CN103781489B - 用于基于血红蛋白的氧载体的口服递送 - Google Patents

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Abstract

描述了一种制备适合于口服递送的含有基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此形成的组合物。有三种示例性组合物构造，其包括(1)负载血红蛋白的纳米粒子溶液,(2)包有肠溶衣的血红蛋白胶囊和(3)包有肠溶衣的血红蛋白片剂。为了促进血红蛋白的生物利用度和生物相容性，在每种HBOC制剂中添加肠吸收促进剂。保护层确保完整血红蛋白结构在肠道中递送而不会在胃中降解。所述HBOC制剂可以用于预防或即刻治疗高山症(HAS)或用于治疗低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他缺氧病症。除了递送氧以外，来自HBOC制剂的血红蛋白的血红素基团可以向人体提供血红素铁以辅助产生更多的红细胞。

Description

用于基于血红蛋白的氧载体的口服递送
著作权声明/许可
本专利文件的一部分公开内容含有接受著作权保护的内容。著作权所有者不反对任何人对专利文件或专利公开内容如其在专利和商标局专利文件或档案中出现的那样进行原样复制，，但在除此以外的任何情况下，著作权所有人均保留著作权所有。以下声明适用于如下所述的以及在所附附图中的工艺/方法、实验和数据：著作权2010,BillionKing International Limited,保留所有权利。
技术领域
本发明涉及一种用于制备适合口服递送的包含基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此制备的组合物。可口服递送的HBOC组合物适合用于治疗多种其中需要增强组织氧合的病症。
发明背景
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至机体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从机体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其可以在离体状态下被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧体。
已在开发基于血红蛋白的氧载体(HBOC)作为利用全血制品治疗的替代方式。典型地，过去HBOC已经用作用于紧急情况下失血性休克的复苏液。然而，存在许多的并发症妨碍了HBOC的广泛使用。此类并发症包括小尺寸血红蛋白的溢出、心肌梗塞、高血压和肾毒性(Bonaventura等人,2007;Natanson等人,2008)。稳定和纯化HBOC中的血红蛋白的多种尝试已经得到了有前景的结果；然而，仍然没有FDA-批准的HBOC用于常规临床使用。
尽管大量的研究已经致力于用于静脉递送的HBOC制剂，此类静脉递送在非医院环境中是不便的或不可能的。因此，在本领域中对于可以在非医院环境中口服递送的HBOC组合物存在着需求。此类组合物可以用来治疗医药或环境条件引起的其中需要增强组织氧合的病症。
其中需要增强氧合的一种环境是在高海拔处。高山症(HAS)典型地出现在快速升高至2,500米以上的海拔时。每天数以千计的人旅行到高海拔，诸如山区，其中约20%经历HAS的症状，包括头痛、恶心、头晕和睡眠障碍。通常，症状是足够轻微的，他们可以通过限制活动并且留在同一海拔适应环境几天而缓解。不恰当地适应环境且继续登高，则该病症可能进展为高原脑水肿或高原肺水肿，高原脑水肿或高原肺水肿是威胁生命的病症，需要积极治疗(Paralikar,2010)。
高海拔处的较低氧水平通过刺激外周化学感受器而增加通气，导致过度换气。过度换气减少了肺泡二氧化碳水平，导致低二氧化碳血症和血液的碱中毒。同时，脑血流增加以确保足够的氧供。由此引起的血液pH的改变和大脑压力的增加导致上述轻微的症状。响应于缺氧环境，人体启动一系列适应机制，即，适应环境。例如，肾脏分泌过多的碳酸氢盐并保留氢离子。最后，血液和脑脊液pH以及通气率恢复。另一重要调节是缺氧刺激肾脏释放激素促红细胞生成素。骨髓中的促红细胞生成素-敏感性定向干细胞被刺激分化成红细胞(RBC)。可以生成新的RBC并在血流中循环4-5天(Barrett等人,2009)。长期适应环境导致血容量和RBC细胞群增加，因此携氧能力可以增加。血液碱中毒将氧-血红蛋白解离曲线左移。同时，伴随的RBC中的2,3-二磷酸甘油酸增加将曲线右移。结果，p50的净增加(血红蛋白和氧之间的亲和力减小)增加了组织可利用的O2(Barrett等人,2009)。
在过去已经采取了多种方式来治疗HAS。采用乙酰唑胺的治疗增加了适应环境的速率(Paralikar,2010)。乙酰唑胺——肾碳酸酐酶抑制剂——减少碳酸氢盐的重吸收从而保持氢离子的平衡。而且，乙酰唑胺抑制脑脊液的产生并减少脑脊液压力。还已经发现类固醇，特别是地塞米松，有效缓解症状(Hackett等人,1988)。然而，两种药物(乙酰唑胺和类固醇)均不以增强细胞氧递送为目标来减轻病症。另外，已有报道中草药红景天可以提高血氧水平(Xiu,2002)。然而，红景天有副作用包括易怒、烦躁不安和失眠。
关于HBOC，已经有一些尝试来建立血红蛋白的替代递送机制。一种方式配制血红蛋白-囊泡，其模拟RBC的细胞结构。血红蛋白-囊泡通过将血红蛋白包封在薄脂质双层膜内而形成。然而，此类制剂，和现有技术HBOC一样，被设计用于静脉递送。
口服药物递送对于患者是便利的，特别是在非临床环境中；然而，需要解决几个潜在的问题，特别是对于基于蛋白的药物诸如HBOC。首先，肽或蛋白可能被胃中的低pH胃介质和胰液中的蛋白酶降解和消化。其次，肽或蛋白的高分子量和亲水性妨碍了它们在肠中的吸收。因此，在本领域中需要口服递送HBOC组合物，以确保安全和有效地递送氧至有增强氧输送的需求的患者中。这样的组合物可以用于治疗具有HAS或其他低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他基于缺氧的疾病的患者。
发明内容
本发明涉及一种制备适合于口服递送的含有基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此制备的基于血红蛋白的氧载体。本发明的制剂具有用于通过氧递送预防或即刻治疗高山症(HAS)的特殊应用；然而，本发明的口服制剂可以在需要利用HBOC增强氧递送至组织的任何情况下使用，诸如用于治疗低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他缺氧疾病。
本发明的HBOC制剂使用负载血红蛋白的纳米粒子胶囊或片剂来促进血红蛋白的生物利用度和生物相容性。不同构造的保护层确保血红蛋白的完整结构，而不会在胃中降解。可以添加任选的附加的赋形剂用于定时释放或控制释放组合物或用于组合物保存和/或稳定。
在一个实施方案中，通过提供下述包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统中的至少一种将基于血红蛋白的氧载体口服递送至需要其的受试者：纳米粒子溶液、包有肠溶衣的胶囊和/或包有肠溶衣的片剂。所述递送系统被构造成使得基于血红蛋白的氧载体在肠道中释放并使得血红蛋白以基本上未降解的形式被递送至患者血流。如本文中所用，术语“基本上未降解的形式”是指至少90%的血红蛋白分子保留了相当的天然血红蛋白的结构。
附图简述
图1显示负载血红蛋白的纳米粒子的形成和结构。
图2显示包有肠溶衣的血红蛋白胶囊的结构。
图3显示包有肠溶衣的血红蛋白片剂的结构。
图4显示负载血红蛋白的纳米粒子的透射电镜图像。
图5显示包有肠溶衣的血红蛋白胶囊在(1)模拟胃液，(2)模拟肠液和还有(3)依次模拟胃液和模拟肠液中的溶出曲线。
具体实施方式
本发明针对HBOC的口服递送制剂，其经口服施用将氧递送至脉管系统。描述了三种不同类别的用于口服施用的HBOC。血红蛋白不同地负载在每种组合物中以建立HBOC的个体化的和特定的释放和吸收性质。在根据本发明的组合物中，血红蛋白蛋白质被包封在耐酸材料中以避免在施用所述组合物的受试者的胃中的酸降解并且使得能够在所述受试者的肠道中吸收。所述三种药物构造为：(1)负载血红蛋白的纳米粒子溶液,(2)包有肠溶衣的血红蛋白胶囊和(3)包有肠溶衣的血红蛋白片剂。在药物组合物中使用多种血红蛋白，包括各种分子量的纯化血红蛋白、交联血红蛋白、未聚合的四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白和缀合的血红蛋白。可以在本发明的口服药物组合物中使用的血红蛋白的实例在美国专利号7,932,356、7,989,593、8,048,856、8,084,581、8,106,011中给出，它们的公开内容通过引用合并于本文中。
在负载血红蛋白的纳米粒子溶液中,血红蛋白被包埋在由阴离子聚合物和阳离子壳聚糖链组成的聚合电解质络合物内确保血红蛋白的完整结构并且使得能够经由口服施用途径有效吸收。可以与壳聚糖络合的阴离子聚合物包括聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMAA-PMMA)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)和γ-谷氨酸(γ-PGA)。阴离子组分和阳离子组分的比例保持在产生带正电荷的纳米粒子的比率，发现该比例使得具有增强的与带负电荷的肠上皮细胞的粘膜附着(Dünnhaupt等人,2011)。
壳聚糖,一种阳离子多糖，通过碱脱乙酰作用衍生自几丁质。该多糖链由N-葡糖胺和N-乙酰葡糖胺单元构成。壳聚糖是无毒的且与软组织相容的(Iwasaki等人,2004)。更重要的是，壳聚糖具有附着于粘膜表面并且暂时地打开上皮细胞间的紧密连接的特殊性质(Artursson等人,1994),使其成为理想的肠吸收促进剂。
在水基条件下在室温下，不使用将破坏血红蛋白的完整结构的有害有机溶剂，通过聚合电解质络合作用产生负载血红蛋白的纳米粒子。纳米粒子包括三种主要组分：阴离子聚合物、壳聚糖和血红蛋白。图1图示了阳离子壳聚糖链、预混合的阴离子聚合物链和血红蛋白的络合过程，由此产生带正电荷的负载血红蛋白的纳米粒子的最终产物。将阴离子聚合物和血红蛋白的预混合溶液调整至高于血红蛋白的等电点的最终pH，引起蛋白质表面上的正电荷，因此引起与阴离子聚合物的强亲和力。形成纳米粒子的示例性方法公开在Makholf等人,2011、Sonaje等人，2010、Lin等人,2008、Brunel等人,2010中,它们的公开内容通过引用合并。
已经证明壳聚糖表现出针对大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌活性，因此对于长期储存不需要防腐剂(Sudarshan等人,1992)。然而，为了延长药物组合物的保质期，任选地向纳米粒子混合物添加维生素C或N-乙酰半胱氨酸(NAC)。维生素C或N-乙酰半胱氨酸充当抗氧化剂以防止无活性的高铁-血红蛋白的形成，高铁-血红蛋白不能递送氧。无活性的成分(赋形剂)任选地包括着色剂、风味剂、干燥剂、用于促进口服组合物的吞咽的额外包衣等。
在一个实施方案中，制备50mL0.05%w/v PMAA-PMMA共聚物水溶液并将其调整至pH7。向制备的PMAA-PMMA共聚物溶液中加入血红蛋白(200mg)，并充分混合以形成第一混合物。制备相同体积(50mL)的0.05%w/v壳聚糖(分子量:130k)水溶液，并且将其调整至pH4.5。然后在磁性搅拌下在室温下将第一混合物逐滴加入至pH经调整的壳聚糖溶液。通过在20,000rpm超离心1小时收集纳米粒子。将在超离心后包含多个纳米粒子的小球（pellet）重新悬浮在5mL去离子水中用于进一步表征。使用动态光散射和激光多普勒电泳(ZetasizerHS3000,Malvern)测量粒度和ζ电位，它们的结果在表1中给出。产生粒度为约574nm的高度带正电荷(41mV)的负载血红蛋白的纳米粒子。与通过相同程序制备的空白纳米粒子相比，将血红蛋白负载至聚合电解质络合物中增加了粒度和ζ电位两者。负载血红蛋白的纳米粒子的球形形态也显示在通过透射电镜(JEM-2011,JEOL)获得的图4中。包封率/解离率百分比(AE%)和最终产品浓度在表1中给出。通过HPLC-UV系统(Waters1525,Waters)以约410nm的波长测量并确定血红蛋白的量。使用的柱为基于二氧化硅凝胶过滤柱(BioSep-SEC-S2000SEC,300×7.8mm,Phenomenex)。流速和进样体积分别为25mL/min和30μL。AE%通过下面的方程计算：
表1
冻干是一种用于形成稳定的干蛋白质制剂的成熟技术。本发明的方法描述了在制造成包有肠溶衣的胶囊或片剂之前添加冷冻保护剂和肠吸收促进剂、通过冻干制备的血红蛋白制剂。将冷冻保护剂诸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖添加到血红蛋白溶液以保持冻干期间蛋白质的结构。肠吸收促进剂诸如聚氧乙烯-20-失水山梨醇单油酸酯、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物、环糊精、油酸、癸酸钠、辛酸钠、去氧胆酸钠和胆酸钠水合物包含在冻干制剂中。还可以包含其他用于血红蛋白的稳定剂诸如抗氧化剂。
在一个实施方案中，使用实验室冻干机(LyoBeta25,Telstar)在表3中列举的操作参数下测试6种冻干制剂(表2)。加入蔗糖作为冷冻保护剂并加入N-乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂。向血红蛋白溶液加入两种非离子表面活性剂作为稳定剂和肠吸收促进剂。聚氧乙烯-20-失水山梨醇油酸酯(通常称为聚山梨醇酯80)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物(通常称为聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，PPG)两者均是FDA批准的用于口服制剂的赋形剂。PPG是三嵌段共聚物，其PEO-PPO-PEO重量比为40%-20%-40%且分子量为8,400Da。在冻干之前和之后测量高铁-血红蛋白水平。在使用血气分析仪(IL682Co-OximeterSystem,Instrumental Laboratory)测量高铁-血红蛋白之前将冻干的样品在去离子水中重构。在冻干后高铁-血红蛋白水平没有显著的改变。含有PPG的组(制剂样品F3,F6;显示在表3中)与没有PPG的其他制剂相比具有最低的高铁-血红蛋白水平。
表2
表3
为了在体外研究冻干的血红蛋白(制剂样品F1-F3;显示在表3中)跨上皮的运输，使用在transwell装置上的Caco-2细胞单层。Caco-2细胞培养模型是人上皮结直肠腺癌细胞系的培养物，是一种用于研究人肠功能并且因此研究药物肠吸收机制的公认方法。首先，Caco-2细胞生长在T75培养瓶中。使用补充有10%胎牛血清(FBS),1%非必需氨基酸(NEAA),和抗生素(50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素)的DMEM(高葡萄糖,Gibco)作为培养基。将生长的Caco-2细胞用胰蛋白酶消化并将6×105个细胞接种在组织培养物处理的聚碳酸酯Costar Transwell6孔/板(生长面积4.7cm2,Corning Costar Corp.,NY)的每孔上。在37℃在95%空气和5%CO2的气氛中保持Caco-2单层培养物。每隔一天更换在顶端隔室和基底端隔室两室中的培养基。使用与一对筷式电极(chopstick electrode)连接的Millicell-电阻系统(Millicell-Electrical Resistance System)(Millipore Corp.)来监测跨上皮电阻(transepithelial electric resistance,TEER)，所述跨上皮电阻揭示细胞间紧密连接的紧密性。在接种后19-21天后将Caco-2单层培养物用于跨上皮运输研究。空白和细胞单层之间的TEER差应当在400ohm/cm2-500ohm/cm2的范围。在跨上皮运输研究之前用新鲜培养基培养细胞24小时。在开始试验之前，洗涤细胞单层并将其与预温的补充有NaHCO3(0.35g/L)和25mM HEPES(如果pH6.5)或10mM甲磺酸(如果pH<6)的Hank平衡盐溶液(HBSS)孵育30min。吸出HBSS并重新填充1.5ml HBSS至顶端隔室和重新填充2ml至基底端隔室。将HBOC和赋形剂负载至顶端隔室。FITC-右旋糖苷(4kDa,Sigma)可以用作阳性标志物以测试细胞单层的通透性。初始TEER值通过Millicell-ERS测量。细胞在37℃孵育并以50r.p.m.回旋振荡3小时。在1.5小时和3小时的时间点记录TEER值。在实验结束时，在基底端隔室处收集2ml HBSS并用高效液相色谱(HPLC)分析以定量穿过的HBOC。使用荧光光谱仪(EUROStar)定量FITC-右旋糖苷。实验结束时的血红蛋白吸收百分比和TEER变化在表4中给出。吸收百分比计算为相比于顶端隔室中初始负载的血红蛋白量，在研究结束时在基底端隔室中血红蛋白的量。添加聚山梨醇酯80和PPG分别引起了血红蛋白吸收的3.9倍和2.6倍增加。在样品F2中聚山梨醇酯80的存在引起了与样品F1相比更显著的TEER下降(10%)，而对于样品F3没有显著的TEER改变。
表4
在一个实施方案中，冻干的血红蛋白固体混合物包封在包有肠溶衣的胶囊中。包有肠溶衣的胶囊是市售的，并且由具有聚丙烯酸树脂包衣的明胶组成。包有肠溶衣的胶囊是耐酸的但在6–7级别的pH水平下溶解，6–7级别的pH水平是肠中存在的pH水平。图2是显示本发明的包有肠溶衣的胶囊的基本结构的示意图。在37℃在模拟胃液(pH1.2,不含胃蛋白酶)和模拟肠液(pH6.8,不含胰酶)中进行包有肠溶衣的血红蛋白胶囊的释放研究。三种包有肠溶衣的胶囊(尺寸9)各自填充以10mg冻干的血红蛋白固体混合物。每种胶囊以三种方案置于10mL释放介质中：(1)在模拟胃液中4小时;(2)在模拟肠液中4小时;(3)在模拟胃液中2小时，接着在模拟肠液中2小时。在不同采样时间释放的血红蛋白量通过在410nm的HPLC-UV测量测定。三种方案的溶出曲线显示在图5中。在模拟胃液中血红蛋白被包有肠溶衣的胶囊良好地保护，并且在方案1中没有血红蛋白被释放。仅当在方案2和3中置于模拟肠液中时血红蛋白才释放。
在一个实施方案中，进行冻干血红蛋白的体内研究以评价全身递送血红蛋白的功效。Sprague Dawley(SD)大鼠(约300g,n=3)接受包封在含有9mg粉末的包有肠溶衣的胶囊中的冻干血红蛋白的口服给药。利用饲管以0.9g/kg的剂量将胶囊给予每只大鼠。从尾静脉采集血液以使用血红蛋白分析仪(血浆/低血红蛋白系统（Plasma/Low HbSystem）)测定血浆血红蛋白浓度。在给药前并且在给药后以3小时和6小时的时间间隔测量血浆血红蛋白浓度。基线血浆血红蛋白浓度为0.17g/dL并且在6小时的研究期间递增。血浆血红蛋白浓度在3小时和6小时的时间间隔时分别为0.28g/dL和0.34g/dL，其与基线相比占63.5%和97.1%的增加。
在一个实施方案中，通过出血性贫血动物模型研究通过口服递送血红蛋白对贫血治疗的功效。在研究中使用平均体重为200–250g的雄性成年Wistar大鼠。出血性贫血模型通过30%血液静脉切开放血术来建立，其中在第1天移除15%血液，接着在第3天移除另外15%血液。在每次移除血液后，将等体积的盐水溶液输注至动物体内。在伤口闭合后施加压力以止血，并且经肌内给予抗生素。在第4天测定血红蛋白水平以确认出血性贫血模型的建立(HGB<10g/dL)。贫血大鼠随机分成两组，盐水对照组(n=6)和血红蛋白组(n=8)。冻干的血红蛋白粉末在盐水溶液中重构为0.2g/mL的浓度并且以1g/kg的剂量通过经口灌胃施用于动物。相同体积(5mL)的血红蛋白溶液或盐水溶液每天两次经口施用于动物，即，早晨和晚上，间隔8小时。在给药后第7天和第14天测量血液参数和体重，包括血红蛋白含量(HGB,在表5中)、血细胞比容(HCT,在表6中)、红细胞计数(RBC,在表7中)、平均红细胞体积(MCV,在表8中)和体重(BW,在表9中)。所有数据表示为均值±标准差。使用T-TEST进行统计学分析。p<0.05的值被认为显著。发现在给药后第7天，与血液移除前的基线值相比HCT、RBC、MCV和BW显著增加。还观察到与盐水对照组相比，血红蛋白含量(HGB)、血细胞比容(HCT)、红细胞计数(RBC)和平均红细胞体积(MCV)显著改善并且维持了体重(BW)，而没有不良反应。
表5:血红蛋白水平的变化(HGB,g/L)
++p<0.01,与血液移除前的基线值相比较
**p<0.01,与盐水组值相比较
表6:血细胞比容的变化(%,HCT)
+p<0.05,++p<0.01,与血液移除前的基线值相比较
**P<0.01,与盐水组相比较
表7:红细胞计数的变化(1×1012/L,RBC)
++P<0.01,与血液移除前的基线值相比较
*P<0.05,与盐水组相比较
表8:平均红细胞体积的变化(fL,MCV)
++P<0.01,与血液移除前的基线值相比较
*P<0.05,与盐水组相比较
表9:大鼠体重的变化（g,BW）
++P<0.01,与基线值相比较
*P<0.05,**P<0.01与盐水组相比较
在另一个实施方案中，将冻干的血红蛋白固体混合物压制成片芯片剂（coretablet），然后包衣肠溶膜。本文所述的片芯片剂使用作为活性成分的冻干的血红蛋白混合物，以及其他形成片剂的赋形剂诸如乳糖一水合物、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、微晶纤维素、无水二碱式磷酸钙。任选的赋形剂诸如乙基纤维素、纤维素酯、聚(甲基丙烯酸酯)可以添加至冻干的血红蛋白固体混合物以实现血红蛋白的持续释放，并且因此实现氧至组织的持续递送。将充分混合的粉末负载至压片机、单冲压片机、或旋转式压片机以形成片芯片剂，然后由肠溶包衣材料对所述片芯片剂进行膜包衣，所述肠溶包衣材料包括聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和醋酸邻苯二甲酸纤维素。图3是显示本发明的肠溶包衣的片剂的基本结构的示意图。与肽或蛋白质的静脉递送相比，口服递送在药代动力学方面具有优势，因为口服递送系统使得能够实现肽或蛋白至从载体的控制释放。肽或蛋白质药物的递送的这种控制释放模式在直接静脉递送中是无法获得的。对于被引入至脉管系统中的血红蛋白，控制释放和血液中血红蛋白浓度的持续升高与来自直接注射的在注射部位的游离血红蛋白的突然大量增加相比具有更大的生理学益处。血红蛋白水平的快速增加提高了发生副作用的机会，所述副作用诸如外渗、心肌梗塞和肾毒性。
HBOC中的血红蛋白的血红素基团由保持在杂环中的铁(Fe)离子(带电荷的原子)组成。除了通过HBOC将氧递送至人体以外，血红素基团可以向身体提供血红素铁以辅助产生更多的红细胞。乙酰唑胺、类固醇和红景天不能向身体提供血红素铁。
HBOC的口服递送是预防或治疗HAS的无创的、便利的和有效的方式，并且因此，其对于人们在从海平面区域旅行至高海拔区域之前或期间服用是有利的。未降解的血红蛋白在肠道中的吸收，略过了血红蛋白的从头合成，提高了血液的携氧能力，因此提高了适应环境的速度。口服可递送的HBOC也可以用来治疗由于失血引起的急性贫血或使得个体为在正常或低氧供给大气中需要体力的活动作好准备，例如用于运动员、宇航员、潜水员、或驻扎在潜艇中的海军人员。用HBOC改善组织氧合还可以进一步用于预防/治疗组织缺血，并且促进伤口愈合，诸如糖尿病性足溃疡。尽管已经就多个实施方案描述了前述发明，但这些实施方案并非限制性的。本领域普通技术人员将理解大量的变化形式和改型。这样的变化形式和改型被认为包括在下列权利要求的范围内。
下面的参考文献涉及本发明的各个方面并且通过引用合并于本文中：
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Claims (22)

1.一种包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统，所述递送系统选自：
(a)纳米粒子溶液；
(b)包有肠溶衣的胶囊；和/或
(c)包有肠溶衣的片剂,
其中所述递送系统被构造成在肠道中释放所述基于血红蛋白的氧载体使得所述血红蛋白以基本上未降解的形式被递送到受试者的血流，其中基本上未降解的形式是指至少90％的血红蛋白分子保留了相当的天然血红蛋白的结构；
其中所述纳米粒子包含阴离子聚合物；壳聚糖、几丁质或壳聚糖寡糖；和血红蛋白，其中所述阴离子聚合物为聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物；
其中所述胶囊或者所述片剂中包含的基于血红蛋白的氧载体呈所述纳米粒子形式。
2.根据权利要求1所述的递送系统，其中所述基于血红蛋白的氧载体包括纯化血红蛋白、交联血红蛋白、未聚合的四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白、或缀合的血红蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的递送系统，其中所述递送系统包含纳米粒子溶液并且所述纳米粒子溶液包含带正电荷的纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的递送系统，其中所述纳米粒子溶液还包含壳聚糖和/或阴离子聚合物。
5.根据权利要求3所述的递送系统，其中所述纳米粒子溶液还包含壳聚糖和/或阴离子聚合物。
6.根据权利要求1所述的递送系统，其中所述递送系统是包有肠溶衣的胶囊并且所述包有肠溶衣的胶囊包括聚丙烯酸树脂包衣的明胶胶囊，所述明胶胶囊由冻干形式的所述基于血红蛋白的氧载体和一种或者多种的稳定剂、冷冻保护剂、或肠吸收促进剂填充。
7.根据权利要求6所述的递送系统，其中所述肠吸收促进剂选自聚氧乙烯-20-失水山梨醇单油酸酯、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物、环糊精、油酸、癸酸钠、辛酸钠、去氧胆酸钠或胆酸钠。
8.根据权利要求1所述的递送系统，其中所述递送系统是包有肠溶衣的片剂并且所述包有肠溶衣的片剂包含冻干形式的所述基于血红蛋白的氧载体以及一种或多种的稳定剂、冷冻保护剂、肠吸收促进剂、或形成片剂的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的递送系统，其中所述包有肠溶衣的片剂还包含选自聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或邻苯二甲酸醋酸纤维素中的一种或多种的包衣材料。
10.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的纳米粒子溶液。
11.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的包有肠溶衣的胶囊。
12.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的包有肠溶衣的片剂。
13.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的纳米粒子溶液、包有肠溶衣的胶囊或包有肠溶衣的片剂中的两种或多种。
14.根据权利要求1-13任一项所述的包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统在制备用于预防和/或治疗高山症(HAS)和/或低氧病症的药物中的用途，其中所述递送系统被构造成以控制释放的方式将基于血红蛋白的氧载体沿所述受试者的肠道递送至靶部位，其中所述沿肠道递送至靶部位是pH-依赖性的。
15.根据权利要求1-13任一项所述的包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统在制备用于预防和/或治疗贫血和/或低氧病症的药物中的用途，其中所述递送系统被构造成以控制释放的方式将基于血红蛋白的氧载体沿所述受试者的肠道递送至靶部位，其中所述沿肠道递送至靶部位是pH-依赖性的。
16.一种制备基于血红蛋白的氧载体制剂的方法，包括：
a)在水基条件下在室温下通过聚合电解质络合作用将至少一个血红蛋白分子包埋在聚合电解质络合物中，以形成带正电荷的负载血红蛋白的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含阴离子聚合物；壳聚糖、几丁质或壳聚糖寡糖；和血红蛋白，其中所述阴离子聚合物为聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物；或
b)冻干含血红蛋白的溶液，然后将所述冻干的血红蛋白分子包封在包有肠溶衣的胶囊或包有肠溶衣的片剂中。
17.权利要求16所述的方法，其中含有阴离子聚合物和血红蛋白的溶液被预混合并且调节至高于血红蛋白的等电点的pH以便在所述血红蛋白的蛋白质表面上引起正电荷并使得在所述包埋或所述包封之前形成与所述阴离子聚合物的强亲和力。
18.权利要求17所述的方法，其中在调节pH之后向所述溶液中加入维生素C或N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为稳定剂。
19.权利要求16所述的方法，其中在所述冻干之前向所述含血红蛋白的溶液中加入冷冻保护剂和肠吸收促进剂。
20.权利要求19所述的方法，其中所述冷冻保护剂是葡萄糖、蔗糖或海藻糖中的一种或多种。
21.权利要求19所述的方法，其中所述肠吸收促进剂是聚氧乙烯-20-失水山梨醇单油酸酯、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物、环糊精、油酸、癸酸钠、辛酸钠、去氧胆酸钠或胆酸钠中的一种或多种。
22.权利要求16所述的方法，其中所述包有肠溶衣的片剂还包含形成片剂的赋形剂。
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