JP2002060346A - 新規な虚血・再灌流障害抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 脳梗塞、虚血性臓器障害、臓器移植等再灌流
傷害、血管性障害、動脈硬化及び心筋梗塞等の虚血・再
灌流障害に起因する疾患に対する虚血・再灌流障害抑制
剤を提供する。 【構成】 セレノプロテインＰまたは当該蛋白質のＣ末
端ペプチドもしくは当該ペプチド群を主要有効成分とす
る虚血・再灌流障害抑制剤。 【効果】 新規な虚血・再灌流障害抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は医療用医薬品の分野に
関し、血漿蛋白質の新たな用途に関する。さらに詳細に
は、臓器移植時あるいは種々のショック時に生じる虚血
・再灌流障害に起因する血管性障害、神経障害、臓器・
組織障害及び運動機能障害等の疾患に対する医薬品に関
する。より詳しくは、血漿蛋白質の一種であるセレノプ
ロテインＰを、好適には当該セレノプロテインＰのＣ末
端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を有効成分として
含有する、虚血・再灌流障害抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
虚血・再灌流障害に起因する臓器障害等の疾患が注目さ
れている。虚血とは局所性の強い貧血を意味する。虚血
の種類としては、腫瘍など外部からの圧迫による動脈壁
の狭窄または閉塞によって生じる圧迫性虚血、血栓・動
脈硬化症のように血管内または血管自体の変化による閉
塞性虚血、および脳貧血・狭心症などのように血管痙攣
による痙攣性虚血に分けることができ、虚血が血管内腔
の狭窄によるか、または完全閉塞によるかに依って相対
的虚血と絶対的虚血とに分類される。また、病態に起因
する場合以外にも手術中の出血防止、止血処置などで、
容易に虚血が生じる。通常、虚血により生ずる局所の変
化は、虚血の持続時間、虚血に対する組織の感受性、あ
るいはその部位での血管吻合の有無によって異なるが、
一般に虚血領域の細胞や組織に酸素欠乏と栄養障害をも
たらし、酸素欠乏はＡＴＰ産生の途絶を介して、まず機
能が障害され、ついには変性、壊死、あるいは萎縮をき
たす。このように、循環障害の結果起こる限局性の虚血
性壊死が梗塞である。梗塞は基本的には貧血性梗塞と出
血性梗塞に大別できる。前者は脳、心、腎、脾にしばし
ば観られ、後者は肺、腸、精巣、卵巣などに、時に脳に
も観られる。このように、血流を止める虚血状態は程度
の差があるにせよ組織に悪影響を及ぼす。特に、脳に関
しては、血管性障害に付随して大脳(前頭葉)性、小脳
性、前庭(迷路)性及び脊髄性の運動失調症が生じる。

【０００３】初期の梗塞や梗塞にまで至らない手術中の
虚血の場合などは、虚血状態を改善すれば梗塞が回避さ
れるようにも考えられるが、実際には頻繁に虚血・再灌
流障害が生じる。虚血・再灌流障害とは、虚血に陥った
臓器への血流再開に伴う再潅流あるいは再酸素化が逆に
虚血臓器の細胞や組織に生じる障害のことである。脳や
心筋、肺、肝、腎、膵、消化管などの虚血後の障害発生
機序としては、主に好中球やマクロファージなどの貪食
細胞、血管内皮細胞などにより産生される活性酸素、フ
リーラジカルの発生、ロイコトリエン、トロンボキサン
の生成、脂質・糖の過酸化、タンパク質の変性、酵素の
不活性化、ＤＮＡ鎖の切断、核酸塩基の修飾などが組織
障害の原因の一つと考えられている。また、同時に生じ
る内皮細胞の障害が、微小循環障害を起こして虚血は遷
延し、アルブミン透過性の亢進、好中球の内皮細胞への
接着、組織への浸潤、細胞内Ｃａイオンの流入なども引
き起こし、障害を増悪させている。この障害は虚血時間
に依存し、虚血時間が長いほど再灌流時の障害も悪化す
る傾向にある。

【０００４】これらのことから、虚血時に生じる組織細
胞の障害とその再灌流時に生じる障害を抑制する事が、
虚血を伴う種々の病態の改善や手術時の組織障害などを
低減させるためには必要であることが理解される。つま
り、虚血による直接の障害を押さえるためには、細胞が
維持されるのに必要な物質、例えば、酸素や栄養濃度が
低い状態でも細胞死が生じにくい状態に保つことが必要
であり、また、再灌流障害を抑制するためには、血管拡
張による血流の改善、抗酸化活性の上昇、ケミカルメデ
ィエーターの制御などが必要である。

【０００５】現在、スーパーオキシドジスムターゼやカ
タラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼほか多数の生
体の酸化障害に対する予防、制御物質のほか、実際に治
療に用いられている虚血性心疾患治療剤である塩酸トリ
メタジジン、トロンボキサン合成酵素阻害剤であるオザ
グレルナトリウム、脳循環代謝改善剤である酒石酸イフ
ェンプロジル、虚血性脳障害改善剤であるフマル酸ニゾ
フェノンなどもあるが、これらにより障害が完全に抑制
できるわけではない。このような、種々の虚血が原因と
なる障害を改善するためには、現在開発もしくは使用さ
れている既知の物質以外の物質で、細胞にとって悪条件
下で生じる細胞死を抑制する物質、細胞内抗酸化能を上
昇させる物質を探索することが必要とされており、この
ような物質の同定には大きな意味があると考えられ、よ
り効果の高い新規な虚血・再灌流障害抑制剤、特に脳領
域に関しては、血管性障害、虚血・再灌流障害に付随し
て生じる神経障害、運動失調改善剤が切望されている。
なお、本項(従来の技術及び発明が解決しようとする課
題)の記述は、「虚血によりなぜ細胞は死ぬのか」田川
邦夫著、共立出版；「脳卒中ハンドブック」佐野圭司、
アイ・ピー・シー；「今日の診療」ＣＤ-ＲＯＭ版、医
学書院；「医学大辞典」ＣＤ-ＲＯＭ版、南山堂；「最
新医学大辞典」ＣＤ-ＲＯＭ第２版、医歯薬出版の記述
を参考にした。

【０００６】

【発明の構成】

【課題を解決するための手段】上述の状況の下、本願発
明者等は先に、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロ
テインＰに、そしてより好適な態様として当該セレノプ
ロテインＰのＣ末端側ペプチドに、従来報告されていな
かった細胞死抑制活性が認められることを見出し、この
知見を基に特許出願した(ＰＣＴ/ＪＰ９９/０６３２
２)。本願発明者は、新たな虚血・再灌流障害抑制剤を
供するべく鋭意研究した結果、驚くべきことに従来試み
られることのなかった前記セレノプロテインＰまたはそ
のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、モデル
動物での実際の生体内投与によって、虚血・再灌流障害
抑制剤、とりわけ脳領域における血管性障害に付随する
運動失調改善剤として人間その他の動物に充分に適応で
きる事実を見出し、この知見に基づいて本願発明を完成
するに至った。

【０００７】セレノプロテインＰは１９７７年にグルタ
チオンペロキシダーゼ(ｇｕｌｕｔａｔｈｉｏｎ−ｐｅ
ｒｏｘｉｄａｓｅ)とは異なるセレン含有タンパク質と
して確認され、１９８２年にセレンがセレノシステイン
(ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎ)の形態で取り込まれてい
ることが明らかにされた。さらに、１９９１年にセレノ
プロテインＰのｃＤＮＡのクローニングにより全長のア
ミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該蛋白質は最
大１０個のセレノシステインを含む可能性等が示された
(Ｈｉｌｌ Ｋ.Ｅ. ａｎｄ Ｂｕｒｋ Ｒ.Ｆ., Ｂｉｏｍ
ｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ., １０, ｐ.１９８−２０
８,(１９９７))。本願発明はこのセレノプロテインＰの
新たな薬効に関するものであり、本願発明の虚血・再灌
流障害抑制剤の本態はセレノプロテインＰである。ここ
で用いられるセレノプロテインＰに特段の制約はなく、
所望の虚血・再灌流障害抑制活性を有するものであれば
如何なる分子形態のものを包含する。すなわち、完全分
子型セレノプロテインＰをはじめ種々の分子形態のもの
が対象となり得る。この中で、好適な態様はセレノプロ
テインＰのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群で
あり、中でもＣ末端側１０３アミノ酸配列または当該ア
ミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記いずれか
のアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列を含
有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチ
ド群は、とりわけ好適な態様として推奨され得る。な
お、本願発明でいうペプチド群とは、糖鎖の有無、荷電
の相違、断片化の多様性等に起因する微細構造の異なる
ペプチドの集合体を意味する。

【０００８】当該ペプチドの精製過程における知見によ
り、当該ペプチドまたはペプチド群は(ａ)分子量分画膜
に基づき１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量画分に回収さ
れ、(ｂ)イオン交換樹脂への結合性の検討の結果、血中
でｐＨ７からｐＨ８の間に等電点を示す構造とｐＨ８以
上に等電点を示す構造を有し、(ｃ)非還元系ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでは分子量１３〜１４ｋＤａの２本のバンド及び
それらに糖鎖の付加された１６〜１７ｋＤａの２本のバ
ンドを示し、また(ｄ)還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
では、前記バンドに加えて３〜４ｋＤａ、７〜９ｋＤａ
及び１０〜１２ｋＤａのバンドを呈する性状を有するこ
と、さらに断片化された前記ペプチドにも活性が存在す
ることが明らかになった。

【０００９】より詳細な解析により、当該ペプチドまた
はペプチド群は、次式、 (Ｉ)：Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｘａａ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕおよび／または (ＩＩ)：Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｘａａ Ｇｌｎ ＣｙｓＬｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉ
ｌｅ (式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン
酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅは
イソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍ
ｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏ
はプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔ
ｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバ
リン及びＸａａはセレノシステインの各残基をそれぞれ
表す)で例示されるアミノ酸配列もしくは当該アミノ酸
配列の部分配列を有するペプチドまたはペプチド群であ
ることが判明した。

【００１０】本願発明に使用されるセレノプロテインＰ
または当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド
群を製造する方法は特に限定されるものではないが、例
えばヒト血液より分離する方法、または遺伝子組換え技
術により製造することができる。以下に、好適な態様と
して血漿を出発原料として調製する方法を概説する。本
願発明に使用される虚血・再灌流障害抑制剤の主要構成
成分となるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来
するペプチドもしくはペプチド群は、一般的な酵素類よ
りも熱、変性剤、幅広いｐＨ、血中のプロテアーゼに対
して安定であるため、これを精製同定するに際しては、
一つの態様として、血漿を出発原料とし種々のクロマト
グラフィー工程、例えば、ヘパリンクロマトグラフィ
ー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗体カラムのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー等、適用可能な
種々の担体を用いた分画方法の他、硫酸アンモニウム沈
殿分画、分子量膜分画、等電点分画、電気泳動分画等、
種々の分画法が利用可能である。これらの分画法を組み
合わせることにより、所望のセレノプロテインＰまたは
ペプチドもしくはペプチド群を分画することが可能であ
る。その望ましい組み合わせの一例を調製例１ないし調
製例３に示す。態様の概略は、例えばペプチドまたはペ
プチド群に対して、順に、ヘパリンクロマトグラフィ
ー、硫酸アンモニウム沈殿分画、陰イオン交換クロマト
グラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び
陰イオン交換クロマトグラフィーである。この組み合わ
せにより得られる活性画分は、純度的に推定夾雑物５％
以下、例えばヒト血漿を出発原料とした場合、細胞死抑
制活性を指標とすると、２×１０５/１ｍｇ蛋白質/ｍｌ
の活性を示す状態で精製することが可能である。出発原
料の血漿の活性が約２０〜４０/１ｍｇ蛋白質/ｍｌ程度
であるので、比活性で推定５,０００〜１０,０００倍程
度上昇する。

【００１１】上述の方法等で調製されたセレノプロテイ
ンＰまたはペプチドもしくはペプチド群の活性を最大限
に維持するために、本願発明のセレノプロテインＰまた
はペプチドもしくはペプチド群は新鮮であるか、４℃で
保存する場合には保存後約５日以内のものが好ましい。
あるいは、本願発明の当該蛋白質またはペプチドもしく
はペプチド群は好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存
することができるし、さらには、溶液を凍結し保存する
ことも可能である。本願発明では、有効成分としての当
該蛋白質またはペプチドもしくはペプチド群と公知の適
当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本願発明の虚血
・再灌流障害抑制剤とすることができる。本願発明の虚
血・再灌流障害抑制剤の有効投与量は、投与対象者の年
齢、症状及び重症度などにより変動し、最終的には医師
の意図により変動する。投与方法は局部での経門脈ある
いは経動脈的単回大量(ボーラス)投与あるいは点滴の静
脈内投与が最適である。また、低分子ペプチド群の場合
は経口や経皮投与等も可能である。

【００１２】本願発明の虚血・再灌流障害抑制剤の投与
対象は、虚血・再灌流障害に起因する疾患の患者であれ
ば特に限定されることはないが、脳梗塞、虚血性臓器障
害、臓器移植等再灌流障害、血管性障害、神経障害、動
脈硬化及び心筋梗塞等の患者がその対象として考慮され
得る。虚血・再灌流障害抑制剤として本願発明のセレノ
プロテインＰまたはこれに由来するペプチドもしくはペ
プチド群を主要構成成分として含有する薬剤を使用する
場合、本薬剤を単独で投与することもできるし、他の治
療薬剤との併用投与も効果を増大させるための有効な手
段として期待できる。本願発明の虚血・再灌流障害抑制
剤は、患者が虚血性臓器障害を被った直後や、臓器移植
のための外科的手術前後に投与されることが効果的であ
り、血管性障害に付随する運動失調に対しては、予防的
または治療的投与のいずれにおいても効果が期待でき
る。

【００１３】今回の血液由来の本願発明で用いるセレノ
プロテインＰまたは当該ペプチドもしくはペプチド群
は、マウスでの単回静脈内投与毒性試験、反復静脈内投
与毒性試験、一般薬理試験、ウイルス不活化試験などに
よりその安全性が確認されている。以下、調製例及び実
施例に沿って本願発明をさらに詳細に説明するが、これ
らは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。な
お、以下に示す調製例及び実施例では、特に断りのない
限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製の試薬を使用した。

【００１４】調製例１ (セレノプロテインＰの調製)セレノプロテインＰ(Ｃ末
端１０３アミノ酸)をマウスに免疫することを基に得ら
れたモノクローナル抗体を、１８０ｍｇ／２５ｍｌｇｅ
ｌの比率で固定化担体に固定化し抗体カラムを作製し
た。リン酸化生理食塩水(ＰＢＳ)により平衡化した抗体
カラムに血漿１リットルを通液し、該抗体カラムにセレ
ノプロテインＰを吸着させた。ＰＢＳを用いて洗浄し、
４Ｍ尿素／２０ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ４.５)によ
り結合物を溶出した。前記溶出画分を２０ｍＭ ＭＥＳ
バッファー(ｐＨ４.５)により平衡化したヘパリンセフ
ァロース(５ｍｌ)に通液した。次に、ヘパリンカラムを
２０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ６.５)２０ｍｌを用い
て洗浄した。さらに、２０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ
６.５)／０.５Ｍ ＮａＣｌ／１.５ｍＭ ＤＴＴ(Ｄｉｔ
ｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ)３０ｍｌにより洗浄した。Ｄ
ＴＴを除去するために２０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ
６.５)／０.５Ｍ ＮａＣｌ２０ｍｌを用いて洗浄した。
その後、２０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ６.５)／１.０
Ｍ ＮａＣｌ ３０ｍｌにより吸着物を溶出した。溶出・
回収された物質は電気泳動、ウエスタンブロッティング
により約６６ｋＤａの分子量を有する完全分子型セレノ
プロテインＰであることを確認した。回収量は約３ｍｇ
であった。

【００１５】調製例２ (セレノプロテインＰ由来Ｃ末端ペプチドまたは当該ペ
プチド群の調製)以下の調製工程における活性の追跡
は、すべて細胞死抑制活性を指標とする下記アッセイ法
に拠った。 (アッセイ法)０.０５μＭ ２ＭＥおよび０.１％ＢＳＡ
を含有する無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬社製)で継代可
能なＤａｍｉ細胞(Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｓ.Ｍ., ｅｔ
ａｌ.,Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ.７２, ｐ.１９６８−１９７
７(１９８８)に記載：１×１０６ｃｅｌｌ/ｄｉｓｈ/３
ｍｌ)１ｍｌにＲＰＭＩ１６４０/Ｄ−ＭＥＭ/Ｆ−１２
の１：２：２混合培地(ＳＡ ｍｅｄｉｕｍ)を２ｍｌ添
加後、３日間培養し、アッセイ時に当該細胞を回収し
た。細胞を５０％ＰＢＳ/ＳＡ/０.０３％ＨＳＡ(ＳＩＧ
ＭＡ社製)により２回洗浄し、同培地で３×１０４ｃｅ
ｌｌ/ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液を
サンプル添加ウェルのみ２００μｌ、段階希釈のための
ウェルには１００μｌずつを９６ｗｅｌｌプレートに分
注した。サンプル添加ウェルにアッセイ試料を２μｌ添
加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対
して段階希釈した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで
４〜５日間培養し判定した。アッセイの評価法としては
培養４日目以降、活性のないｗｅｌｌの細胞は死滅し活
性のあるｗｅｌｌの細胞は生存し続けることから、生細
胞が被検試料の何倍希釈まで存在するかで評価した。

【００１６】血漿中の細胞死抑制活性はヘパリン結合性
を示す。そこで、先ず、血漿中のヘパリン結合画分を集
めるためにヘパリンカラムを用いた分画を行なった。ヒ
ト血漿を出発原料とし、血漿中のヘパリン結合蛋白をヘ
パリンカラム(Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社製)に吸着させた後、０.３Ｍ塩化ナ
トリウムで洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウムにより吸着画分
を溶出した。目的の細胞死抑制活性の殆どは０.３Ｍ塩
化ナトリウム洗浄画分に回収されるが、活性物質の精製
には２Ｍ塩化ナトリウム溶出画分を用いた。ヘパリンに
結合した細胞死抑制活性の粗分画を実施するために、硫
酸アンモニウム沈殿による分画を行なった。２Ｍ塩化ナ
トリウムヘパリン溶出画分の総量に対して３１.３％Ｗ/
Ｖ(約２Ｍ)の硫酸アンモニウムを添加し、沈澱物を回収
した。沈殿物を水に溶解し、分子量３,５００カットの
透析膜を用いて水に対して透析した。透析の完了した溶
液を回収後、その総量に対して１/５０量の１Ｍトリス
塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を添加し、さらに、２０ｍＭト
リス塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いてＯＤ２８０の値で
２０〜３０になるように溶液濃度を調整した。この溶液
から不溶物質を除去するため、１.０μｍ及び０.４５μ
ｍの濾過フィルターを用いて濾過した。

【００１７】２０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)に
より平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー担体
(Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ：ＢｉｏＲａｄ社
製)に、濾過済みの蛋白溶液を通液し、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを実施した。この時、非吸着画分及び
５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分に活性が存在していた
ため、この画分を回収し混合した。陰イオン交換クロマ
トグラフィーにより得られた活性画分に対して、１Ｍク
エン酸緩衝液(ｐＨ４.０)と１Ｍクエン酸を６：４の割
合で混合した溶液を総量の１/５０量添加し、２０ｍＭ
クエン酸緩衝液(ｐＨ約４.０)となるように蛋白溶液を
調製した。２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)により
平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー担体(Ｍａ
ｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ：ＢｉｏＲａｄ社製)
に、前述の蛋白溶液を通液し、陽イオン交換クロマトグ
ラフィーを実施した。２２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)で洗浄後、５５０
ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐ
Ｈ４.０)により溶出される画分に活性が存在したため、
この画分を回収した。得られた５５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム溶出画分の総量に対して１Ｍトリスアミノメタン溶液
を１/３０量添加し、ｐＨを約７.５に調整した。この溶
液に対して３.５Ｍ 硫酸アンモニウム溶液(１Ｍトリス
塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)を１/５０量添加しｐＨを約７.
５に調整)を２/３量添加後、硫酸アンモニウム濃度が
１.４Ｍ、塩化ナトリウム濃度が３３０ｍＭになるよう
に塩濃度を調整した。さらに、不溶物質を除去するため
に、０.４５μmの濾過フィルターを用いて濾過した。

【００１８】次に１.４Ｍ硫酸アンモニウム及び３３０
ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ７.５)で平衡化した疎水クロマトグラフィー担体
(Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ：Ｂｉｏ
Ｒａｄ社製)に前述の濾過済み蛋白溶液を通液し、疎水
クロマトグラフィーを実施した。非吸着画分及び平衡化
緩衝液(ｐＨ７.５)洗浄画分に活性が存在したため、こ
の画分を回収した。吸着画分には殆ど活性は存在しなか
った。活性画分を疎水クロマトグラフィー担体に結合さ
せるために、活性画分に対して硫酸アンモニウム濃度が
２.０Ｍになるように上記の約ｐＨ７.５の３.５Ｍ硫酸
アンモニウム溶液を添加した。２.０Ｍ硫酸アンモニウ
ム及び２４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)により平衡化した疎水クロマト
グラフィー担体(Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ
ＨＩＣ：ＢｉｏＲａｄ社製)に試料を通液し、活性成分
を吸着させた。平衡化緩衝液により洗浄後、吸着してい
る活性を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)により
溶出した。回収した活性画分を水に対して１昼夜透析
し、この回収した活性画分をヘパリンカラムに確実に吸
着させるために、１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.５)を１/
５０量添加し、ｐＨを約５.０に調整した。

【００１９】２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.５)(緩衝液
Ａ)及び２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液(ｐＨ６.２)(緩衝液Ｂ)を調製し、緩衝液Ａで平衡化
したヘパリンカラム(Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ：
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製)にｐＨ調整した活性画分を通
液した。その後、緩衝液Ｂを緩衝液Ａに対して５％混合
した溶液(０.１Ｍ ＮａＣｌ)によりカラムの２倍量洗浄
した後、さらに、緩衝液Ｂの緩衝液Ａに対して２０％混
合した溶液(０.４ＭＮａＣｌ)により溶出し、活性画分
を回収した。ここで得られた活性画分を１５ｍｇ/ｍｌ
程度の濃度まで膜濃縮器(ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３：ａ
ｍｉｃｏｎ社製)により濃縮した。濃縮した活性画分の
総量に対して２％の酢酸を添加後、０.４５μｍの濾過
フィルターにより不溶物の除去を行なった。

【００２０】２％酢酸及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを
含む溶液により平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー
担体(Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ：Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製)に活性画分を１ｍｌ通液し、ゲル濾過クロマト
グラフィーを実施し、活性を分画後、回収した。０.１
％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む１
％アセトニトリルにより平衡化したＣ４逆相ＨＰＬＣ
(Ｗａｋｏｓｉｌ ５Ｃ４−２００ ６ｍｍx １５０ｍ
ｍ：Ｗａｋｏ社製)に前述の画分を通液し、平衡化溶媒
で洗浄後、０.１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロ
パノールを含む条件下で１％から４０％アセトニトリル
のリニアグラジエント溶出により得られた活性画分を回
収した。

【００２１】得られた活性画分をさらに細かく分画する
ためにイオン交換クロマトグラフィー担体Ｍｉｎｉ Ｑ
(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製)による分画を実施した。２０
ｍＭエタノールアミン(ｐＨ９.１５)の条件下で塩化ナ
トリウムによるリニアグラジエント溶出を行なった。分
画された画分には全て活性が存在しており、全ての画分
が本願発明のペプチドに対する抗体と反応した。つまり
活性物質はいくつかの構造の異なる状態で存在している
ことが確認された。この段階での目的の活性物質は、電
気泳動による解析の結果、非還元状態で１０ｋＤａから
３０ｋＤａの数本のバンドより構成され、還元状態では
３〜４ｋＤａと７〜９ｋＤａにスメアなバンドが１本、
１３〜１４ｋＤａに２本、１６〜１７ｋＤａに２本の最
低６本のバンドを示した。これらのバンドは全て先述の
抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出可能
であった。非還元状態での電気泳動において、２８〜２
９ｋＤａ近傍にも抗体に反応する蛋白が確認されること
より、２量体を形成しているものも存在している可能性
が示唆された。

【００２２】調製例３ (抗セレノプロテインＰ抗体結合担体カラムを用いたセ
レノプロテインＰ断片の調製)血漿中のヘパリンセファ
ロース結合画分を２Ｍ硫酸アンモニウムにより沈殿さ
せ、その沈殿画分に対して５倍容量以上の２０ｍＭＴｒ
ｉｓバッファー(ｐＨ８.０)を用いて沈殿を溶解させ
た。この溶液に存在するセレノプロテインＰを抗セレノ
プロテインＰ抗体を担体に結合させた抗セレノプロテイ
ンＰ抗体結合担体カラムに吸着させ、リン酸化生理食塩
水(ＰＢＳ)で洗浄した。その後、４Ｍ尿素を含有する２
０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)によりセレノプロテ
インＰを溶出し、当該溶出液をさらに２０ｍＭクエン酸
緩衝液(ｐＨ４.０)で平衡化した陽イオン交換体(Ｍａｃ
ｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＢｉｏＲａｄ社)に吸着さ
せた。これを、塩化ナトリウムによる塩濃度勾配溶出
し、細胞死抑制活性を示す画分を回収した。このとき、
全長のセレノプロテインＰを得ることが可能であるが、
この物質は蛋白質当たりの細胞死抑制活性は明らかに弱
い値を示した。本方法によれば、短時間の精製が可能で
あるため、蛋白質当たりの細胞死抑制活性の強いセレノ
プロテインＰ断片を得ることができた。ここで得られた
断片もまた、糖鎖の有無、分子間結合の有無、内部切断
の有無などにより種々の大きさの分子種を含む混合画分
であり、非還元電気泳動で１０−３０ｋＤａのサイズを
示すセレノプロテインＰ断片群であった。

【００２３】実施例１ (脳虚血再潅流障害モデルにおけるセレノプロテインＰ
断片の虚血・再灌流障害抑制効果、その１)脳梗塞にお
ける脳神経障害に影響を与える因子の一つとして、虚血
状態で遊離されてくる遊離脂肪酸が考えられている。セ
レノプロテインＰは脂肪酸により誘導される細胞死(神
経芽細胞ＮＴ２において確認している)を抑制すること
が可能であることから、脳梗塞におけるセレノプロテイ
ンＰの影響を検討するため、１４週齢スナネズミを用い
たセレノプロテインＰ断片の脳梗塞モデルに対する虚血
・再灌流障害抑制効果を検討した。塩酸ケタミン(１０
０ｍｇ／ｋｇ)の腹腔内注射にて全身麻酔をかけ、正中
切開にて頚静脈を露出させ調製例２で調製したセレノプ
ロテインＰ断片を１ｍｇ／匹の量で静脈内投与した。３
０分後両側の頚動脈をクリップし、３０分遮断後、再潅
流させ、２４時間後の生存率を比較した。

【００２４】

【表１】 対照となる生理食塩水投与群よりセレノプロテインＰ断
片投与群の死亡率が明らかに低く、急性期の脳梗塞で回
復している割合が高いことを示唆する結果が得られた。

【００２５】実施例２ (脳虚血再潅流障害モデルにおけるセレノプロテインＰ
断片の虚血・再灌流障害抑制効果、その２運動失調改善
効果)セレノプロテインＰの脳虚血再灌流障害、運動失
調に及ぼす影響を麻痺の度合いで確認するために、１２
週齢のスナネズミを用いて評価した。実施例１と同様に
塩酸ケタミン(１００ｍｇ／ｋｇ)の腹腔内注射にて全身
麻酔をかけ、正中切開にて頚静脈を露出させ調製例２で
調製したセレノプロテインＰ断片を１ｍｇ／匹の量で静
脈内投与した。３０分虚血、４５分間虚血を行なった
後、血流を再灌流させ、６時間後及び２４時間後の麻痺
の度合いにより評価した。６時間後及び２４時間後の麻
痺の状態を表２に示すスコアで判定し評価した。結果を
表３及び表４に示す。

【００２６】

【表２】

【００２７】

【表３】３０分虚血モデル

【００２８】

【表４】４５分虚血モデル

【００２９】３０分虚血モデルにおける６時間後の麻痺
の状態及び２４時間後の麻痺の状態を評価すると、セレ
ノプロテインＰ断片投与群の方が明らかに症状が良好で
ある結果が得られた。また、４５分虚血モデルでは６時
間後の麻痺の度合いは大差ないが、２４時間後の麻痺の
度合いに大きな差が観られた。

【００３０】実施例３ （クロトー(klotho)マウスへのセレノプロテインＰの投
与による運動失調の改善効果）血管性障害に付随する運
動失調の改善を目的として、クロトーマウスを用いて本
願発明のセレノプロテインＰ断片の効果を確認した。ク
ロトーマウスは、Ｎａｔｕｒｅ,３９０:４５−５１,１
９９７に記載され、京都大学大学院医学研究科の鍋島陽
一先生の許可を得て日本クレアより入手した。１群４匹
の４週齡のクロトーマウスに対して８週齡まで、生理食
塩水に溶解した調製例２で得られたセレノプロテインＰ
断片(１.５ｍｇ／ｍｌ)及び生理食塩水を毎週３００μ
ｌずつ腹腔に投与し、その状態変化を観察した。その結
果、生理食塩水投与群、セレノプロテインＰ断片投与群
ともに、4週齡からの体重の増加は観察されず、根本原
因を解決する事は無かった。しかし、その行動を比較す
るとセレノプロテインＰ断片投与群が手のひらに乗せた
際、自発的に逃げるために飛び降りることが可能である
のに対し、生食投与群は自発的な逃避行動をとることが
出来なかった。これはセレノプロテインＰ断片による運
動能低下の改善効果を示すものと考えられた。

【００３１】実施例４ (肝虚血再潅流モデルにおけるセレノプロテインＰ断片
の虚血・再灌流障害抑制効果)スナネズミを用いた肝虚
血再潅流モデルおけるセレノプロテインＰ断片の虚血・
再灌流障害抑制効果を検討した。セレノプロテインＰの
影響を確認するために、セレノプロテインＰ断片及び生
理食塩水を事前投与し門脈血流遮断による虚血を行な
い、その後再潅流させた際の３０時間後のスナネズミの
生存率、血中のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰの濃度変化、組
織の観察によって評価した。スナネズミに１０倍希釈し
たネンブタール(５０ｍｇ/ｍｌ)を３００μｌ腹腔内投
与により麻酔し、腹部切開により下大静脈を露出、そこ
から調製例２で調製されたセレノプロテインＰ断片１ｍ
ｇ／匹、もしくは生理食塩水を静注した。５分後に門脈
を露出し、クリップにより血流遮断した。４０分後に再
潅流させ、腹部縫合後、３０時間後に全てのスナネズミ
を麻酔下で解剖し血液、臓器採取、血中の肝臓マーカー
酵素の解析を行なった。結果を表５に示す。

【００３２】

【表５】 その結果、生理食塩水投与群の死亡率が３/４であるの
に対し、セレノプロテインＰ断片投与群においては０/
３となった。ＡＬＰの活性が生理食塩水投与群ではコン
トロールの５倍程度上昇していたのに対し、セレノプロ
テインＰ投与群では正常値を示していた。肝臓もしくは
腸の細胞膜に傷害が起こるとＡＬＰが上昇するため、傷
害を受けるはずの細胞がセレノプロテインＰにより安定
化され傷害が低減された結果、セレノプロテインＰ投与
群が生き残った可能性が示唆される。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120>Nobel Agent for Ischemia-Reperfusion Injury <130>JP387YS <160>7 <210>1 <211>29 <212>PRT <213>Human plasma <220> <223>Xaa represents selenocysteine <400>1 Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser 1 5 10 15 Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu 20 25 <210>2 <211>28 <212>PRT <213>Human plasma <220> <223>Xaa represents selenocysteine <400>2 Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser 1 5 10 15 Leu Cys Ser Xaa Gln Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn Ile 20 25

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セレノプロテインＰを主要構成成分とす
   る、虚血・再灌流障害抑制剤。
2. 【請求項２】 セレノプロテインＰが、セレノプロテイ
   ンＰのＣ末端側ペプチドまたは当該ペプチド群である請
   求項１記載の虚血・再灌流障害抑制剤。
3. 【請求項３】 ペプチドまたは当該ペプチド群が、セレ
   ノプロテインＰのＣ末端側１０３アミノ酸配列または当
   該アミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記い
   ずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配
   列を含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該
   ペプチド群である、請求項２記載の虚血・再灌流障害抑
   制剤。
4. 【請求項４】 ペプチドまたは当該ペプチド群が、次
   式、 (Ｉ)：Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌ
   ｅｕ Ｌｅｕ ＣｙｓＬｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓ
   ｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅ
   ｒ Ｘａａ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｈｉ
   ｓ Ｌｅｕおよび／または (ＩＩ)：Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
   Ｘａａ Ｇｌｎ ＣｙｓＬｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
   ｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｇ
   ｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉ
   ｌｅ (式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
   はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
   ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン
   酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅは
   イソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍ
   ｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏ
   はプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔ
   ｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバ
   リン及びＸａａはセレノシステインの各残基をそれぞれ
   表す)で表されるアミノ酸配列もしくは当該アミノ酸配
   列の部分配列または前記アミノ酸配列を含有するアミノ
   酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である請
   求項２または請求項３に記載の虚血・再灌流障害抑制
   剤。
5. 【請求項５】 ペプチドまたは当該ペプチド群が、(ａ)
   分子量分画膜に基づき１０〜３０ｋＤａの分子量画分に
   回収され、(ｂ)イオン交換樹脂への結合性の検討の結
   果、血中でｐＨ７からｐＨ８の間に等電点を示す構造と
   ｐＨ８以上に等電点を示す構造を有し、(ｃ)非還元系Ｓ
   ＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量１３〜１４ｋＤａの２本のバ
   ンド及びそれらに糖鎖の付加された１６〜１７ｋＤａの
   ２本のバンドを示し、また(ｄ)還元条件下でのＳＤＳ−
   ＰＡＧＥでは、前記バンドに加えて３〜４ｋＤａ、７〜
   ９ｋＤａ及び１０〜１２ｋＤａのバンドを呈するペプチ
   ドまたは当該ペプチド群である請求項２から請求項４の
   いずれかに記載の虚血・再灌流障害抑制剤。
6. 【請求項６】 虚血・再灌流障害に起因する疾患が、脳
   梗塞、虚血性臓器・組織障害、臓器移植等再灌流傷害、
   動脈硬化、心筋梗塞及び血管性障害に付随する運動失調
   より選択される、請求項１から請求項５のいずれかに記
   載の虚血・再灌流障害抑制剤。
7. 【請求項７】 虚血・再灌流障害に起因する疾患が、血
   管性障害に付随する運動失調である請求項６記載の虚血
   ・再灌流障害抑制剤。