KR20220082811A - 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 유사체 및 이의 사용 및 제조 방법 - Google Patents

티오숙시닐-가교 헤모글로빈 유사체 및 이의 사용 및 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 혈액 대체제로서 유용한 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 유사체, 이를 포함하는 약학 조성물, 이의 사용 및 제조 방법을 제공한다.

Description

티오숙시닐-가교 헤모글로빈 유사체 및 이의 사용 및 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/893,220의 우선권을 주장하며, 이 가출원은 전체가 참고로 여기에 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 유사체, 이를 포함하는 제약 조성물, 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.
헤모글로빈은 일부 무척추 동물의 조직뿐만 아니라 거의 모든 척추 동물의 적혈구에 존재하는 철 함유 산소 수송 금속 단백질이다. 적혈구의 헤모글로빈은 폐에서 신체의 나머지 부분으로 산소를 운반한 다음 신체 세포에서 이산화탄소를 내쉴 수 있는 폐로 이산화탄소를 되돌리는 역할을 한다. 헤모글로빈은 이러한 산소 수송 특성을 가지고 있기 때문에 인간 또는 동물 유래 적혈구에서 추출한 정제 헤모글로빈은 생체 외에서 안정화되고 생체 내 및 생체 외에서 사용될 수 있다면 강력한 산소 치료제 개발에 사용하기에 이상적인 소재이다.
자연 발생 헤모글로빈은 2α 및 2β 글로빈 소단위체로 구성된 비공유 결합 이종사량체이며 일반적으로 적혈구 내에 존재할 때 안정하다. 그러나 적혈구에서 자연적으로 발생하는 헤모글로빈이 제거되면 불안정해지며 혈액 순환에서 2개의 이량체(αβ 글로빈 사슬)로 분할된다. 이량체 헤모글로빈은 저분자량(약 32kDa)으로 인해 사구체 여과를 통해 신장에서 빠르게 제거되거나(Bunn, HF et al., 1969, J Exp Med, 129: 909-23) 합토글로빈-CD163 경로를 통해 간에서 제거된다(Kristiansen, M. et al., 2001, Nature, 409: 198-201). 사량체 결합의 붕괴는 해리된 헤모글로빈이 신장을 통해 여과되어 배설될 때 신장 손상을 일으킬 뿐만 아니라 혈액 순환에서 기능적 헤모글로빈의 지속 가능성에 부정적인 영향을 미친다.
이러한 문제를 극복하기 위해 연구자들은 안정적인 사량체 구성 또는 증가된 분자량을 갖는 다양한 형태의 변형된 헤모글로빈(헤모글로빈 기반 산소 운반체, HBOC)을 개발하려고 시도했다. 이들 HBOC는 인간 또는 동물 유래 적혈구로부터 정제된 헤모글로빈으로부터 개발되고 분자내 또는 분자간 가교, 중합, PEG화 또는 캡슐화에 의해 추가로 변형된다(Keipert, PE et al., 1992, Biomater Artif Cells Immobil Biotechnol, 20: 737-45). 기질이 없는 헤모글로빈과 비교하여 이러한 HBOC는 사용된 헤모글로빈 변형 전략에 따라 더 긴 혈액 저류 및 다른 산소 수송 능력을 가질 수 있다.
이러한 HBOC의 안전성, 효능 및 약동학은 전임상 및 임상 시험에서 평가되었지만(Jahr, JS et al., 2012, Curr Drug Discov Technol, 9: 158-65; Kim, HW & Greenburg, AG, 2004, Artif Organs, 28: 813-28), 미국 식품의약국(FDA)은 아직 인간에게 사용하기 위한 HBOC를 승인하지 않았다. 인간 헤모글로빈 제품은 1993년부터 개발되어 3상 시험에서 평가되었지만 임상 시험 연구에서 보고된 바람직하지 않은 부작용 때문에 임상 사용을 위한 개발이 중단되었다(Hess, J. et al., 1991, Blood 78:356A; Jahr, JS et al., 2012, Curr Drug Discov Technol, 9:158-65, Winslow, RM, 2000, Vox Sang, 79:1-20, Cheng, DC et al., 2004, J Thorac Cardiovasc Surg, 127 : 79-86, Greenburg, AG et al., 2004, J Am Coll Surg, 198: 373-383, Hill, SE et al., 2002, J Cardiothorac Vasc Anesth, 16: 695-702).
무세포 인간 HBOC 제품의 사용 실패는 대조군에 비해 사망 및 심근경색의 위험이 유의하게 증가하는 것과 관련이 있는 것으로 보고되지만, Hemopure의 소 헤모글로빈 글루타머-250, HBOC-201은 다음의 치료에 승인되었다. 빈혈 및 2001년 이후 남아프리카에서 수술 중 사용을 위해(Lok, C., 2001, Nature, 410:855; Mer, M. et al., 2016, Transfusion(Paris), 56:2631-36) 또한 2014년 이후로 동종 수혈이 선택사항이 아닌 미국에서 생명을 위협하는 빈혈이 있는 환자에게 제공됨(Lundy, JB et al., 2014, Int J Burns Trauma, 4: 45-8; Posluszny, JA & Napolitano, LM, 2016, Archives of Trauma Research, 5: e30610, Resar, LM et al., 2016, Transfusion, 56: 2637-47).
신장 독성 문제는 헤모글로빈 해리를 방지하여 해결되지만 투여 후 혈관 수축은 HBOC 제품의 또 다른 안전 문제이다. 무세포 헤모글로빈은 적혈구 내부의 헤모글로빈과 관련하여 산화질소(NO)를 제거하는 데 훨씬 더 효과적인 것으로 나타났으며, 이는 HBOC 투여로 관찰된 혈관 수축 및 고혈압을 초래한다(Mozzarelli, A. et. al., 2010, Blood Transfus, 8(S3): s59-s68). 평균 동맥 혈압은 HBOC 주입 직후 증가했으며 이러한 증가는 종종 감소된 심박출량 및 증가된 총 말초 저항과 관련이 있다(Hess, JR et al., 1993, J Appl Physiol, 74(4):1769-78). 혈관 수축은 조직 관류 및 산소 공급을 제한할 수 있으며 혈액 손실 및 혈액 희석으로 고통받는 환자에게 심각한 역효과이다.
HBOC에 의한 NO 소거가 혈관수축으로 이어지는 주요 기전으로 간주되지만, 모세혈관 전 세동맥의 산소 압력(Winslow, RM, 2003, J Intern Med, 253(5): 508-17; Tsai, AG et al., 2003, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 284(4): H1411-9) 및 용액 점도(Gaucher-Di, SC et al., 2009, Biomaterials, 30(4): 445-51)와 같은 다른 가능한 요인도 고려된다. NO 소거 외에도 산소 과잉 공급(Winslow, RM, 2008, Biochim Biophys Acta, 2008, 1784: 1382-86) 및 헴 매개 산화 부작용(Alayash, AI, 1999, Nat Biotechnol, 17: 545-9; Alayash, AI, 2004, Nat Rev Drug Discov, 3: 152-9)을 포함한 HBOC 독성의 다른 메커니즘도 제안되었다.
NO에 대한 반응성이 낮고 산화적 부작용을 방지하기 위해 산소를 과잉 공급하는 능력이 감소된 일부 새로운 HBOC가 설계되었지만, 이러한 새로 설계된 HBOC와 관련된 일부 설명할 수 없는 독성이 전임상 연구에서 여전히 관찰되었다. 이러한 결과는 HBOC 변형의 다양한 화학과 HBOC 독성에 대한 영향이 완전히 이해되지 않았으며 HBOC의 부작용 프로파일이 화학적 및/또는 유전적 변형의 특성에 따라 다르다는 것을 보여주었다.
헤모글로빈 기반 산소 치료제의 최근 개발은 중합, PEG화, 가교 및 캡슐화와 같은 다양한 화학적 접근법을 통합하여 개선된 부작용 프로파일을 갖는 안정화된 다량체 헤모글로빈을 형성하여 안정화된 헤모글로빈이 적혈구 외부에서 기능할 수 있도록 한다. 선행 기술은 고도로 정제된 기질이 없는 헤모글로빈이 동물 적혈구를 용해한 후 열처리(Sakai, H. et al, 1994, Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 22(3) :651-6), 수상 추출(Lee, CJ & Kan, P., 1993, 미국 특허 5,407,579), 접선 유동 여과(Palmer, AF et al, 2009, Biotechnol Prog, 25(6): 1803-9; Elmer, J. et al, 2009, Biotechnol Prog, 25(5): 1402-10) 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피(Sun, G. & Palmer, AF, 2008, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 867( 1):1-7; Houtchens, RA & Rausch, CW, 2000, 미국 특허 6,150,507; Pliura, DH et al, 1996, 미국 특허 5,545,328)를 통해 다양한 정제 전략을 수행함으로써 얻을 수 있다고 교시하고 있다. 고도로 정제된 기질이 없는 헤모글로빈은 다양한 화학적 접근을 통해 지정된 산소 친화성을 가진 헤모글로빈 기반 제품을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이러한 접근법 중 화학적 가교결합은 사량체 내의 분자내 결합 및 안정화된 사량체 간의 분자간 결합을 통해 안정화된 다량체 헤모글로빈을 형성하는 하나의 일반적인 접근법이다. 이러한 화학적으로 안정화된 헤모글로빈은 추가로 변형되어 지정된 특성을 갖는 HBOC를 형성할 수 있다.
헤모글로빈 처리에 사용되는 화학적 가교제인 Bis-3,5-dibromosalicyl fumarate(DBSF)는 분자 내 가교를 통해 헤모글로빈을 안정화시킬 뿐만 아니라 헤모글로빈의 산소 친화력에도 영향을 미친다(Beanna, JN et al. 미국 특허 5,248,766; Wong BL 등 미국 특허 8,106,011 B1). 안정화된 다량체 헤모글로빈은 기질이 없는 헤모글로빈의 부작용을 줄이고 헤모글로빈의 순환 반감기를 증가시키기 위해 선호되는 형태이다. 그러나, 본 발명자들은 가교된 헤모글로빈 상의 푸마릴 부분이 시험관내 및 생체내에서 티올과 반응함을 확인하였다. 기존의 헤모글로빈 제품은 일반적으로 N-아세틸 시스테인(NAC) 또는 시스테인(Cys)과 같은 티올 함유 부형제와 함께 제형화되어 약학적 조성물에서 기능장애 메트헤모글로빈 수준을 감소시키는 것을 목표로 한다(Beanna, JN et al. 미국 특허 5,248,766). Timothy, EE 미국 특허 5,281,579, Wong BL 등 미국 특허 8,106,011 B1). 그러나 티올 함유 부형제와 가교 헤모글로빈의 푸마릴 부분의 반응은 메트헤모글로빈을 환원시키는 능력을 감소시키며, 이는 제품 저장 동안 HBOC 제품 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
인간에서 혈장의 산화환원 상태는 글루타티온, 시스테인(Cys) 및 호모시스테인과 같은 저분자량 티올에 의해 엄격하게 조절된다. 혈장 산화환원 상태의 불균형은 심혈관 질환과 관련된 것으로 밝혀졌다(Brunelli, E et al. Oxid Med Cell Longev, 1-11, 2017). 따라서, 선행기술에 의해 교시된 푸마릴기를 포함하는 가교결합제를 갖는 안정화된 다량체 헤모글로빈은 약제학적 조성물의 시험관내 불안정성 및 생체내 산화환원 시스템 불균형을 유발할 수 있는 문제이다. 따라서, 개선된 제품 안전성 프로파일 및 바람직한 산소 운반 특성을 가질 뿐만 아니라, 안정화된 다량체 헤모글로빈을 생성하는 기술에 대한 기술이 필요하다. 시험관 내 및 생체 내에서 티올과 반응하지 않는 가교제를 포함한다. 이러한 안정화되고 가교된 헤모글로빈은 다양한 의료 응용 분야에 따라 다양한 의료 응용 분야에서 사용될 수 있으며 다른 수준의 산소 친화도가 바람직한 경우에 그러하다.
본 개시내용은 일반적으로 티오숙시닐-가교 헤모글로빈, 이를 포함하는 제약 조성물, 및 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 티오숙시닐 가교결합제 중 적어도 하나는 헤모글로빈 안정화에 유용하다. 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈 형성의 개략도는 도 1에 도시되어 있다. 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈은 하나 이상의 푸마릴 가교결합제로 β - β 가교결합된 헤모글로빈에 티올의 분자간 1,4-첨가에 의해 생성될 수 있다.
시험관내 및 생체내에서 안정화된 헤모글로빈과 티올 사이의 반응을 피함으로써 푸마릴기를 함유하는 가교제를 사용하여 이전에 공지된 안정화된 헤모글로빈과 관련된 안정성 문제를 극복하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈이 본원에서 제공된다. 놀랍게도, 가교된 헤모글로빈의 푸마릴 부분에 대한 티올의 접합은 또한 생체내 조직 산소화를 개선하지만 유리하게는 p50 값을 변경하지 않는다.
제1 측면에서, 사량체 헤모글로빈 및 화학식 1의 적어도 하나의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 이 본원에 제공된다:
Figure pct00001
1
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온, 여기서
각각의 N*은 독립적으로 사량체 헤모글로빈의 라이신 잔기 측쇄의 질소 및 사량체 헤모글로빈의 N-말단의 질소로 이루어진 군에서 선택된 질소를 나타내고; 그리고
R1 은 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2 )nY이고, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2OR4, 또는 -(CRR2R3), 여기서 R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4 ; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R4 는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 R1 은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00002
, 및
N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수이다.
특정 실시양태에서, R1 은 하기 화학식 2의 부분(moiety)이다:
Figure pct00003
2
여기서 n은 0, 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 정수이고;
각 경우에 R은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4)2 , -NH(C=O)R4 , 또는 -NH(C=O)N(R4)2 이고;
R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4 , -(C=O)NHR4 , -OR4 또는 -N(R4)2 이고; 그리고
R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
또는 R1 은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00004
, 및
N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수이다.
특정 실시양태에서, n은 1 또는 2이고; R은 수소이고; R2는 -NHR4, -NH(C=O)R4, 또는 -NH(C=O)R4N(R4)2 이고; R3 은 수소, -OR4, -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고, 여기서 R4는 각 경우에 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
및
Figure pct00007
,
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온(여기서, m은 1 내지 1000에서 선택되는 정수임).
특정 실시양태에서, 각각의 N*은 독립적으로 사량체 헤모글로빈의 베타 글로빈 사슬에서 리신 잔기 측쇄의 질소 및 사량체 헤모글로빈의 베타 글로빈 사슬의 N-말단에 있는 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 실질적으로 순수하다.
화학식 1의 1, 2 또는 3개의 티오숙시닐 가교 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 티오숙시닐 가교 부분은 사량체 헤모글로빈의 2개의 베타 글로빈 쇄를 가교시킨다.
특정 실시양태에서, 사량체 헤모글로빈은 인간 헤모글로빈, 소 헤모글로빈, 또는 돼지 헤모글로빈이다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 실질적으로 기질이 없다.
제2 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 중 하나 이상 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 10-90%의 중량 백분율로 제약 조성물에 존재한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 화학식 1의 1, 2, 또는 3개의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈; 또는 이들의 조합을 포함한다.
제3 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈을 제조하는 방법이 본원에 제공된다:
사량체 헤모글로빈을 푸마릴 가교결합제와 접촉시켜 푸마릴 가교결합 헤모글로빈을 형성하는 단계; 푸마릴-가교 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시켜 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 형성하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 푸마릴 가교결합제는 비스-3,5-디브로모살리실 푸마레이트(DBSF), 푸마릴 클로라이드 및 비스(살리실) 푸마레이트 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 티올은 화학식 R1SH 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온을 갖고, 여기서 R1은 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY이고, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 R1 이 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY 로 이루어진 군으로부터 선택되고 , 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2OR4, 및 -(CRR2R3), 여기서 R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00008
, 및
N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수이다.
특정 실시양태에서, 티올은 하기 화학식 3을 갖는다:
Figure pct00009
3
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온, 여기서
n은 0, 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 정수이고;
각 경우에 R은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4) 2, 또는 -NH(C=O)R4이고;
R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4, 또는 -N(R4)2 이고; 그리고
R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 티올은 디티오트레이톨, HS(CH2CH2O)mCH3, HS(CH2CH2O)mH, 글루타티온 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 m은 1-1000 사이에서 선택된 정수이다.
특정 실시양태에서, n은 1 또는 2이고; R은 수소이고; R2는 -NHR4, -NH(C=O)R4, 또는 -NH(C=O)(NR4)2 이고; R3은 수소, -OR4, -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고, 여기서 R4는 각 경우에 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 티올은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00010
디티오트레이톨, HS(CH2CH2O)mCH3, 및 HS(CH2CH2O)mH 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온, 여기서 m은 1-1000 사이에서 선택된 정수이다.
특정 실시양태에서, 푸마릴-가교 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시키는 단계, 푸마릴-가교 헤모글로빈 및 티올은 1:1; 1:2; 또는 1:3 이상의 몰비로 존재하고;
특정 실시양태에서, 푸마릴-가교 헤모글로빈 및 티올은 1:3 초과의 몰비로 존재한다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 단리되고 실질적으로 순수한 형태이다.
제4 측면에서, 치료가 필요한 대상체에서 혈액 순환계의 용적을 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 치료학적 유효량을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다
제5 측면에서, 쇼크를 필요로 하는 대상체에서 쇼크의 치료를 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 본원에 기재된 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 치료적 유효량을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다.
제6 측면에서, 산소를 이를 필요로 하는 대상체의 조직 및 기관에 산소를 공급하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 치료적 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다.
제7 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상의 시스템에 수혈하는 것을 포함하고, 여기서 암은 삼중 - 음성 유방암 또는 결장직장암이다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 실질적으로 순수하다.
본 발명은 티올에 의한 푸마릴 가교 헤모글로빈의 변형에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 티올에 의한 푸마릴-가교결합된 헤모글로빈의 변형은 푸마릴-가교결합된 헤모글로빈의 p50 값을 10% 이하로 변경시킨다. 아래의 예에서, 시스테인이 푸마릴-가교 헤모글로빈의 푸마릴 부분에 접합되어 생성되는 650mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 주입은 쇼크 래트 모델에서 간 조직 산소화의 상당한 증가를 보여준다. 또한, 실험 전반에 걸쳐 푸마릴 가교 헤모글로빈과 비교하여 말초 동맥 질환 마우스 모델에서 개선된 혈류 회복에 의해 효능 향상이 더욱 입증되었다.
본 개시내용은 또한 티오숙시닐-가교 헤모글로빈의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 1) 푸마릴-가교 헤모글로빈을 함유하는 용액의 용존 산소 수준을 0.1 mg/L까지 감소시키는 단계; 2) 상기 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액과 티올을 저산소 조건에서 혼합하여 티오숙시닐의 메트헤모글로빈 수준뿐만 아니라 티올 시약과도 95% 이상의 푸마릴 가교가 반응하는 조건에서 티오숙시닐 가교 헤모글로빈을 형성하는 단계; 가교된 헤모글로빈은 2% 미만으로 감소되고 3) 선택적으로 임의의 잔류 티올을 0.03%(w/w) 미만으로 제거한다. N-아세틸 시스테인(NAC)을 약 0.05~0.2%의 농도로 첨가하여 생산과정에서 생성되는 메트헤모글로빈을 더욱 감소시키고 보관 중 생성되는 것을 방지한다. 또한, 본 발명은 커플링 반응에 사용되는 티올 시약의 당량, pH 값 및 반응 시간을 조절하여 티오숙시닐 가교 헤모글로빈을 고수율 및 순도로 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법은 37℃ 및 pH 7.4에서 측정시 약 5-70 mmHg 범위의 p50을 갖는 티오숙시닐- 가교 헤모글로빈을 제조하는데 사용될 수 있다. 헤모글로빈의 의도된 화학적 변형 및 의료 용도에 따라 다양한 수준의 산소 친화도가 바람직하다. 이러한 실시양태에서, 가교된 헤모글로빈의 푸마릴 부분에 접합하기 위해 사용되는 티올 함유 시약은 예를 들어 시스테인, NAC, β-메르캅토에탄올, 및 본원에 기재된 바와 같은 기타 티올 화합물을 포함할 수 있다. 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈은 β 글로빈 사슬 사이에 적어도 하나(1XL), 2개(2XL) 또는 3개(3XL)의 알킬 티올 가교결합제(들)를 함유하는 약 65kDa의 분자량을 갖는 사량체 헤모글로빈일 수 있다.
하기 실시예에서, 시스테인-숙시닐 가교된 소혈 헤모글로빈(bovine hemoglobin)을 함유하는 용액은 시스테인을 푸마릴-가교된 소혈 헤모글로빈의 푸마릴 부분에 접합함으로써 생성된다. 변형 단계에서는 pH 8.0-8.3의 40-80mM 시스테인이 사량체 헤모글로빈(tHb = 7-10g/dL)과 함께 -탈산소 조건(예: 용해 산소(DO) 수준이 0.1 mg/L 미만으로 유지됨)에서 10~30℃에서 15~30시간 동안 배양된다. 푸마릴 가교 헤모글로빈에서 푸마릴 부분이 시스테인에 의해 최대 95%까지 변형될 수 있으며 변형 후 시스테인-숙시닐 가교 헤모글로빈의 메트헤모글로빈 수준이 2% 미만으로 감소될 수 있다. 반응 혼합물의 잔류 시스테인/시스틴은 30 kDa NMWCO 막을 사용하는 여과 단계에 의해 제거될 수 있으며, 이를 통해 반응 혼합물을 아세테이트 완충액 (99mM NaCl, 46mM 아세트산나트륨)으로 10-16 정용여과 부피(DV)를 통해 여과하여 시스테인 및 시스틴 수준을 0.03%(w/w) 아래로 낮출 수 있다.
시스테닐-숙시닐 가교된 소혈 헤모글로빈을 포함하는 약제학적 조성물은 하기 제품 특성을 갖는 0.2%(w/w) NAC의 존재 하에 질소 하에 유지될 수 있으며, tHb = 9.5-10.5g/dL, pH 7.4-8.4, O2Hb ≤10%, MetHb(메트헤모글로빈) ≤5%, 내독소 ≤0.25EU/mL 및 95-100% 순도 범위의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈이다.
본 개시내용은 또한 티오숙시닐-가교 헤모글로빈, 예를 들어 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 산소 전달을 개선하고 출혈성 쇼크, 심근 허혈 재관류 손상, 말초　동맥 질환 및 외상성 뇌 손상을 포함하는 전역 및 국소 허혈/저산소 상태에 대한 치료에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 자가면역 질환 치료 및 암 치료에도 사용된다.
본 개시의 상기 및 다른 목적 및 특징은 첨부 도면과 함께 취해질 때 개시의 다음의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1 은 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 형성의 개략도이다.
도 2는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 형성 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 3 은 DBSF 반응에 의한 (A) 비가교 소 헤모글로빈 및 (B) 푸마릴 가교 헤모글로빈에 대한 크기 배제 크로마토그램을 도시한다.
도 4 는 ( A ) DBSF 반응에 의한 푸마릴 가교 헤모글로빈 및 ( B ) 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 디콘볼루션 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 시스테닐-숙시닐 펩타이드의 ESI-MS/MS 스펙트럼을 나타낸 것으로, 시스테인-숙시닐 가교 헤모글로빈에서 푸마릴기의 이중 결합에 대한 시스테인 변형의 확인을 나타낸다.
도 6 은 다양한 티올 함유 시약(시스테인, β - 메르캅토에탄올 및 호모시스테인)에 대한 푸마릴기의 이중 결합 반응성의 디콘볼루션 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7 은 2일 및 9일에 시스테인 및 N-아세틸 시스테인(NAC)에 대한 비스-3,5-디브로모살리실 숙시네이트(DBSS)로 가교된 헤모글로빈의 반응성의 디콘볼루션 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 8 은 (a) BocLysF와 β - 메르캅토에탄올을 사용하여 알킬티오숙신아미드를 제공하고, (b) BocLysF-BME 및 시스테인을 사용하여 알킬티오숙신아미드를 제공하는 (c) BocLysF-Cys의 전환 반응식을 나타낸다.
도 9는 시스테닐-숙시닐-가교 헤모글로빈 및 푸마릴-가교 헤모글로빈 용액에서 각각 NAC 및 NAC2의 안정성을 도시한다.
도 10 은 혈액 순환에서 헤모글로빈의 생체내 안정성을 입증하는 ( A ) 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 및 ( B ) 푸마릴-가교 헤모글로빈 의 디콘볼루션된 ESI-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 11 은 쥐의 심한 출혈성 쇼크에서 650mg/kg의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액의 주입이 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액과 비교하여 간 조직 산소 수준의 상당한 증가를 초래함을 보여준다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. 통계 분석은 양방향 ANOVA로 수행된다. ***p<0.001 대 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액.
도 12는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 및 푸마릴 가교 헤모글로빈 치료 후 허혈성 사지에서 Oxy-Hb 수준의 증가를 보여준다. Oxy-Hb는 사지 허혈을 유도하기 전과 후, 그리고 치료 후 최대 21일까지 다양한 시점에서 Oxygen Mapper가 있는 TiVi 700 Tissue Viability Imager로 측정된다. 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 치료의 경우, Oxy-Hb의 상당한 증가가 주입 후 30분 및 치료 후 최대 21일에 관찰되는 반면, 푸마릴-가교 헤모글로빈은 치료 후 14일 및 치료 후 21일에 상당한 증가를 보여준다. Oxy-Hb 수준은 결찰된 사지에서 측정된 플럭스 밀도를 동일한 시점에서 동일한 마우스에서 대조군 사지(결찰 없이)로 나눈 값으로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01 대 대조군.
도 13 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 및 푸마릴 가교 헤모글로빈 치료 후 허혈성 사지의 관류 회복을 보여준다. 혈액 관류는 사지 허혈을 유도하기 전과 후에, 그리고 치료 후 최대 21일까지 다른 시점에서 Moor Serial Laser Doppler Imager 로 측정된다. 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 및 푸마릴 가교 헤모글로빈 치료 후 21일까지 관류의 상당한 회복이 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 대조군.
도 14는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 및 푸마릴 가교 헤모글로빈 치료 후 사지 허혈에서 중간엽 줄기 세포(MSC) 집단의 유지를 보여준다. 순환하는 CD45-CD29+, CD45-CD105+, CD45-CD106+ MSC 집단의 증가는 사지 허혈을 유도한 후에 관찰되며 대조군과 비교하여 더 오랜 기간 동안 지속된다. MSC 집단의 더 중요한 개선은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 치료 시 관찰된다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 대조군.
도 15는 심각한 출혈성 쇼크의 비인간 영장류(사이노몰구스 원숭이) 모델에서 근육 조직(삼두근)의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 회복 산소를 보여준다. 자가 혈장 치료(대조군)와 비교할 때 500mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 주입하면 근육 조직 산소화가 증가한다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다.
도 16 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 치료 후 심각한 출혈성 쇼크의 비인간 영장류 모델에서 평균 동맥압의 회복을 보여준다. 자가 혈장 치료에 비해 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 치료 후 최대 3시간까지 더 높은 평균 동맥압이 유지된다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다.
도 17 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리한 후 허혈성 사지에서 Oxy-Hb 수준의 용량 의존적 증가를 보여준다. Oxy-Hb는 사지 허혈을 유도하기 전과 후, 그리고 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료한 후 최대 21일의 다른 시점에서 Oxygen Mapper가 있는 TiVi 700 Tissue Viability Imager로 측정된다 (그룹당 n=8). Oxy-Hb의 유의하고 용량 의존적 증가는 주입 후 1시간 및 치료 후 최대 21일에 관찰된다. Oxy-Hb 수준은 결찰된 사지에서 측정된 플럭스 밀도를 동일한 시점에서 동일한 마우스에서 대조군 사지(결찰 없이)로 나눈 값으로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 음성 대조군.
도 18 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료한 후 허혈성 사지에서 용량 의존적 관류 회복을 보여준다. 혈액 관류는 사지 허혈을 유도하기 전과 후, 그리고 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료한 후 최대 21일까지 다른 시점에서 무어 직렬 레이저 도플러 이미저에 의해 측정된다. 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (그룹당 n=8)으로 치료한 후 최대 21일까지 관류의 상당한 용량 의존적 회복이 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 음성 대조군.
도 19는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료한 후 사지 허혈에서 중간엽 줄기 세포(MSC) 집단의 선택적 활성화를 묘사한다. 순환하는 CD45-CD29+, CD45-CD105+, CD45-CD106+ MSC 인구의 유의하고 용량 의존적 증가가 사지 허혈을 유도한 후 관찰되었으며 음성 대조군과 비교하여 더 오랜 기간 동안 지속되었다. 데이터는 평균 ± SD로 보고된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 음성 대조군.
도 20 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리한 후 심근 경색 면적의 현저한 감소를 나타낸다. 조직학적 분석 결과, LAD 결찰 후 대조군과 처리군 사이에 유사한 위험 영역이 유도되는 것으로 나타났다(왼쪽 그래프). 100mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료를 받은 그룹에서 경색 면적의 상당한 감소가 관찰되었다 (오른쪽 그래프).
도 21 은 C57 마우스 모델에서 루푸스 유도 및 치료의 개략도이다. 루푸스 신염은 2주 동안 총 3번의 프로이트 보조제와 함께 세포자멸사 세포 핵 추출물을 격주 주사하여 유도되고 치료(800 mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈)는 2주 동안 주 2회 제공된다. 병리학적 분석을 위한 첫 번째 유도로부터 12주 동안 질병 진행을 계속하였다.
도 22는 감소된 면역글로불린(Ig, 점수: 0-3) 동형 M(IgM) 및 동형 G(IgG)가 신장의 사구체에 침착됨을 도시한다. *p<0.05, ***p<0.001.
도 23은 현저하게 감소된 세포 증식, 백혈구 침윤, 섬유소성 괴사/핵붕괴, 세포 크레센트(crescents) 및 유리질 혈전, 신장의 와이어 루프와 함께 더 낮은 사구체 활성 지수를 보여준다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 24 는 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈을 사용한 급성 치료가 TBI 후 개선된 신경학적 점수를 보여준다. 복합 신경 점수는 TBI 후 4시간, 1일, 3일 및 7일에 8개의 신경학적 평가 배터리를 사용하여 얻다. 그래프는 상이한 시점에서 신경점수에 대한 시스테닐-숙시닐 가교결합된 헤모글로빈 용액을 사용한 치료의 효과를 도시한다. 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈-처리된 TBI 동물은 처리 24시간 후 신경점수에서 유의한 증가를 나타낸다(*p<0.05). 양방향 반복 측정 아노바(ANOVA)에 이어 Sidak 사후 테스트; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 25 는 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈을 사용한 급성 치료가 TBI 후 개선된 운동 회복을 보여준다. TBI 후 1시간에 운동 기능에 대한 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 치료의 효능은 수평 사다리 작업 및 실린더 테스트를 사용하여 평가된다. 왼쪽 그래프는 래더 테스트의 오류 점수에 대한 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 처리의 효과를 나타낸다. 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈은 3일차 대조군과 비교하여 TBI 랫트에서 사다리 테스트 성능을 유의하게 향상시켰지만(*p<0.05) 7일차에는 그렇지 않았다. 7일차 대조군의 오류 점수만 유의하게 더 낮다. 7일차 대조군의 오류 점수만 3일차보다 현저히 낮았지만(**p<0.01), 처리군은 3일차에 동일한 회복 수준에 도달했다. 오른쪽 그래프는 TBI 후 3일차 및 7일차에 수행된 실린더 테스트 중 비대칭 발 사용 정도를 보여준다. 대조군과 치료군 사이에 영향을 받은 발의 사용에서 유의한 차이는 발견되지 않았다(p>0.05). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다.
도 26 은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 치료하여 TBI로 유발된 성상교세포증의 감소를 보여준다. 성상교세포 활성화에 대한 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 사용한 단일 급성 치료의 효과는 TBI 후 7일차에 뇌 조직에서 수행된 GFAP 면역형광으로 평가된다. (A) 그래프는 동측(Ipsi) 및 대측(Contra) 해마와 시상에서 GFAP 양성 성상교세포의 평균 세포 면적을 보여준다. (*p<0.05), 양측 t 검정; 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다. (B) 대조군(상단 패널) 및 치료군(하단 패널) 모두에 대해 동측 해마(치과 및 CA 영역), 동측 시상 및 반대측 해마(CA 영역)에서 활성화된 성상세포의 ImageJ를 사용하여 배경 임계값 후 대표적인 200X 확대 이미지 ). DG: 치상회, CA: 해마 CA 영역, Thal: 시상, i: 동측, c: 손상 부위와 관련하여 반대측.
정의
본 발명을 설명하기 위해 다음과 같은 용어를 사용한다. 본 명세서에 기재된 특정한 정의가 없는 경우, 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 공통된 의미가 부여될 것이다.
본 출원 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나 포함하거나 포함하는 것으로 기술되거나 공정이 특정 공정 단계를 갖거나 포함하거나 포함하는 것으로 기술되는 경우, 본 교시의 조성물은 또한 본질적으로, 또는 인용된 구성요소로 구성되며, 본 교시의 프로세스는 또한 인용된 프로세스 단계로 본질적으로 구성되거나 또는 구성될 수 있음을 인지한다.
애플리케이션에서 요소 또는 구성요소가 인용된 요소 또는 구성요소의 목록에 포함 및/또는 선택되는 경우, 요소 또는 구성요소는 인용된 요소 또는 구성요소 중 임의의 하나일 수 있음을 이해해야 한다. 요소 또는 구성요소는 인용된 요소 또는 구성요소 중 둘 이상으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특징은 본 명세서에 명시적이든 묵시적이든 본 교시의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", "치료(treatment)" 등은 장애/질병 및/또는 이와 관련된 증상을 감소 또는 개선하는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것이 장애, 상태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 치료는 장애 또는 상태, 및/또는 이와 관련된 증상의 예방을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "예방" 또는 "방지하다"는 장애, 상태 또는 이와 관련된 증상의 발병을 억제하거나 적어도 지연시키는 임의의 작용을 지칭한다. 예방에는 1차, 2차 및 3차 예방 수준이 포함될 수 있다. b) 2차 예방 활동은 질병의 조기 치료를 목표로 하여 질병의 진행과 증상의 출현을 예방하기 위한 개입 기회를 증가시킨다. c) 3차 예방은 기능을 회복하고 질병 관련 합병증을 줄임으로써 이미 확립된 질병의 부정적인 영향을 줄인다.
본원에 사용된 용어 "대상(subject)"은 치료, 관찰 및/또는 실험의 대상이거나 대상이었던 동물, 일반적으로 포유동물 또는 인간을 지칭한다. 용어가 본원에 기재된 화합물의 투여와 함께 사용되는 경우, 대상은 본원에 기재된 화합물의 치료, 관찰 및/또는 투여의 대상이었다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 연구자가 찾고 있는 세포 배양, 조직 시스템, 대상, 동물 또는 인간에서 생물학적 및/또는 의학적 반응을 유발하는 화합물 또는 약제의 양을 의미한다. 수의사, 임상의 또는 의사, 치료 중인 질병, 상태 또는 장애의 증상 완화를 포함한다.
"조성물(composition)"이라는 용어는 명시된 양의 명시된 성분을 포함하는 제품뿐만 아니라 명시된 양의 명시된 성분의 조합으로부터 직간접적으로 생성되는 모든 제품을 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 화합물의 원하는 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 매질을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 하나 이상의 용매, 희석제 또는 기타 액체 비히클(vehicles); 분산 또는 현탁 보조제; 표면 활성제; 등장제; 증점제 또는 유화제; 방부제; 고체 바인더; 윤활제; 등등. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15판, EW Martin(Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, AH Kibbe ed. (American Pharmaceutical Assoc. 2000)]은 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "할로(halo)" 또는 "할라이드(halide)"는 플루오로(fluoro), 클로로(chloro), 브로모(bromo) 또는 요오도(iodo)를 포함한다.
본원에 사용된 "알킬(alkyl)"은 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬 기의 예에는 메틸-, 에틸-, 프로필(예: n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예: n-부틸, 이소 -부틸, sec-부틸, tert-부틸), 펜틸 기(예: 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 이소-펜틸, tert-펜틸, 1,2-디메틸 프로필, 네오펜틸, 및 1-에틸프로필), 헥실기 등이 있다. 다양한 구체예에서, 알킬기는 R 은 1 내지 40개의 탄소 원자(즉, C1-40 알킬 기), 예를 들어 1 내지 30개의 탄소 원자(즉, C1-30 알킬 기)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가질 수 있고, "저급 알킬기"로 지칭될 수 있다. 저급 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필(예: n-프로필 및 이소프로필), 및 부틸 기(예: n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸)가 있다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 본원에 기재된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다. 알킬기는 일반적으로 다른 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기로 치환되지 않는다.
본원에 사용된 "알케닐(alkenyl)"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 지칭한다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐 기 등을 포함한다. 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부(예: 2-부텐) 또는 말단(예: 1-부텐)일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 40개의 탄소 원자(즉, C2-40 알케닐 기), 예를 들어 2 내지 20개의 탄소 원자(즉, C2-20 알케닐 기)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다. 알케닐기는 일반적으로 다른 알케닐기, 알킬기 또는 알키닐기로 치환되지 않는다.
본원에 사용된 "시클로알킬(cycloalkyl)"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 달리 언급되지 않는 한 고리 시스템에 3-12개의 탄소 원자를 갖고 수소, 직쇄, 분지쇄 및/또는 고리 치환기를 포함하는 모노사이클릭 탄화수소를 의미한다. 예시적인 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "융합 고리(fused ring)" 또는 "융합 고리 부분(fused ring moiety)"는 다환 고리를 의미한다. 고리 중 적어도 하나가 방향족이고 그러한 방향족인 경우 적어도 2개의 고리를 갖는 시스템 고리(탄소고리 또는 헤테로고리)는 방향족 또는 비방향족, 및 탄소환 또는 헤테로환일 수 있다. 이러한 다환 고리 시스템 본 명세서에 기재된 바와 같이 고도로 p-접합되고 임의로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로원자(heteroatom)"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 말하며, 예를 들어 질소, 산소, 규소, 황, 인 및 셀레늄을 포함한다.
본원에 사용된 "아릴(aryl)"은 방향족 모노사이클릭 탄화수소 고리 시스템 또는 2개 이상의 방향족 탄화수소 고리가 함께 융합된 다환 고리 시스템(즉, 공통의 결합을 가짐) 또는 하나 이상의 방향족 모노사이클릭 탄화수소 고리가 하나 이상의 시클로알킬 및/또는 시클로헤테로알킬 고리에 융합된다. 아릴 기는 고리 시스템(예: C6-24 아릴 기)에 6 내지 24개의 탄소 원자를 가질 수 있으며, 이는 다중 융합 고리를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다환식 아릴 기는 8 내지 24개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴 기의 임의의 적합한 고리 위치는 정의된 화학 구조에 공유적으로 연결될 수 있다. 방향족 탄소환식 고리(들)만을 갖는 아릴기의 예는 페닐, 1-나프틸 (바이사이클릭), 2-나프틸 (바이사이클릭), 안트라세닐 (트라이사이클릭), 페난트레닐 (트라이사이클릭), 펜타세닐(펜타사이클릭) 등을 포함한다. 하나 이상의 방향족 탄소환식 고리가 하나 이상의 시클로알킬 및/또는 시클로헤테로알킬 고리에 융합된 다환식 고리 시스템의 예는 무엇보다도 시클로펜탄의 벤조 유도체 (즉, 5,6-이환식 시클로알킬인 인다닐기/방향족 고리 시스템)를 포함한다. 시클로헥산 (즉, 테트라히드로나프틸 기, 6,6-비시클릭 시클로알킬/방향족 고리 시스템임), 이미다졸린 (즉, 5,6-비시클릭 시클로헤테로알킬/방향족 고리 시스템인 벤즈이미다졸리닐 기), 및 피란 (즉, 6,6-바이사이클릭 사이클로헤테로알킬/방향족 고리 시스템인 크로메닐 그룹)가 있다. 아릴 기의 다른 예는 벤조디옥사닐, 벤조디옥솔릴, 크로마닐, 인돌리닐 기 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 하나 이상의 할로겐 치환기를 가질 수 있고, "할로아릴" 기로 지칭될 수 있다. 퍼할로아릴기, 즉 모든 수소 원자가 할로겐 원자로 대체된 아릴기(예: -C6F5)는 "할로아릴"의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 또 다른 아릴 기로 치환되고 바이아릴 기로 지칭될 수 있다. 바이아릴 기의 각각의 아릴 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
"아르알킬(aralkyl)"이라는 용어는 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본원에 사용된 "헤테로아릴(heteroaryl)"은 방향족 모노시클릭 고리 시스템을 지칭한다 산소(O), 질소(N), 황(S), 규소(Si), 및 셀레늄(Se) 또는 고리 중 하나 이상인 다환 고리 시스템 고리 시스템에 존재하는 R은 방향족이고 하나 이상의 고리 헤테로원자를 포함한다. 다환 헤테로아릴기는 함께 융합된 2개 이상의 헤테로아릴 고리를 갖는 것을 포함할 뿐만 아니라, 하나 이상의 방향족에 융합된 하나 이상의 모노사이클릭 헤테로아릴 고리를 갖는 것으로서 탄소환식 고리, 비방향족 탄소환식 고리 및/또는 비방향족 시클로헤테로알킬 고리에 융합된 적어도 하나의 모노사이클릭 헤테로아릴 고리를 갖는 것들을 포함한다. 헤테로아릴기는 전체적으로 예를 들어 5 내지 24개의 고리 원자를 가질 수 있고 1-5개의 고리 헤테로원자(즉, 5-20원 헤테로아릴 기). 헤테로아릴 기는 안정적인 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 정의된 화학 구조에 부착될 수 있다. 일반적으로 헤테로아릴 고리는 O-O, S-S 또는 S-O 결합을 포함하지 않는다. 그러나 헤테로아릴 기에서 하나 이상의 N 또는 S 원자는 산화될 수 있다(예: 피리딘 N-옥사이드 티오펜 S-옥사이드, 티오펜 S,S-디옥사이드). 헤테로아릴기의 예는, 예를 들어, 하기 나타낸 5- 또는 6-원 모노사이클릭 및 5-6 바이사이클릭 고리 시스템을 포함한다: 여기서 T는 O, S, NH, N-알킬, N-아릴, N-(아릴알킬)(예: N-벤질), SiH2, SiH(알킬), Si(알킬)2, SiH(아릴알킬), Si(아릴알킬)2 또는 Si(알킬)(아릴알킬)이다. 이러한 헤테로아릴의 예 고리는 피롤릴, 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피리미딜, 피리다지닐, 피라지닐, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 이소티아졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 퀴놀릴, 2-메틸퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴녹살릴, 퀴나졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤족사디아졸릴, 벤족사졸릴, 신놀리닐, 1H-인다졸릴, 2H-인다졸릴, 인돌리지닐, 이소벤조푸일, 나프티리디닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 옥사졸로피리디닐, 티아졸로피리디닐, 이미다조피리디닐, 푸로피리디닐, 티에노피리디닐, 피리도피리미디닐, 피리도피라지닐, 피리도피리다지닐, 티에노티아졸릴, 티에녹사졸릴, 티에노이미다졸릴기 등. 헤테로아릴 기의 추가 예는 4,5,6,7-테트라히드로인돌릴, 테트라히드로퀴놀리닐, 벤조티에노피리디닐, 벤조푸로피리디닐, 등등이다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"임의로 치환된(optionally substituted)"이라는 용어는 알킬, 사이클로알킬 아릴 등과 같은 화학 그룹을 나타내며, 여기서 하나 이상의 수소는 본 명세서에 기재된 치환체, 예를 들어 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐 , 알키닐, 시클로알킬, 히드록실, 알콕실, 아미노, 니트로, 술프히드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 술폰아미도, 케톤, 알데히드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 부분, -CF3 , -CN 등으로 대체될 수 있다.
"탄소환(carbocycle)"이라는 용어는 당업계에 인식되어 있으며 고리의 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비방향족 고리를 의미한다.
"니트로(nitro)"라는 용어는 당업계에 인식되어 있으며 -NO2를 나타낸다. 용어 "할로겐"은 당업계에 인식되고 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 지칭하며; "술프히드릴"이라는 용어는 당업계에 인식되어 있으며 -SH를 의미한다. 용어 "히드록실"은 -OH를 의미하고; "설포닐" 및 "설폰"이라는 용어는 당업계에 인식되어 있으며 -SO2-를 나타낸다. "할라이드"는 할로겐의 해당 음이온을 나타낸다.
용어 "알킬티오(alkylthio)"는 결합된 황 라디칼을 갖는 히드로카르빌 기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "알킬티오" 부분은 -S-알킬, -S-알케닐, 또는 -S-알키닐 중 하나로 표시된다. 대표적인 알킬티오 그룹은 메틸티오, 에틸티오 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "히드로카르빌(hydrocarbyl)"은 =O 또는 =S 치환기를 갖지 않고 일반적으로 하나 이상의 탄소-수소 결합 및 주로 탄소 골격을 갖는 탄소 원자를 통해 결합된 기를 지칭하지만, 임의로 헤테로원자를 포함할 수 있다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜 및 트리플루오로메틸과 같은 기는 본 출원의 목적을 위해 히드로카르빌로 간주되지만, 아세틸(연결 탄소에 =O 치환기를 가짐) 및 에톡시(이를 통해 연결됨)와 같은 치환기는 탄소가 아닌 산소)가 아니다. 히드로카르빌 기는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 피험자의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 염을 의미하며, 합리적인 이익/위험 비율에 상응한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Berge et al. J. Pharmaceutical Sciences(1977) 66:1-19에 약제학적으로 허용되는 염이 자세히 설명되어 있다. 본원에서 제공되는 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 무독성 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 말레산과 같은 유기산과 형성된, 또는 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용함으로써 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르브산염, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 베실레이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루콘산염, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 글루코스설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코틴산염, 질산염, 올레에이트, 펙살레이트, 팔미트산염, 옥살산염, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염이 유도될 수 있는 유기산은 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등을 들 수 있다.
적절한 염기로부터 유도된 약제학적으로 허용되는 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은 적절한 경우 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 반대이온을 사용하여 형성된 아민 양이온, 예를 들어 할로겐화물, 수산화물, 카르복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 저급 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트를 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기 염기는 예를 들어 1차, 2차 및 3차 아민, 자연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 사이클릭 아민, 염기성 이온 교환 수지 등, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민 및 에탄올아민을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 염기 부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 화합물과 관련하여 용어 "단리된(isolated)"은 화합물이 세포 또는 유기체에 없고 화합물이 세포 또는 유기체에서 전형적으로 동반하는 성분의 일부 또는 전부로부터 분리됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 화합물의 샘플과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"은 샘플이 60 중량% 이상의 화합물을 함유함을 의미한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 70 중량% 이상의 화합물; 75중량% 이상의 화합물; 80중량% 이상의 화합물; 85중량% 이상의 화합물; 90 중량% 이상의 화합물; 95중량% 이상의 화합물; 또는 화합물의 적어도 98 중량% 이상의 화합물을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 화합물의 샘플과 관련하여 "실질적으로 기질이 없는(substantially stroma-free)"이라는 용어는 샘플이 5중량% 미만의 기질을 함유함을 의미한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 4중량% 미만의 기질; 3중량% 미만의 기질; 2중량% 미만의 기질; 1중량% 미만의 기질; 0.5중량% 미만의 기질; 0.1중량% 미만의 기질; 0.05중량% 미만의 기질; 또는 0.01중량% 미만의 기질의 기질을 함유한다.
본 개시내용은 사량체 헤모글로빈 및 하나 이상의 하기 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제공한다:
Figure pct00011
1
또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 양쪽성 이온(여기서, 각각의 N*은 사량체 헤모글로빈의 라이신 잔기 측쇄의 질소 및 사량체 헤모글로빈의 N-말단의 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소를 독립적으로 나타냄)이고; 그리고
R1은 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY이고, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2 , -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, -(NR 4)S(O)2OR4, 및 -(CRR2R3 ), 여기서 R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4 ; 그리고 R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00012
, 및
N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수이다.
하기 예는 일반적으로 α2β2 사량체 헤모글로빈을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈에 관한 것이지만, 다른 형태의 헤모글로빈, 예를 들어 다른 사량체 헤모글로빈, 예를 들어 α2γ2; 삼량체 헤모글로빈, 예를 들어 αβ2 , α2β, αγ2 및 α2γ; 이량체 헤모글로빈, 예를 들어 αβ 및 αγ; 등등; 뿐만 아니라 하나 이상의 단량체 형태의 헤모글로빈을 포함하는 중합체 형태의 헤모글로빈; 및 폴리알킬렌 옥사이드에 접합, 피리독살 포스페이트와의 반응, 디알데히드와의 반응, 비스-디아스피린 에스테르와의 반응, 요오도아세트아미드 또는 기타 티올과의 반응을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 화학적 변형 방법을 거친 헤모글로빈 유도체 -차단 시약, 또는 시약, 예를 들어 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG) 또는 화학적으로 유사한 화합물, 또는 유전적으로 가교결합된 헤모글로빈 유도체, 예를 들어 2αβ2(디알파 베타 헤모글로빈)의 존재하에서의 반응, 여기서 디알파 부분 예를 들어, 각 알파 사슬의 N-말단 및 C-말단을 공유적으로 연결하는 글리신 링커와 유전적으로 가교된 2개의 알파 사슬을 포함한다.
사량체 헤모글로빈은 자연 발생 및/또는 비자연 발생 α, β, 및 γ 글로빈 사슬 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
사량체 헤모글로빈은 인간 헤모글로빈, 소 헤모글로빈, 돼지 헤모글로빈, 양 헤모글로빈, 말 헤모글로빈, 또는 다른 무척추동물로부터의 혈액 및 재조합 및/또는 형질전환된 헤모글로빈일 수 있다.
사량체 헤모글로빈이 인간 헤모글로빈인 경우[예를 들어, 2개의 α 글로빈 사슬(UniProt 수탁 번호: P69905); 및 2개의 β글로빈 사슬(UniProt Accession Number: P68871)을 포함], 각각의 N*은 위치 1, 8, 12, 17, 41, 57, 61, 62, 91, 100, 128 및 140의 α 글로빈 사슬; 또는 β글로빈 사슬의 위치 1, 9, 18, 60, 62, 66, 67, 83, 96, 121, 133 및 145에서 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상에 존재하는 질소를 독립적으로 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 N*은 독립적으로 α 글로빈 사슬의 위치 100에서 아미노산 잔기에 존재하는 질소를 나타낸다.
사량체 헤모글로빈이 소 헤모글로빈인 경우[예를 들어, 2개의 α 글로빈 사슬을 포함(UniProt 수탁 번호: P01966); 및 2개의 β글로빈 사슬(UniProt 수탁 번호: P02070)], 각각의 N*은 위치 1, 8, 12, 17, 41, 57, 62, 69, 91, 100, 128 및 140의 α 글로빈 사슬; 또는 β 글로빈 사슬의 위치 1, 7, 16, 18, 58, 60, 64, 65, 75, 81, 94, 103, 119 및 131에서에서 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상에 존재하는 질소를 독립적으로 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 N*은 독립적으로 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상 및 β 글로빈 사슬의 1 및 81에 존재하는 질소를 나타낸다.
사량체 헤모글로빈이 돼지 헤모글로빈인 경우[예를 들어, 2개의 α 글로빈 사슬을 포함(UniProt 수탁 번호: P01965); 및 2개의 β글로빈 사슬(UniProt 수탁 번호: P02067)], 각각의 N*은 α 글로빈 사슬의 위치 1, 7, 11, 16, 40, 56, 61, 68, 90, 99, 127 및 139; 또는 β 글로빈 사슬의 위치 1, 9, 18, 60, 62, 66, 67, 77, 83, 88, 133 및 145에서 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상에 존재하는 질소를 독립적으로 나타낼 수 있다. 가교 반응에서 산소의 존재는 또한 생성된 가교 헤모글로빈의 p50 값에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 푸마릴 가교 반응의 산소 함량에 따라 푸마릴 가교 헤모글로빈 및 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 p50 값은 5-70 mmHg 범위의 값을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 헤모글로빈은 산소화된 조건 하에 가교되어, 5-20 mmHg 또는 10-20 mmHg의 p50 값을 갖는 푸마릴-가교 헤모글로빈뿐만 아니라 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제공한다. 특정 실시양태에서, 헤모글로빈은 탈산소화 조건 하에 가교되어, p50 값이 20-70 mmHg; 20-70mmHg; 30-70mmHg; 40-70mmHg; 40-60mmHg; 38-50mmHg; 45-65mmHg; 또는 55-65 mmHg 인 푸마릴-가교 헤모글로빈뿐만 아니라 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제공한다.
헤모글로빈이 요오도아세트아미드와 반응하여 헤모글로빈이 먼저 티오차단되어 티오차단된 헤모글로빈을 형성하는 경우; 이렇게 형성된 티오차단된 헤모글로빈을 푸마릴 가교 결합제로 가교시켜 푸마릴 가교된 티오차단된 헤모글로빈을 형성하는 단계; 및 푸마릴-가교된 티오차단된 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시켜 티오숙시닐-가교 티오차단된 헤모글로빈을 형성하는 단계를 포함하며, 탈산소화된 조건 하에 가교되어 생성된 티오숙시닐-가교 티오차단된 헤모글로빈의 p50 값은 15-50 mmHg; 25-50mmHg; 또는 35-50 mmHg의 범위인 반면, 산소화 조건 하에 가교된 생성된 티오숙시닐-가교 티오차단된 헤모글로빈의 p50 값은 5-20 mmHg; 5-15mmHg, 5-10mmHg 또는 10-15mmHg의 범위일 수 있다.
특정 실시양태에서, R1은 알킬 또는 -(CR2)nY이고; 또는 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00013
, 및
N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염이고, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수이다.
R1이 다음과 같은 경우:
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
m은 1-1000, 1-900, 1-800, 1-700, 1-600, 1-500, 1-400, 1-300, 1-200, 1-100, 1-50, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 일 수 있다.
R1이 -(CR2)nY인 경우에, n은 0-10, 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2, 0-1, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 또는 1-2일 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 R은 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 특정 실시양태에서, R1은 -(CH2)nY이다.
특정 실시양태에서, Y는 -(CRR2R3)이고, 여기서 R은 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4)2, 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4 또는 -N(R4)2 이고; R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, R은 수소이다. 특정 실시양태에서, R2는 -N(R4)2 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3 은 -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4 또는 -N(R4)2 이다.
특정 실시양태에서, Y는 -(CRR2R3)이고, 여기서 R은 수소이고; R2는 수소, -N(R4)2, -NH(C=O)R4, 또는 -NH(C=O)N(R4)2 이고; R3은 -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4 또는 -N(R4)2 이다.
특정 실시양태에서, R1은 -(CH2)n(CHR2R3)이고, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이고; R2는 -N(R4)2 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3 은 -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고; 각각의 R4는 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R1은 -(CH2)n(CHR2R3)이고, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이고; R2는 -N(R4)2 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3은 -CO2H이고; 각각의 R4는 수소 또는 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00016
Figure pct00017
, 및
Figure pct00018
,
또는 이의 양쪽성이온의 약학적으로 허용가능한 염(여기서, m은 1 내지 1000에서 선택되는 정수임).
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 2개의 α 글로빈 사슬(UniProt 수탁 번호: P01966) 및 2개의 β 글로빈 사슬(UniProt 수탁 번호: P02070)을 포함하는 α2β2 사량체 소 헤모글로빈을 포함하며, 여기서 β 글로빈 사슬은 화학식 1 의 하나 이상의 티오숙시닐 가교 부분과 가교되며, 여기서 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00019
및
Figure pct00020
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온, 여기서 적어도 하나의 N*은 β 글로빈 사슬의 N-말단에 있는 질소를 나타내고 적어도 하나의 N*는 β 글로빈 사슬의 위치 81에 있는 라이신 측쇄에 있는 질소를 나타낸다.
화학식 1에 도시된 황이 셀레늄, 이황화물 및 이셀렌화물로 대체된 유사체를 제공하며, 여기서 R1 및 각각의 N*은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 실시양태에서 정의된 바와 같다.
화학식 1a의 하나 이상의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제공한다:
Figure pct00021
1a
또는 이의 접합체 염 또는 양쪽성 이온, 여기서, 각각의 N*은 헤모글로빈의 라이신 잔기 측쇄의 질소 및 헤모글로빈의 N-말단의 질소로 이루어진 군으로부터 선택된 질소를 독립적으로 나타내며; R1은 알킬티오기이다.
특정 실시양태에서, 알킬티오기는 화학식 2a의 부분이다:
Figure pct00022
2a
여기서 n은 0, 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 정수이고; 각 경우에 R은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4)2, 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4 또는 -N(R4)2 이고; R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 알킬티오 기는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이다:
Figure pct00023
, 및
Figure pct00024
또는 이의 짝염, 여기서 m은 1 내지 1000에서 선택되는 정수이다.
특정 실시양태에서, n은 1 또는 2이고; R은 수소이고; R2는 -NHR4, 또는 -NH(C=O)R4 이고; R3은 수소, -OR4, -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고, 여기서 R4는 각 경우에 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 알킬티오 기는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00025
Figure pct00026
, 및
Figure pct00027
,
또는 이의 양쪽성 이온의 짝염, 여기서 m은 1 내지 1000에서 선택되는 정수이다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈은 단리되고/되거나 실질적으로 순수하다. 특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 실질적으로 기질이 없다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제 및/또는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 및 그의 제약상 허용되는 염은 단독으로 또는 표준 제약 관행에 따른 제약 조성물 중의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다. 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 국소를 포함하며, 바람직한 방법은 정맥내 투여이다.
따라서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된, 치료적 유효량의 본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하기에 적합한 것을 포함하는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제제화될 수 있다: (1) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 정맥내 투여에 의한 비경구 투여이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 특정 실시양태는 아미노와 같은 염기성 작용기를 함유할 수 있고, 따라서 제약상 허용되는 산과 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이와 관련하여 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 개시내용의 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 비교적 무독성, 무기 및 유기 산 부가염을 지칭한다. 이들 염은 투여 비히클 또는 제형 제조 공정에서 제자리(in situ)에서 제조되거나, 유리 염기 형태의 본 발명의 정제된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 적절한 유기 또는 무기산과 별도로 반응시키고, 후속 정제 동안 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조할 수 있다. 대표적인 염은 브로마이드, 클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 및 라우릴술포네이트 염 등을 포함한다.
화합물의 제약상 허용되는 염은 예를 들어 무독성 유기산 또는 무기산으로부터의 화합물의 통상적인 무독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 무독성 염은 염산염, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리시클릭, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 제조된 염, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이소티온산 등을 포함한다.
다른 경우에, 본원에 기재된 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈은 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있고, 따라서 제약상 허용되는 염기와 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 경우에 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 비교적 무독성인 무기 및 유기 염기 부가염을 지칭한다. 이들 염은 마찬가지로 투여 비히클 또는 제형 제조 공정에서의 제자리에서(in situ), 또는 유리산 형태의 정제된 화합물을 적절한 염기, 예컨대 제약상 허용되는 금속의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염과 별도로 반응시켜 제조할 수 있다. 양이온, 암모니아, 또는 약학적으로 허용되는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 함께 사용한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토류 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가 염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미료, 향미제 및 방향제, 방부제, 가용화제, 완충제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다.
헤모글로빈을 포함하는 약제를 제조하는 방법은 본원에 기술된 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈을 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 본원에 기재된 화합물을 액체 담체(액체 제제), 액체 담체에 이어 동결건조(멸균수 등으로 재구성하기 위한 분말 제제), 또는 미분 고체 담체와 균일하고 친밀하게 회합시켜 제조되며, 또는 둘 다 수행한 다음 필요한 경우 제품을 성형하거나 포장한다.
비경구 투여에 적합한 본 개시내용의 제약 조성물은 본원에 기재된 1종 이상의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 1종 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수용액 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 멸균 분말과 조합하여 포함하고, 이는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성할 수 있으며, 설탕(예: 자당), 알코올, 비이온성 계면활성제(예: Tween 20), 항산화제, 완충제, 정균제, 킬레이트제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 화합물에 대한 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 보장될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제학적 형태의 장기간 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 야기될 수 있다.
약제학적 조성물은 3-15g/dL의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 4-15g/dL; 5-15g/dL; 5-14g/dL; 6-14g/dL; 7-13g/dL; 8-12g/dL; 9-11g/dL; 또는 9.5-10.5g/dL의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 단리되고 실질적으로 순수한 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 화학식 1의 1, 2 및 3개의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함한다. 제약 조성물 및 이들의 상대적인 양은 가교 반응의 반응 조건을 변경하고 및/또는 원치 않는 푸마릴-가교 헤모글로빈 가교 및/또는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈 티올 부가 생성물을 정제에 의해 분리함으로써 용이하게 제어될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 화학식 1의 하나의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈; 화학식 1로 표시되는 2개의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐 가교형 헤모글로빈; 및 3개의 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 화학식 1의 1개의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈; 화학식 1로 표시되는 2개의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐 가교형 헤모글로빈; 및 상기 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분을 3개 갖는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈을 각각 2.8-3.4:5.6-6.2:0.7-1.3; 2.9-3.3:5.7-6.1:0.8-1.2; 3.0-3.2:5.8-6.0:0.9-1.1; 또는 3.1:5.9:1.0의 질량비로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약학 조성물에 존재하는 모든 티오숙시닐-가교 헤모글로빈의 총 중량에 대해 0.1-99%; 0.1-95%; 0.1-90%; 0.1-80%; 0.1-70%; 0.1-60%; 0.1-50%; 10-50%; 20-50%; 20-40%; 25-45%; 또는 25-35% wt/wt의 화학식 1의 티오 숙시닐 가교 부분을 1개 갖는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 포함한다(예를 들어, 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분을 1개 갖는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈; 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부위를 2개 갖는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈; 및 제약 조성물에 존재하는 화학식 1의 3개의 티오숙시닐 가교 잔기를 갖는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 총 중량에 대해).
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약 조성물에 존재하는 모든 티오숙시닐-가교 헤모글로빈의 총 중량에 대해 화학식 1의 2개의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 0.1-99%; 0.1-95%; 0.1-90%; 10-90%; 20-90%; 20-80%; 20-70%; 30-70%; 40-70%; 50-70%; 50-60%; 또는 55-65% wt/wt로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약 조성물에 존재하는 모든 티오숙시닐-가교 헤모글로빈의 총 중량에 대해 화학식 1의 3개의 티오숙시닐 가교 부분을 갖는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 0.1-99%; 0.1-95%; 0.1-90%; 0.1-80%; 0.1-70%; 0.1-60%; 0.1-50%; 0.1-40%; 0.1-30%; 0.1-20%; 5-20%; 또는 5-15% wt/wt로 포함한다.
제약 조성물은 푸마릴 가교 헤모글로빈을 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2중량% 미만, 1중량% 미만, 0.5중량% 미만, 또는 0.1중량% 미만으로 포함하거나; 또는 실질적으로 푸마릴 가교된 헤모글로빈이 없다.
티오숙시닐 가교 혈색소 및 푸마릴 가교 혈색소는 90:10 내지 99.99:0.01의 질량비로 약학 조성물에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 혈색소 및 푸마릴 가교 혈색소는 각각 91:9 내지 99.99:0.01; 92:8 내지 99.99:0.01; 93:7 내지 99.99:0.01; 94:6 내지 99.99:0.01; 95:5 내지 99.99:0.01; 96:4 내지 99.99:0.01; 97:3 내지 99.99:0.01; 98:2 내지 99.99:0.01; 99:1 내지 99.99:0.01; 99.5:0.5 내지 99.99:0.01; 또는 99.9:0.1 내지 99.99:0.01의 질량비로 제약 조성물에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 푸마릴 가교 헤모글로빈을 실질적으로 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 항산화제를 추가로 포함한다. 예시적인 항산화제는 시스테인, N-아세틸 시스테인, γ-글루타밀-시스테인, 글루타티온, 2,3-디메르캅토-1-프로판올, 1,4-부탄디티올, 나트륨 디티오나이트, 기타 생물학적으로 적합한 티올 및 아스코르브산염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 메트헤모글로빈의 형성을 억제하거나 역전시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 5%(w/w) 이하의 항산화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 4.5%(w/w) 이하; 4.0%(w/w) 이하; 3.5%(w/w) 이하; 3.0%(w/w) 이하; 2.5%(w/w) 이하; 2.0%(w/w) 이하; 1.5%(w/w) 이하; 1.0%(w/w) 이하; 0.9%(w/w) 이하; 0.8%(w/w) 이하; 0.7%(w/w) 이하; 0.6%(w/w) 이하; 0.5%(w/w) 이하; 0.4%(w/w) 이하; 0.3%(w/w) 이하; 0.2%(w/w) 이하; 또는 0.1%(w/w) 이하의 항산화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 0.001 내지 1%(w/w); 0.01 내지 1%(w/w); 0.01 내지 1%(w/w); 0.01 내지 0.9%(w/w); 0.01 내지 0.8%(w/w); 0.01 내지 0.7%(w/w); 0.01 내지 0.6%(w/w); 0.01 내지 0.5%(w/w); 0.01 내지 0.4%(w/w); 0.01 내지 0.3%(w/w); 0.05 내지 0.3%(w/w); 0.1 내지 0.3%(w/w); 또는 0.15 내지 0.25%(w/w) 항산화제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 중량 기준으로 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈, NAC, 수크로스, 및 트윈 20을 포함하는 고체 제약 조성물이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교 헤모글로빈, NAC, NaCl 및 아세트산나트륨을 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 티오숙시닐-가교 헤모글로빈, NAC, NaCl, 아세트산나트륨, 수크로스, 및 트윈 20을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제조하는 방법을 제공한다. 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 당업자에게 공지된 임의의 수의 공지된 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 제조하는 방법은 사량체성 헤모글로빈을 푸마릴 가교제와 접촉시켜 푸마릴-가교 헤모글로빈을 형성하는 단계; 푸마릴-가교 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시켜 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 형성하는 단계를 포함한다.
당업계에 공지된 헤모글로빈을 분자내 가교결합할 수 있는 임의의 푸마릴 가교결합제가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 푸마릴 가교결합제는 하기 화학식 4의 화합물로 나타낼 수 있다:
Figure pct00028
4
여기서 각각의 LG는 독립적으로 당업계의 임의의 이탈기일 수 있다. 예시적인 이탈기는 Cl, Br, I, 3,5-디브로모살리실레이트, 살리실레이트 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, LG는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00029
Figure pct00030
, 및
Figure pct00031
.
화학식 4의 화합물은 제자리에서(in situ), 예를 들어 푸마르산과 카르보닐 활성화제 및 임의로 커플링 첨가제의 반응에 의해 수행되거나 형성될 수 있다.
예시적인 카르보닐 활성화제는 카르보디이미드, 예를 들어 DCC, DIC, EDC, CIC, BMC, CPC, BDDC, PIC, PEC 및 BEM, 우로늄/아미늄 염, 예를 들어 HATU, HBTU, TATU, TBTU, HAPyU, TAPipU, HAPipU, HBPipU, HAMBU, HBMDU, HAMTU, 5,6-B(HATU), 4,5-B(HATU), HCTU, TCTU 및 ACTU, AOP, BOP와 같은 포스포늄 염, PyAOP, PyBOP, PyOxm, PyNOP, PyFOP, NOP 및 PyClock, BOMI, BDMP, BMMP, BPMP 및 AOMP와 같은 이모늄 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 커플링 첨가제는 HOBt 6-NO2 -HOBt, 6-Cl-HOBt, 6-CF3-HOBt, HOAt, HODhbt, HODhat, HOSu 및 Oxyma를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 가교결합제는 살리실 푸마레이트 유사체이고, 여기서 각각의 살리실 기의 아릴 고리는 독립적으로 임의로 치환된다.
비스-3,5-디브로모살리실 푸마레이트(DBSF), 푸마릴 클로라이드 및 비스(살리실) 푸마레이트 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가교제와 사량체 헤모글로빈을 접촉시키는 단계에서 가교제와 사량체 헤모글로빈의 몰비는 각각 0.8:1 내지 20:1일 수 있다. 특정 실시양태에서, 가교결합제 및 사량체 헤모글로빈은 각각 0.8:1 ~ 19:1; 0.8:1 ~ 18:1; 0.8:1 ~ 17:1; 0.8:1 ~ 16:1; 0.8:1 ~ 15:1; 0.8:1 ~ 14:1; 0.8:1 ~ 13:1; 0.8:1 ~ 12:1; 0.8:1 ~ 11:1; 0.8:1 ~ 10:1; 0.8:1 ~ 9:1; 0.8:1 ~ 8:1; 0.8:1 ~ 7:1; 0.8:1 ~ 6:1; 0.8:1 ~ 5:1; 0.8:1 ~ 4:1; 0.8:1 ~ 3.5:1; 0.8:1 ~ 3:1; 0.8:1 ~ 2.5:1; 0.8:1 ~ 2:1; 0.8:1 ~ 1.5:1; 1:1 ~ 3:1; 1.1:1 ~ 3:1; 1.5:1 ~ 3:1; 2:1 ~ 3:1; 또는 2.25:1 ~ 2.75:1 사이의 몰비로 존재한다.
가교제와 사량체 헤모글로빈을 접촉시키는 단계에서, 사량체 헤모글로빈의 농도는 5 - 25g/dL 사이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 사량체 헤모글로빈의 농도는 가교제와 사량체 헤모글로빈을 접촉시키는 단계에서 5-20 g/dL; 10 - 20g/dL; 10 - 18g/dL; 10 - 16g/dL; 10 - 15g/dL; 11 - 15g/dL; 12 - 15g/dL; 또는 13 - 15g/dL 일 수 있다.
사량체 헤모글로빈은 수용액과 같은 극성 양성자성 용매에서 가교제와 반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 가교 반응은 물에서 일어난다.
가교 반응을 촉진하기 위해, 반응 용매의 pH는 7보다 큰 pH에서 유지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 가교 반응 용매의 pH는 7-10, 8-10; 8.5 내지 9.5; 8.7 내지 9.3; 또는 8.9 내지 9.1사이의 pH를 가진다.
이렇게 형성된 푸마릴-가교 헤모글로빈은 여과, 열-유도 침전, 원심분리, 크로마토그래피 등과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 임의로 정제할 수 있다.
그런 다음 푸마릴-가교 헤모글로빈은 티올과 반응하여 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 형성할 수 있다.
티올은 본원에 기재된 임의의 실시양태에서 정의된 바와 같은 화학식 R1SH로 나타낼 수 있다.
푸마릴-가교 헤모글로빈은 5-20 g/dL 사이의 농도로 티올과의 반응에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 푸마릴-가교 헤모글로빈은 5-18 g/dL, 5-16 g/dL; 5-14 g/dL; 5-12 g/dL; 7-12 g/dL; 8-12 g/dL; 또는 9-11 g/dL의 농도로 티올과의 반응에 존재한다.
티올은 1-500mM의 농도로 푸마릴-가교 헤모글로빈과의 반응에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 티올은 1-450mM; 1-400mM; 1-350mM; 1-300mM; 1-250mM; 1-200mM; 1-180mM; 1-160mM; 1-140mM; 1-120mM; 1-100mM; 10-100mM; 20-100mM; 30-100mM; 30-90mM; 40-80mM; 77.5-310mM, 174-3110mM, 9.7-77.5mM; 19.4-77.5mM; 또는 38.8-77.5mM의 농도로 푸마릴-가교 헤모글로빈과의 반응에 존재할 수 있다.
티올과 푸마릴-가교 헤모글로빈의 반응은 pH 7-11에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 티올과 푸마릴-가교 헤모글로빈의 반응은 pH 7-11; 7-10; 7.4 내지 10; 7.4 내지 9, 7.4 내지 8.2, 또는 8.2 내지 9에서 수행된다. 티올 첨가 반응 용매의 pH는 필요에 따라 원하는 범위 내의 pH 완충액을 사용하거나 반응 혼합물에 브뢴스테드 염기를 첨가함으로써 원하는 pH로 유지될 수 있다. 적절한 브뢴스테드 염기 또는 pH 완충제의 선택은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 유용한 브뢴스테드 염기에는 그룹 I 및 그룹 II 수산화물, 탄산염 및 중탄산염, 유기 아민 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
푸마릴 가교 헤모글로빈은 수용액과 같은 극성 양성자성 용매에서 티올과 반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 티올 부가 반응은 물에서 일어난다.
티올과 푸마릴-가교 헤모글로빈의 반응은 일반적으로 모든 푸마릴-가교 헤모글로빈 출발 물질이 원하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈으로 전환될 때까지 수행될 수 있고, 푸마릴-가교 헤모글로빈은 더 이상 원하는 티오숙시닐-가교 헤모글로빈으로 전환되지 않고/않거나, 불순물 및/또는 부산물의 농도가 원하는 양 이상으로 증가한다. 반응 조건에 따라 티올과 푸마릴 가교 헤모글로빈의 반응은 1-72시간; 6-72시간, 12-72시간, 24-72시간, 36-72시간, 48-72시간, 60-72시간, 12-48시간 또는 24-48시간이 소요될 수 있다. 티올과 푸마릴 가교 헤모글로빈의 반응 속도가 매우 느린 경우(예: 특정 고분자량 페길화 티올의 경우와 같이), 티올과 푸마릴 가교 헤모글로빈의 반응은 최대 한 달 진행될 수 있다.
이렇게 형성된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 여과, 열-유도 침전, 원심분리, 크로마토그래피 등과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 임의로 정제할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 사용하는 치료 방법을 제공한다. 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 헤모글로빈 기반 산소 운반체가 사용될 수 있는 모든 치료 방법에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈액 순환계의 부피를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음의 임의의 실시양태 또는 조합에 따른 치료적 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다. 여기에 설명된 실시예. 특정 실시양태에서, 대상체는 출혈성 쇼크를 앓고 있다.
본 개시내용은 산소를 이를 필요로 하는 대상의 조직 및 기관에 공급하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 임의의 실시양태 또는 실시양태의 조합에 따른 치료적 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다 여기에 설명되어 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 예를 들어 심근 허혈-재관류 손상을 비롯한 허혈을 앓고 있다. 허혈은 전역적이거나 지역적일 수 있다.
본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 조합에 따른 치료 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다. 티오숙시닐-가교 헤모글로빈은 단독으로 또는 하나 이상의 암 치료제 및/또는 암을 치료하기 위한 방사선 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인두암, 식도암 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 암은 삼중-음성 유방암 또는 결장직장암이다.
암 치료제는 보르테조밉, 5-플루오로우라실, 독소루비신 또는 시스플라틴일 수 있다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 전신성 홍반성 루푸스를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 조합에 따른 치료적 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 말초 동맥 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 조합에 따른 치료 유효량의 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 대상체의 시스템에 수혈하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 외상성 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 대상체의 시스템 내로 치료적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 조합에 따른 티오숙시닐-가교 헤모글로빈을 수혈하는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1: 프로세스 개요
시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈을 만드는 과정의 예시적인 개략 흐름도는 도 2에 나와 있다. 도축장에서 수집된 소 전혈은 한외여과 단계 및 컬럼 크로마토그래피에 의해 처리, 용해 및 정제되어 고도로 정제된 헤모글로빈 용액(PHS)을 생산한다. 헤모글로빈이 이종이량체로 해리되는 것을 방지하기 위해 DBSF와 가교 반응을 통해 사량체 헤모글로빈을 안정화하고 한외여과 단계를 통해 잔류 DBSF 및 가수분해된 유도체를 제거하여 DBSF 및 3-5, 디브로모살리실산(DBSA) 수준을 0.03% (w/w) 미만으로 만들었다. 푸마릴 가교에 의해 가교된 헤모글로빈(푸마릴 가교 헤모글로빈)은 시스테인과 푸마릴 가교 헤모글로빈에 존재하는 푸마릴 부분의 1,4-부가 반응에 의해 변형되어 탈산소 조건에서 메트헤모글로빈 수준이 2% 미만인 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 형성한다. 그리고 한외여과 정제 단계를 거쳐 시스테인 및 시스틴 수준을 0.03%(w/w) 미만으로 만든다. 상기 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 포함하는 용액에 메트-헤모글로빈 수치를 낮추기 위해 N-아세틸 시스테인을 0.05~0.2% 농도로 첨가하였다.
실시예 2: 고도로 정제된 소 헤모글로빈 용액의 제조
원심분리를 통해 소의 전혈에서 혈액 세포를 분리하고 수집된 혈액 세포를 세포 세척 단계에 적용하였다(Lima, MC, 2007, Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 35(4):431-47). 특정 실시양태에서, 문헌에 기재된 혈액 세포로부터 헤모글로빈을 단리 및 정제하는 방법을 사용하여 현재 방법에 사용되는 헤모글로빈을 제조할 수 있다 (Houtchens, RA & Rausch, CW, 2000, 미국 특허 6,150,507; Wong, BL & Kwok, SY, 2011, 미국 특허 7,989,593 B1). 수집된 혈구로부터 중공사여과 단계를 통해 혈장의 잔류량을 추가로 제거하였다. 세척된 혈액 세포와 저장성 용액을 혼합하여 엄격하게 제어된 과정을 통해 세포 내 헤모글로빈을 방출했다. 세포 파편은 0.2 μm 여과 단계를 통해 세포 용해물에서 제거되었고, 부분적으로 정제된 헤모글로빈 용액을 형성하기 위해 불순물을 부분적으로 제거하기 위한 추가 한외여과 단계가 뒤따랐다. 헤모글로빈 용액을 추가로 정제하기 위해, 네거티브 모드 음이온 컬럼 크로마토그래피 단계 전에 헤모글로빈 용액을 완충제 교환하여 최소 염 농도를 함유하였다. pH, tHb 및 염 농도가 조정된 고도로 정제된 헤모글로빈을 함유하는 통과 분획을 수집하고, 멸균 여과하고 다운스트림 공정 전에 2-8℃에서 보관하였다. 스트로마-프리 헤모글로빈의 제조를 위한 엄격한 공정 제어로 고순도 헤모글로빈의 품질과 순도를 분석하고 표 1에 요약했다.
표 1: 고도로 정제된 헤모글로빈 용액의 오염 물질 및 불순물 수준.
오염물질/불순물
마이코플라스마 감지 불가
인지질 포스파티딜에탄올아민 BLOD(LOD = 0.52g m/mL)
포스파티딜세린 BLOD(LOD = 1.73g m/mL)
스핑고미엘린 BLOD(LOD = 0.42g m/mL)
총 인지질 <9.2 nmol/mL
내독소 <0.1EU/mL
잔류 소 DNA <0.025pg/ml
단백질 불순물 소 면역글로불린 G 0.17ppm
소 혈청 알부민 <0.02ppm
소 혈장 단백질 0.02ppm
소 탄산 탈수효소 36.04ppm
LOD: 감지 한계; BLOD: 감지 한계 미만
실시예 3: 푸마릴 가교 사량체 헤모글로빈의 제조
가교 반응은 탈산소 조건, 즉 0.9% w/v NaCl 수용액에서 용존 산소 수준이 0.1 mg/L 미만인 조건에서 수행하였다. DBSF를 고도로 정제된 소 헤모글로빈 용액에 첨가하여 푸마릴 가교 헤모글로빈을 형성하였다. 이 안정화 절차는 사량체 형태의 헤모글로빈(~65kDa)을 안정화시켜 신장을 통해 배설되는 이량체 형태로의 해리를 방지한다. 사량체 헤모글로빈의 안정화는 고도로 정제된 헤모글로빈(tHb = 13 - 15 g/dL)과 2.5 몰 당량의 DBSF를 pH 9.0에서 질소 분위기(용존 산소 수준을 0.1mg/L 미만으로 유지)에서 4시간 동안 반응시켜 수행하여 헤모글로빈이 산화되는 것을 방지하고, 생리학적으로 비활성인 제2철 메트헤모글로빈을 형성한다. 반응 동안, 탈산소화된 0.1 - 0.5 M NaOH 용액을 첨가하여 반응 pH를 유지하였다. 이어서, 반응 혼합물을 30kDa 공칭 분자량 컷오프(NMWCO) 막을 사용하여 접선 유동 여과를 통해 정제하였다. 정제 과정에서 반응 탱크에 아세테이트 완충액(99mM NaCl, 46mM 아세트산 나트륨)을 연속 공급하여 헤모글로빈 용액의 농도를 9.5-10.5g/dL로 유지하였다. 10-16 정용여과 부피를 거친 후 정제가 완료되었다. 수득된 푸마릴-가교된 사량체 헤모글로빈의 순도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정되었다.
실시예 4: 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 헤모글로빈 안정화의 측정
PDA 검출기 및 크기 배제 컬럼(ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 컬럼, 200Å, 1.7um, 4.6mm x 300mm)이 장착된 UPLC 시스템(ACQUITY UPLC H-class System)을 400분 동안 0.25mL/분의 유속으로 Tris-MgCl2 Buffer(50mM Tris, 750mM MgCl2 및 0.116mM EDTA-Na2, pH 6.5)로 평형화시켰다. 샘플(3mg/mL)을 물로 새로 준비하고 검출 파장을 280nm로 설정하여 SEC로 분석했다. 이 컬럼 조건에서 가교되지 않은 모든 소 헤모글로빈은 도 3A에 도시된 바와 같이 이량체 형태로 해리된 반면, 가교된 헤모글로빈은 도 3B에 도시된 바와 같이 소량의 옥타머를 갖는 사량체로 나타났다. SEC 크로마토그램에서 9.4, 10.8 및 11.5분의 머무름 시간에서 관찰된 용출 피크는 각각 8량체, 사량체 및 2량체 형태의 헤모글로빈의 단백질 신호이다. 다른 형태의 헤모글로빈의 백분율은 해당 피크의 통합 강도에 의해 정량화되었다. 가교 반응의 완료 시, 반응 혼합물은 도시된 바와 같이 85 중량% 이상의 가교된 사량체 소 헤모글로빈(65 kDa), 10 중량% 미만의 가교된 팔량체 헤모글로빈, 및 5 중량% 미만의 이량체 헤모글로빈을 함유할 수 있다. 도 3B에서. 소 푸마릴-가교 헤모글로빈 분자의 사량체 구조는 도 4A에 도시된 바와 같이 베타 글로빈 사슬(β - β 가교) 사이에 적어도 1 내지 3개의 가교제(들)를 함유하였다.
실시예 5 티올 함유 시약에 의한 β-β가교의 변형
푸마릴-가교 헤모글로빈에서 가교제의 푸마릴 부분의 선택적 변형 시스테인, 호모시스테인, NAC 및 2-메르캅토에타올(BME)과 같은 티올 함유 분자를 사용하여 달성되었다. 유리하게는, 베타 글로빈 사슬의 위치 92에 있는 시스테인 잔기는 푸마릴 부분과 반응하지 않았다.
실시예 5A: 시스테인에 의한 β- β가교의 변형
이 구체예에서, 베타 사슬 사이의 가교제의 푸마릴 부분은 시스테인에 의해 변형되었다. 변형 단계에서 pH 8.0-8.3의 40-80mM 시스테인을 아세테이트 완충액(99mM NaCl, 46mM 아세트산나트륨, pH 8.2-8.4)에서 푸마릴-가교 헤모글로빈(tHb = 7-10g/dL)과 함께 용존 산소(DO) 수준이 0.1 mg/L 미만으로 유지되는 탈산소 상태에서 10 - 30℃에서 15 - 30시간의 기간 동안 인큐베이션했다. 반응 혼합물의 잔류 시스테인/시스틴은 30kDa NMWCO 막을 사용한 여과 단계에 의해 제거되었으며, 반응 혼합물은 시스테인/시스틴 수준을 0.03% (w/w) 미만으로 만들기 위해 아세테이트 완충액으로 10-16 정용여과 부피(DV)를 거쳤으며, 표 2에 나타낸 바와 같다. 시스테인/시스틴 수준과는 별도로, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈에서 DBSF 및 이의 가수분해된 유도체(DBSA)의 수준도 0.03%(w/w) 미만이었다.
표 2: 여과 단계 후 시스테인-숙시닐 가교된 소 헤모글로빈에서 시스테인 및 시스틴의 수준.
배치 번호 시스테인 %(w/w) 시스틴 %(w/w)
C8002 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
C8003 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
C8005 <0.0289(BLOQ) <0.0289(BLOQ)
BLOQ: 정량화 한계 미만
푸마릴 가교 헤모글로빈에 대한 시스테인 변형의 완료를 ESI-MS 분석으로 평가하였다. 전자분무 이온화 삼중 사중극자 질량 분석기 및 C3 컬럼(Agilent, Poroshell 300SB-C3, 5μm, 1.0mm x 75mm)이 장착된 UPLC 시스템(Agilent 6460)을 30분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴로 평형화했다. 샘플(0.3mg/mL)을 물로 새로 준비하고 양이온 모드를 사용하여 ESI-MS 시스템으로 분석했다. 샘플의 ESI-MS 질량 스펙트럼은 해당 TIC 크로마토그램의 디콘볼루션에 의해 얻어졌다. β-β 가교 글로빈 사슬에 대한 시스테인의 1:1 화학량론적 첨가는 도 4B에 도시된 바와 같이 포화 상태에서 발견되었다. 도 4A에 도시된 바와 같이, DBSF에 의한 β 글로빈 사슬 간의 가교를 통한 헤모글로빈의 안정화는 1, 2 및 3 가교 가교를 함유하고 각각 약 31988 Da, 32068 Da 및 32148 Da의 분자량을 갖는 3개의 주요 종을 생성하였다. 시스테인 아미노산(121 Da)은 이러한 β - β 가교된 글로빈 사슬의 푸마릴 부분에 공유 결합되어 도 4B에 도시된 같이 각각 32,109 Da, 32,310 Da 및 32,511 Da의 종을 생성했다.
상기 샘플을 추가로 ESI-MS/MS 분석으로 분석하여, 푸마릴 가교 헤모글로빈의 β-β 가교의 푸마릴 부분이 시스테인 아미노산에 의해 변형되었음을 확인하였다. 샘플을 10% SDS-PAGE로 분석하고 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 20%(v/v) 메탄올 및 10%(v/v) 아세트산을 사용하여 시각화했다. 32kDa 이하의 주요 가교 글로빈 사슬에 해당하는 단백질 밴드를 SDS-PAGE 겔에서 절단하고 큐브(1 x 1mm)로 자르고 50% 아세토니트릴/20% 50mM 중탄산 암모늄 용액으로 탈색했다. 탈색된 겔 큐브를 37℃에서 밤새 50mM 중탄산 암모늄에서 10ng/μL 시퀀싱 등급 트립신으로 겔 내 분해했다. 트립신 소화 후, 트립신 소화 펩티드를 50%(v/v) 아세토니트릴과 1%(v/v) 트리플루오로아세트산으로 확산시켜 추출했다. 상청액을 수집하고 45℃에서 SpeedVac에 의해 용매를 제거하였다. 트립신으로 분해된 펩타이드를 0.1%(v/v) 포름산에 녹이고 역상 C18 컬럼으로 분리한 후 Orbitrap-Velos Mass Spectrometer를 사용하여 분석했다. EIS-MS/MS 데이터는 가교 사이트 분석을 위해 pLink 검색 엔진에 입력되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, β 글로빈 사슬의 1번 위치에 N 말단 질소와 81번 위치에 라이신 측쇄 질소가 가교된 펩타이드를 확인하였다. 중요하게는, 가교 펩타이드의 분자량은 80 Da(푸마릴 부분) 대신 201 Da였으며, 이는 시스테인 아미노산(MW=121 Da)이 β-β가교 펩타이드의 푸마릴 부분에 공유 결합되었지만 베타 글로빈의 92번 위치에 있는 시스테인의 티올 기는 아님을 확인시켜준다.
시스테닐-숙시닐화 가교제(들)를 포함하는 신규 헤모글로빈 유사체가 상기 공정에 의해 생성되었다. 생성된 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 함유하는 약제학적 조성물은 0.2%(w/w) NAC의 존재 하에 질소 하에 유지되었으며, 다음과 같은 생성물 특성을 갖는다: tHb = 9.5-10.5g/dL, pH 7.4-8.4, O2Hb≤10%, MetHb≤5%, 내독소≤0.25EU/mL 및 90-100% 범위의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈.
실시예 5B: β - β 티올 함유 시약에 의한 가교의 변형 비교
pH 8.2에서 푸마릴 부분을 시스테인, 호모시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 다른 티올 함유 시약과 반응시킬 때, 푸마릴 부분과 티올 시약 사이의 상이한 변형 정도가 관찰되었다. 티올 함유 시약의 예비 연구는 시스테인, β-메르캅토에탄올 및 호모시스테인을 포함하지만 이에 국한되지 않는 입체 및 전자 효과(pKaSH 값)를 기반으로 선택되었다.
시스테인(pKaSH = 8.35), β-메르캅토에탄올(pKaSH = 8.87), 호모시스테인(pKaSH = 9.6)을 포함한 탈기된 티올 시약의 다양한 농도 (111μL, RA- 완충액 pH=8.2에서 1000, 775, 258 및 86mM) 탈산소화 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액(9.0g/dL, pH = 8.2) 1mL에 첨가하였다(Pitman, IH & Morris, IJ, 1979, Aust J Chem, 32: 1567-73). 3, 6 및 24시간에 샘플을 수집하고 탈염 컬럼(Bio-Spin P6에 대해 150mL, 2회)을 사용하여 과량의 티올을 제거했다. 샘플은 도 6과 같이 ESI-MS를 사용하여 분석되었으며 결과는 표 3에 요약되어 있다.
표 3: 다른 티올 과 푸마릴 가교 헤모글로빈의 반응성.
티올 함유 시약 시스테인
(mM)		 β-메르캅토에탄올
(mM)		 호모시스테인
(mM)
농축
(mM)		 8.6 25.8 77.5 8.6 25.8 77.5 100 8.6 25.8 77.5
반응 시간 3시간 x x x x x x x x x x
6시간 x x x x x x x x x x
24시간 x x v x x x v x x x
x: 푸마릴-티올 커플링 반응의 불완전 포화
v: 푸마릴-티올 커플링 반응의 포화
푸마릴-가교 헤모글로빈과 티올 사이의 푸마릴-티올 반응 정도는 시간 및 농도 의존적으로 진행되었다. 변형되지 않은 푸마릴-가교 헤모글로빈은 다양한 농도의 티올과 함께 3시간 및 6시간 배양 후에도 검출 가능한 상태로 유지되었다. 24시간에, 77.5mM 시스테인 및 100mM β-메르캅토에탄올과의 반응은 푸마릴 가교-헤모글로빈에서 β-β 가교의 모든 푸마릴 부분을 완전히 변형시킨 반면, 비변형 푸마릴-가교 β-β 글로빈 사슬은 시스테인, β-메르캅토에탄올 및 호모시스테인의 농도가 낮게 인큐베이션된 헤모글로빈 혼합물에서 검출 가능한 상태로 남아 있었다.
이러한 결과는 β-β가교의 푸마릴 부분이 티올과 매우 효율적인 마이클 부가(1,4-부가) 반응을 겪었음을 나타낸다. pH, 염 농도, 티올 당량 및 반응 기간과 같은 반응 조건은 푸마릴 가교 헤모글로빈에서 원하는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈으로의 90-100% 전환율을 달성하도록 최적화되었다.
가교된 헤모글로빈의 가교제와 시스테인 또는 NAC와 같은 티올 사이의 이러한 변형이 도 7에 도시된 바와 같이, 예상된 바와 같이 비스-3,5-디브로모살리실 숙시네이트(DBSS)로 가교된 헤모글로빈에서는 발생하지 않았다는 점은 주목할 만하다.
실시예 6: 수성 조건하에서 푸마라미드와 알킬티올의 반응 연구
모델 분자 N,N'-비스(1-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-(카르복시)펜틸)푸마아미드를 사용하여 수성 조건에서 푸마라미드와 알킬티올 사이의 반응을 확인했다(BocLysF; 도 8a). BocLysF (15mM)를 수성 조건(0.1M 인산염 완충액, pH = 8.2, 탈산소화됨)에서 β-메르캅토에탄올 및 시스테인을 포함한 모델 알킬티올(77.5mM)과 7일 동안 반응시켰을 때, 반응 혼합물의 MS 스펙트럼은 출발 물질 BocLysF의 완전한 소모 및 티올 첨가 생성물의 예상 질량 피크의 출현(각각 M+H+; 649 및 692 Da)을 명확하게 보여주었다. 반응 혼합물의 NMR 분석에서 알 수 있는 바와 같이, 푸마라마이드 이중 결합 신호의 손실, C2 탄소에 geminal proton 결합 피크를 갖는 숙신아미드의 형성 및 아민 신호의 분할이 발견되었다. 이러한 관찰은 한 쌍의 geminal proton이 생성된 succinamide의 C2 탄소에 도입된 티올-미셀-부가(thiol-Michael-addition) 경로를 통해 푸마라미드와 알킬티올 사이의 부가 반응의 발생에 의해 합리화될 수 있다. 중요하게는, 반응 혼합물이 깨끗하고 예상되는 숙신아미드 및 잔류 알킬티올이 NMR 스펙트럼에서 관찰되었으며, 이는 푸마릴과 알킬티올의 반응이 완료되었음을 시사한다. 따라서 헤모글로빈을 포함한 푸마릴 가교 단백질의 가교 후 변형 및 기능화에 이상적인 반응이다. 푸마라미드 BocLysF 및 N,N'-비스(1-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-(카르복시)펜틸)-1-(2-히드록시에틸티오)- 숙신아미드를 포함하는 생성된 숙신아미드(BocLysF-BME) 의 전체 특성화 데이터 도 8b) 및 N,N'-비스(1-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-(카르복시)펜틸)-1-(S-시스테닐)숙신아미드 (BocLysF-Cys; 도 8c)가 표 4-6에 도시된다.
표 4: d6-DMSO에서 BocLysF의 1H 및 13C 신호의 완전한 할당.
1H [ppm] 13C [ppm]
CH(COOH)(NHCOOC( CH 3 )3) 1.36 28.70
CH (COOH)(NHCOOC(CH3)3) 3.74 54.47
CH(COOH)(N H COOC(CH3)3) 6.66 -
CH 2 CH2CH2CH2NH 1.58 31.30
CH2 CH 2 CH2CH2NH 1.27 23.40
CH2CH2 CH 2 CH2NH 1.39 29.13
CH2CH2CH2 CH 2 NH 3.10 38.91
CH2CH2CH2CH2N H 8.39 -
CH = CH 6.77 133.47
표 5. d6-DMSO에서 BocLysF-BME의 1H 및 13C 신호의 완전한 할당.
1H [ppm] 13C [ppm]
CH CH 2CH2CH2CH2NH 1.55 32.86
CHCH2 CH 2CH2CH2NH 1.21 22.62
CHCH2CH2 CH 2CH2NH 1.34 20.96
CHCH2CH2CH2 CH 2NH 2.96 39.35
CHCH2CH2CH2CH2N H 7.88, 8.04 -
CH(NHCOOC( CH 3)3)(COOH)] 1.36 28.69
CH (NHCOOC(CH3)3)(COOH)] 3.69 59.87
CH(N H COOC(CH3)3)(COOH)] 6.17 -
Figure pct00032
 2.31, 2.56 38.99
Figure pct00033
 3.60 43.57
Figure pct00034
 2.61 34.56
Figure pct00035
 3.48 61.15
표 6. d6-DMSO에서 BocLysF-Cys의 1H 및 13C 신호의 완전한 할당.
1H [ppm] 13C [ppm]
CH CH 2CH2CH2CH2NH 1.55 33.41
CHCH2 CH 2CH2CH2NH 1.20 22.26
CHCH2CH2 CH 2CH2NH 1.35 29.31
CHCH2CH2CH2 CH 2NH 2.90, 3.13 39.98
CHCH2CH2CH2CH2N H 8.16, 8.43 　-
CH (NHCOOC(CH3)3)(COOH)] 3.63 56.22
CH(NHCOOC( CH 3)3)(COOH)] 1.34 28.55
CH(N H COOC(CH3)3)(COOH)] 6.05 　-
Figure pct00036
 2.38, 2.52 37.90
Figure pct00037
 3.71 42.87
Figure pct00038
 2.75, 2.94, 3.06 34.26
Figure pct00039
 3.46 55.37
실시예 7: 약제학적 조성물에서 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈의 순도
실시예 5에 기재된 바와 같이, 시스테인과 푸마릴 가교 헤모글로빈의 가교의 푸마릴 잔기를 반응시켜 시스테인-숙시닐 β-β 가교 헤모글로빈을 함유하는 약학 조성물을 제조하였다.
상기 실시예에 의해 생성된 시스테닐-숙시닐가교 헤모글로빈의 순도를 ESI-MS 분석을 통해 평가하였다. 샘플은 C3 컬럼(Agilent Poroshell 300SB-C3, 5μm, 1.0mm × 75mm)이 있는 액체 크로마토그래피 시스템(Agilent 6460)에 연결된 Agilent 6540 Electrospray Ionization Quadrupole-Time-of-Flight 분광계에서 LC-MS로 분석되었으며 질량 스펙트럼은 Agilent MassHunter 정성 분석 소프트웨어에서 최대 엔트로피 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션되었다. 가교된 종은 디컨볼루션된 MS 데이터의 분자 질량을 이론적인 수치와 일치시켜 확인했다. 분자종의 상대적 존재비는 디콘볼루션 스펙트럼의 곡선 아래 면적을 사용하여 추정되었다.
ESI-MS 스펙트럼의 분석에 기초하여, 푸마릴-가교 헤모글로빈은 28%, 58% 및 15%의 몰비로 존재하는 푸마릴 가교 1개(1XL), 2개(2XL) 또는 3개(3XL)를 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 각각 적어도 1개의 푸마릴 브릿지가 β글로빈 사슬 사이에 가교되었다. 언급된 시스테인으로 변형된 후, 변형되지 않은 푸마릴-가교된 β-β 글로빈 사슬의 질량에 해당하는 피크는 ESI-MS 스펙트럼에서 검출할 수 없었다. 대신, 피크는 유사한 비율로 존재하는 것으로 밝혀졌지만 분자량은 각각 1(1XL+1Cys), 2(2XL+ 2Cys) 및 3개의 시스테인 아미노산(3XL+3Cys)의 화학량론적 첨가에 해당하는 121, 242 및 363 Da만큼 이동한 것으로 나타났다. 시스테인 변형 전후의 β-β 가교에 대한 분자량을 각 성분에 대해 나타내었다. 이 발견은 시스테인과 푸마릴 가교된 헤모글로빈 사이의 푸마릴 티올 커플링 반응이 완전히 완료되었으며 표 7에 나타낸 바와 같이 시험된 반응 조건 하에서 시스테인으로 변형된 후 적어도 95% 이상의 전환이 달성되었다는 개념을 뒷받침한다.
표 7: 시스테인 변형 전후의 푸마릴 가교 헤모글로빈에서 베타-베타 글로빈 사슬(β-β)의 비율.
가교 종 분자 질량 다양한 수의 푸마릴 가교를 갖는 % 헤모글로빈 시스테인에 의한 변형 후 다양한 수의 시스테닐-숙시닐 가교를 갖는 헤모글로빈 %
푸마릴 가교 β- β글로빈 사슬 1 푸마릴 가교결합(XL) 31988Da 28% NA
2 푸마릴 가교결합(2XL) 32068Da 58% NA
3 푸마릴 가교결합(3XL) 32148Da 15% NA
시스테닐 -숙시닐 가교 β- β글로빈 사슬 1 시스테닐-숙시닐 가교결합제(1XL+1Cys) 32109Da 0% 31%
2 시스테닐-숙시닐 가교결합제(2XL+2Cys) 32310Da 0% 59%
3 시스테닐-숙시닐 가교결합제(3XL+3Cys) 32511Da 0% 10%
NA: 해당 없음
실시예 8: 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도에 대한 pH 및 반응 매질의 영향
pH 및 반응 매질을 포함한 다른 반응 변수에서 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도를 조사하였다. β-메르캅토에탄올의 탈기 용액 (111μL; RA- 또는 추가 0.9% NaCl 포함 RA-에서 775mM)을 1mL의 탈산소 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액 (8.7g/dL, pH = 7.4, 8.2 또는 9.0; RA- 또는 RA-에서 추가 0.9% NaCl 포함)에 첨가했다. 6시간 및 24시간에 샘플을 수집하고 탈염 컬럼(Bio-Spin P6에 150μL, 2회)을 사용하여 과량의 티올을 제거했다. ESI-MS 분석을 이용하여 시료를 분석하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다. 6시간째에 채취한 시료에서는 푸마릴 브릿지의 완전한 포화가 검출되지 않았다. 상이한 pH 값 및 염 농도에서의 반응 조건 중에서, 77.5mM까지 β-메르캅토에탄올에 의한 푸마릴 가교의 변형은 pH 7.4 또는 pH 9.0에서 24시간 내에 완료되었다. pH 8.2에서 77.5mM 시스테인으로 완전한 변형이 달성되었지만, pH 8.2에서 77.5mM β-메르캅토에탄올에 의한 변형은 불완전하게 남아 있었고 24시간의 인큐베이션 후에도 변형되지 않은 푸마릴 다리의 존재가 감지되었다. 결과는 또한 반응 매질의 염도가 증가할 때 커플링 반응의 반응 속도에 관찰 가능한 영향이 없음을 보여주었다.
표 8: 푸마릴-가교 헤모글로빈과 β-메르캅토에탄올 사이의 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도에 대한 pH 및 반응 매질의 영향.
반응 조건 반응 시간 반응 pH
7.4 8.2 9.0
RA-* 완충액 중 77.5mM β-메르캅토 에탄올 6시간 x x x
24시간 v x v
추가 0.9% NaCl이 포함된 RA-* 완충액 중 77.5mM β-메르캅토에탄올 6시간 x x x
24시간 v x v
x: 푸마릴-티올 커플링 반응의 불완전 포화
v: 푸마릴-티올 커플링 반응의 포화
* Ringer's Acetate Minus Buffer(RA-Buffer)
실시예 9: 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도에 대한 티올 함유 시약 농도 및 반응 시간의 영향
β-메르캅토에탄올(111 μL; RA-에서 775, 388, 194, 97 및 48mM, pH 9.0) 또는 시스테인(111 μL; RA-에서 775, 388, 194 및 97mM, pH = 9.0)의 탈기 용액을 1.0 mL의 탈산소 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액(9.0 g/dL, pH = 9.0)에 첨가하였다. 6, 24, 48 및 72시간에 샘플을 수집하고 탈염 컬럼(Bio-Spin P6에 150μL; 2회)을 사용하여 과량의 티올을 제거했다. 모든 시료는 ESI-MS를 이용하여 분석하였고 그 결과를 표 9에 정리하였다. 푸마릴-티올 반응속도는 농도 의존적으로 증가하였고 시스테인과 β - 메르캅토에탄올과 푸마릴 잔기의 결합속도는 농도가 증가함에 따라 19.4mM에서 38.8mM까지 2배 증가하였다. 시스테인 또는 β - 메르캅토에탄올에 의한 푸마릴 부분의 완전한 변형은 24시간 이내에 달성되었다. 9.7mM과 같은 낮은 티올 시약 농도에서는 반응 속도가 상당히 감소하였지만, 반응 시간을 72시간으로 연장함으로써 푸마릴 브릿지의 포화를 달성하였다.
표 9: 푸마릴-가교 헤모글로빈과 티올(시스테인 및 β-메르캅토에탄올) 간의 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도에 대한 티올 농도 및 반응 시간의 영향.
시스테인 β-메르캅토에탄올
농도(mM) 9.7 19.4 38.8 77.5 4.8 9.7 19.4 38.8 77.5
반응 시간 6시간 x x x x x x x x x
24시간 x x v v x x x v v
48시간 x v v v x x v v v
72시간 v v v v x v v v v
x: 푸마릴-티올 커플링 반응의 완전한 포화
v: 푸마릴-티올 커플링 반응의 포화
푸마릴 부분의 완전한 변형은 티올 시약의 물리화학적 특성 및 최적이 아닌 커플링 조건에 의해 제한될 수 있다. 푸마릴 부분의 포화를 유도하는 반응 조건은 티올 시약마다 다르기 때문에 입체 및 전자 효과와 같은 고유한 분자 특성 및 반응 조건은 적어도 티올 시약의 등가물과 조합하여 작용한다. pH와 지속 시간은 변형 속도뿐만 아니라 커플링 반응의 전체 전환에도 영향을 미친다. 예를 들어, 77.5, 174 및 310mM N-아세틸 시스테인(NAC) 을 pH 8.2에서 푸마릴 가교 헤모글로빈과 함께 인큐베이션하고 24시간 및 48시간에 수집된 샘플을 ESI-MS로 분석했다. 결과는 푸마릴-티올 커플링 반응의 전환율이 24시간에서 모든 농도에 대해 95% 미만으로 발견되었음을 보여주었다. 95%에서 푸마릴-티올 커플링 반응은 310mM NAC를 사용하여 인큐베이션 시간을 48시간으로 연장한 경우에만 관찰되었다. 시스테인을 이용한 푸마릴-티올 반응과 비교할 때, 푸마릴 브릿지를 포화시키기 위한 NAC의 농도는 4배 더 높았고 배양 시간은 2배였다. 이러한 결과는 NAC에 의한 가교 헤모글로빈의 푸마릴 부분의 >95% 전환을 달성하기 위해 더 높은 NAC 농도 및 인큐베이션 시간이 필요할 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 당업자가 의도적으로 푸마릴-티올 커플링 반응을 수행하려고 시도하고 완전한 반응을 보장하기 위해 반응 조건을 최적화하려고 노력하지 않는 한, 메트헤모글로빈의 형성을 억제하는 것은 높은 수준의 전환에서 티오숙시닐-가교 헤모글로빈의 형성을 초래하지 않을 것이다(표 10).
표 10: 푸마릴-티올 커플링 반응의 반응 속도에 대한 NAC 농도 및 반응 시간의 영향.
반응 시간 NAC 농도
77.5mM 174mM 310mM
24 시간 x X X
48 시간 x x v
x: 푸마릴-티올 커플링 반응의 불완전 포화
v: 푸마릴-티올 커플링 반응의 포화
실시예 10: 티올 함유 시약의 변형 후 푸마릴 가교 헤모글로빈의 p50 값의 변화
헤모글로빈의 산소 친화도 특성은 산소 해리 곡선에서 결정된 p50 값으로 설명할 수 있다. 헤모글로빈의 산소 해리 곡선은 다른 산소 장력에서의 헤모글로빈 포화도 사이의 관계를 나타내며, p50은 헤모글로빈이 50% 포화된 산소 장력이다.
시약의 완전 반응에 의해 생성된 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 p50 값을 평가하였다. 헤모글로빈 용액에 대한 산소 해리 곡선은 Hemox 분석기(TCS Scientific, New Hope, PA)를 사용하여 얻었다. 산소 장력은 Clark 산소 전극을 이용하여 측정하였고, 헤모글로빈 포화도는 내장된 이중 파장 분광 광도계를 이용하여 측정하였다. 측정은 최종 헤모글로빈 농도가 0.05g/dL인 Hemox 용액(135mM NaCl, 5mM KCl 및 30mM TES, pH 7.4)에서 수행되었으며 온도는 측정 내내 37℃를 유지했다. 산소 해리 곡선의 컴퓨터 기반 분석을 수행하여 산소 결합에 대한 p50을 산출했다. 산소 해리 매개변수는 Hemox 분석기 소프트웨어(TCS Hemox DAQ 시스템, 버전 2.0)에 포함된 비선형 최소 제곱 절차에 의해 각 산소 해리 곡선에 Adair 방정식을 피팅하여 파생되었다.
그 결과 310mM NAC에서 48시간 동안 푸마릴 가교 혈색소를 배양하여 95% 이상의 푸마릴 가교 혈색소가 티오숙시닐 가교 혈색소로 전환되었으며 p50 값이 11% 증가함을 보여준다. 대조적으로, 77.5mM 시스테인 또는 100mM β-메르캅토에탄올과 함께 인큐베이션하여 제조된 순도 95% 이상의 티오숙시닐 가교형 헤모글로빈 용액은 표 11에 나타난 바와 같이 미변형 푸마릴 가교형 헤모글로빈과 비교하여 유사한 p50 값을 나타내었다.
표 11: 다른 티올 시약으로 변형된 후 티오숙시닐-가교결합된 헤모글로빈의 p50 값.
인큐베이션 시간 푸마릴 가교 헤모글로빈 티오숙시닐 가교 헤모글로빈
N-아세틸 시스테인 β-메르캅토에탄올 시스테인
- 77.5mM 174mM 310mM 100mM 77.5mM
0시간 55mmHg - - - - -
24시간 - 56
mmHg		 60mmHg 63mmHg 53
mmHg		 54
mmHg
48시간 - 58mmHg 62mmHg 61mmHg - -
결과는 또한 실시예 5A에 기재된 제조 절차에 따라 시스테인을 티올-차단된 푸마릴-가교 헤모글로빈 (베타글로빈의 92번 위치 시스테인 잔기가 푸마릴 가교제와의 가교반응에 앞서 요오도아세트아미드와의 반응에 의해 차단(알킬화)된 헤모글로빈)에 접합함으로써 완전한 변형이 달성되었음을 나타낸다. 시스테닐-숙시닐 가교 티올 차단 헤모글로빈의 p50 값은 또한 표 12에 나타낸 바와 같이 ~36 mmHg(탈산소 조건에서 가교) 또는 ~9 mmHg(산소 조건에서 가교)의 p50 값을 갖는 것에 대해 수정 후에도 변경되지 않은 채로 유지되었다. 이것은 상이한 산소 운반 능력을 갖는 푸마릴-가교결합된 헤모글로빈에 대한 시스테인의 접합이 놀랍게도 그들의 p50 값을 변경하지 않았음을 나타낸다.
표 12: 탈산소화 또는 산소화 조건하에서 가교된 티올-차단된 푸마릴-가교 헤모글로빈으로부터 생성된 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈의 p50 값.
티올 차단 푸마릴 가교 소 헤모글로빈 티올 차단 시스테닐-숙시닐 가교 소 헤모글로빈
탈산소 조건에서의 가교 반응 37mmHg 35mmHg
산소 상태에서의 가교 반응 9mmHg 9mmHg
실시예 11: 시스테닐-숙시닐 가교결합된 헤모글로빈의 시험관내 안정성
시스테인, NAC 또는 글루타티온(GSH)과 같은 소분자 티올의 존재 하에 시스테인-숙시닐 가교된 헤모글로빈에서 시스테닐-숙시닐화된 부분의 안정성을 테스트했다. 이러한 소분자 티올은 예를 들어 메트헤모글로빈 수준을 감소시키기 위해 부형제로서 헤모글로빈 기반 치료 약물 제형에서 일반적으로 사용된다.
푸마릴 가교 헤모글로빈 및 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 1:4 또는 1:8 몰비(100mg/mL 헤모글로빈)로 NAC, 시스테인 또는 GSH와 함께 무독성의 환경에서 인큐베이션했다. 다양한 시점에서 채취한 샘플을 C3 컬럼(Agilent Poroshell 300SB-C3, 5μm, 1.0 mm x 75mm)이 있는 액체 크로마토그래피 시스템(Agilent 6460)에 연결된 Agilent 6540 Electrospray Ionization Quadrupole-Time-of-Flight 분광계에서 ESI-MS로 분석했다. 질량 스펙트럼은 Agilent MassHunter 소프트웨어의 Maximum Entropy 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션되었다. 가교된 글로빈 종은 디컨볼루션된 MS 데이터의 분자량을 이론적인 수치와 일치시켜 확인했다. 분자종의 상대적 존재비 는 디콘볼루션 스펙트럼의 곡선 아래 면적을 사용하여 추정되었다.
표 13은 8배 몰 과량의 NAC의 존재 하에 12개월에 걸쳐 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈의 ESI-MS 데이터로부터 유도된 상이한 가교된 β-β 종의 상대적 존재비의 추정치를 보여준다. 주요 가교 종의 곡선 아래 면적(AUC)은 적어도 12개월 후에도 안정적으로 유지되어 시간 경과에 따른 가교 종의 풍부함의 안정성을 보여준다.
표 13: 12개월에 걸친 NAC의 존재 하에 시스테닐 β- β숙시닐 가교된 헤모글로빈에서 글로빈 사슬의 안정성.
상이한 수의 시스테닐-숙시닐 β-β 가교를 갖는 % 헤모글로빈
시간 1XL+1Cys 2XL+2Cys 3XL+3Cys
출시 시 32% 58% 10%
1 개월 39% 51% 11%
2 개월 36% 53% 11%
5 개월 40% 53% 6%
7개월 42% 51% 7%
10개월 39% 55% 7%
11개월 35% 57% 8%
12 개월 37% 56% 7%
백분율은 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼에서 추정된 다양한 가교 종의 상대적 존재비이다. "XL" - 가교, "Cys" - 시스테인.
대조적으로, 푸마릴-가교 헤모글로빈의 푸마릴 부분은 9주 모니터링 기간 동안 NAC와 지속적으로 반응했으며, NAC는 헤모글로빈 분자의 β-β 가교에 공유적으로 부착되었다 (표 14). 시스테인 및 GSH에 대한 유사한 반응도 분명했다(표 15 및 16).
표 14: 9주에 걸쳐 0.2% NAC의 존재 하에 푸마릴 β-β 가교 헤모글로빈에서 글로빈 사슬의 안정성.
다른 종의 헤모글로빈 % β- β가교
시간 1XL 2XL 1XL+1NAC 2XL+1NAC 2XL+2NAC
3일차 18% 20% 20% 37% 5%
1주 19% 21% 20% 37% 3%
3주 12% 9% 28% 43% 8%
5주 9% 삼% 32% 44% 11%
9주 삼% 0% 38% 41% 19%
백분율은 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼에서 추정된 다양한 가교 종의 상대적 존재비이다. XL” - 가교, “NAC” - N-아세틸 시스테인.
표 15: 4시간에 걸친 4배 몰 과량의 시스테인을 갖는 푸마릴 가교된 헤모글로빈 에서 β- β 글로빈 사슬의 안정성.
다른 종의 헤모글로빈 % β-β가교
시간 1XL+1Cys 2XL 2XL+1Cys 2XL+2Cys
T = 0.25시간 20% 58% 22% 0%
T = 4시간 22% 24% 34% 20%
표 16: 4시간에 걸친 글루타티온의 4배 몰 과량을 갖는 푸마릴 β-β가교된 헤모글로빈에서 글로빈 사슬의 안정성.
다른 종의 헤모글로빈 % β-β가교
시간 1XL 1XL+1GSH 2XL 2XL+1GSH
T = 0.25시간 27% 4% 64% 5%
T = 4시간 20% 9% 58% 12%
백분율은 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼에서 추정된 다양한 가교 종의 상대적 존재비이다. "XL" - 가교, "GSH" - 글루타티온.
실시예 12: 시스테닐-숙시닐 가교결합된 헤모글로빈 용액에서 부형제로서의 NAC의 안정성
티올 함유 화합물은 기능 장애 메트헤모글로빈의 전환 및 예방을 위한 부형제로서 헤모글로빈 기반 산소 치료제에서 일반적으로 사용된다. 본 실험에서 NAC는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액에서 부형제로 사용되었으며 , NAC는 기능장애 메트헤모글로빈을 기능적 헤모글로빈 형태로 환원시키면 N,N'-diacetyl-L-cystine(NAC2)으로 산화되었다. 샘플은 저장에 걸쳐 다양한 시점에서 채취되었고 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 용액 에서 NAC 및 그의 산화 생성물인 NAC2 의 수준을 역상 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 측정을 위해 샘플을 5% 메타인산으로 처리하여 단백질을 침전시키고 상층액을 XBridged C18 컬럼(5mm, 4.6mm x 250mm)에서 100mM 인산 나트륨 pH 2.3, 5.7mM 나트륨 1-옥탄설포네이트:메탄올 91:9(v/v)을 포함하는 완충액에서 등용매 용출을 사용하여 분리했다. NAC 및 NAC2는 9.375mg/mL에서 300mg/mL 범위의 각각의 보정 곡선을 사용하여 정량화되었다.
푸마릴-가교 헤모글로빈 용액(도 9A)에서 NAC 및 NAC2의 총 수준과 대조적으로, 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈은 도 9B에 도시된 바와 같이 장기간에 걸쳐 안정한 수준의 티올 부형제 NAC를 가졌다.
실시예 13:시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 기능적 안정성
0.2% NAC(v/v) 존재하에서 푸마릴 가교 혈색소 및 시스테닐-숙시닐 가교 혈색소 용액의 p50 값은 Hemox 분석기(TCS Scientific Corp)를 사용하여 측정하였다. Hemox 완충액(pH 7.4) 중 0.5 mg/mL의 헤모글로빈 생성물 샘플을 30분 동안 산소를 버블링하여 산소화한 다음, pO2 가 1.9mmHg에 도달할 때까지 질소를 버블링하여 탈산소화했다. 생성된 산소 평형 곡선은 측정되는 샘플의 불완전한 산소화를 조정하기 위해 Adair 방정식을 사용하여 TCS 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 생산 후 최소 3개월 동안 안정적인 p50 값을 보였다. 대조적으로, 푸마릴-가교 헤모글로빈은 아마도 표 17에 도시된 바와 같이 가교된 헤모글로빈 분자의 β-β 가교에 대한 NAC의 공유 결합으로 인해 10주에 걸쳐 p50 값에서 12% 증가를 나타냈다.
표 17: 각각 0.2% NAC의 존재에서 푸마릴-가교 헤모글로빈 및 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈의 p50 안정성 .
시간 Adair의 p50(mmHg)
푸마릴 가교 헤모글로빈 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈
출시 시 64 67
1 개월 66 67
3 개월 70 67
실시예 14: 시스테닐-숙시닐 가교결합된 헤모글로빈 의 생체내 안정성
생체 내 안정성을 평가하기 위해 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 쥐를 이소플루란(유도용 5%, 유지용 1-2%)으로 마취하고 푸마릴 가교 헤모글로빈 또는 시스테닐 숙시닐 가교 헤모글로빈을 20 mg/kg의 용량 수준에서 시간당 0.8-2.0 mL로 대퇴 정맥을 통해 정맥 주사했다. 0.5-1mL 혈액 샘플을 헤파린 튜브에 주입한 지 2시간 후에 대퇴 동맥에서 수집했다. 강력한 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈장 샘플에서 헤모글로빈 생성물이 농축되었다. 혈장 샘플을 20mM Tris-HCl pH 8.9에서 80000배로 희석하고 20mM Tris-HCl pH 8.9로 평형화된 HiTrap Q HP 컬럼(GE Healthcare)에 로딩했다. 헤모글로빈 생성물은 20mM Tris-HCl pH 8.9에서 0 - 400mM NaCl의 구배에 걸쳐 HiTrap Q HP 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 용출되었다. 헤모글로빈 생성물의 농축은 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 평가하였다. 풀링된 분획은 Agilent 6540 Electrospray Ionization Quadrupole-Time-of-Flight 분광기를 사용하여 ESI-MS로 분석되었다.
도 10A에 도시된 바와 같이, 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈의 β - β 가교는 사전 주입과 비교하여 생체내에서 티올로 추가 변형을 겪지 않았다. 대조적으로, 푸마릴-가교 헤모글로빈 생성물의 것들은 생체내 시스테인 및 NAC로 변형되었다 (도 10B). 시스테인은 혈장에서 중요한 산화환원 조절제이고 NAC는 헤모글로빈 제품 제형의 부형제이다. 이들 결과는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 생체내 안정성을 보여준다.
실시예 15: 출혈성 쇼크에서 조직 산소화의 회복(푸마릴-가교 헤모글로빈 대 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈)
스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트의 심각한 출혈성 쇼크 모델에서 간 조직 산소화를 다음과 같이 평가했다.
그룹 1: 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액(650mg Hb/kg 체중); 그리고
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (650mg Hb/kg 체중).
스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트를 마취하고 수술 절차를 위해 계측했다. 개복술은 간을 노출시키기 위해 큰 중간 절개로 수행되었다. 대면적 산소 센서(LAS, Oxford Optronix, UK)를 쥐 간의 우엽과 삼각형 엽 사이에 삽입하여 안정화시켰다. 기준선 산소 장력 수준을 수집한 후, 상승된 동맥 젖산 수준(8 ~ 11mM/L) 및 동맥 기저 과잉 <-12mM/L에 의해 반영된 바와 같이 산소 공급/수요 불균형을 유발하기 위해 쥐를 출혈로 저혈압 상태로 만들었다. 쇼크 유도 후 진입 기준을 충족한 후 래트에게 650mg/kg 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액(그룹 1) 또는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(그룹 2)을 주입했다. 이 2개의 헤모글로빈 분자의 간 산소 장력 수준을 모니터링하고 주입 후 최대 1시간까지 비교했다.
도 11에 나타난 바와 같이, 실험 전반에 걸쳐 650mg/kg의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(그룹 2)의 주입이 푸마릴-가교 헤모글로빈 용액(그룹 1)에 비해 간 조직 산소화의 유의한 증가를 나타냄을 결과로 알 수 있다.
이는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈이 기존의 푸마릴 가교 헤모글로빈과 비교하여 허혈/저산소 조건에서 우수한 산소 오프로딩 능력을 가짐을 나타낸다.
실시예 16: 허혈성 사지에서의 혈액 관류 회복(푸마릴-가교 헤모글로빈 대 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈)
허혈성 사지의 혈류 회복은 말초 동맥 질환을 모방한 대퇴 동맥 결찰을 수행하여 마우스에서 평가되었다.
그룹 1: 음성 대조군(볼륨 일치 RA 버퍼, n=8)
그룹 2: 푸마릴 가교 헤모글로빈 용액(1600mg/kg, n=2)
그룹 3: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(1600mg/kg, n=3)
치명적인 사지 허혈을 유도하기 위해 ICR(CD-1) 마우스를 마취시켜 수술 절차를 수행했다. 대퇴 동맥은 복재 동맥과 슬와 동맥으로 분기되는 원위 지점까지 결찰되었다. 24시간 후 동맥 결찰시에, 마우스에 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 상이한 처리를 투여하였다. 기준선, 결찰 직후, 치료 후 7일, 치료 후 14일 및 치료 후 21일에 혈류를 모니터링하기 위해 직렬 레이저 도플러 영상 분석(Moor Instruments, Devon, UK) 을 수행했으며 무릎에서 발가락까지의 평균 혈류를 정량화하고 계산했다. Tivi106 Oxygen Mapper 분석기(WheelsBridge AB, 스웨덴)로 변조된 Tivi600 조직 생존율 이미저를 수행하여 기준선, 결찰 직후, 처리 후 30분, 처리 후 60분, 처리 후 7일, 처리 후 14일에 산소화 헤모글로빈의 변화를 모니터링했다. 및 치료 후 21일차. 무릎에서 발끝까지 산소화된 Hb(Oxy-Hb)의 평균 변화를 정량화하고 계산했다.
도 12에 나타난 바와 같이, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 처리를 받은 마우스 그룹에서 처리 후 30분에 RA-완충제 그룹(음성 대조군)과 비교하여 Oxy-Hb의 유의한 증가가 있었던 반면 (p<0.05), 푸마릴 -가교 헤모글로빈 처리는 RA-완충군과 비교하여 Oxy-Hb의 유의한 증가를 나타내지 않았다. 처리 후 21일차에 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(110.5±7.8%, p<0.01 vs 대조군)과 푸마릴-가교 헤모글로빈 용액(106.0±2.6%, p<0.05 vs 대조군)으로 모두 처리한 마우스는 RA-완충액보다 Oxy-Hb에서 유의하게 더 높은 수준(74.6±12.7%)으로 나타났다.
도 13에 나타난 바와 같이, 시스테닐-숙시닐 가교 혈색소 용액(34.9±3.0%, p<0.001) 및 푸마릴 가교 혈색소 용액(29.3±2.0%, p<0.05) 처리 후 7일차에 RA-완충제군(음성 대조군)과 비교하여, 7일차부터 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 처리에 의한 관류의 유의한 증가의 유사한 경향이 관찰되었다. 처리 후 21일차에, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(56.5±9.6%, p<0.001 vs 대조군)으로 처리된 마우스는 안정화된 푸마릴-가교 헤모글로빈 용액(41.6±4.3%, p<0.05 vs 대조군) 및 RA-완충액(23.5±9.7%)에 비해 혈액 관류에서 더 유의한 개선을 가져왔다.
21일차에 Oxy-Hb 및 관류의 "지속적인" 개선에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 순환 중간엽 줄기 세포 집단을 처리 후 다양한 시점에서 유세포 분석으로 분석했다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 결과는 CD45-CD29+, CD45-CD105+, CD45-CD106+ MSC 집단의 증가가 사지 허혈 유도 후 관찰되었고 대조군과 비교하여 21일까지 더 긴 기간 동안 지속되었음을 나타내었다. 관류의 회복과 일치하게, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 치료 후 MSC 개체군의 더 현저한 증가가 관찰되었다.
종합적으로 말초동맥질환 모델에서 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈는 산소화 혈색소, 혈류 및 순환 간엽줄기세포 개체군 측면에서 기존의 푸마릴 가교 헤모글로빈보다 우수한 치료 효과를 보였다.
실시예 17: 안정화된 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 사용 방법
본 발명의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액은 산소 전달을 개선하고 출혈성 쇼크, 심근 허혈 재관류 손상, 말초 동맥 질환 및 외상성 뇌 손상을 비롯한 전역 및 국소 허혈/저산소 상태에 대한 치료에 사용되었다. 또한, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액은 다음과 같이 자가면역 질환 및 암 치료에도 사용하였다 :
출혈성 쇼크: 출혈성 쇼크에서 조직 산소화 및 평균 동맥압의 회복;
말초 동맥 질환: 심각한 사지 허혈에서 혈류의 상당한 회복 및 Oxy-Hb 수준의 증가;
심근 허혈 재관류 손상: 심장의 심근 경색의 현저한 감소;
전신성 홍반성 루푸스: 조직/장기의 면역 복합체 형성의 현저한 감소 및 조직/장기 손상의 개선;
외상성 뇌 손상: 조절된 피질 충격(CCI) 유도 외상성 뇌 손상에서 신경 및 운동 기능의 상당한 개선 및 TBI 유도 성상세포 활성화의 감소; 그리고
암 치료: 삼중 음성 유방암(TNBC) 및 결장직장암 이종이식 모델에서 각각 종양 성장의 상당한 억제.
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 투여량은 약 100-1600mg/kg이다.
실시예 18: 사이노몰구스 원숭이에서 중증 출혈성 쇼크의 치료
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 사이노몰구스 원숭이의 심각한 출혈성 쇼크 치료에 사용되었다.
근육 조직 산소화 및 평균 동맥압은 사이노몰구스 원숭이의 중증 출혈성 쇼크 모델에서 다음과 같이 평가되었다.
그룹 1: 자가 혈장(양성 대조군, 동량의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 투여)(n=2)
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈솔루션(500mg/kg 체중)(n=2)
사이노몰구스 원숭이를 마취하고 수술 절차를 위해 장비했다. 바늘에 갇힌 산소 센서(Oxford Optronix, UK)를 삼두근에 삽입하고 안정화시켰다. 혈압 센서(Biopac Systems Inc, US)를 왼쪽 대퇴동맥에 삽입하고 안정화시켰다. 기준선 산소 장력 수준과 평균 동맥압을 수집한 후, 원숭이는 출혈에 의해 저혈압이 되어 평균 동맥압을 20mmHg 로 낮추고 60분 동안 평균 동맥압을 20-24mmHg 범위로 유지했다. 쇼크 유도 후 기준을 충족한 원숭이 에게 자가 혈장(양성 대조군) 또는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 주입했다. 이 두 그룹의 근육 산소화 장력 수준과 평균 동맥압을 측정하고 주입 후 최대 3시간까지 비교했다.
도 15에 도시된 바와 같이, 결과는 500mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액의 주입이 소생술 후 근육 조직 산소화의 증가를 초래하고 소생술 3시간 후 더 나은 회복을 유지함을 나타낸다. 평균 동맥압 회복의 경우 도 16과 같이 소생 3시간 후 시점에서 자가 혈장 치료보다 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 주입하면 평균 동맥압이 더 잘 회복되었다.
이것은 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈이 조직 산소화를 증가시켰고 심각한 출혈성 쇼크를 가진 사이노몰구스 원숭이에서 평균 동맥압의 더 나은 회복을 유지했음을 보여준다.
실시예 19: 마우스에서 말초 동맥 질환의 치료
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 혈액 관류 및 생쥐의 약화된 임계 사지 허혈에서 산소 전달에 사용되었다.
허혈성 사지의 혈류 회복은 말초 동맥 질환을 모방한 대퇴 동맥 결찰을 수행하여 마우스에서 평가되었다. 이 연구에서는 32마리의 마우스를 각 그룹에 8마리씩 4개의 그룹으로 무작위 배정했다.
그룹 1: RA-완충액(음성 대조군, 그룹 4에 부피 일치);
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (400mg Hb/kg 체중);
그룹 3: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (800mg Hb/kg 체중); 그리고
그룹 4: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 (1600mg Hb/kg 체중).
치명적인 사지 허혈을 유도하기 위해 ICR(CD-1) 마우스를 마취시켜 수술 절차를 수행했다. 대퇴 동맥은 복재 동맥과 슬와 동맥으로 분기되는 말단 지점까지 결찰되었다. 24시간 후 동맥 결찰시에, 마우스에 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 상이한 처리를 투여하였다. 결찰 직후, 치료 후 7일, 치료 후 14일 및 치료 후 21일차 기준선에서의 혈류를 모니터링하기 위해 직렬 레이저 도플러 영상 분석(Moor Instruments, Devon, UK)을 수행했으며 무릎에서 발끝까지의 평균 혈류를 정량화하여 계산하였다. Tivi106 Oxygen Mapper 분석기(WheelsBridge AB, 스웨덴)로 변조된 Tivi600 조직 생존율 이미저를 수행하여 기준선, 결찰 직후, 처리 후 30분, 처리 후 60분, 처리 후 7일, 처리 후 14일 및 치료 후 21일차 기준선에서 산소화된 헤모글로빈의 변화를 모니터링하기 위해 수행되었다. 무릎에서 발가락까지의 산소화 Hb의 평균 변화를 정량화하고 계산했다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 처리 후 (800mg/kg Hb, *p<0.05; 1600mg/kg Hb, *p<0.05) 30분에 RA-완충군(그룹 1)과 비교하여 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 (Hb)을 투여받은 모든 마우스 그룹에서 Oxy-Hb의 유의하고 용량 의존적 증가가 있었다. 처리 후 21일차에 400mg/kg Hb(102.3±4.0%, p***<0.001), 800mg/kg Hb(125.7±32.3%, **p<0.01) 및 1600mg/kg Hb(128.0±30.5%,**p<0.01)로 처리된 마우스에서 RA-완충제(74.6±12.7%)보다 유의하게 높은 수준의 산소화 Hb를 나타냈다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 처리 후 7일 이후부터 계속 치료(400mg/kg Hb, **p<0.01; 800mg/kg Hb, p<**0.01; 1600mg/kg Hb, ***p<0.001)하고 RA-완충군(그룹 1)과 비교하여 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 용액을 투여받은 모든 마우스 군(그룹 2-4)에서 허혈성 사지 혈류의 유의한 개선이 있었다. 처리 후 21일차에 400mg/kg Hb(36.5±8.5%, *p<0.05), 800mg/kg Hb(45.7±14.7%, **p<0.01) 및 1600mg/kg Hb(61.0± 15.2%, ***p<0.001)으로 처리한 마우스가 RA-완충제(23.5±9.7%)보다 유의한 혈류량이 더 높았다.
21일차에 Oxy-Hb 및 관류의 "지속적인" 개선에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 순환 중간엽 줄기 세포 집단을 처리 후 다양한 시점에서 유세포 분석으로 분석했다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 결과는 CD45-CD29+, CD45-CD105+, CD45-CD106+ MSC 집단의 증가가 사지 허혈 유도 후 관찰되었고 음성과 비교하여 21일까지 더 긴 기간 동안 지속 되었음을 나타낸다. 통제 그룹. 이것은 치료 후 21일차에 Oxy-Hb 및 관류의 유의한 증가의 관찰과 일치했다.
종합적으로, 실험 데이터는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈이 순환하는 중간엽 줄기 세포를 활성화하고 마우스에서 약화된 임계 사지 허혈에서 관류의 기능적 회복과 산소 전달을 초래함을 보여준다.
실시예 20: 래트에서 심근 허혈-재관류 손상의 치료
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 급성 심근 허혈 재관류의 래트 모델에서 심근 경색 크기를 줄이기 위한 심장 보호제로 사용되었다. 12마리의 래트를 다음과 같이 무작위로 2개의 그룹으로 나누었다:
그룹 1: 수유 링거의 용액(Lactated Ringer's Solution)(대조군); 그리고
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (100mg Hb/kg 체중).
심근 허혈 및 재관류는 표준 쥐 모델에서 확립되었다. 간단히 말해서, 이소플루란을 사용하여 Wistar 래트에서 마취를 유도하였다. 그런 다음 동물을 가열된 설치류 수술대에 놓고 직장 프로브로 내부 온도를 지속적으로 모니터링했다. 동물은 소변 배출을 모니터링하기 위한 방광 카테터 삽입술, 유체 주입을 허용하기 위한 오른쪽 경정맥 삽관, 지속적인 동맥압 모니터링 및 혈액 회수를 위한 왼쪽 경동맥 삽관 및 기관 절개술을 받았다. 키홀 개복술을 통해 복막 카테터를 삽입한 후 티오펜탈 나트륨(thiopental sodium) 5 mg/kg을 반복적으로 주입하여 마취를 유지하고 부프레노핀(buprenorphine) 0.1 mg/kg sc로 진통을 확인했다. 기계적 환기(1회 호흡량 12ml/kg, PEEP 3cmH2O, RR 80bpm)를 유도하기 전에 10ml/kg의 유체 볼루스를 제공하고 수유 링거(Lactated Ringer) 용액 + 포도당 2.5%(10 ml/kg/h)를 유지 관리로 사용했다.
수술 단계가 끝나면 기구 장착 후 60분의 회복 기간 후에 네 번째와 다섯 번째 갈비뼈 사이에서 왼쪽 개흉술을 시행했다. 좌전하행(LAD) 관상동맥과 조임에 의해 유도된 허혈을 포함하는 심근 영역 주위에 올가미를 배치했다. 허혈 단계는 급성 결찰의 40분에 이어 120분의 재관류 지속되었다. 100 mg/kg의 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 용액 또는 수유 링거(Lactated Ringer's) 용액을 허혈 후 20분에 주입하고 1.5 ml/kg/h의 속도로 재관류 후 20분까지 계속하였다. 심박수, 평균 동맥혈압 및 온도를 지속적으로 측정하고 심근경색/손상 정도를 조직학적으로 위험 면적의 비율로 경색 크기로 평가하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, 100 mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액의 주입은 대조군과 비교할 때 심근경색 크기의 유의한 감소를 입증하였다. 중요하게도, 이 연구에서 동물에게 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 정맥내 투여했을 때 허혈 및 재관류 기간 동안 실험 전반에 걸쳐 혈압 및 혈역학적 부작용이 없었다.
실시예 21: 전신성 홍반성 루푸스 마우스 모델에서 신장 보호 효과
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 생쥐의 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 치료에 사용되었다.
루푸스 신염에 대한 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액의 치료 효과를 조사 하였다. 활성화된 림프구 유래 DNA(ALD-DNA)는 분류 정제된 세포 사멸 면역 세포로부터 제조되었다. 도 21에 도시된 바와 같이, 뮤린 루푸스 신염은 1일차에 프로인트 경쟁 애쥬번트(Freund’s compete adjuvant)에 용해된 ALD-DNA(100g/마우스)로 면역화된 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. 프로인트 불완전 애주번트(Freund’s incomplete adjuvant)를 포함하는 ALD-DNA(50g/마우스)의 부스트 에멀젼을 14일과 28일에 시행하였다. 2주의 치료 기간 동안 1, 4, 8, 11일에 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈을 800 mg/kg으로 정맥내 투여하였다.
12주 질병 진행 후, 마우스를 겁먹게 하고 신장을 수확하고, 고정하고, 절개하였다. 신장 조직 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 신장 손상 평가를 수행한 반면, 사구체 면역 복합체 침착 평가는 플루오린화합물 표지된 항체를 사용하여 면역 복합체 침착(IgM 및 IgG)의 면역형광 염색으로 수행했다. 점수 체계는 다음과 같이 표시된다.
0 = 정상/신호 없음
1 = 사구체의 25% 미만에서 약한 세포 분열/약한 신호
2 = 중등도의 세포 파괴 및 풍선 세포의 출현 및 사구체의 50% 이상에서 공포/중등도 신호
3 = 사구체의 50% 이상에서 광범위한 세포 파괴 및 공포 형성/광범위한 강한 신호. 사구체 활동 지수는 총점 0-15의 아래 매개변수로 평가된다.
a) 세포 증식 (0-3)
b) 백혈구 침윤 (0-3)
c) 섬유소성 괴사 또는 카르헥시스(karrhexis) (0-3)
d) 셀룰러 크레센트(cellular crescents) (0-3)
e) 유리질 혈전, 와이어 루프(0-3)
대조군과 비교할 때 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 용액으로 처리한 경우 사구체 IgG 및 IgM 침착의 유의한 감소가 관찰되었다(도 22). 또한, 총 사구체 활성 지수가 대조군보다 현저히 낮아 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리한 신장에서 세포 증식, 섬유소성 괴사 및 세포 크레센트가 더 적은 것으로 관찰되었다(도 23).
결론적으로, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 마우스에서 루푸스 신염의 발병을 유의하게 개선한다.
실시예 22: 쥐의 심각한 외상성 뇌 손상의 치료
시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈은 쥐 모델에서 제어된 피질 충격에 의해 생성된 외상성 뇌 손상(TBI)의 치료에 사용되었다. TBI 후 기능적 및 조직 병리학 적 결과에 대한 단일 용량으로 투여된 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 사용한 치료의 효과가 평가되었다. 이 연구에서 21마리의 스프래그 돌리 래트(Sprague Dawley Rats)를 다음과 같이 2개의 그룹으로 무작위로 지정했다.
그룹 1: 식염수 완충액(음성 대조군); 그리고
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 (620mg Hb/kg 체중).
실험 시작 약 14일 전에 각 쥐에게 BUTONVAB95BS(Instech) 버튼이 있는 대퇴 정맥 카테터를 이식하고 12:12시간 명암 주기로 Opti-Rat 케이지에 쌍으로 수용하고 음식과 물을 최소 7일 동안 임의로(ad libitum) 제공했다. 개방 두개골 제어 피질 충격(CCI)에 의한 심각한 외상성 뇌 손상을 유도하기 위해 쥐에게 1.2mg/kg의 지속 방출 부프레노르핀(Buprenorphine SRTM Lab)과 0.03mg/kg의 일반 부프레노르핀(Vetergesic) 또는 1.2mg/kg의 지속 방출을 투여했다. 30분 또는 24시간 전에 부프레노르핀을 피하주사하고 마취하여 수술을 시행하였다. 멸균 메스를 사용하여 정중선을 따라 단일 절개로 두개골을 노출시킨 다음, 관상 중앙의 왼쪽 정수리 뼈에 마이크로 드릴 장치(Harvard Apparatus, 72-6065)를 사용하여 6mm 원형 개두술을 수행했다. 시상 및 람다형 봉합사는 손상되지 않은 경막을 노출시키기 위해 가장 바깥쪽 경계로 사용된다. 트레피네이션 부위는 충격을 받을 준비가 될 때까지 멸균 식염수로 채워졌다. 손상되지 않은 경막이 있는 노출된 피질은 통제된 피질 충격 손상을 받았다. 5.0mm 직경의 임팩터 로드 팁이 있는 Leica Impact OneTM 장치에 장착된 임팩터 액추에이터에 의해 노출된 피질에 제어된 피질 충격이 생성되었으며, 4.0m/s의 속도로 피질에 충격을 가하고 피질 변형 깊이 왼쪽 정수리 피질 내에서 부상을 생성하기 위해 200ms의 체류 시간으로 3.00mm로 설정한다.
CCI 절차가 끝나면 상처를 멸균 식염수로 세척한 다음 단일 중단 봉합사로 피부 상처를 봉합하고 래트를 회복시켰다. TBI 후에 추가 산소를 공급하지 않았다. CCI 후 1시간 후, 쥐에게 620mg/kg(그룹 2, n=10) 또는 등가 부피의 식염수(그룹 1, n=11)의 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 단일 주입했다.
신경학적 기능은 TBI 후 4시간 및 1일, 3일 및 7일에 21점 신경점수를 사용하여 평가되었으며 감각 운동 기능도 3일 및 7일에 실린더 및 수평 래더(ladder) 테스트로 각각 평가되었다. 뇌를 TBI 후 7일차에 수확하고 조직화학적 분석을 위해 처리하였다.
단일 중증 TBI는 치료군(그룹 2) 및 식염수 대조군(그룹 1) 모두에서 TBI 후 7일차에 1-3일 내에 신경 및 운동 결손을 유도한 후 자발적 회복을 유도했다. 흥미롭게도, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액을 사용한 치료는 생리 식염수 대조군에 비해 신경 기능과 운동 기능을 모두 상당한 수준으로 향상시켰다. 결과는 도 24에 도시된 바와 같이 CCI 후 1시간에 620 mg/kg 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액의 단일 용량이 1일차에 더 나은 신경학적 점수를 나타냈다(신경점수에서 26% 개선, *p<0.05 ). 동시에, CCI 1시간 후 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리하면 수평 사다리 테스트로 측정한 TBI 동물의 성능이 3일차 식염수 대조군에 비해 유의하게 향상되었다(래더 오류 점수 18% 감소, *p<0.05). 대조적으로, 식염수 대조군은 동일한 회복 수준에 도달했지만 7일에만(*p<0.05, 동일한 그룹의 Day와 비교), 이는 TBI 후 기능 회복 촉진에 대한 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈의 효과를 나타낸다(도 25A). 그러나 이러한 개선은 명확한 천장을 가진 탐색적 행동에서 자발적인 앞발 사용에 접근하는 실린더 테스트(도 25B)가 나타나지 않았다.
TBI로 유도된 쥐 모델에서 관찰된 신경학적 기능과 운동 기능의 유의한 개선 외에도, 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리된 쥐는 GFAP 면역형광 분석에서 TBI 유도 성상세포 활성화의 유의한 감소를 도 26에 도시된 바와 같이 보여주었다(*p<0.05 ; t-test).
실시예 23: 암 치료 연구: 삼중 음성 유방암 및 결장직장암에서의 종양 억제
삼중음성 유방암과 결장직장암은 모두 고형 종양의 형성과 관련된 저산소 환경으로 인해 불량한 예후와 높은 사망률과 관련이 있다. 효과적인 치료 옵션을 찾는 데 있어 일부 문헌에서는 종양 미세 환경에서 저산소증-A2A 아데노신 수용체(A2aR) 유도 면역 억제를 약화시켜 다양한 암 모델에서 고형 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 전신 산소 공급의 사용을 제안한다. 따라서, 삼중음성 유방암과 결장직장암에서 각각 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈이 종양 성장을 억제하는 역할에 대해 테스트되었다.
실시예 23A: 삼중-음성 유방암 이종이식 모델에서 종양 성장의 억제
TNBC 4T1 이종이식편에서 종양 성장의 현저한 억제는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액 투여 후 관찰되었다. 뮤린 삼중 음성 유방암 이종이식편(TNBC) 모델을 사용했다. 뮤린 TNBC 4T1 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 10% FBS, 4mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 100U/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양했다. 대략 1 x 105 암 세포(TNBC 4T1 세포주)를 4 내지 6주령의 암컷 면역 적격 BALB/C 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 1주일 동안 성장한 후 종양이 있는 마우스를 다음과 같이 두 그룹으로 무작위 배정했다.
그룹 1: 식염수 완충액(대조군); 그리고
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(400mg Hb/kg 체중).
각 그룹에 대해 4-6마리의 마우스에게 4주 동안 매주 1회 식염수 또는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(400mg/kg)을 제공했다. 종양 부피는 치료 첫날부터 3일마다 기록되었다. 종양 부피는 수정된 타원체 공식을 사용하여 계산되었다. 종양 부피 = ½ x LW2, 여기서 L 및 W는 각각에서 디지털 캘리퍼스(Mitu-toyo Co, Tokyo, Japan)로 측정한 종양 덩어리의 각각의 측정에서의 길이와 너비를 나타낸다. 결과는 TNBC 4T1 이종이식편에서 종양 성장의 억제(22-51%)가 표 18에 나타낸 바와 같이 대조군과 비교하여 2차 주사 후 6일차에 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리된 마우스에서 관찰되었음을 입증했다.
표 18: 동계 4T1 모델에 대한 대조군에 대한 정규화된 종양 부피의 백분율 변화.
측정 시간 대조군에 대한 정규화된 종양 부피의 % 변화
실험 1 실험 2 실험 3 실험 4
1차 주사 후 6일 -39.6% 4.2% -17.0% -25.9%
2차 주사 후 6일 -51.2% -23.4% -49.1% -22.4%
실시예 23B: 결장직장암 이종이식 모델에서 종양 성장의 억제
CT26 이종이식편에서 종양 성장의 현저한 억제는 표 13에 나타낸 바와 같이 시스테닐-숙시닐 가교된 헤모글로빈 용액의 투여 후에 관찰되었다. 쥐의 결장직장암 이종이식편(TNBC) 모델을 사용하였다. 뮤린 CT26 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 배양했다. 대략 1 x 105 암 세포(CT26 세포주)를 4 내지 6주령의 면역 적격 암컷 BALB/C 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 1주일 동안 성장했을 때 종양이 있는 마우스를 다음과 같이 두 그룹으로 무작위 배정했다.
그룹 1: 식염수 완충액(대조군); 그리고
그룹 2: 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액(400mg Hb/kg 체중)
각 그룹에 대해 4-6마리의 마우스에게 4주 동안 매주 1회 식염수 또는 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈(400mg/kg)을 제공했다. 종양 부피는 치료 첫날부터 3일마다 기록되었다. 종양 부피는 수정된 타원체 공식을 사용하여 계산되었다. 종양 부피 = ½ x LW2, 여기서 L 및 W는 각각의 측정에서 디지털 캘리퍼스(Mitu-toyo Co, Tokyo, Japan)로 측정한 종양 덩어리의 길이와 너비를 나타낸다. 결과는 CT26 이종이식편에서 종양 성장의 억제(60%)가 표 19에 나타낸 바와 같이 대조군과 비교하여 2차 주사 후 6일차에 시스테닐-숙시닐 가교 헤모글로빈 용액으로 처리된 마우스에서 관찰되었음을 입증하였다.
표 19: 동계 CT26 모델에 대한 대조군에 대한 정규화된 종양 부피의 백분율 변화.
측정 시간 대조군에 대한 정규화된 종양 부피의 % 변화
1차 주사 후 6일 -60.77%
2차 주사 후 6일 -65.77%

Claims (27)

  1. 사량체 헤모글로빈, 그리고 적어도 하나 이상의 하기 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분,
    Figure pct00040

    1
    또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온을 포함하고, 여기서
    각각의 N*은 독립적으로 사량체 헤모글로빈의 라이신 잔기 측쇄의 질소 및 사량체 헤모글로빈의 N-말단의 질소로 이루어진 상기 군에서 선택된 질소를 나타내고; 그리고
    R1은 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY이고, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2OR4 및 -(CRR2R3), 여기서 R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R 3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 상기 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 R1 은 하기로 구성된 상기 군으로부터 선택된 부분이고:
    Figure pct00041
    , 및
    N 5 -(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  2. 제1항에 있어서, R1은 하기 화학식 2의 부분이고:
    Figure pct00042

    2
    여기서 n은 0, 1, 2, 3 및 4로 구성된 상기 군에서 선택되는 정수이고;
    각 경우에 R은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 상기 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4)2 , -NH(C=O)R4 , 또는 -NH(C=O)N(R4)2 이고;
    R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4, -(C=O)NHR4, -OR4 또는 -N(R4)2 이고; 그리고
    R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    또는 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분이고:
    Figure pct00043
    , 및
    N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  3. 제2항에 있어서, n은 1 또는 2이고; R은 수소이고; R2는 -NHR4, -NH(C=O)R4, 또는 -NH(C=O)R4N(R4)2 이고; R3은 수소, -OR4, -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고, 여기서 R4는 각 경우에 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  4. 제1항에 있어서, 여기서 R1 은 상기 군으로 구성된 것으로부터 선택되고:
    Figure pct00044

    Figure pct00045

    Figure pct00046
    , 및
    Figure pct00047
    ,
    또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온이고, 여기서, m은 1 내지 1000에서 선택되는 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 N*은 독립적으로 사량체 헤모글로빈의 베타 글로빈 사슬의 라이신 잔기 측쇄의 질소 및 상기 사량체 헤모글로빈의 베타 글로빈 사슬의 N 말단의 질소로 이루어진 상기 군에서 선택되는 질소를 나타내는, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈은 실질적으로 순수한 것인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈은 화학식 1의 티오숙시닐 가교 부분을 1, 2 또는 3개 포함하는 것인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 티오숙시닐 가교 부분이 사량체 헤모글로빈의 2개의 베타 글로빈 사슬을 가교시키는, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 인간 헤모글로빈, 소 헤모글로빈 또는 돼지 헤모글로빈인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈이 실질적으로 기질이 없는 것인, 티오숙시닐-가교 헤모글로빈.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈 중 적어도 하나 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 여기서 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈이 10-90%의 중량 백분율로 제약 조성물에 존재하는 것인, 제약 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제약 조성물은 화학식 1의 1, 2 또는 3개의 티오숙시닐 가교 부분을 포함하는 티오숙시닐 가교 헤모글로빈; 또는 그의 조합을 포함하는, 제약 조성물.
  14. 제1항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법에 있어서, 상기 방법은:
    푸마릴 가교결합 헤모글로빈을 형성하는 단계에 의하여 사량체 헤모글로빈을 푸마릴 가교 결합제와 접촉시키는 단계;
    제1항의 티오숙시닐 가교 헤모글로빈을 형성하는 단계에 의하여 푸마릴 가교 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시키는 단계;를 포함하는, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 여기서 상기 푸마릴 가교 결합제는 비스-3,5-디브로모살리실 푸마레이트(DBSF), 푸마릴 클로라이드 및 비스(살리실) 푸마레이트로 구성된 상기 군으로부터 선택되는 것인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 티올이 하기 화학식을 갖는: R1SH 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온, 여기서 R1 은 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 R1이 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 -(CR2)nY 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 n은 0-10에서 선택되는 정수이고; R은 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 2개의 경우의 R은 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 3-6원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고; Y는 OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2OR4, 및 -(CRR2R3), 여기서 R2 는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4 ; R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, OR4, SR4, N(R4)2, -(C=O)R4, -(C=O)OR4, -O(C=O)R4, -O(C=O)OR4, -(C=O)N(R4)2, -(NR4)(C=O)R4, -(NR4)(C=O)OR4, -O(C=O)N(R4)2, -O(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=O)N(R4)2, -(C=NR4)N(R4)2, -(NR4)(C=NR4)N(R4)2, -(S=O)R4, -S(O)2R4, -S(O)2OR4, -S(O)2N(R4)2, -OS(O)2R4, -(NR4)S(O)2R4, -OS(O)2OR4, -OS(O)2N(R4)2, -(NR4)S(O)2N(R4)2, 또는 -(NR4)S(O)2OR4; R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 상기 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 R1은 하기로 구성된 상기 군으로부터 선택된 부분이고:
    Figure pct00048
    , 및
    N 5-(1-((카르복시메틸)아미노)-1-옥소-3λ3-프로판-2-일)글루타민 또는 그의 제약상 허용되는 염이고, 여기서 m은 1-1000에서 선택되는 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 티올이 하기 화학식 3을 갖고:
    Figure pct00049

    3
    또는 그 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성이온이고, 여기서
    n은 0, 1, 2, 3 및 4로 이루어진 상기 군에서 선택되는 정수이고;
    각 경우에 R은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 상기 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -N(R4)2, 또는 -NH(C=O)R4 이고;
    R3은 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -CO2R4, -(C=O)NHR 4, -OR4 또는 -N(R4)2 이고; 그리고
    R4는 각 경우에 수소, 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 상기 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는 상기 티올은 디티오트레이톨, HS(CH2CH2O)mCH3, HS(CH2CH2O)mH, 글루타티온 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 구성된 상기 군으로부터 선택되고, 여기서 m은 1-1000 사이에서 선택된 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 여기서 n은 1 또는 2이고; R은 수소이고; R2는 -NHR4, -NH(C=O)R4, 또는 -NH(C=O)(NR4)2 이고; R3은 수소, -OR4, -CO2R4 또는 -(C=O)NHR4 이고, 여기서 R4는 각 경우에 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 티올은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00050

    Figure pct00051
    ,
    디티오트레이톨, HS(CH2CH2O)mCH3, 및 HS(CH2CH2O)mH 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온이고, 여기서 m은 1-1000 사이에서 선택된 정수인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸마릴 가교 헤모글로빈을 티올 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 양쪽성 이온과 접촉시키는 단계에서, 상기 푸마릴 가교 헤모글로빈 및 상기 티올은 적어도 1:1; 1:2; 또는 1:3의 몰비로 존재하는 것인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 여기서 상기 푸마릴 가교 헤모글로빈 및 상기 티올이 1:3 초과의 몰비로 존재하는 것인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 티오숙시닐 가교 결합된 헤모글로빈은 단리되고 실질적으로 순수한 형태인, 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 제조방법.
  23. 그의 필요로 하는 대상체에서 혈액 순환계의 부피를 증가시키는 방법에 있어서, 여기서 상기 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 치료적 유효량을 상기 대상체의 상기 시스템에 수혈하는 단계를 포함하는, 그의 필요로 하는 대상체에서 혈액 순환계의 부피를 증가시키는 방법.
  24. 그의 필요로 하는 대상체에서 쇼크의 치료를 위한 방법에 있어서, 여기서 상기 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 치료적 유효량을 상기 대상체의 상기 시스템에 수혈하는 것을 포함하는, 그의 필요로 하는 대상체에서 쇼크의 치료를 위한 방법.
  25. 그의 필요로 하는 대상체의 조직 및 기관에 산소를 공급하는 방법에 있어서, 여기서 상기 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 치료적 유효량을 상기 대상체의 상기 시스템에 수혈하는 것을 포함하는, 그의 필요로 하는 대상체의 조직 및 기관에 산소를 공급하는 방법.
  26. 그의 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 있어서, 여기서 상기 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈의 치료적 유효량을 상기 대상체의 상기 시스템에 수혈하는 것을 포함하고, 여기서 암은 삼중-음성 유방 암 또는 대장암인, 그의 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 티오숙시닐 가교 헤모글로빈은 실질적으로 순수한 것인 방법.
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