JP5261806B2 - 高温安定性酸素担体を含む医薬組成物の製造方法およびその使用 - Google Patents

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本出願は、２０１０年５月２７日に提出された米国仮特許出願第６１／３４８，７６４号および２０１１年１月２６日に提出された米国特許出願第１３／０１３，８４７号の優先権を主張するものであり、その開示は参照により組み込まれる。

本発明は、高温安定性酸素担体を含む医薬組成物の製造方法および当該方法により製造された組成物に関する。本発明はまた、高温安定性酸素担体を含む医薬組成物のヒトおよびその他の動物のための癌治療、酸素欠乏障害の治療および臓器保存のための使用に関する。

発明の背景

ヘモグロビンは、殆どの脊椎動物において、血管系と組織の間のガス交換のために重要な役割を果たす。それは、血液循環を介して呼吸器系から体細胞へと酸素を運搬し、また代謝老廃物である二酸化炭素を、二酸化炭素が吐出される呼吸器系へと体細胞から運び去ることを担当している。ヘモグロビンはこの酸素輸送の特徴を有しているので、エクスビボで安定化でき且つインビボで使用できれば、強力な酸素供給体として使用することができる。

天然に存在するヘモグロビンは、赤血球内に存在するときには一般に安定な四量体である。しかしながら、天然に存在するヘモグロビンが赤血球から取り出されると、それは血漿中で不安定になり、二つのα−β二量体に分裂する。これら二量体の各々は、分子量が約３２ｋＤａである。これら二量体は、腎臓を通して濾過および排泄されるときに実質的な腎障害を引き起こす。四量体結合の分解はまた、循環系における機能的ヘモグロビンの持続可能性に悪影響を与える。

四量体の分解を防止するために、ヘモグロビン加工における最近の発展は、四量体内での分子内結合、並びに四量体間での分子間結合を形成してポリマーヘモグロビンを形成するために、種々の架橋技術を取込んできた。従来技術は、ヘモグロビンの循環半減期を増大させるためには、ポリマーヘモグロビンが好ましい形態であることを教示している。しかし、本発明者等が確認したように、ポリマーヘモグロビンは血液循環系において容易にメトヘモグロビン（met-hemoglobin）に変換される。メトヘモグロビンは酸素と結合することができず、従って組織に酸素供給することができない。従って、従来技術によりポリマーヘモグロビンの形成を生じることが教示された架橋は問題である。当該技術においては、ポリマーヘモグロビンの同時形成を伴うことなく安定な四量体を形成するための、分子内架橋を可能にする技術が必要とされている。

更に、ヘモグロビンを安定化させようとした従来技術に伴う更なる問題には、許容できない高パーセンテージの二量体ユニットを含んだ四量体ヘモグロビンの産生が含まれる：二量体の存在により、ヘモグロビン組成物は、哺乳類への投与について満足できないものとなる。ヘモグロビンの二量体形態は、哺乳類の身体において幾つかの重篤な腎障害を生じる可能性がある；この腎障害は死亡の原因になり得るほどに十分に重篤である。従って、当該技術においては、最終生成物中に望まれない二量体形態が低い安定な四量体ヘモグロビンを製造することが必要とされている。

安定なヘモグロビンを作製しようとする従来技術に伴う更なる問題には、哺乳類において、アレルギー効果を生じ得る免疫グロブリンＧなどのタンパク質不純物の存在が含まれる。従って、当該技術では、タンパク質不純物の存在しない安定な四量体ヘモグロビンを製造できる方法が必要とされている。

従来技術のヘモグロビン製造に伴う他の問題は、哺乳類での輸血に続く血管収縮を含む。この血管収縮は内皮由来弛緩因子のヘモグロビン分子の反応性スルフヒドリル基への結合によるものであると示されている。従って、当該技術には、輸血に続く血管収縮を引き起こさない安定化された四量体ヘモグロビンの作製の必要性がある。

上記問題に加えて、当該技術では、リン脂質を含まず且つ工業的規模で製造できる安定化された四量体ヘモグロビンが必要とされている。

本発明は、重篤な腎障害、血管への有害な影響または死亡を含む他の重篤な副作用を起こすことなく、哺乳類において使用するために適した高温安定性の精製された架橋四量体ヘモグロビンを産生する方法を提供する。本発明はまた、高温安定性の精製された架橋四量体ヘモグロビン、並びにインビボおよびエキソビボ組織の酸素化のための当該ヘモグロビンの使用を含む。当該方法は、少なくとも赤血球および血漿を含む哺乳類の全血である出発物質を含む。赤血球は哺乳類の全血中の血漿から分離され、続いて濾過によって濾過された赤血球画分が得られる。濾過された赤血球は洗浄され、血漿タンパク質が除去される。洗浄された赤血球は、流量が５０〜１０００リットル／時の瞬間細胞溶解装置中で、白血球を溶解することなく赤血球を溶解するために充分な時間をかけて制御された低張溶解により破壊される。濾過が行われて、溶解物から不用残留物の少なくとも一部が除去される。前記溶解物から、第１のヘモグロビン溶液が抽出される。

第１の限外濾過プロセスは、四量体ヘモグロビンよりも高分子量を有する不純物を除去し、更に第１のヘモグロビン溶液から何れかのウイルスおよび残存する不用残留物を除去するように構成された限外濾過を使用して行われて、第２のヘモグロビン溶液が得られる。流液カラムクロマトグラフィ（Flowthrough column chromatography）を第２のヘモグロビン溶液において行い、タンパク質不純物、二量体ヘモグロビンおよびリン脂質を除去して、リン脂質非含有低二量体ヘモグロビン溶液を形成する。不純物を除去するように構成されたフィルタを使用して、第２の限外濾過プロセスをリン脂質非含有低二量体ヘモグロビン溶液において行い、濃縮され精製されたリン脂質非含有低二量体ヘモグロビン溶液を得る。

完全に酸素化された環境中でスルフヒドリル溶液により、濃縮され精製されたリン脂質非含有低二量体ヘモグロビン溶液におけるヘモグロビン分子のスルフヒドリル基を阻害する。ヘモグロビン分子はシステイン部位で内皮由来弛緩因子に結合できなくなるように、得られたヘモグロビン分子の各々はチオール保護基を有する少なくとも１つのシステイン分子を有する。

得られる架橋四量体ヘモグロビンの分子量が６０〜７０ｋＤａであるように、チオール保護化ヘモグロビンの少なくともα-αおよび／またはβ-βサブユニットでフマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルによって架橋化されて、ポリマーヘモグロビンの形成を伴わない高温安定性架橋四量体ヘモグロビンが形成される。架橋四量体ヘモグロビンのために適切な生理学的緩衝液が交換される。何れかの残留する非架橋四量体ヘモグロビンおよび何れかの残留化学物質を接線流限外濾過(tangential-flow ultrafiltration)を用いて除去される。Ｎ−アセチルシステインが０．２〜０．４％の濃度で架橋四量体ヘモグロビンに対して添加され、メトヘモグロビンレベルが５％以下に維持される。リン脂質非含有低二量体チオール保護化高温安定化架橋四量体ヘモグロビンを次に、薬学的に許容される担体に添加し、薬学的に許容される担体は生理学的緩衝液または水であってよい。この工程に続いて、得られたヘモグロビンは気密性ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、エチレンビニルアルコール(PE、EVA、EVOH)輸血容器に任意に包装される。当該包装は、不活性メトヘモグロビンの形成を齎す酸素汚染を防止する。上記の方法により産生された高温安定性架橋ヘモグロビンは、種々の癌、例えば、白血病、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、上咽頭癌および食道癌などの治療のために使用される。癌細胞を破壊する機序は、腫瘍細胞における酸素化を改善し、それにより放射線および化学療法剤に対する感受性を向上するというものである。高温安定性架橋四量体ヘモグロビンはまた、臓器移植中の臓器組織の保存またはインビボにおける酸素供給が不足した状況、例えば、酸素が剥奪された心臓などにおける心臓の保存のために使用される。

図１は、異なるヘモグロビンのアミノ酸配列アラインメントを図示する。 図２は、本発明の方法の概要を図示するフローチャートである。 図３は、本発明の方法において使用される瞬間細胞溶解装置を模式図である。 図４は、酸素化および脱酸素化の環境におけるスルフヒドリル試薬でのヘモグロビンの反応を示すグラフである。 図５は、架橋四量体ヘモグロビンのための高速液体クロマトグラフィ分析を図示する。 図６は、架橋四量体ヘモグロビンのためのエレクトロスプレーイオン化質量(ESI-MS)分析を図示する。 図７は、（ａ）精製ヘモグロビン溶液および（ｂ）架橋四量体ヘモグロビンのための円偏光二色性(CD)分光法分析を示す。 図８は、インビトロでの架橋四量体ヘモグロビンの化学増感効果を示す。 図９は、本発明の架橋四量体ヘモグロビンを用いる正常組織の酸素化の改善を図示する。 図１０は、本発明の架橋四量体ヘモグロビンを用いる極度の低酸素腫瘍領域の酸素化の改善を図示する。 図１１は、本発明の安定化架橋四量体ヘモグロビンでの処理後の重篤な出血性ショックのラットモデルにおける平均動脈圧変化を示す。 図１２は、流液カラムクロマトグラフィのための溶出プロファイルである；ヘモグロビン溶液は流液画分中にある。 図１３は、工業的規模操作のための限外濾過を伴う流液CMカラムクロマトグラフィシステムを概略的に図示する。 図１４は、酸素化環境におけるスルフヒドリル反応と脱酸素化環境における反応との間の比較である。 図１５は従来のヘモグロビンと対比した本発明の架橋四量体ヘモグロビンの熱安定性を示すグラフである。 図１６は、本発明の架橋四量体ヘモグロビンのための輸液バッグの模式図である。 図１７は、インビトロにおけるメトヘモグロビンの形成を試験するために用いられる装置の模式図である。 図１８は、図１７の装置におけるポリマーヘモグロビンと本発明のヘモグロビンとについてのメトヘモグロビン形成の割合を示す。

発明の詳細な説明

ヘモグロビンは、哺乳類および他の動物の血液の赤血球における、鉄を含んだ酸素輸送タンパク質である。ヘモグロビンは、タンパク質の三次構造および四次構造の両方の特徴を示す。ヘモグロビン中のアミノ酸の殆どは、短い非螺旋セグメントにより接続されたαへリックスを形成する。水素結合は、ヘモグロビンの内側の螺旋セクションを安定させて分子内での引力を生じ、それによって各ペプチド鎖を特定の形状に折畳む。ヘモグロビン分子は、四つの球状タンパク質サブユニットから組み立てられる。各サブユニットは、埋め込まれたヘム基と共に、「ミオグロブリン畳み込み」配列で接続された１組のαへリックス構造セグメントに配置されたポリペプチド鎖で構成される。

ヘム基は、ポルフィリンとして知られる複素環の中に保持された鉄原子からなっている。該鉄原子は、１つの面内にある環の中心において、四つの全ての窒素原子に均等に結合している。次に、酸素はポルフィリン環の平面に対して垂直に、鉄中心に結合することができる。このように、単一のヘモグロビン分子は、酸素の４つの分子と結合する能力を有する。

ヒト成人において、最も共通するタイプのヘモグロビンは、ヘモグロビンＡと呼ばれる四量体であり、α２β２と称する非共有結合で結合された二つのαサブユニットおよび二つのβサブユニットからなり、各々がそれぞれ１４１アミノ酸残基および１４６アミノ酸残基でできている。αサブユニットおよびβサブユニットのサイズおよび構造は、相互に非常に類似している。四量体の約６５ｋＤａの総分子量について、各サブユニットは約１６ｋＤａの分子量を有している。四つのポリペプチド鎖は、塩橋、水素結合および疎水性結合によって相互に結合される。ウシヘモグロビンの構造はヒトヘモグロビンに類似している（α鎖で９０．１４％の同一性；β鎖で８４．３５％の同一性）。相違点は、ウシヘモグロビンにおける二つのスルフヒドリル基がβＣｙｓ９３に位置するのに対して、ヒトヘムロビンにおけるスルフヒドリル基はαＣｙｓ１０４、βＣｙｓ９３およびβＣｙｓ１１２にそれぞれ位置することである。図１は、ウシ、ヒト、イヌ、ブタおよびウマのヘモグロビンのアミノ酸配列アラインメントを示しており、それぞれＢ、Ｈ、Ｃ、Ｐ、およびＥで標識されている。種々の起源に由来する異なるアミノ酸には影が付されている。図１は、ヒトヘモグロビンが、それらのアミノ酸配列を比較したときに、ウシ、イヌ、ブタおよびウマのヘモグロビンとの高い類似性を有していることを示している。

赤血球の内部で天然に存在するヘモグロビンにおいて、α鎖とその対応するβ鎖との会合は非常に強く、生理学的条件下では脱離しない。しかし、赤血球の外側では、一つのαβ二量体ともう一つのαβ二量体との会合は非常に弱い。結合は、各々が約３２ｋＤａの二つのαβ二量体に分離する傾向を有している。これらの望ましくない二量体は、腎臓により濾過され排泄されるためには十分に小さく、その結果として潜在的な腎障害および実質的に血管内保持時間の低下が生じる。

従って、有効性および安全性の両方のために、赤血球の外側で使用される全てのヘモグロビンを安定化させることが必要とされる。安定化されたヘモグロビンを製造するための方法を以下で概説する；本発明の方法の概観が図２のフローチャートに提示されている。

最初に、赤血球由来ヘモグロビンの供給源としての全血源を選択する。ヒト、ウシ、ブタ、ウマおよびイヌの全血を含む哺乳類の全血が選択されるが、これらに限定されない。赤血球を血漿から分離し、濾過し、洗浄して、血漿タンパク質不純物を除去する。

赤血球からヘモグロビンを放出するために、細胞膜を溶解させる。赤血球を溶解させるために種々の技術を使用できるが、本発明では、工業的規模の生産に適した容量で正確に制御できるように、低張条件下での溶解を使用する。この目的のために、図３に見られる瞬間細胞溶解装置を、赤血球を溶解するために使用する。低張溶解が、ヘモグロビンおよび不用残留物を含有する溶解物の溶液を形成する。工業的規模での製造を可能にするために、溶解は、白血球または他の細胞を溶解することなく、赤血球だけを溶解するように注意深く制御される。１つの態様において、瞬間細胞溶解装置のサイズは、約３０秒で赤血球が装置を横切るように選択され、細胞溶解装置は、静的ミキサーを含む。脱イオン化された蒸留水が低張溶液として使用される。勿論、異なる塩水濃度を有する他の低張溶液の使用は、異なる時間で赤血球細胞溶解が得られることが理解される。制御された溶解方法は、白血球または細胞物質を溶解せずに赤血球のみを破壊するので、毒性タンパク質、リン脂質または白血球由来のＤＮＡおよび他の細胞物質の放出を最小限に抑える。低張溶液は３０秒後に、即ち、赤血球を含有する溶液が細胞溶解装置の静的ミキサー部分を横切った後、直ちに添加される。得られたヘモグロビンは、他の溶解技術を使用して得られたヘモグロビンよりも高い純度で、且つ低レベルで汚染物、例えば望ましくないＤＮＡおよびリン脂質を有する。白血球由来の望ましくない核酸およびリン脂質不純物は、それぞれポリメラーゼ連鎖反応法（検出限界＝６４ｐｇ）および高速液体クロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ、検出限界＝１μ／ｍＬ）によっても、ヘモグロビン溶液中において検出されない。

２つの限外濾過プロセスが行われる：１つは、流液カラムクロマトグラフィの前に、ヘモグロビンよりも大きい分子量を有する不純物を除去するものであり、もう１つは、流液カラムクロマトグラフィの後に、ヘモグロビンよりも小さい分子量を有する不純物を除去するものである。後者の限外濾過プロセスはヘモグロビンを濃縮する。幾つかの態様において、第１の限外濾過のために１００ｋＤａのフィルタが使用されるのに対して、第２の限外濾過のためには３０ｋＤａのフィルタが使用される。

流液カラムクロマトグラフィが使用されて、精製されたヘモグロビン溶液中のタンパク質不純物、例えば免疫グロブリンＧ、アルブミンおよび炭酸脱水酵素が除去される。幾つかの態様において、カラムクロマトグラフィは、ＤＥＡＥカラム、ＣＭカラム、ヒドロキシアパタイトカラムなどの商業的に入手可能な１つのイオン交換カラムまたはこれらカラムの組合せを使用することにより行われる。カラムクロマトグラフィのためのｐＨは、典型的には６〜８．５である。１つの態様において、流液ＣＭカラムクロマトグラフィ工程は、ｐＨ８．０でタンパク質不純物を除去するために使用される。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が行われて、カラムクロマトグラフィから溶出した後に、試料中に残存しているタンパク質不純物およびリン脂質が検出される。この独特の流液カラムクロマトグラフィ分離が、工業的規模での製造を可能にする連続的な分離スキームを可能にする。ＥＬＩＳＡの結果は、溶出した架橋四量体ヘモグロビン中で、これら不純物の量が実質的に低いことを示している（免疫グロブリンＧ：４４．３ｎｇ／ｍＬ；アルブミン：２０．３７ｎｇ／ｍＬ；炭酸脱水素酵素：８１．２μｇ／ｍＬ）。異なるｐＨ値で異なる種類のカラムを用いたタンパク質不純物除去の結果を以下の表１に示す。

望ましくない血管収縮を引き起こすヘモグロビンのシステイン部位に対する内皮由来弛緩因子の結合を防止するために、酸素化条件下でヘモグロビンをスルフヒドリル試薬との反応に供する。これは、脱酸素化条件下でのヘモグロビンとスルフヒドリル試薬との間の反応を強調する従来技術の教示とは対照的な方向にある。本発明は、スルフヒドリル試薬が、酸素化条件下でヘモグロビンの反応性スルフヒドリル基とより早く且つ完全に反応することを示している。ヘモグロビンのスルフヒドリル基とのスルフヒドリル試薬の反応は、ヨウ化物を生成する。従って、アルキル化反応の完全性は、ヨウ化物放出を測定することによりモニターできる。図４および図１４において示されるように、経時的な実験の間に、アルキル化反応は、脱酸素化環境に比較して、酸素化環境においてより早く且つより効率的に行われる。反応完了のために必要とされる反応時間は、脱酸素化環境に比較して、酸素化環境において５時間未満に短縮される。より短い反応時間は、工業的規模プロセスのために非常に重要である。それはまた、最終生成物中の副作用を引き起こす望まれない不純物に起因する反応を減少する。

スルフヒドリル反応プロセスに続き、ヘモグロビンは、フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチル（ＤＢＳＦ）によるα−αおよび／またはβ−β架橋化を受ける。ポリマーヘモグロビンの形成を防止するために、反応は、脱酸素化された環境において、ヘモグロビンのＤＢＳＦに対するモル比が１：２．５〜１：４．０の間で、得られるα−αおよび／またはβ−β架橋ヘモグロビンが６０〜７０ｋＤａの分子量を有する四量体ヘモグロビンであり、且つポリマーヘモグロビンが存在しないことが示されるように、注意深く制御される。ＤＢＳＦ反応の収率は高く、＞９９％、最終生成物における二量体濃度は低く、本発明との関連で、低い二量体含有量とは５％未満、より好ましくは２％未満の二量体を意味する。１つの態様において、架橋は、β−β架橋ヘモグロビンが全架橋四量体ヘモグロビンの５０％よりも多くなるように選択される。もう１つの態様において、架橋は、β−β架橋ヘモグロビンが全架橋四量体ヘモグロビンの６０％よりも多くなるように選択される。更に、β−β架橋ヘモグロビンが全架橋四量体ヘモグロビンの７０％よりも多くなるように条件が選択される。β−β架橋ヘモグロビンがα−α架橋四量体ヘモグロビンよりも低い酸素親和性を有し得るという幾つかの証拠がある。従って、β−β架橋ヘモグロビンが、α−α架橋ヘモグロビンよりも酸素運搬の効率を高めるために好ましい状況であり得る。更に、β−β架橋ヘモグロビンは、腎毒性の減少を助けるであろう少ないα−β二量体を生じ得る。

Ｎ−アセチルシステインを０．２〜０．４％の濃度でα−αおよび／またはβ−β架橋四量体ヘモグロビンに対して添加し、メトヘモグロビンレベルを５％未満に維持する。

ヘモグロビンの最終適用に依存して、本発明の精製された架橋四量体ヘモグロビンは任意に気密包装に脱酸素環境において包装される。本発明において使用される包装は、結果として２年以上に亘り安定したα−αおよび／またはβ−β架橋四量体ヘモグロビンを生じる。一方、本発明のヘモグロビンは、酸素化条件下では２、３日以内に急速にメトヘモグロビンに変わる。従来技術のヘモグロビン溶液は、高酸素透過性を有するＰＶＣ血液バッグまたはステリコン（Stericon）血液バッグに包装されおり、そのために製品の寿命が短縮される。

本発明の多くの態様において、架橋ヘモグロビンを含む酸素担体を含む医薬組成物は、静脈注射により送達される。そのため、包装設計および物質の選択は、静脈注射の適用に向けられる。EVA/EVOH物質の多層包装が使用されて気体透過性が最小化され、不活性なメトヘモグロビンの形成が回避される。本発明の精製された架橋ヘモグロビンと共に使用されるために設計された１００ｍＬの注入バッグは、厚さ０．４ｍｍの５層EVA/EVOH積層物質から作られ、室温気圧当たり２４時間当たり１００平方インチ当たり０．００６〜０．１３２ｃｍ^３の酸素透過性を有する。この物質はクラスＶＩプラスチック(USP<88>に定義されている)であり、インビボ生物反応性試験および物理化学試験に適合し、静脈注射目的のための注入バッグを作るために適切である。この主要なバッグは、特にα−αおよび／またはβ−β架橋四量体ヘモグロビン溶液を、不安定性の原因となって最終的にその治療特性に影響する長期間の酸素暴露から保護するために有用である。

血液生成物の二次保護のために、潜在的な空気の漏出から保護し、脱酸素化状態に生成物を維持するためにアルミニウム上包装の使用が知られている。しかしながら、アルミホイル上包装においてピンホールのある可能性があり、これはその気密を損ない、生成物を不安定にする。従って、本発明は、二次包装として、酸素化を防ぎ、また光暴露を防ぐアルミニウム上包装パウチを使用する。上包装パウチの組成は、０．０１２ｍｍのポリエチレンテレフタレート（PET）、０．００７ｍｍのアルミニウム（AL）、０．０１５ｍｍのナイロン（NY）および０．１ｍｍのポリエチレン（PE）を含む。上包装フィルムは、０．１４ｍｍの厚さと、室温気圧当たり２４時間当たり１００平方インチ当たり０．００６ｃｍ^３の酸素透過率を有する。この二次包装は、ヘモグロビンのための安定時間を延長し、生成物貯蔵寿命を延長する。

高速液体クロマトグラフィ（HPLC）、エレクトロスプレーイオン化質量分析 (ESI-MS)、および円偏光二色性（CD）分光分析を使用して、α−αおよび／またはβ−β架橋四量体ヘモグロビンが分析され、特徴付けがなされる。ウシ血液源について、図５はHPLC分析による分子量分布に関して生成物の組成を示す。HPLC分析法を使用して、四量体および二量体の量がそれぞれ検出される。HPLC分析のための移動相は、塩化マグネシウム（0.75M）を含み、これは二量体、非架橋四量体と安定化されたα−αおよび／またはβ−β架橋四量体とを分離できる。ヘモグロビンの二量体への分離の促進について、塩化マグネシウムは同じイオン強度での塩化ナトリウムよりも約３０倍効率的である。

ESI-MSは、非常に大きな分子の分析を可能にする。それは、タンパク質をイオン化し、次いでイオン化されたタンパク質を質量／電荷比に基づいて分離することにより、高分子量化合物を分析するイオン化技術である。従って、分子量およびタンパク質相互作用を正確に決定することができる。図６において、ＥＳＩ−ＭＳ分析結果は、安定性四量体のサイズが６５ｋＤａであることを示している。１９０〜２４０ｎｍの遠紫外線ＣＤスペクトルは、ヘモグロビンにおけるグロブリン部分の二次構造を明らかにしている。図７において、精製された架橋ヘモグロビンのスペクトルの一致性は、ＤＢＳＦによる架橋後でさえも、ヘモグロビン鎖が適正に折り畳まれていることを明らかにしている。このＣＤの結果は、架橋ヘモグロビンがαへリックスの４２％、βシートの３８％、βターンの２．５％およびランダムコイルの１６％を有していることを示している。それは更に、架橋四量体ヘモグロビンを形成するためのＤＢＳＦでの架橋工程がヘモグロビンの二次構造に影響しないことを裏付ける。

本発明の方法により産生された精製された架橋四量体ヘモグロビンは、６０〜７０ｋＤａの分子量を有し、少なくとも１つのシステイン部分を有し、ヘモグロビンはシステイン部位で内皮由来弛緩因子に結合する能力を持たないように、前記システイン部分は、チオール保護基を含む。更に、架橋ヘモグロビンは非発熱性であり、エンドトキシン非含有（＜０．０５ＥＵ／ｍＬ）であり、ストローマ非含有（＜１％）である。

本発明の方法は、架橋四量体ヘモグロビンの大規模な工業生産のために適用される。加えて、医薬担体（例えば、カプセル形態における水、生理学的緩衝液）との組み合わせる架橋四量体ヘモグロビンは、哺乳類での使用に適している。

本発明の架橋四量体ヘモグロビンは、組織の酸素化、癌治療、出血性ショックなどの酸素欠乏症の治療、および低酸素含量環境下での心臓保存（例えば心臓移植）のために使用される。架橋四量体ヘモグロビンの用量は、約０．３〜１．３ｇ／ｋｇの濃度範囲で選択される。

癌治療における使用について、本発明の酸素担体を含有する医薬組成物は、腫瘍組織における酸素化を改善することにより、化学感受性（例えば、化学療法に対する感受性）および放射線感受性を高めるための組織酸素化剤として働く。

図８は、インビトロにおける架橋四量体ヘモグロビンを含む組成物を適用した後の癌腫瘍細胞の向上された化学的感受性を明示する。５つの異なる癌細胞株（Ａ）ジャーカット（白血病）、（Ｂ）ＨＫＥＳＣＩ（食道癌）、（ｃ）ＣＯＬＯ２０５（大腸癌）、（Ｄ）Ａ５４９／Ｃｉｓｐ（肺癌）および（Ｅ）ＭＣＦ−７／ＡＤＭ（乳癌）は種々の化学療法剤単独、または本発明の架橋四量体ヘモグロビンとの組み合わせた化学療法剤で処理される。腫瘍細胞成長の阻害は、ＡＴＰ腫瘍化学的感受性アッセイ（ATP-TCA）（ジャーカット、ＣＯＬＯ２０５、Ａ５４９／ＣｉｓｐおよびＭＣＦ−７／ＡＤＭ細胞株について）またはＭＴＴ細胞増殖アッセイ（ＨＫＥＳCｌ細胞株について）により決定される。結果は、化学的感受性は、化学療法に対して高度に耐性であるＡ５４９／ＣｉｓｐおよびＭＣＦ−７／ＡＤＭを含む全ての癌細胞株において本発明の架橋四量体ヘモグロビンの添加により高度に増強されることを示す。図８における結果は、架橋四量体ヘモグロビンの添加により増強された化学的感受性の結果として、白血病細胞、食道癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞および乳癌細胞についての治療効果が大いに増大したことを示す。

加えて、本発明の架橋四量体ヘモグロビンの正常組織（図９）と極度に低酸素の腫瘍組織（図１０）（ヒト上咽頭癌(CNE2)）とにおける酸素化の改善能力が本発明において示される。ヒトＣＨＥ２異種移植片の組織トラックに従う代表的な酸素プロファイルを図１０に示す。微小位置決めシステム（DTI Limited）に結合された光ファイバー酸素センサ（Oxford Optronix Limited）によって直接モニターされる。１．２ｇ／ｋｇの架橋四量体ヘモグロビンの静脈注射の後、ｐＯ２の中央値は、０．２ｍｍＨｇから、３時間では３．９ｍｍＨｇにまで、６時間では１０．６ｍｍＨｇまでにそれぞれ上昇する。最も低酸素の領域においてさえも、本発明の酸素担体を含有する医薬組成物は、有意に酸素圧を上昇した。他の同様な商業的製品または何れの現存する技術も、本発明により製造された酸素担体を含有する医薬組成物と比べると、同様に高い効果を示すものはない。

酸素欠乏障害の治療における使用および心臓保存における使用のために、本発明の酸素担体含有医薬組成物は、標的臓器に対して酸素を提供する代替血液として働く。幾つかの態様において、当該組成物は、心臓保存のための心筋保護液として使用される。

０．５ｇ／ｋｇの本発明の架橋四量体ヘモグロビンで治療した後の、重篤な出血性ショック（例１２ｂを参照されたい）のラットモデルにおける平均動脈圧変化を図１１に示す。重篤な出血性ショックのラットモデルにおいて、安定性架橋四量体ヘモグロビンでの治療後に、平均動脈圧は安全且つ安定なレベルに復帰し、基線またはその近傍も維持される。本発明のヘモグロビンでの治療に続き、平均動脈圧が正常にまで復帰するまでの反応時間は、陽性コントロールとして使用するラット全血の投与に続く場合よりもまさに短い。上記結果は、本発明のヘモグロビンを注入した後の血管作動性イベントが、安定した血流力学状態を維持するために有益であることを示す。従来のヘモグロビンに基づく酸素担体は、多くの血管収縮イベントを引き起こした。例えば、ヘモピュア（Hemopure(登録商標)）製品（Biopure Co., USA）は、カッツら（Katz et al., 2010）により開示されるように基線（９６±１０ｍｍＨｇ）に比べて高い平均動脈圧（１２４±９ｍｍＨｇ）を生じた。

本発明のヘモグロビンの注入のための使用は、マウス（１８％から７５％）およびビーグル犬（４６％から９７％）のショックモデルにおいて生存率を上昇する。重篤な出血性ショック動物モデルの生存率は、異なる量の架橋四量体ヘモグロビンの注入により有意に増大される（例１２を参照されたい）。従って、本発明のヘモグロビンは出血性ショックの治療として使用される。

例
次の例は、如何なる意味でも本発明の範囲を限定することを意図することなく、本発明の特定の態様を説明することにより提供される。

例１
全体的な工程
図２に、本発明の方法の概略フロー図が示される。ウシ全血を、抗凝固剤として３．８％（ｗ／ｖ）のクエン酸三ナトリウム溶液を含む閉じた滅菌容器／バッグ中に採取する。次いで、血液を直ちにクエン酸三ナトリウム溶液と充分に撹拌し、血液の凝固を阻害する。赤血球（RBC）は、アフェレーシス機序により、血漿および他の小さい血液細胞から単離および回収される。「細胞洗浄機」はこの方法のために、ガンマ線滅菌された使い捨ての遠心分離ボウルと共に使用される。ＲＢＣは等容量の０．９％（ｗ／ｖ塩化ナトリウム）塩水で洗浄される。

洗浄されたＲＢＣを溶解し、ＲＢＣ細胞膜に対して低張性ショックを処置することにより、ヘモグロビン内容物を放出する。ＲＢＣ溶解装置のために特殊化された図３に示す瞬間細胞溶解装置を、この目的のために使用する。ＲＢＣ溶解に続き、ヘモグロビン分子を１００ｋＤａ膜を使用する接線流限外濾過により、他のタンパク質から単離する。濾液中のヘモグロビンを、流液カラムクロマトグラフィのために採取し、３０ｋＤａ膜によって更に１２〜１４ｇ／ｄＬまで濃縮する。カラムクロマトグラフィを行い、タンパク質不純物を除去する。

最初に、濃縮ヘモグロビン溶液を自然の酸素化条件下にてスルフヒドリル試薬（アルキル化反応）で修飾し、次いで前記成分をＤＢＳＦと反応させて、安定性α−αおよび／またはβ−β架橋四量体ヘモグロビン分子を形成する。

例２
時間および制御された低張溶解および濾過
ウシ全血を新たに採取し、冷却条件下で輸送する。細胞洗浄機およびこれに続く０．６５μｍの濾過を経て、赤血球を血漿から分離する。赤血球（RBC）濾液を０．９％塩水で洗浄した後、濾液を低張溶解により破壊する。前記低張溶解は、図３に示した瞬間細胞溶解装置を使用して行う。この細胞溶解装置は、細胞溶解を支援するための静的ミキサーを含む。ヘモグロビン濃度が制御された（１２〜１４ｇ／ｄＬ）ＲＢＣ懸濁液を４容量の精製水と混合して、ＲＢＣ細胞膜に対して低張ショックを発生させる。低張ショックの時間は、白血球および血小板の望ましくない溶解を回避するように制御される。この低張溶液は、瞬間細胞溶解装置の静的ミキサー部分を約３０秒間に亘って通過する。このショックは、溶解物が静的ミキサーを出るときに、該溶解物を１／１０容量の高張緩衝液と混合することによって３０秒後に停止される。使用される高張溶液は、０．１Ｍリン酸緩衝液、７．４％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４である。図３の瞬間細胞溶解装置は、連続運転で１時間あたり５０〜１０００Ｌの溶解物、好ましくは１時間当たり少なくとも３００Ｌの溶解物を処理することができる。

ＲＢＣ溶解の後、赤血球の溶解物を０．２２μｍのフィルタにより濾過してヘモグロビン溶液を得る。白血球からの核酸およびリン脂質不純物は、それぞれポリメラーゼ連鎖反応（検出限界＝６４ｐｇ）およびＨＰＬＣ法（検出限界＝１μｇ／ｍＬ）により、ヘモグロビン溶液中に検出されない。最初の１００ｋＤａ限外濾過が行われ、ヘモグロビンよりも高分子量を有する不純物が除去される。ヘモグロビン溶液を更に精製するために、流液カラムクロマトグラフィが続いて行われる。次いで、第二の３０ｋＤａ限外濾過が行われ、ヘモグロビンよりも低分子量を有する不純物が除去されて、濃縮される。

例３
ストローマを含まないヘモグロビン溶液におけるウイルスクリアランス研究
本発明の生成物の安全性を証明するために、（１）０．６５μｍダイアフィルトレーション工程および（２）１００ｋＤａ限外濾過工程のウイルス除去能力が、ウイルス検証研究によって示される。これは、異なるモデルウイルス（脳心筋炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、およびウシパルボウイルス）を用いたこれら２つの処理の縮小規模バージョンの慎重なスパイキングによって行われた。この研究においては、４つのタイプのウイルスが使用された（次の表２参照）。これらのウイルスは、それらの生物物理学的および構造的特徴が変化し、かつそれらは物理的および化学的な薬剤または治療に対する抵抗性において変化を示す。

ウイルス検証スキームを、以下の表３に簡単に示す。

（１）０．６５μｍダイアフィルトレーションおよび（２）１００ｋＤａ限外濾過における４種類のウイルスの対数減少結果の要約を、下記の表４に示す。全ての４種類のウイルス、ＢＶＤＶ， ＢＰＶ， ＥＭＣＶおよびＰＲＶは０．６５μｍダイアフィルトレーションおよび１００ｋＤａ限外濾過によって効率的に除去された。

例４
流液カラムクロマトグラフィ
何れのタンパク質不純物も更に除去するために、ＣＭカラム（ＧＥヘルスケア社から商業的に入手可能）を使用する。出発緩衝液は２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ８．０）であり、溶出緩衝液は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）である。出発緩衝液でＣＭカラムを平衡化した後、タンパク質試料を該カラムに装填する。未結合のタンパク質不純物を、少なくとも５カラム容量の出発緩衝液で洗浄する。溶出を８カラム容量の２５％溶出緩衝液（０〜０．５ＭのＮａＣｌ）を使用して行う。溶出プロファイルを図１２に示す；ヘモグロビン溶液は流液画分中に存在する。

流液画分の純度を、ＥＬＩＺＡにより分析する。その結果を下記の表５に示す。

ヘモグロビン溶液は、ｐＨ８のＣＭカラムクロマトグラフィからの流液の中に存在するので（溶出液中ではない）、連続的な工業的規模の操作にとっては良好なアプローチである。工業的規模の操作のために、第一の限外濾過設備を流液ＣＭカラムクロマトグラフィシステムに直接接続し、かつ流液配管を第二の限外濾過設備に接続することができる。概略工業的プロセス構成を図１３に示す。

例５
スルフヒドリル反応および架橋
（５ａ）スルフヒドリル反応
本発明において、ヘモグロビンとスルフヒドリルとの間の反応は従来の教示と対照的に酸素化環境で行われ、前記反応は窒素のような不活性雰囲気で典型的に生じる。アルキル化スルフヒドリル試薬はヘモグロビンの遊離スルフヒドリル基をアルキル化するために添加される。この態様において、ヘモグロビンとスルフヒドリル試薬とのモル比率は１：２から１：４である。この反応は、ヘモグロビンのスルフヒドリル基と反応する内皮由来弛緩因子の結合を排除できる。内皮由来弛緩因子は、ヘモグロビンの反応スルフヒドリル基の結合することを示されており、それはヘモグロビンに基づく酸素担体の発生前の注入後に観察される血圧の上昇を説明できる。スルフヒドリル反応の完了は、生成物の放出または残留スルフヒドリル試薬（２６５ｎｍでのＵＶ分光測定法による）を測定することによってモニターできる。図１４は、酸素化環境における反応と脱酸素化環境における反応との間の比較を示す。図１４は、残留スルフヒドリル試薬が経時的実験の間に酸素化環境中、３時間で横ばい状態になることを示す。これに対し、多くの未反応スルフヒドリル試薬は脱酸素化環境において残存する。酸素化環境におけるスルフヒドリル反応の収率は、反応の４時間後に高くなる（９２．７％）。

（５ｂ）：安定な四量体を形成するための架橋反応
α−αおよび／またはβ−βの架橋反応は脱酸素環境において行う。フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチル（ＤＢＳＦ）をヘモグロビン溶液に加えて、四量体内にα−α架橋および／またはβ−β架橋を含む架橋四量体ヘモグロビンを形成する。任意に、多少のα−β架橋が四量体内に含まれる。

この態様において、ヘモグロビンとＤＢＳＦとのモル比率は１：２．５から１：４．０である。ＤＢＳＦ安定化法は、ヘモグロビンの四量体形態（６５ｋＤａ）を安定化させて、腎臓を通して排泄される二量体（３２ｋＤａ）への解離を防止する。この架橋プロセスにおいて、四量体ヘモグロビンのみが形成され、ポリマーヘモグロビンは形成されない。このプロセスは、生理学的に不活性な第一鉄メトヘモグロビンを形成するためにヘモグロビンの酸化を防止するために、窒素の不活性雰囲気中において行われる。ＤＢＳＦ反応の完了は、ＨＰＬＣを使用して残留ＤＢＳＦを測定することによりモニターされる。ＤＢＳＦ反応の収率は高く、＞９９％である。

１つの態様において、架橋反応は室温（１５−２５℃）で脱酸素化環境（溶解酸素＜０．１ｍｇ／Ｌ）にて行われる。ＢＤＳＦが、ヘモグロビン溶液に添加され、架橋四量体ヘモグロビンを形成する；この架橋四量体ヘモグロビンは以下に説明されるように特徴付けられる。この特徴は１つの態様のみに基づくことに留意されたい。四量体内の架橋の種々の割合およびタイプは、使用されるＤＢＳＦの量、反応の時間および温度、並びに他のプロセス条件によって制御される。

ヘモグロビンとＤＢＳＦとのモル比率を１：５．０に変化させるとき、八量体（１３ｋＤａ）のパーセントが１８％まで敏速に増加する。

（５ｂ−１）１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる架橋ヘモグロビンの電気泳動分析
架橋ヘモグロビン溶液を等容量の試料還元緩衝液（６２ｍＭトリス−ＨＣｌ，１０％（ｖ／ｖ）グリセロール５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールおよび２．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）と混合し、９５℃で１０分間に亘って加熱した。試料混合物を、４％濃縮用ゲルと共に１５％アクリルアミドスラブゲルを用いて分離した。電気泳動を６０ｍＡの一定電流で動作させた。電気泳動後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーＲ３５０、２０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸で染色した。ブラックライトユニット（ＢＬＵ）で表されるタンパク質のバンドの強度をバイオ−ラッドクオンティティワンソフトウエア（Bio-Rad Quantity One Software）を用いて定量化した。

（５ｂ−２）１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥから励起されるタンパク質のバンドのトリプシン消化
タンパク質のバンドを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り取り、立方体（１×１ｍｍ）に切断し、１０％メタノール／１０％酢酸で脱染色した。脱染色ゲルを２５ｍＭのＮＨ₄ＣＯ₃中の１０ｍＭＤＴＴで還元し、暗所で４５分間に亘って２５ｍＭのＮＨ₄ＣＯ₃中の５５ｍＭインドアセタミドでアルカリ化し、次いで３７℃で一晩、２５ｍＭのＮＨ₄ＣＯ₃中の２０ｎｇ／μＬ修飾トリプシンでゲル内消化した。トリプシン消化後に、トリプシン消化ペプチドを５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）への拡散によって抽出した。

（５ｂ−３）トリプシン消化タンパク質バンドのマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI−TOF MS)
ゲル立方体から抽出されたトリプシン消化エプチドを、プレートは１μＬのマトリックス溶液（２ｍｇ／ｍＬＨＣＣＡ）で予備スポットされたアンカーチッププレート上にスポットし、５０％アセトニトリル／０．１ＴＦＡで飽和され、空気乾燥される。乾燥後に、試料スポットを１０ｍＭリン酸塩緩衝液で洗浄し、ＥｔＯＨ：アセトン：０．１％ ＴＦＡ（６：３：１比率）の溶液を用いて再結晶化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を８００−３５００ Ｄａのｍ／ｚ範囲の間のリフレクトロンモードで操作されるブルーカーオートフレックスIII（Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany）で行われ、パラメータを次のように設定した：ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）のためにイオン源２５ｋＶ、およびＰＭＦのためにリフレクタ２６．３ ｋＶ。外部キャルブレーションを、ブルーカーペプチドミックキャルブレーションスタンダードを用いて行った。Ｓ／Ｎ比が４を越えるピークは、フレックス分析（Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany）によって自動的に標識化される。ＭＳデータをＭＡＳＣＯＴ ２．２．０４およびバイオツール２．１ソフトウエア（Bruker Daltonic GmbH, Bremen, Germany）を介してさらに分析し、かつこれらのデータをＮＣＢＩ非冗長（ＮＣＢＩｎｒ）データベースの哺乳類プロテインに対して調査した。次のパラメータをデータベース調査のために用いた：モノアイソトピック質量精度＜２５０ｐｐｍ、親電荷＋１、稽留開裂１、固定修飾としてのシステインのカルバミドメチル化、種々の修飾としてのメチオニンの酸化。ＰＭＦに基づく６７（ｐ＝０．０５）以上のプロテインスコアでの結果は、陽性同定として考慮される。確信的な同定のための他の基準は、プロテイン一致が少なくとも１５％配列適用範囲と、少なくとも４ペプチドの一致を有するべきことである。

（ａ）１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳから分析結果を組み合わせた後、架橋ヘモグロビンの組成を決定する。結果から、架橋ヘモグロビンの７０％がβ−β架橋である。

例６
製剤後の生成物における低レベルの不活性メトヘモグロビンの維持
他の酸素担体医薬品またはＵＳ特許７４９４９７４ Ｂ２およびＵＳ特許７５０４３７７ Ｂ２に開示される方法に従って形成される生成物を比較すると、本発明による生成物は低レベルの不活性メトヘモグロビン分子を含む。この態様において、Ｎ−アセチルシステインのような抗酸化剤が架橋四量体ヘモグロビンに対して０．２％で添加される。抗酸化剤を添加しないと、不活性メトヘモグロビンが高レベル（１２−２０％）で見出される。本発明による生成物は、低レベルの不活性メトヘモグロビン（＜５％）を有し、それは治療に用いられるときにより大きい効力をもたらす高温安定性である。

本発明による生成物の安定性を証明するために、熱安定性試験を８０℃で行う。結果は図１５に図示される。ＵＳ特許７４９４９７４およびＵＳ特許７５０４３７７に従って作られる生成物は、高メトヘモグロビン含有量（２２−２８％）を示す。しかしながら、本発明の生成物は低レベルのメトヘモグロビン（＜５％）を示す。

例７
包装および生成物安定性
本発明の生成物は脱酸素条件下において安定であるので、該生成物の包装はガス透過性を最小化することが重要である。静脈適用のために、注文設計された１００ｍＬの注入バッグを、室温気圧当たり２４時間当たり１００平方インチ当たり０．００６〜０．１３２ｃｍ^３の酸素透過性を有する厚さ０．４ｍｍの５層のＥＶＡ／ＥＶＯＨ積層材料から作製した。この特別な物質はクラスＶＩプラスチック（ＵＳＰ＜８８＞に定義されている）であり、これはインビボ生物学的反応性試験および物理化学的試験に適合し、静脈注入目的の注入バッグを製造するために適している（望ましい用途に応じて、他の形態の包装も同様にこの材料から製造できることに留意されたい）。二次包装のアルミニウム上包装パウチもまた、この一次包装注入バッグに適用されて追加のバリアを提供し、光暴露および酸素拡散を最小化する。パウチの組成は：０．０１２ｍｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、０．００７ｍｍのアルミニウム（ＡＬ）、０．０１５ｍｍのナイロン（ＮＹ）および０．１ｍｍのポリエチレン（ＰＥ）からなる。上包装フィルムは０．１４ｍｍの厚さ、および室温気圧当たり２４時当たり１００平方インチ当たり０．００６ｃｍ^３の酸素透過速度を有している。該注入バッグの概略的描写が図１６に図示されている。本発明による各注入バッグについての全体の酸素透過性は、室温気圧当たり２４時間当たり０．００２５ｃｍ^３である。

安定性研究は、４０℃、７５％相対湿度で前記包装材料について行う。結果を以下の表６に示す。結果は、包装物質が長時間に亘って低レベルのメトヘモグロビンを維持することを示す。

例８
毒性研究
実験は、本発明の精製架橋四量体ヘモグロビンの潜在的毒性を評価するために行われる。１０匹の雄性Sprague-Dawleyラットを３群に、コントロール群に３匹、低用量群に３匹および高用量群に４匹を割り当てる。通常塩水（コントロール）、低用量（５．５２ｇ／ｋｇ）での精製架橋四量体ヘモグロビン、高用量（６．９０ｇ／ｋｇ）での精製架橋四量体ヘモグロビンは、各々ラットに対して頸静脈を介して３ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの注入速度で連続的な静脈内注入により投与される。薬物処理日程を以下の表７に示す。架橋四量体ヘモグロビンは３３．３時間までに亘りラットに対して注入される。動物は９日間の期間に亘り詳しく関される。

９日目に臨床病理評価のために血液試料を全ての実験動物から採取する。尿は０日目から３日目および９日目において尿検査のために採取される。最終的な剖検は９日目において行われる。評価される指標は、臨床観察、体重、体重変化、水消費、臨床病理（ケマトロジー(chematology)、臨床化学および尿検査）、臓器重量、臓器体重比、臓器体重比、全体病理および組織病理を含む。本発明の架橋四量体ヘモグロビンでの処理は致死的または不都合な臨床所見を齎すことはなく、並びに体重変化および水消費における著しい影響はない。

処理に関連する臨床化学および血液学指標において観察される明らかな変化はない。尿検査は、塩化物およびカリウムの濃度は２日目において、コントロール群よりも処理群において低いことを示す。血液染色すると、２日目から３日目において尿中により高いタンパク質濃度とより多くの赤血球がコントロール群よりも処理群において見られる。それらの観察は、全て間もなく正常に回復する。有意差、肺体重比に観察されない。研究の間、予期しない死および毒性の臨床的兆候は観察されない。加えて、全体病理および組織病理解析が、肺、心臓、肝臓、脾臓及び腎臓を含む全ての臓器において大きな異常がないことが明白にする（そのような異常は注入の毒性副作用に起因する）。

例９
心臓保存
架橋四量体ヘモグロビンはビーグル犬における心肺バイパス中の心臓保存のモデルにおいて心臓保護液として使用できる。１８頭のビーグル犬を無作為に３群に分ける；擬似、セントトーマス溶液（St. Thomas’ solution (STS)）、および０．１％の架橋四量体ヘモグロビン群。心肺バイパスは標準的な方法でベントのために上行大動脈、上および下大動脈、および左心室のカニューレ挿入により確立される。擬似群を除いて、０．１ｇ／ｄＬの架橋四量体ヘモグロビンなしでＳＴＳ（ＳＴＳ群）または０．１ｇ／ｄＬ架橋四量体ヘモグロビンと共にＳＴＳ（０．１％Ｈｂ群）を大動脈クランプ後に大動脈基部に心停止を達成するまで注入し、それを１２０分間維持する。心臓血液搏出量、肺動脈圧、肺動脈楔入圧、平均動脈圧、中心静脈圧および心拍並びに血液ガスを含む心臓機能を再灌流の間測定し、基線と比較する。また、クレアチンキナーゼＭＢ、乳酸脱水素酵素およびトロポニン−１を含む心筋酵素の放出を心障害の代理マーカーとして測定する。ヘマトキシリンおよびエオシン染色および心臓水含量検出を行い、心筋の形態学的および病理学的変化を再灌流後１２０分に測定する。

基本条件下で、心臓機能、酸素消費量および心筋酵素の放出の測定は、３群間で同じである。再灌流中では、心拍数、心臓血液搏出量および中心静脈圧は擬似群に比較してＳＴＳ群において大きく減少される。しかしながら、心拍数、心臓血液搏出量、中心静脈圧および心臓酸素消費量は０．１％Ｈｂ群において大いに保持され、これは擬似群のものと同じである。ＳＴＳ中の架橋四量体ヘモグロビンはまた、乳酸脱水素酵素、クレアチンキナーゼＭＢおよびトロポニン−１の出現をＳＴＳ群に比べて大きく減少する。更に、細胞腫脹、脂肪変化およびヒアリン変化は、ＳＴＳ群と比較して０．１％Ｈｂ群において有意に減少された。肺動脈圧、肺動脈楔入圧、平均動脈圧および心臓水含量を含む他の測定は、３群の間で有意差はない。本研究における０．１％Ｈｂ群の全ての測定は、擬似群に比較して有意差はない。心肺バイパス中のＳＴＳ中の０．１ｇ／ｄＬｇの架橋四量体ヘモグロビンは、ＳＴＳ（現在の標準的な心臓保護液）の場合よりも良好に心臓保護効果を示し、また結果は擬似群に匹敵する。

例１０
組織酸素化、正常および癌組織における研究
（１０ａ）正常組織における酸素化の改善
架橋四量体ヘモグロビンによる正常組織酸素化についての幾つかの研究が行われる（図９に示される）。比較薬物動態および薬力学研究はバッファローラットにおいて行われる。雄性同系交配バッファローラットは個々に０．２ｇ／ｋｇの架橋四量体ヘモグロビン溶液またはリンゲル酢酸緩衝液（コントロール群）を静脈注射により投与される。血漿ヘモグロビンの濃度−時間プロファイルをヘモキュー（Hemocue、登録商標）光度計により１、６、２４、４８時間に測定し、基線測定値と比較する。当該方法はヘモグロビンの光度計測定に基づき、ヘモグロビンの濃度を直接にｇ／ｄＬとして出力する。バッファローラットの後肢において酸素分圧（ｐＯ２）をＯｘｙｌａｂ（登録商標）組織酸素化および温度モニター(Oxford Optronix Limited)により直接に測定する。ラットを３０〜５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール溶液の腹腔内注射により麻酔し、続いて筋肉内に酸素センサを挿入する。全ｐＯ２読み出しは、データトラックス２データ収集システム（Datatrax2 data acquisition system (World Precision Instrument)）によりリアルタイム法で記録される。

図９において見られるように、０．２ｇ／ｋｇの架橋四量体ヘモグロビン溶液の注入は、本発明の架橋四量体ヘモグロビンの薬物動態（血漿ヘモグロビン濃度）および薬力学（筋肉組織への酸素送達）特性の間の相関を示す。重要なことには、酸素化における有意な増加が、血漿ヘモグロビン濃度と比較してより長い時間に亘り観察される。血漿ヘモグロビン濃度をグラフ（Ａ）に示し、筋肉への酸素送達をグラフ（Ｂ）に示す。

（１０ｂ）極度な低酸素腫瘍領域における酸素化の改善
極度な低酸素腫瘍領域における酸素化の改善をヒト上咽頭癌（ＣＮＥ２）異種移植モデルにより評価する。ＣＮＥ２細胞株を癌遺伝学研究室（香港大学）から入手する。約１×１０^６細胞を４〜６週齢の同系交配ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ−ｎｕ（ヌード）マウスに皮下注射する。腫瘍が８〜１０ｍｍの直径に達したときに、腫瘍塊内の酸素分圧をオキシラブ（Oxylab、登録商標）組織酸素供給温度モニター（Oxford Optronix Limited）により直接モニターする。酸素分圧を完全にコンピュータ化されたＰＴＳ３０微小位置決めシステム（Discovery Technology International）により腫瘍トラックに沿って測定する。全ｐＯ２読み出しをデータトラックス２データ収集システム（World Precision Instrument）によりリアルタイム法で記録する。ｐＯ２読み出しが安定化されるときに、１．２ｇ／ｋｇの本発明の架橋四量体ヘモグロビン溶液をマウスの尾静脈から静脈注射し、組織の酸素化を測定する。結果は、大部分の低酸素腫瘍領域において酸素化の有意な増大を証明する。１．２ｇ／ｋｇの架橋四量体ヘモグロビンの静脈注射の後、ｐＯ２の中央値は、０．２ｍｍＨｇから３．９ｍｍＨｇ（３時間）および１０．６ｍｍＨｇ（６時間）までそれぞれ上昇する（図１０に示す）。

例１１
癌治療研究（架橋四量体ヘモグロビンの化学増感効果）
本発明の架橋四量体ヘモグロビンの化学増感効果を異なる癌細胞株において評価する。白血病細胞株（ジャーカット）、大腸癌細胞株（ＣＯＬＯ２０５）、シスプラチン耐性肺癌細胞株（Ａ５４９／Ｃｉｓｐ）およびアドリアマイシン耐性乳癌細胞株（ＭＣＦ−７／ＡＤＭ）をチャイニーズ・アカデミー・オブ・メディカル・サイエンス・センター・インスティテュート（Chinese Academy of Medical Sciences Cancer Institute）から得る。８０００のジャーカット細胞、４０００のＣＯＬＯ２０５細胞、３０００のＡ５４９／Ｃｉｓｐ細胞および３０００のＭＣＦ−７／ＡＤＭ細胞を個々にトリプリケートで９６ウェルプレートに播種する。付着後、細胞を３７℃で種々の化学療法剤単独または０．５ｍｇ／ｍＬの架橋四量体ヘモグロビン溶液との併用と共にインキュベートする。ジャーカット細胞を、０．３１、０．６３、１．２５、２．５、５および１０μｇ／ｍＬの硫酸ビンクリスチンにより処理する；ＣＯＬＯ２０５細胞を０．７８、１．５６、３．１３、６．２５および１２．５μｇ／ｍＬの５−フルオロウラシルにより処理する；Ａ５４９／Ｃｉｓｐ細胞を０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５および１２．５μｇ／ｍＬのシスプラチンで処理する；およびＭＣＦ−７／ＡＤＭ細胞を０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５および１２．５μｇ／ｍＬのアドリアマイシンで処理する。処理後、癌細胞成長の阻害をＡＴＰ腫瘍化学的感受性アッセイ（ＡＴＰ−ＴＣＡ）により測定する。

食堂癌細胞株ＨＫＥＳｃ−１を癌遺伝学研究室（香港大学）から入手する。２０００の癌細胞を９６ウェルプレートに播種する。付着後、細胞を３７℃で０．０８、０．４、２、１０および５０μｇ／ｍＬのシスプラチン単独、または３ｍｇ／ｍＬの架橋四量体ヘモグロビン溶液との併用でインキュベートする。インキュベーション後、細胞毒性をＭＴＴ細胞増殖アッセイにより評価する。結果は、本発明の架橋四量体ヘモグロビンの添加は、化学療法に対して極めて抵抗性であるＡ５４９／ＣｉｓｐおよびＭＣＦ−７／ＡＤＭ細胞を含む種々の癌細胞株において化学的感受性を有意に向上することを示す（図８に示す）。

例１２
急性の重篤な出血性ショックの治療
（１２ａ）ビーグル犬における急性の重篤な出血性ショックの治療
ビーグル犬における急性重症出血性ショックのモデルにおいて本発明の架橋四量体ヘモグロビンを蘇生剤として使用する。６０頭のビーグル犬を無作為に蘇生剤に従って４群、各群１５頭に分ける。

グループ１：デキストラン（陰性コントロール）
グループ２：動物自家血液（陽性コントロール）
グループ３：低用量処理（０．３５ｇ架橋四量体ヘモグロビン／体重ｋｇ）
グループ４：中用量処理（１．０５ｇ架橋四量体ヘモグロビン／体重ｋｇ）。

急性の重篤な出血性ショックは、動物の全血の５０％を抜き取ることにより樹立する。樹立された出血性ショックの後１０分に、デキストラン（５０ｍL／ｋｇ）、動物自家血液（５０ｍL／ｋｇ）、異なる用量の架橋四量体ヘモグロビン（５ｍL／ｋｇ、１５ｍL／ｋｇ）を動物に注入する。架橋四量体ヘモグロビンの注入速度は１０ｍＬ／ｋｇ／ｈで設定し、その後、全ての実験動物を７日間に亘り観察する。研究期間に亘って、生存、体重、エレクトロカルジオグラフィ（ＥＣＧ）、血圧、心拍数、呼吸数、体温、血漿ヘモグロビン濃度、血液学、動脈血液ガス、尿検査、臨床化学、凝固、健康状態および有害イベントを含む一群のパラメータを観察および分析する。特に、生存は主要な終点である。７日間の観察の後、本発明の架橋四量体ヘモグロビン処理群は、正常群および自家血液群と比較して、非常に高い生存率を有する（下記の表８に示す）。

（１２ｂ）ラットにおける急性重篤出血性ショックの治療
本発明の架橋四量体ヘモグロビンをまた急性重篤出血性ショックのラットモデルにおいて蘇生剤として使用する。８０匹のSprague-Dawleyラットを蘇生剤に従い無作為に５群、各群１６ラットに分ける。

グループ１：乳酸リンゲル溶液（陰性コントロール）
グループ２：動物自家血液（陽性コントロール）
グループ３：低用量処理（０．１ｇ架橋四量体ヘモグロビン／体重ｋｇ）
グループ４：中用量処理（０．３ｇ架橋四量体ヘモグロビン／体重ｋｇ）
グループ５：高用量処理（０．５ｇ架橋四量体ヘモグロビン／体重ｋｇ）。

急性の重篤な出血性ショックは、動物の全血の５０％を抜き取ることにより樹立し、それは３５ｍＬ／体重ｋｇと推定される。樹立された出血性ショックの後１０分に、乳酸リンゲル溶液、動物自家血液、異なる用量の架橋四量体ヘモグロビン（０．１ｇＨｂ／ｋｇ、０．３ｇＨｂ／ｋｇ、０．５ｇＨｂ／ｋｇ）を動物に注入する。架橋四量体ヘモグロビンの注入速度は５ｍＬ／時に設定し、その後、全ての実験動物を２４時間に亘り観察する。研究期間に亘って、生存、血行動態、心筋機構、心臓血液搏出量、心臓機能、血液ガス、組織酸素送達および消費、組織灌流および酸素張力（肝臓、腎臓および脳）、肝機能および腎機能、血液レオロジー（血液粘度）、およびミトコンドリア呼吸制御速度（肝臓、腎臓および脳）を含む一群のパラメータを観察および分析する。特に、生存は主要な終点である。２４時間の観察の後、本発明の架橋四量体ヘモグロビン処理群は、正常群および自家血液群と比較して、非常に高い生存率を有する（下記の表９に示す）。

例１３：インビトロでのメトヘモグロビン形成研究
従来技術は、高分子量ポリマーヘモグロビン溶液が好ましいと述べており、それは環流中により長い残留性を生じるためである。従って、本発明の安定性架橋四量体ヘモグロビンを、インビトロにおいてシミュレート環流条件における安定性分析について高分子量ポリマーヘモグロビンと比較する。試験環流を図１７に示す。メトヘモグロビン形成バイパス回路において、Ａは試料貯蔵容器であり、Ｂは試料出口であり、Ｃはポンプであり、Ｄはリキ−セル接触器（Liqui-Cel contactor）であり、Ｅは試料収集点であり、Ｆは試料入口である。本発明の架橋四量体ヘモグロビン溶液の時間的経過メトヘモグロビン形成は、約６８％のポリマー画分を含む（≧128,000 MW）商業的に入手可能な製品（オキシグロビン（登録商標））と比較される。実験前に、全ての試料を５ｇ／ｄＬに希釈し、５０ｍＬの希釈された試料を試料入口から試料貯蔵容器に導入する。液体ポンプ速度を３０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、試料を回路に満たす。実験の間中、試料貯蔵容器を３７℃で維持する。メトヘモグロビンレベルを測定するために、０．２ｍＬの試験試料を共酸素測定法(IL-682, Instrumentation Laboratory)のための試料収集点から収集する。圧縮空気を次に、リキ−セル膜接触器を経て流速２．０ｍＬ／ｍｉｎで通過させ、試料の酸素化を開始する。０．２ｍＬの試料を３０分間隔で収集する。５時間の処理の後、本発明の架橋四量体ヘモグロビン溶液と当該商業的に入手可能な製品（オキシグロビン（登録商標））のメトヘモグロビン画分は、それぞれ８．７％および１６．４％に増加する。これは、ポリマーヘモグロビンのための不活性メトヘモグロビン形成率が本発明の架橋四量体ヘモグロビンについてのものよりも実質的に大きいことを立証する（図１８）。

上記のように種々の態様に関して本発明を説明したが、このような態様は限定的なものではない。当業者は多くの変形例および修飾を理解するであろう。このような変形および修飾は、特許請求の範囲の範囲内に含まれるものと看做される。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 高精製高温安定性酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該酸素担体を含有する医薬組成物がヘモグロビンを含み、当該方法が、
ａ）少なくとも赤血球および血漿を含む哺乳類の全血を用意すること；
ｂ）前記哺乳類の全血中の当該血漿から当該赤血球を分離すること；
ｃ）当該血漿から分離された当該赤血球を濾過して、濾過された赤血球画分を得ること；
ｄ）当該濾過された赤血球画分を洗浄して、血漿タンパク質不純物を除去し、洗浄された赤血球を得ること；
ｅ）５０〜１０００リットル／時の流量で瞬間細胞溶解装置中で、白血球を溶解することなく赤血球を溶解するために充分な時間に亘り制御された低張溶解により当該洗浄された赤血球を破壊し、破壊された赤血球の溶解物を含む溶液を作ること；
ｆ）濾過を行って当該溶解物から不用残留物の少なくとも一部分を除去すること；
ｇ）当該溶解物から第１のヘモグロビン溶液を抽出すること；
ｈ）四量体ヘモグロビンよりも高分子量を有する不純物を除去し、更に当該第１のヘモグロビン溶液からの何れのウイルスおよび残存する不用残留物を除去するように構成された限外濾過フィルタを使用して第１の限外濾過プロセスを行い、第２のヘモグロビン溶液を得ること；
ｉ）前記第２のヘモグロビン溶液において流液カラムクロマトグラフィを行い、リン脂質、タンパク質不純物および二量体ヘモグロビンを除去し、リン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液を形成すること；
ｊ）当該リン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液について、不純物を除去するように構成されたフィルタを用いて第２の限外濾過プロセスを行って、濃縮され精製されたリン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液を得ること；
ｋ）ヘモグロビン分子がシステイン部位で内皮由来弛緩因子に結合できないように、当該ヘモグロビン分子の各々がチオール保護基を含む少なくとも１つのシステイン部分を有するように、完全な酸素化環境においてスルフヒドリル試薬により、当該濃縮され精製されたリン脂質非含有低タンパク質不純物および低二量体ヘモグロビン溶液におけるヘモグロビン分子のスルフヒドリル基を阻害すること；
ｌ）得られる架橋四量体ヘモグロビンの分子量が６０〜７０ｋＤａであり、本質的に非ポリマー架橋四量体ヘモグロビンからなるようにポリマーヘモグロビンの形成を伴わずに、当該チオール保護化ヘモグロビンをフマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルによって架橋化して高温安定性架橋四量体ヘモグロビンを形成すること；
ｍ）当該架橋四量体ヘモグロビンのために適切な生理学的緩衝液を交換すること；
ｎ）何れの残留非架橋四量体ヘモグロビンおよび何れの残留化学物質を洗浄により除去すること；
ｏ）Ｎ−アセチルシステインを０．２〜０．４％の濃度で当該架橋四量体ヘモグロビンに対して添加して、メトヘモグロビンレベルを５％以下に維持すること；および
ｐ）当該低二量体、リン脂質非含有、チオール保護化、８０℃の温度まで高温安定性の、ポリマーヘモグロビンを含まない架橋四量体ヘモグロビンを薬学的に許容される担体に対して添加すること。
を含む方法。
［２］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該瞬間細胞溶解装置が静的ミキサーを含む方法。
［３］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、前記架橋四量体ヘモグロビンがウシ、ブタ、イヌまたはウマヘモグロビンに由来する方法。
［４］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該カラムクロマトグラフィが１または１以上のカチオン交換カラムおよびアニオン交換カラムを含む方法。
［５］ ［４］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該イオン交換カラムが１または１以上のＤＥＡＥカラム、ＣＭカラムおよび／またはヒドロキシアパタイトカラムである方法。
［６］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルによるヘモグロビンの架橋化が、少なくともα−αおよび／またはβ−β架橋を含む方法。
［７］ ［６］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の５０％よりも大きくなるように選択される方法。
［８］ ［６］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の６０％よりも大きくなるように選択される方法。
［９］ ［６］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の７０％よりも大きくなるように選択される方法。
［１０］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該薬学的に許容される担体が生理学的緩衝液または水である方法。
［１１］ ［１］に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、更に、当該製造された組成物を環境条件で２４時間当たり０．００２５ｃｍ^３未満の酸素透過性を有する多層の柔軟な輸血包装中に包装することを含む方法。
［１２］ ［１］に記載の方法により形成される非ポリマー性架橋四量体ヘモグロビンから本質的になるヘモグロビンを含む、高精製された高温安定性酸素担体を含有する医薬組成物。
［１３］ ［１２］に記載の組成物を用意することを含む、インビボまたはエキソビボの何れかにおいて組織を酸素化する方法。

Claims (13)

1. 高精製高温安定性酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該酸素担体を含有する医薬組成物が非ポリマー性四量体ヘモグロビンを含み、当該方法が、
   ａ）少なくとも赤血球および血漿を含む、採取された哺乳類の全血を用意すること；
   ｂ）前記哺乳類の全血中の当該血漿から当該赤血球を分離すること；
   ｃ）当該血漿から分離された当該赤血球を濾過して、濾過された赤血球画分を得ること；
   ｄ）当該濾過された赤血球画分を洗浄して、血漿タンパク質不純物を除去し、洗浄された赤血球を得ること；
   ｅ）５０〜１０００リットル／時の流量で瞬間細胞溶解装置中で、白血球を溶解することなく赤血球を溶解するために充分な時間に亘り制御された低張溶解により当該洗浄された赤血球を破壊し、破壊された赤血球の溶解物を含む溶液を作ること；
   ｆ）濾過を行って当該溶解物から不用残留物の少なくとも一部分を除去すること；
   ｇ）当該溶解物から第１のヘモグロビン溶液を抽出すること；
   ｈ）四量体ヘモグロビンよりも高分子量を有する不純物を除去し、更に当該第１のヘモグロビン溶液からの何れのウイルスおよび残存する不用残留物を除去するように構成された限外濾過フィルタを使用して第１の限外濾過プロセスを行い、第２のヘモグロビン溶液を得ること；
   ｉ）前記第２のヘモグロビン溶液において流液カラムクロマトグラフィを行い、リン脂質、タンパク質不純物および二量体ヘモグロビンを除去し、リン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液を形成すること；
   ｊ）当該リン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液について、不純物を除去するように構成されたフィルタを用いて第２の限外濾過プロセスを行って、濃縮され精製されたリン脂質非含有の低タンパク質不純物および低二量体のヘモグロビン溶液を得ること；
   ｋ）ヘモグロビン分子がシステイン部位で内皮由来弛緩因子に結合できないように、当該ヘモグロビン分子の各々がチオール保護基を含む少なくとも１つのシステイン部分を有するように、完全な酸素化環境においてスルフヒドリル試薬により、当該濃縮され精製されたリン脂質非含有低タンパク質不純物および低二量体ヘモグロビン溶液におけるヘモグロビン分子のスルフヒドリル基を阻害すること；
   ｌ）得られる架橋四量体ヘモグロビンの分子量が６０〜７０ｋＤａであり、本質的に非ポリマー架橋四量体ヘモグロビンからなるようにポリマーヘモグロビンの形成を伴わずに、当該チオール保護化ヘモグロビンをフマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルによって架橋化して高温安定性架橋四量体ヘモグロビンを形成すること；
   ｍ）当該架橋四量体ヘモグロビンのために適切な生理学的緩衝液を交換すること；
   ｎ）何れの残留非架橋四量体ヘモグロビンおよび何れの残留化学物質を洗浄により除去すること；
   ｏ）Ｎ−アセチルシステインを０．２〜０．４％の濃度で当該架橋四量体ヘモグロビンに対して添加して、メトヘモグロビンレベルを５％以下に維持すること；および
   ｐ）当該低二量体、リン脂質非含有、チオール保護化、８０℃の温度まで高温安定性の、ポリマーヘモグロビンを含まない架橋四量体ヘモグロビンを薬学的に許容される担体に対して添加すること；
   を含む方法。
2. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該瞬間細胞溶解装置が静的ミキサーを含む方法。
3. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、前記架橋四量体ヘモグロビンがウシ、ブタ、イヌまたはウマヘモグロビンに由来する方法。
4. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該カラムクロマトグラフィが１または１以上のカチオン交換カラムおよびアニオン交換カラムを含む方法。
5. 請求項４に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該イオン交換カラムが１または１以上のＤＥＡＥカラム、ＣＭカラムおよび／またはヒドロキシアパタイトカラムである方法。
6. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルによるヘモグロビンの架橋化が、少なくともα−αおよび／またはβ−β架橋を含む方法。
7. 請求項６に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の５０％よりも大きくなるように選択される方法。
8. 請求項６に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の６０％よりも大きくなるように選択される方法。
9. 請求項６に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該架橋化条件が、β−β架橋が全架橋の７０％よりも大きくなるように選択される方法。
10. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、当該薬学的に許容される担体が生理学的緩衝液または水である方法。
11. 請求項１に記載の酸素担体を含有する医薬組成物を製造する方法であって、更に、当該製造された組成物を環境条件で２４時間当たり０．００２５ｃｍ^３未満の酸素透過性を有する多層の柔軟な輸血包装中に包装することを含む方法。
12. 請求項１に記載の方法により形成された、非ポリマー性架橋四量体ヘモグロビンから本質的になるヘモグロビンを含む高精製高温安定性酸素担体を含有する医薬組成物。
13. 請求項１２に記載の組成物を用意することを含む、インビボまたはエキソビボの何れかにおいてヒトを除く哺乳類の組織を酸素化する方法。

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