘤的形成和相关的缺氧环境而与不良预后和高死亡率相关。在寻找有效的治疗选项时，一些文献建议使用全身氧合，以通过削弱肿瘤微环境中缺氧-A2A腺苷受体(A2aR)驱动的免疫抑制来抑制各种癌症模型中实体瘤的生长和转移。因此，测试了半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白分别在抑制三阴性乳腺癌和结直肠癌中的肿瘤生长中的作用。
实施例23A：三阴性乳腺癌异种移植模型中肿瘤生长的抑制
在施用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液后，观察到TNBC4T1异种移植中肿瘤生长的显著抑制。采用鼠三阴性乳腺癌异种移植(TNBC)模型。在补充有10％FBS、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中于37℃在5％CO2下培养鼠TNBC 4T1细胞。将大约1×105个癌细胞(TNBC 4T1细胞系)皮下注射到4到6周龄雌性免疫感受态BALB/C小鼠中。在肿瘤已生长一周后，将荷瘤小鼠随机分为如下两组：
第1组：盐水缓冲液(对照)；和
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(400mg Hb/kg体重)。
对于每组，每周一次对4-6只小鼠给予盐水或半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(400mg/kg)，持续4周。从治疗的第一天开始，每三天记录肿瘤体积。使用修正的椭球公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2×LW2，其中L和W代表肿瘤块的长度和宽度，于每次测量时通过数字卡尺(Mitu-toyo公司，Tokyo,Japan)测量。结果证实，与对照组相比，在第2次注射后6天，在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗的小鼠中观察到TNBC 4T1异种移植中肿瘤生长的阻抑(22-51％)，如表18中所示。
表18：同基因4T1模型的归一化肿瘤体积相对于对照组的百分比变化。
实施例23B：结直肠癌异种移植模型中肿瘤生长的抑制
在施用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液后，观察到CT26异种移植中肿瘤生长的显著抑制，如表13中所示。采用鼠结直肠癌异种移植模型。在补充有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640中于37℃在5％CO2下培养鼠CT26细胞。将大约1×105个癌细胞(CT26细胞系)皮下注射到4到6周龄雌性免疫感受态BALB/C小鼠中。当肿瘤生长一周时，将荷瘤小鼠随机分为如下两组：
第1组：盐水缓冲液(对照)；和
第2组：半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液(400mg Hb/kg体重)
对于每组，每周一次对4-6只小鼠给予盐水或半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白(400mg/kg)，持续4周。从治疗的第一天开始，每三天记录肿瘤体积。使用修正的椭球公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2×LW2，其中L和W代表肿瘤块的长度和宽度，于每次测量时通过数字卡尺(Mitu-toyo公司，Tokyo,Japan)测量。结果证实，与对照组相比，在第2次注射后6天，在用半胱氨酰基-琥珀酰基交联的血红蛋白溶液治疗的小鼠中观察到CT26异种移植中肿瘤生长的阻抑(60％)，如表19中所示。
表19：同基因CT26模型的归一化肿瘤体积相对于对照组的百分比变化。
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Claims (18)

1.一种硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其包含四聚体血红蛋白和1个、2个或3个式1的硫代琥珀酰基交联基团：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中
所述硫代琥珀酰基交联基团使所述四聚体血红蛋白的两条β珠蛋白链交联，每一N*均独立地表示存在于β珠蛋白链的1位和81位处的任一个或多个氨基酸残基中的氮；并且
其中所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白是基本上纯净的，
其中R1是式2的基团：
其中n是选自由0、1、2、3和4组成的组的整数；
R是氢；
R2是氢、-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；
R3是-CO2R4；并且
R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢和烷基；
或R1是选自由以下组成的组的基团：
和N5-(1-((羧基甲基)氨基)-1-氧代-3λ3-丙-2-基)谷氨酰胺或其药学上可接受的盐，其中m是选自1-500的整数。
2.根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中n是1或2。
3.根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中R1选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中m是选自1-500的整数。
4.根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中所述四聚体血红蛋白是人血红蛋白、牛血红蛋白或猪血红蛋白。
5.根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白基本上不含基质。
6.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白和至少一种药学上可接受的赋形剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白以10-90％的重量百分比存在于所述药物组合物中。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的组合，所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白包含1个、2个或3个式1的硫代琥珀酰基交联基团。
9.一种用于制备根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的方法，其包括以下步骤：
使四聚体血红蛋白与富马酰基交联剂接触，由此形成富马酰基交联的血红蛋白；使所述富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触，由此形成根据权利要求1所述的硫代琥珀酰基交联的血红蛋白，其中使所述富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触的步骤为将含有富马酰基交联的血红蛋白的溶液的溶解氧水平降低到0.1mg/L；在低氧条件下将富马酰基交联的血红蛋白溶液与硫醇混合，以在至少95％的富马酰基桥与硫醇试剂反应以及将硫代琥珀酰基交联的血红蛋白的高铁血红蛋白水平降低到小于2％的条件下形成硫代琥珀酰基交联的血红蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述富马酰基交联剂选自由富马酸双-3，5-二溴水杨基酯(DBSF)、富马酰基氯和富马酸双(水杨基)酯组成的组。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫醇具有式3：
或其药学上可接受的盐或两性离子，其中
n是选自由0、1、2、3和4组成的组的整数；
R是氢；
R2是氢、-N(R4)2或-NH(C＝O)R4；
R3是-CO2R4；并且
R4在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢和烷基；或所述硫醇选自由以下组成的组：HS(CH2CH2O)mCH3和HS(CH2CH2O)mH、谷胱甘肽或其药学上可接受的盐，其中m是在1-500之间选择的整数。
12.根据权利要求11所述的方法，其中n是1或2。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫醇选自由以下组成的组： HS(CH2CH2O)mCH3及HS(CH2CH2O)mH或其药学上可接受的盐或两性离子，其中m是在1-500之间选择的整数。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触的步骤，所述富马酰基交联的血红蛋白和所述硫醇以至少1∶1的摩尔比存在。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触的步骤，所述富马酰基交联的血红蛋白和所述硫醇以至少1∶2的摩尔比存在。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述富马酰基交联的血红蛋白与硫醇或其药学上可接受的盐或两性离子接触的步骤，所述富马酰基交联的血红蛋白和所述硫醇以至少1∶3的摩尔比存在。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述富马酰基交联的血红蛋白和所述硫醇以大于1∶3的摩尔比存在。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫代琥珀酰基交联的血红蛋白呈分离的形式。
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