TWI610685B - 用於癌症標靶治療及診斷成像之包含經修飾的基於血紅素之治療劑的醫藥組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於治療癌症的含有基於血紅素之治療劑之醫藥組成物。該血紅素部分可標靶癌細胞且該治療部分(亦即活性劑/治療藥物)可有效殺死該等癌細胞。本發明中使用之該基於血紅素之治療劑可用於治療各種癌症，諸如胰臟癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌及腦癌。可單獨或與諸如化學治療劑之其他治療劑組合使用該組成物以給出關於癌症治療、抑制癌轉移及/或減少復發之協同效應。本發明主張之基於血紅素之5FU-兩染料共軛物及/或基於血紅素之5FU-一染料共軛物亦可用於活細胞成像及診斷成像。
Description
本發明描述已經化學修飾以產生具有標靶癌細胞之能力之材料的基於血紅素之治療劑。本發明另外描述一種用於化學工程以產生基於血紅素之治療劑的設計。本發明另外係關於含有基於血紅素之治療劑之醫藥組成物，其用於人類及其他動物之癌症標靶治療，特定言之，用於肝癌、乳癌、胰臟癌及由各別前驅細胞誘發或與其相關之腫瘤。此外，本發明提供一種用於活細胞成像及診斷成像之螢光標記修飾之血紅素。
化學治療為使用抗癌藥物治療癌細胞。已使用化學治療多年且其為對於癌症之最常見治療中之一者。在大多數情況下，化學治療藉由干擾癌症細胞生長或再生之能力而起作用。不同群組之藥物以不同方式起作用以對抗癌細胞。化學治療可就一些類型之癌症而言單獨使用或與其他治療，如輻射(或放射治療)或手術組合。通常，化學治療藥物之組合用於對抗特異性癌症。存在超過50種常用之化學治療藥物。
儘管化學治療可在治療某些癌症中相當有效，但化學治療藥物到達身體之所有部分，而非僅到達癌細胞。因此，在治療期間可能存在許多副作用。因此，需要具有一種降低化學治療藥物之劑量以減輕副作用
且維持其於癌症治療期間之療效的方法。就降低劑量而言，其可有益於患者(較少副作用)及化學治療藥物之製造商(較低生產成本)。
常用放射冶療劑包括銠-105錯合物、釤-153錯合物及其他相關錯合物；此等藥劑亦對於癌症患者具有大量副作用。
低氧症在癌症中具普遍性。低氧症及貧血(其促進腫瘤缺氧)可藉由剝奪腫瘤細胞的對於此等藥劑之細胞毒活性而言必需的氧氣而導致電離輻射及化學治療耐藥性。經由包括蛋白質組及基因組變化之一或多種間接機制，低氧症亦可能降低對於放射治療及化學治療之腫瘤敏感度。
因此，在此項技術中需要改良之癌症治療，其標靶癌細胞及組織，同時減小癌症治療對非癌變細胞及組織之影響。
在本發明中，提供一種標靶癌細胞以藉由治療藥物(例如化學治療劑、放射治療劑)有效殺死癌細胞之基於血紅素之治療劑。常用化學治療及放射冶療劑廣泛用於不同患者，然而，發現許多副作用。可藉由化學修飾血紅素且將其連接至一或多種治療藥物而克服此等問題。當與用於癌症之熟知治療藥物(例如化學治療藥物，包括5-氟尿嘧啶、替莫唑胺(Temozolomide)、順鉑)相比時，本發明之基於血紅素之治療劑不僅可標靶癌細胞，且亦在腫瘤治療中有效得多。此外，由於可以低劑量使用基於癌症標靶血紅素之治療劑，來自治療藥物之不利副作用得以極大地減小。
大部分治療藥物極昂貴。若治療劑量降低，則各患者之治療成本可顯著減低。基於血紅素之治療劑為降低治療劑量之良好方法，因為經修飾之血紅素可標靶癌細胞。
本發明主張的基於血紅素之治療劑亦可連接於螢光探針以促進活細胞成像及診斷成像。亦即與螢光素共軛之基於血紅素之治療劑可吸收至肝癌細胞及乳癌細胞中。藉由緊接著在如下文中所描述之一系列活
細胞吸收研究中將新鮮螢光素共軛之基於血紅素之治療劑用於細胞來驗證細胞對於該等治療劑之吸收。觀測到螢光素共軛之基於血紅素之治療劑在曝露15min之後吸收至肝癌細胞(例如HepG2細胞系)及乳癌細胞中且信號在曝露1小時之後出現峰值。
一或多個螢光素分子(例如7個螢光素分子)可連接於穩定血紅素分子以增強用於活細胞成像及診斷成像之信號。本發明亦比較與螢光探針共軛及不與其共軛之基於血紅素之治療劑標靶癌細胞以治療癌症。在本發明之比較研究中，當與單獨的治療藥物相比時，基於血紅素之治療劑之劑量可降低。結果支持本發明主張的基於血紅素之治療劑可極大地減輕來源於治療藥物之副作用。
因此，本發明之第一態樣為經化學修飾之血紅素與一或多個官能基之構築體，該等官能基可用作治療藥物之鍵以標靶癌細胞。本發明之第二態樣為藉助於可分裂或不可分裂之鍵或連接基團將經修飾之血紅素或穩定血紅素化學連接至治療藥物(活性劑)以殺死癌細胞。可連接於本發明之血紅素分子之治療藥物或活性劑包括(但不限於)化學治療藥物，例如5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑或放射冶療藥物，例如銠-105錯合物、釤-153錯合物及其他相關錯合物，或經證明對於治療或緩解癌症有效及能夠經由穩定血紅素分子之該連接基團或藉由經化學修飾之血紅素分子易於連接於本發明之血紅素分子之任何其他治療藥物或化合物。除連接於治療藥物之外，本發明之穩定或經修飾之血紅素分子亦可連接於細胞或螢光標記劑，其包括(但不限於)螢光蛋白、非蛋白有機螢光團、螢光奈米粒子及基於金屬之發光染料。
本發明另外係關於用於人類及其他動物之標靶癌症治療的含有基於血紅素之治療劑之醫藥組成物。該組成物包括治療有效量之該治療劑及醫藥學上可接受之載劑、鹽、緩衝液、水或其組合以治療癌症。本
發明之第三態樣為提供一種使用含有基於血紅素之治療劑之本發明之醫藥組成物以藉由向罹患各種腫瘤及癌症之有需要之個體投予該組成物以治療癌症之方法。可藉由各種途徑，包括(但不限於)靜脈內注射、腹膜內注射及皮下注射向個體投予該組成物。基於血紅素之治療劑之可分裂及不可分裂形式均含有活性劑，諸如化學治療劑(例如5-氟尿嘧啶，5FU)，當在試管內及活體內癌症模型，包括肝癌(肝細胞癌)、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、白血病、神經膠母細胞瘤及乳癌(三陰性乳癌)及胰臟癌中測試時，其均展現療效。
本發明之基於血紅素之治療劑亦經化學修飾以促進治療劑對於癌細胞之標靶以使其更有效地殺死癌細胞。血紅素(Hb)可經化學修飾且連接於不同治療劑(例如5FU、替莫唑胺、順鉑等)。來自不同來源之血紅素為標靶癌細胞之蛋白質。此標靶特性有助於有效地殺死癌細胞、癌症幹細胞及/或癌症前驅細胞。因此，可降低治療劑之劑量。
本發明中使用之基於血紅素之治療劑可用於治療各種癌症，諸如胰臟癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。本發明係關於基於血紅素之治療劑、治療癌症之方法及治療及/或抑制癌組織之癌轉移及癌組織之復發之方法，該癌組織包括(但不限於)肝癌(其可例示於肝癌前驅細胞誘發之腫瘤異種移植模型中)、乳癌，尤其為三陰性乳癌(其可例示於三陰性前驅細胞誘發之腫瘤異種移植模型中)。腫瘤內之細胞在本質上為異質的。一般認為其由以下組成：(1)大多數具有有限分裂能力之癌細胞，及(2)少量癌症幹細胞樣細胞(CSC)，亦稱為前驅細胞，其可形成新腫瘤細胞且在本質上為高度轉移性的。由於CSC之化療耐藥性及轉移性之固有特性，已假設其造成癌症患者之復發。如本發明之具體實例中之一者中所述之腫瘤前驅細胞誘發之小鼠模型為腫瘤癌轉移及復發之最佳代表性模型。
由於血紅素部分可引入氧氣以殺死癌症幹細胞，同時治療劑部分可殺死癌細胞，本發明之基於血紅素之治療劑欲在癌症治療中給出協同效應。
圖1顯示用於構築基於血紅素之治療劑之設計方法。一或多種治療藥物可連接於經修飾血紅素以形成基於血紅素之治療劑。經修飾血紅素或穩定血紅素可藉助於可分裂(1A)或不可分裂鍵(1B)化學連接於治療劑。
圖2顯示來自不同物種之血紅素之胺基酸序列。
圖3A顯示藉由(1)酸酐、(2)乙烯酮及(3)NHS酯之化學修飾血紅素。
圖3B顯示藉由(1)甲醇胺、(2)碳酸酯、(3)縮醛胺、(4)脲、(5)醯胺(2-碳鏈)、(6)醯胺(1-碳鏈)、(7)具有烷基鏈之二硫化物、(8)具有甲醇胺之二硫化物及(9)二硫化物之化學修飾血紅素。
圖4顯示(A)Hb-5FU-烷基(不可分裂)共軛物及(B)Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)共軛物之合成流程。
圖5顯示(A)穩定血紅素、(B)基於經修飾血紅素之5FU(不可分裂共軛物)或Hb-5FU-烷基(不可分裂)共軛物及(C)基於經修飾血紅素之5FU(可分裂共軛物)或Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)共軛物之LC-MS結果。
圖6顯示在HPLC研究中自(A)5FU-甲醇胺(可分裂)模型及5FU-烷基(不可分裂)模型及(B)基於血紅素之5FU共軛物(Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)共軛物)之5FU釋放。
圖7顯示基於血紅素之5FU在胰臟癌Capan-1動物模型中之療效(腫瘤尺寸)。
圖8顯示基於血紅素之5FU在胰臟癌Capan-1動物模型中之療效(腫瘤重量)。
圖9顯示攜帶Capan-1異種移植物之動物模型(小鼠)在藥物治療之後的重量增加。
圖10顯示基於血紅素之5FU在肝癌SMMC7221動物模型中之療效(腫瘤尺寸)。
圖11顯示基於血紅素之5FU在肝癌SMMC7221動物模型中之療效(腫瘤重量)。
圖12顯示基於血紅素之5FU在CD133+肝癌前驅細胞/癌症幹細胞樣細胞HepG2動物模型中之療效(腫瘤尺寸)。
圖13顯示基於血紅素之5FU在CD44+CD24-乳癌前驅細胞/癌症幹細胞樣細胞MCF7動物模型中之療效(腫瘤尺寸)。
圖14顯示基於血紅素之5FU在試管內HCT116結腸癌中之療效(細胞毒性)。
圖15顯示基於血紅素之5FU在試管內HCT460非小細胞肺癌中之療效(細胞毒性)。
圖16顯示基於血紅素之5FU在試管內HL60急性白血病中之療效(細胞毒性)。
圖17顯示基於血紅素之5FU在試管內A172腦癌中之療效(細胞毒性)。
圖18顯示基於血紅素之5FU在試管內乳癌中之療效(細胞毒性)。
圖19顯示基於血紅素之5FU在試管內乳癌中之療效(細胞毒性)。
圖20顯示替莫唑胺(TMZ)及與TMZ連接之經修飾血紅素
之結構。
圖21顯示基於血紅素之TMZ之LC-MS結果。
圖22說明螢光素之一或多種分子可連接於血紅素之一個分子。
圖23說明(A)螢光標記之經修飾血紅素，(B)藉由一種螢光染料標記之Hb-5FU-烷基(不可分裂)-FL共軛物，(C)藉由兩種螢光染料標記之Hb-5Fu-Dan-TAM共軛物可成功地進入至肝癌細胞中。箭頭表明在使用顯微鏡之不同濾光片之顯微鏡下自細胞偵測螢光信號(經單或雙螢光標記)處。
圖24顯示在不同pH(pH 8.0、8.3、8.5、8.8及9)下之螢光素6-羧基琥珀醯亞胺酯(F-6-NHS)修飾之血紅素之各單元之轉化率。
圖25顯示在pH 8.5下於F-6-NHS(3、5、7及9當量)與血紅素之不同比下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。
圖26顯示在pH 8.5下於不同緩衝劑(乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽)中之7當量F-6-NHS比經修飾血紅素情況下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。
圖27顯示在不同條件下之乙烯酮修飾之血紅素之轉化率。
圖28顯示在不同條件下之酸酐修飾之血紅素之轉化率。
圖29顯示藉由ESI-MS方法的具有可分裂二硫化物連接基團之5FU修飾之血紅素共軛物(5FU-烷基-二硫化物(可分裂)NHS酯)之(A)示意性流程及(B)表徵。
圖30顯示藉由ESI-MS方法的具有烷基不可分裂連接基團之螢光標記之5FU修飾之血紅素共軛物(Hb-5FU-烷基(不可分裂)EL共軛物)之(A)示意性流程及(B)表徵。
圖31顯示藉由ESI-MS方法的具有甲醇胺可分裂連接基團之
螢光標記之5FU修飾之血紅素共軛物(Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)FL共軛物)之(A)示意性流程及(B)表徵。
圖32顯示具有兩種螢光染料標記之5FU修飾之血紅素共軛物(Hb-5FU-Dan-TAM)之(A)示意性流程及(B)表徵。
定義
術語「癌症幹細胞(cancer stem cell)」係指在贅生性純系內生物學上相異的細胞，其能夠活體內起始及維持腫瘤生長(亦即癌症起始細胞)。
術語「可分裂共軛物」係指具有至少一個可分裂連接基團之共軛物且其可藉由水解或氧化還原反應易於釋放連接之治療藥物/活性劑。
術語「不可分裂共軛物」係指具有至少一個不可分裂連接基團之共軛物且其無法藉由水解或氧化還原反應易於釋放連接之治療藥物/活性劑。
如在先前技術中所述，大部分癌性組織，諸如癌性腫瘤為低氧的。血紅素可用於減輕低氧症。血紅素在大部分脊椎動物中對於血管系統與組織之間的氣體交換起重要作用。其負責將氧氣經由血液循環自呼吸系統攜帶至身體細胞，且亦將代謝廢物二氧化碳攜帶離身體細胞至呼吸系統，其中呼出二氧化碳。天然存在之血紅素為四聚體，當其存在於紅血球內時大體上穩定。然而，當天然存在之血紅素自紅血球移除時，其在血漿中變得不穩定且分裂為兩個α-β二聚體。此等二聚體中之每一者之分子量為大約32kDa。此等二聚體當經由腎過濾且排泄時可能引起實質性腎損傷。該四聚體鍵之分解亦不利地影響功能性血紅素在循環中的持續性。
在本發明之一個具體實例中，藉由交聯劑使血紅素穩定以形成穩定四聚體。穩定血紅素具有氧氣傳輸特徵且其可於人類或動物體內標
靶癌細胞或組織。基於血紅素之氧氣載體經化學修飾且連接於化學治療劑，觸發受體介導之機制且導致合併之化學治療劑共同定位於癌細胞之細胞質中以增加基於血紅素之氧氣載體及化學治療劑二者之療效。
一種構築基於血紅素之治療藥物之設計顯示於圖1A及圖
1B中。一或多種活性劑(或「治療藥物」，在本文中可互換使用)連接於經修飾或穩定血紅素以形成本發明主張之基於血紅素之治療劑。可取決於待標靶之癌症組織類型及所得化學修飾產物之所需分子尺寸選擇一或多種特定活性劑。此外，選擇之活性劑可在一種以上活性劑的情況下相同或不同。
亦即活性劑等，只要所得分子保持療效且亦能夠與穩定血紅素連接以標靶癌細胞。經修飾血紅素或穩定血紅素可藉助於可分裂(圖1A)或不可分裂鍵(圖1B)化學連接於治療藥物/活性劑。可在本發明中製備用於化學修飾血紅素之不同構築體且穩定血紅素可連接於治療藥物/活性劑。
一些治療藥物(例如化學治療藥物，5FU)由於高毒性而無
法以高劑量進行使用。在本發明中，化學治療劑5FU化學連接於穩定血紅素(約65kDa)。血紅素之來源可為(但不限於)牛、人類、犬、豬、馬、及重組血紅素及/或次單位。圖2顯示分別有牛、人類、犬、豬及馬血紅素標記之B、H、C、P及E之胺基酸序列對準(SEQ ID NO.1-5分別相對於牛、人類、犬、豬及馬之α血紅素鏈；SEQ ID NO.6-10分別相對於牛、人類、犬、豬及馬之β血紅素鏈)。來自各種來源之不同胺基酸為加陰影的。圖2表明當比較胺基酸序列時，人類血紅素與牛、犬、豬及馬血紅素相似性高。
可在連接至治療藥物之前藉由不同官能基對血紅素進行化
學修飾。血紅素可藉由以下進行修飾(1)酸酐，(2)乙烯酮，(3)NHS酯，(4)異硫氰酸酯，(5)異氰酸酯，(6)活化酯(例如氟苯基酯及羰基疊氮化物)，(7)磺醯氯，(8)羰基，繼之以還原胺化，(9)環氧化物，(10)碳酸酯，(11)氟苯，(12)亞胺基酯，(13)羥基甲基膦衍生物，(14)順丁烯
二醯亞胺，(15)烷基鹵化物或鹵乙醯胺，(16)二硫化物，(17)硫代硫酸酯，(18)含有氮
之試劑，(19)丙烯醯基衍生物，(20)芳化劑，(21)乙烯基碸衍生物，(22)自然化學連接(例如硫酯)，(23)N端絲胺酸或蘇胺酸之過碘酸鹽氧化以產生醛以與羥胺、肼或醯肼偶合，(24)碳二醯亞胺，(25)4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯酚，(26)羰基二咪唑，(27)磺酸基-NHS，(28)重氮烷及重氮乙醯基化合物，(29)曼尼期縮合(Mannich condensation)，(30)重氮衍生物，(31)二氮吮衍生物，(32)二苯甲酮及蒽醌，(33)藉由基於吡哆醛-5-磷酸酯之仿生轉胺基作用之N端修飾，(34)在後續生物正交共軛反應(例如炔烴及疊氮化物之偶極加成胡伊斯根1,3-偶極加成(Huisgen 1,3-dipolar addition)，疊氮化物及三芳基膦之施陶丁格連接(Staudinger ligation)，烯烴及四
之狄耳士-阿德爾反應(Diels-Alder reaction)，烯烴及四唑之光化反應)下併入生物正交官能基(例如炔烴及疊氮化物)，(35)金屬類碳烯，(36)鈀活化烯丙基試劑，(37)光親和性標記劑。圖3A顯示藉由(1)酸酐、(2)乙烯酮及(3)NHS酯之化學修飾血紅素。圖3B顯示藉由(1)甲醇胺、(2)碳酸酯、(3)縮醛胺、(4)脲、(5)醯胺(2-碳鏈)、(6)醯胺(1-碳鏈)、(7)具有烷基鏈之二硫化物、(8)具有甲醇胺之二硫化物及(9)二硫化物之化學修飾血紅素。另一方面，穩定血紅素可藉助於可分裂或不可分裂連接基團直接連接於治療藥物及/或螢光劑。
在圖4A中顯示使用不可分裂連接基團(不可分裂共軛物)
與5FU連接之修飾血紅素(Hb-FU)且在圖4B中顯示使用可分裂連接基團(可分裂共軛物)與5FU連接之修飾血紅素(Hb-FU)。已成功展示經修飾血紅素連接於5FU(如LC-MS實驗中所示)。5FU及Hb-FU之質量分別為130Da及約65kDa。可在生理條件下分裂之可分裂連接基團(例如甲醇胺、二硫化物、脲、縮醛胺、碳酸酯、酯、胺基甲酸酯、磷酸酯、醯胺、縮醛、亞胺、肟、醚及磺醯胺基團)可插入血紅素部分與治療部分之間。不可分
裂連接基團包含烷基且芳基連接基團亦可插入血紅素部分與治療部分之間，其不易於藉由水解及/或氧化還原反應分裂。圖5顯示(A)穩定血紅素及(B)基於經修飾血紅素之5FU(不可分裂共軛物)及(C)基於經修飾血紅素之5FU(可分裂共軛物)之LC-MS結果。本發明之醫藥組成物含有本發明主張之基於血紅素之治療劑以標靶癌細胞以及在癌症治療中發揮治療作用。
分別在圖6A及圖6B中顯示來自(A)5FU-甲醇胺(可分裂)
模型及5FU-烷基(不可分裂)模型及(B)具有可分裂連接基團之基於血紅素之5FU(Hb-5FU甲醇胺共軛物)之5FU之釋放。在50mM磷酸鹽緩衝液生理鹽水(pH 7.4)及50%人類血漿中進行來自(圖6A)5FU-甲醇胺(可分裂)模型及5FU-烷基(不可分裂)模型之5FU釋放。100μL樣品(10μmol/mL DMSO)置放於含有900μL 50mM磷酸鹽緩衝液生理鹽水(pH 7.4)或50%人類血漿之1.5mL艾本德試管中且置放於室溫(25℃)或37℃下。在各時間點抽取100μL等分試樣以用於HPLC分析。自樣品於50%人類血漿中之溶液抽取等分試樣且隨後用相同體積之THF中止且經渦旋1min。在3200r.p.m下離心2min之後，吸取上清液之等分試樣且藉由HPLC進行分析。在下DB緩衝液(pH 7.4)及50%人類血漿中進行自(圖6B)具有可分裂連接基團之基於血紅素之5FU(Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)共軛物)之5FU釋放且藉由HPLC進行分析。
在以下條件下觀測5FU-甲醇胺(可分裂)模型之分解(以
降序排列)：37℃下之50%人類血漿>37℃下之PBS(pH 7.4)>室溫(室溫，25℃)下之PBS(pH 7.4)。5FU-烷基(不可分裂)模型在此等條件中之任一者下穩定。
在以下條件(以降序排列)下觀測到具有可分裂連接基團之基於血紅素之5FU(Hb-5FU甲醇胺(可分裂)共軛物)之分解：37℃下之
50%人類血漿>37℃下之DB緩衝液(pH 7.4)。
本發明之醫藥組成物含有基於血紅素之治療劑，其標靶癌細
胞且對於癌症治療發揮治療作用。吾人之動物研究展示抑制胰臟癌異種移植(Capan-1)中之基於血紅素之5FU處理之小鼠之腫瘤生長在腫瘤體積方面為20-22%(圖7)，且在腫瘤重量方面為130%(圖8)。在28天治療時段之後不可觀測到顯著體重減輕(圖9)，表明基於血紅素之5FU不為細胞毒性的。在抑制肝癌異種移植(SMMC7221)中之基於血紅素之5FU處理之小鼠之腫瘤生長在腫瘤體積方面為38%(圖10)，且在腫瘤重量方面為33%(圖11)中可觀測到類似趨勢。吾人之動物研究展示在移植肝癌CD133+幹細胞樣細胞或乳癌CD44+/CD24幹細胞樣細胞之基於血紅素之5FU處理之小鼠中之腫瘤生長的顯著抑制。抑制腫瘤生長在CD133+LCSC異種移植中為188%(圖12)，在CD44+CD24-BCSC異種移植中為200%(圖13)且經分別偵測。
在各種試管內模型中例示說明之基於血紅素之5FU標靶其
他癌細胞之能力。藉由採用MTT分析，測定基於血紅素之5FU對各種癌細胞之細胞毒性：其分別為在HCT116結腸直腸癌中之20%細胞死亡(圖14)，在H460非小細胞肺癌細胞中之60%(圖15)，在Jurket白血病細胞中之28%(圖16)，在A172神經膠母細胞瘤腦癌細胞中之57%(圖17)，在MCF7乳癌細胞中之35%(圖18)，及在Huh7肝癌細胞中之20%(圖19)。
替莫唑胺(TMZ)及與TMZ連接之經修飾血紅素之結構顯
示於圖20中。已成功展示經修飾血紅素連接於TMZ(如LC-MS實驗中所示)。圖21顯示本發明之基於血紅素之TMZ之LC-MS結果。
圖22說明一個以上的螢光素(例如螢光素6-羧基琥珀醯亞
胺酯，F-6-NHS)分子可連接於血紅素之分子。螢光標記之血紅素亦可進入至癌細胞(例如肝癌細胞)中且在圖23A中說明該結果。吾人預期基於經
修飾血紅素之治療劑亦可有效地殺死癌細胞。在本申請案中採用活細胞成像以明確證明各種形式的基於經修飾血紅素之5FU可如何吸收至癌細胞中(圖23A、23B)。肝癌細胞HepG2及CD133+肝癌幹細胞樣細胞曝露於0.0125g/dL 15min，隨後進行活細胞獲取。觀測到基於經修飾血紅素5FU在曝露15min之後吸收至癌細胞之細胞質中。亦觀測到在曝露1h之後的吸收峰值。
就包括pH、莫耳比及緩衝液之不同參數而言對藉由F-6-NHS
修飾血紅素之條件進行最佳化。圖24顯示在不同pH(pH 8.0、8.3、8.5、8.8及9.0)下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。穩定血紅素之化學修飾之較佳條件為pH 8.5。圖25顯示在pH 8.5下於F-6-NHS與1當量血紅素之不同比(3、5、7及9當量)下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。F-6-NHS與穩定血紅素之間的較佳比為7：1。圖26顯示在pH 8.5下於不同緩衝劑(乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽)中在F-6-NHS比血紅素(7：1當量)之情況下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。轉化率在不同緩衝液條件下無顯著差異。
藉由乙烯酮修飾血紅素之條件相對於包括pH、溫度及莫耳
比之不同參數經最佳化。圖27顯示在不同條件下之乙烯酮修飾之血紅素之轉化率。較佳條件為pH 9、37℃及30當量。
藉由酸酐修飾血紅素之條件亦相對於包括pH及莫耳比之不同參數經最佳化。圖28顯示在不同條件下之酸酐修飾之血紅素之轉化率。較佳條件為pH 9及30當量。
與含有作為可分裂連接基團之二硫化物之5FU共軛物連接之經修飾血紅素(Hb-5FU-二硫化物(可分裂)共軛物)之結構顯示於圖29A中。已成功地展示經修飾血紅素藉助於可分裂二硫化物連接基團連接於5FU(如LC-MS實驗中所示)。圖29B顯示LC-MS結果。
出於活細胞成像或診斷成像目的，藉由螢光染料，例如螢光
素-6標記基於血紅素之5FU共軛物。圖30顯示藉由ESI-MS方法的具有烷基不可分裂連接基團之螢光標記之5FU修飾之血紅素共軛物(Hb-5FU-烷基(不可分裂)FL共軛物)之(A)示意性流程及(B)表徵。圖31顯示藉由ESI-MS方法的具有甲醇胺可分裂連接基團之螢光標記之5FU修飾之血紅素共軛物(Hb-5FU-甲醇胺(可分裂)FL共軛物)之(A)示意性流程及(B)表徵。
出於成像目的，亦藉由兩種螢光染料標記基於血紅素之5FU
共軛物(顯示於圖32A中)。5FU-丹磺醯基之約2個分子及TAMRA之2個分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。添加經修飾血紅素溶液之溶液(1mL，10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與55μL的DMSO中之TAMRA NHS(100mM，3.5當量)及55μL的DMSO中之5FU-丹磺醯基NHS(100mM，3.5當量)。在室溫下攪拌反應溶液4小時，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵(顯示於圖32B中)。亦可以與基於血紅素之5FU類似之方式吸收兩染料標記之5FU經修飾血紅素共軛物(Hb-5FU-Dan-TAM)，其中在癌細胞之細胞質中偵測到丹磺醯基-5FU(激發於488nm)及基於TAM-血紅素之藥劑(激發於555nm)二者(圖23C)。
在市場上無可用基於血紅素之治療劑。本發明中製備之含有基於經修飾血紅素之治療劑之醫藥組成物可標靶癌細胞(伴以治療作用)。就用於癌症治療而言，本發明之含有基於經修飾血紅素之治療劑之醫藥組成物充當抗癌劑以殺死癌細胞。基於經修飾血紅素之治療劑為以低劑量使用之良好候選物且可與其他分子標靶或細胞毒性劑合併。
實施例
藉助於描述本發明之特定具體實例來提供以下實施例，不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
實施例1a
合成乙烯酮
在0℃下逐滴添加甲磺醯氯化(MsCl)(DCM中之4.1mmol)至5-己炔-1-醇(4mmol)及三乙胺(4.5mmol)於二氯甲烷(DCM)(100mL)之劇烈攪拌溶液中。隨後使混合物升溫至室溫以攪拌隔夜。將碳酸氫鈉(水溶液)倒入至反應混合物中且分離有機相。用DCM萃取水層且用水及鹽水洗滌經合併之有機萃取物、經硫酸鎂(MgSO4)乾燥且蒸發溶劑。藉由急驟管柱層析(正己烷中之20%乙酸乙酯)來純化粗甲磺酸鹽以產生無色油。
在反應混合物中添加碘化鉀(2.5mmol)至甲磺酸鹽(2mmol)於丙酮(60mL)中之溶液中且加熱至回流20h。在冷卻至室溫之後，濾出沈澱物。用丙酮(20mL)洗滌濾餅且蒸發溶劑。用醚(100mL)稀釋殘餘油且用硫代硫酸鈉溶液(飽和，10mL)進行洗滌。用醚萃取水溶液且用鹽水洗滌經合併之有機萃取物、經無水硫酸鎂乾燥且蒸發溶劑。在真空中分餾殘餘物以得到碘化合物5-己炔-1-碘。
在-78℃下逐滴添加雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰(己烷中之1M，20mL)至苯乙酸甲酯(2.73g，18.2mmol)於無水四氫呋喃(40mL)中之溶液中。在1h之後，使反應混合物升溫至0℃，且逐滴添加無水四氫呋喃(5mL)中之5-己炔-1-碘(4.16g，20mmol)至溶液。在0℃下攪拌1.5h之後，藉由水使反應混合物中止、用飽和氯化銨溶液洗滌且用二乙醚進行萃取。有機層經合併且經無水硫酸鎂乾燥以得到4.17g炔烴官能化酯。
用氫氧化鉀丸粒(1.5g，27mmol)處理炔烴官能化酯(4.17g，18.1mmol)於甲醇(100mL)及水(2mL)中之溶液且加熱至回流隔夜。在真空中濃縮反應混合物。添加水至反應混合物，隨後用二乙醚對其進行洗滌。收集水層且藉由氫氯酸進行酸化且接著用醚萃取。有機層經合併、經無水硫酸鎂乾燥且在真空中濃縮以得到呈無色油狀之炔烴官能化甲酸。
添加乙二醯氯(二氯甲烷中之2M，5mL)至室溫下的炔烴
官能化甲酸(1.08g，5mmol)於無水二氯甲烷(5mL)中之溶液中且攪拌反應混合物2h。在氮氣氛圍下蒸餾溶劑以得到淡黃色油。淡黃色油溶解於無水四氫呋喃(10mL)中，且在0℃下逐滴添加無水三乙胺(6mL，20mmol)至溶液中。在0℃下攪拌所得混合物2h。在氮氣氛圍下過濾形成之鹽，且在110℃(1mmHg)下蒸餾濾過物以得到鮮黃色油狀之乙烯酮。
實施例1b
使用乙烯酮修飾肽及血紅素
在1.0mL艾本德試管(eppendorf tube)中，將肽YTSSSKNVVR水溶液(1mM，10μL)、乙烯酮(10當量，1μL 100mM乙烯酮於無水四氫呋喃中之儲備溶液)及磷酸鹽緩衝液(pH 6.3及7.4，80μL)混合。在室溫下保持反應混合物2h。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定肽之轉化率。使用MS/MS(串聯質譜)分析，測定N端選擇性。
在1.0mL艾本德試管中，將緩衝液中之經穩定血紅素溶液(1.56mM，40μL)、乙烯酮(10、20、30、40及50當量，100mM乙烯酮於無水四氫呋喃中之儲備溶液)及磷酸鹽緩衝液(pH 6.3、7.4及9，160μL)混合。反應混合物保持於室溫下隔夜(在37℃下在pH 9下之一組)。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定蛋白質之轉化率。圖27顯示不同條件(pH、溫度、莫耳比)下之乙烯酮修飾之血紅素之轉化率。較佳條件為pH 9、37℃及30當量。
實施例2a
合成酸酐
在室溫下攪拌炔烴官能化甲酸(100mg，0.46mmol)、(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)(180.5mg，0.94mmol)及三乙胺(0.5mmol)於二氯甲烷(20mL)中之溶液隔夜。用水洗滌反應混
合物。經無水硫酸鎂乾燥有機層且在真空中濃縮，且藉由急驟管柱層析來純化殘餘物(用4%乙酸乙酯/正己烷洗提)以得到酸酐。
實施例2b
使用酸酐修飾肽及血紅素
在1.0mL艾本德試管(eppendorf tube)中，混合肽YTSSSKNVVR水溶液(1mM，10μL)、酸酐(10當量，1μL的酸酐於無水四氫呋喃中之100mM儲備溶液)及磷酸鹽緩衝液(pH 6.3及7.4，80μL)。在室溫下保持反應混合物2h。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定肽之轉化率。使用MS/MS分析，測定N端選擇性。
在1.0mL艾本德試管中，混合緩衝液中之穩定血紅素溶液(1.56mM，40μL)、酸酐(10、20、30、40及50當量，100mM酸酐於無水四氫呋喃中之儲備溶液)及磷酸鹽緩衝液(pH 6.3、7.4及9，160μL)。反應混合物保持於室溫下隔夜(在37℃下在pH 9下之一組)。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定蛋白質之轉化率。圖28顯示不同條件(pH、溫度、莫耳比)下之酸酐修飾之血紅素之轉化率。較佳條件為pH 9及30當量。
實施例3a
合成NHS酯
在室溫下攪拌炔烴官能化甲酸(100mg，0.46mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)(64.4mg，0.56mmol)、(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)(180.5mg，0.94mmol)及4-二(甲胺基)吡啶(DMAP)(0.5mg，催化量)於二氯甲烷(20mL)中之溶液隔夜。用水洗滌反應混合物。經無水硫酸鎂乾燥有機層且在真空中濃縮，且藉由急驟管柱層析來純化殘餘物(用50%乙酸乙酯/正己烷洗提)以得到NHS酯。
實施例3b
使用NHS酯修飾肽及穩定血紅素
在1.5mL艾本德試管中添加6.8μL(10nmol)穩定血紅素
溶液(100mg/mL，1.56mM)或10μL YTSSSKNVVR儲備溶液(1mM)至180μL PBS(pH 7.4，10mM)緩衝液與5μL二甲亞碸(DMSO)中之混合溶液中(穩定血紅素/YTSSSKNVVR最終濃度：0.05mM)。每2min逐份添加每添加0.5μL(0.1當量/份、10、20及40份)及1.0μL(0.2當量/份、5、10及20份)的無水四氫呋喃(1mL)中之新鮮NHS酯(0.8mg)溶液(2mM)且緊接著為渦旋。在90min內完成添加且使反應溶液保持於室溫下另外2.5h。隨後，在室溫下持續3h添加10μL的PBS(pH 7.4，10mM)緩衝液中之乙醇胺溶液(20mM)至反應溶液以中止剩餘的自由NHS酯。
實施例4a
藉由螢光素6-NHS酯修飾穩定血紅素
藉由螢光素6-羧基琥珀醯亞胺酯(F-6-NHS)修飾穩定血紅
素溶液(9.9g/dL)。反應條件(pH、比率、時間、緩衝液)經最佳化且反應混合物藉由LC-ESI MS表徵。在氮氣下藉由乙酸(0.2M)及氫氧化鈉(0.1M)將穩定血紅素溶液調節至不同pH(分別為pH 8.0、8.3、8.5、8.8及9.0)。
逐滴添加DMSO中之不同當量(分別為3、5、7及9當量)之F-6-NHS至穩定血紅素溶液且在暗處於氮氣下攪拌不同反應時間(分別為2、3、4及5h)。藉由Bio Spin Tris 30管柱(10k)(或ultra amicon 4mL：3k)移除過量F-6-NHS。修飾之血紅素溶液儲存於RA緩衝液(pH 7.5)中且藉由LC-ESI MS表徵。
實施例4b
F-6-NHS修飾之血紅素在不同pH下之轉化率
不同pH(pH 8.0、8.3、8.5、8.8及9.0)下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率經最佳化。自反應混合物之LC-MS分析之總離
子計數測定轉化率。在暗處持續4h以3：1之F-6-NHS與1mL RA緩衝液中之穩定血紅素之比進行修飾。結果顯示於圖24中。較佳pH條件為在8.5下進行。在圖24中，a=α鏈，a1=經單螢光素修飾之α鏈，a2=經二螢光素修飾之α鏈，a3=經三螢光素修飾之α鏈，2a=α-α鏈，2a1=經單螢光素修飾之α-α鏈，2a2=經二螢光素修飾之α-α鏈，2a3=經三螢光素修飾之α-α鏈，2 β=β-β鏈，2 β 1=經單螢光素修飾之β-β鏈，2 β 2=經二螢光素修飾之β-β鏈，2 β 3=經三螢光素修飾之β-β鏈，2 β 4=經四螢光素修飾之β-β鏈，2 β'=β'-β'鏈，2 β'1=經單螢光素修飾之β'-β'鏈，2 β'2=經二螢光素修飾之β'-β'鏈，2 β'3=經三螢光素修飾之β'-β'鏈，2 β'4=經四螢光素修飾之β'-β'鏈。
實施例4c
F-6-NHS與穩定血紅素之不同比率下之F-6-NHS修飾之血紅素之轉化率
在暗處持續4h之F-6-NHS與pH 8.5下之1mL RA緩衝液中之穩定血紅素(3、5、7及9當量)之不同比率之情況下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。穩定血紅素濃度為9.9g/dL。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定轉化率。結果顯示於圖25中。F-6-NHS與穩定血紅素之較佳比為7：1。
實施例4d
不同反應時間下之F-6-NHS修飾之血紅素之轉化率
在暗處持續不同反應時間(2、3、4及5h)之7當量F-6-NHS與pH 8.5之1mL RA緩衝液中之穩定血紅素之情況下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。穩定血紅素濃度為9.9g/dL。自反應混合物之LC-MS分析之總離子計數測定轉化率。較佳反應時間為4h。
實施例4e
不同緩衝劑下之F-6-NHS修飾之血紅素之轉化率
在暗處持續4h之7當量F-6-NHS與pH 8.5下之不同緩衝劑
(乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽緩衝液)之情況下之F-6-NHS修飾之血紅素之各單元之轉化率。穩定血紅素濃度為9.9g/dL。轉化率獲自修飾單元之質量強度與對應單元之質量強度總和之比。結果顯示於圖26中。就使用不同類型之緩衝劑而言，轉化率無顯著差異。
實施例5a
合成5FU-甲醇胺(可分裂)NHS酯
在N2氛圍下於室溫下攪拌5FU甲醇胺琥珀酸(375mg，1.86
mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(299mg，2.60mmol)、N-3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，499mg，2.60mmol)及4-二甲胺基吡啶(DMAP，30mg，催化劑)於二氯甲烷(20mL)及二甲基甲醯胺(DMF)(1mL)中之溶液18h。沈澱物經過濾以得到5FU-甲醇胺(可分裂)NHS酯。
實施例5b
藉由5FU-甲醇胺(可分裂)NHS酯修飾血紅素
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝
液，pH 8.5)與110μL DMSO中之5FU-甲醇胺(可分裂)NHS酯(100mM，7當量)。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。估計之轉化產率為95%。可分裂5-FU之約6個分子共軛至修飾之血紅素之一個分子上。
實施例6a
合成5FU不可分裂NHS酯
逐滴添加三乙胺(1.08mL，7.69mmol)至5FU(1.00g，7.69
mmol)於DMF(6mL)中之溶液中。在攪拌10分鐘之後，逐滴添加丙烯
酸甲酯(1.38mL，15.4mmol)。在室溫下持續攪拌反應混合物20h。在真空中濃縮粗混合物且用矽膠藉由急驟層析來純化(藉由5%MeOH/DCM洗提)以得到作為產物之甲酯。甲酯溶液(650mg，3.00mmol)溶解於5% HCl(35mL)中。將反應混合物在回流下加熱3h。當反應混合物冷卻時，添加H2O(20mL)且用乙酸乙酯(6×20mL)萃取有機層。合併之有機層隨後經脫水(MgSO4)、過濾且在真空中濃縮。藉由急驟層析來純化殘餘物(用10% MeOH/DCM進行洗提)。
在N2氛圍下於室溫下攪拌所獲得之產物(375mg，1.86mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(299mg，2.60mmol)、N-3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，499mg，2.60mmol)及4-二甲基胺基吡啶(DMAP，30mg，催化劑)於DCM(20mL)及DMF(1mL)中之溶液18h。過濾沈澱物以得到5FU-烷基(不可分裂)NHS酯。
實施例6b
藉由5FU不可分裂NHS酯修飾血紅素
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與110μL DMSO(二甲亞碸)中之5FU不可分裂NHS(100mM，7當量)。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。估計之轉化產率為95%。不可分裂5FU之約6個分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。
實施例7a
合成可分裂5FU二硫化物N-羥基丁二醯亞胺酯
逐滴添加三乙胺(0.25mL，0.75mmol)至5FU-1-丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(179mg，0.6mmol)、4-[[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]胺基]-4-側氧基-丁酸(126mg，0.5mmol)於DMF(5mL)中之溶液中。在室溫(25℃)下持續攪拌反應混合物4h。在真空中濃縮粗混合物且藉由急驟
層析來純化(藉由5% CH3OH/CH2Cl2洗提)以得到產物5FU-二硫化物(可分裂)琥珀酸。
在N2氛圍下於室溫(25℃)下攪拌5FU二硫化物琥珀酸(109
mg，0.25mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(58mg，0.5mmol)、N-(3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，96mg，0.5mmol)及4-二甲胺基吡啶(DMAP，1mg，催化劑)於DMF(5mL)中之溶液12h。在真空中濃縮粗反應混合物。藉由急驟層析來純化殘餘物(藉由5% CH3OH/CH2Cl2洗提)以得到呈白色固體之產物5FU-二硫化物(可分裂)NHS酯。
實施例7b
藉由5FU-二硫化物(可分裂)-NHS修飾血紅素
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與110μL DMSO中之5FU-二硫化物(可分裂)NHS酯(100mM，7當量)。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。5FU二硫化物之約4個分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。
實施例8
合成替莫唑胺二硫化物N-羥基丁二醯亞胺酯
在冰水浴中逐滴添加三乙胺(0.3mL，0.55mmol)至替莫唑胺酸N-羥基丁二醯亞胺酯(146mg，0.5mmol)及4-[[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]胺基]-4-側氧基-丁酸(126mg，0.5mmol)於無水DMF(5mL)中之攪拌溶液中。使混合物升溫達至室溫(25℃)且接著攪拌4h。在真空中濃縮粗反應混合物。藉由急驟層析來純化殘餘物(藉由40% CH3OH/CH2Cl2洗提)以得到白色固體形式之產物替莫唑胺二硫化物琥珀酸。
在N2氛圍下於室溫(25℃)下攪拌替莫唑胺二硫化物琥珀酸(78.5mg，0.18mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(31mg，0.27mmol)及N-(3-
二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，52mg，0.27mmol)於DMF(1mL)中之溶液12h。在真空中濃縮粗反應混合物。藉由急驟層析來純化殘餘物(藉由5% CH3OH/CH2Cl2洗提)以得到白色固體形式之產物替莫唑胺二硫化物N-羥基丁二醯亞胺酯。
實施例9
藉由螢光素6-NHS及5FU可分裂NHS酯修飾血紅素
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與55μL DMSO中之螢光素6-NHS(100mM，3.5當量)及55μL DMSO中之5FU可分裂NHS(100mM，3.5當量)。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。可分裂5FU之約2.5個分子及螢光素之2.5個分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。
實施例10
藉由螢光素6-NHS及5FU不可分裂NHS酯(藉由一種螢光染料標記)修飾血紅素
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與55μL DMSO中之螢光素6-NHS(100mM，3.5當量)及55μL DMSO中之5FU不可分裂NHS(100mM，3.5當量)。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。不可分裂5FU之約2.5個分子及螢光素之2.5個分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。
實施例11
合成血紅素-5FU-兩染料共軛物(藉由兩種螢光染料標記)之不同化合物以用於活細胞成像
為合成血紅素-5FU-兩染料共軛物以用於活細胞成像，前驅體包括銅離胺酸錯合物、5FU離胺酸、5FU丹磺醯基離胺酸、5FU丹磺醯基
離胺酸NHS酯、5FU丹磺醯基離胺酸乙醇胺、5FU丹磺醯基離胺酸琥珀酸、5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯。
實施例11a 形成銅離胺酸錯合物
以單份添加硫酸銅(II)(五水合物，2.15g，8.60mmol)至L-離胺酸(3.14g，17.2mmol)於碳酸氫鈉溶液(1M，40mL)中之溶液中。攪拌深藍色懸浮液3h，隨後添加甲醇(15mL)。在室溫下持續攪拌反應物24h。過濾所得藍色漿液且在真空中乾燥以得到銅-離胺酸錯合物(藍色粉末)。
實施例11b 形成5FU離胺酸
銅離胺酸錯合物(72.4mg，0.21mmol)及碳酸氫鈉(34.4mg，0.41mmol)溶解於H2O(5mL)中。在室溫下攪拌1h之後，添加5FU-烷基(不可分裂)NHS酯(123mg，0.41mmol)至混濁藍色懸浮液。在室溫下繼續攪拌16h，在該時段期間觀測到顏色變化為透明淡藍色(無沈澱)。隨後添加硫化鈉(16.4mg，0.21mmol)且反應混合物變為灰棕色。使用稀釋氫氯酸將粗混合物中和至pH 4。隨後過濾沈澱物且在真空中濃縮剩餘濾過物且用冷甲醇(20mL)洗滌。獲得粗透明殘餘物且不經純化即用於下一步驟中。
實施例11c 形成5FU丹磺醯基離胺酸
逐滴添加三乙胺(2mL)至0℃下的5FU離胺酸(271mg，0.82mmol)於二甲基甲醯胺(6mL)中之溶液中。在攪拌15min之後，添加5-(二甲胺基)萘-1-磺醯氯(270mg，1.00mmol)且在添加之後觀測到顏色自透明變為褐綠色。在室溫下於暗處攪拌24h之後，在真空中濃縮反應混合物，隨後藉由急驟層析來純化(藉由20%甲醇/二氯甲烷洗提)以產生黃色固體形式之5FU丹磺醯基離胺酸。
實施例11d 形成5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯
添加N-羥基丁二醯亞胺(50.4mg，0.26mmol)、N-3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(30.0mg，0.26mmol)及4-(二甲胺基)吡啶(4mg，催化劑)至5FU丹磺醯基離胺酸(98.0mg，0.17mmol)於二甲基甲醯胺(3mL)中之溶液中。在室溫下於暗處攪拌反應混合物18h。在其之後，在真空中濃縮反應混合物，隨後藉由急驟層析來純化(藉由20%甲醇/二氯甲烷洗提)以產生呈黃色固體之5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯。
實施例11e 形成5FU丹磺醯基離胺酸乙醇胺
在室溫下逐滴添加乙醇胺(500μL)至5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯(103mg，0.16mmol)於二甲基甲醯胺(1.5mL)中之溶液中。在暗處攪拌反應混合物12h。在其之後，在真空中濃縮反應混合物，隨後藉由急驟層析來純化(藉由20%甲醇/二氯甲烷洗提)以產生呈黃色固體之5FU丹磺醯基離胺酸乙醇胺。
實施例11f 形成5FU丹磺醯基離胺酸琥珀酸
添加三乙胺(0.50mL)及琥珀酸酐(40.0mg，0.42mmol)至5FU丹磺醯基離胺酸乙醇胺(28.0mg，0.05mmol)於四氫呋喃(2mL)中之溶液中。持續3h加熱反應混合物至回流。一旦冷卻，在真空中濃縮反應混合物且藉由急驟層析來純化(藉由20%甲醇/二氯甲烷洗提)以產生呈黃色固體之5FU丹磺醯基離胺酸琥珀酸。
實施例11g 形成5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯
添加N-羥基丁二醯亞胺(18.0mg，0.07mmol)、N-(3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(22.0mg，0.07mmol)及4-(二甲胺基)吡啶(2mg，催化劑)至5FU丹磺醯基離胺酸琥珀酸(26.0mg，0.04mmol)於二甲基甲醯胺(1mL)中之溶液中。在室溫下於暗處攪拌反應混合物20h。在真空中移除溶劑且藉由急驟層析(用20%甲醇/二氯甲烷洗提)來純化粗殘餘物以產生呈黃色膜狀之5FU丹磺醯基離胺酸NHS酯。
實施例12
藉由TAMRA-NHS及5FU-丹磺醯基NHS酯修飾血紅素以用於活細胞成像
添加1mL經修飾血紅素溶液(10g/dL，1.56mM，DB緩衝液，pH 8.5)與55μL含TAMRA NHS(100mM，3.5當量)之DMSO及55μL含5FU-丹磺醯基NHS(100mM，3.5當量)之DMSO。在室溫下攪拌反應溶液4h，接著使用生物凝膠P-30凝膠進行純化且藉由ESI-MS表徵。約2個5FU-Dans分子及2個TAMRA分子共軛至經修飾血紅素之一個分子上。
實施例13
用於不同癌細胞系之培養物及試劑
癌細胞在37℃下培養於具有10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、100U/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素之DMEM(Invitrogen)中。對於常氧條件，以環境O2濃度及5% CO2培育細胞；對於低氧條件，以0.1-0.5% O2(Quorum FC-7自動CO2/O2/N2氣體混合器)及5% CO2培育細胞。所用黏附及非黏附癌細胞系之培養條件為可比較的，包括肝癌細胞HepG2、Huh7及SMMC7221；乳癌細胞4T1、MCF7及MDA-MB231；神經膠母細胞瘤腦癌細胞A172及U87MG；結腸直腸癌細胞HCT116及HT29；白血病細胞H60及Jurkat；非小細胞肺癌細胞A549及H460；胰臟癌細胞JF305及Capan-1。
實施例14
癌症幹細胞樣/前驅細胞之分離、培養及試劑
使用流式細胞分析術自人類肝癌細胞分選或分離假定肝及乳癌幹細胞樣細胞/前驅細胞(CD133+LCSC及CD44+/CD24-BCSC)。此等分選之細胞具有自我更新及分化之潛能、能夠在僅以少量注射時於NOD/SCID小鼠中形成腫瘤、能夠形成試管內橢球體且在本質上為高度化療耐藥性
的。使用PE共軛之單株小鼠抗人類CD133(BD Biosciences)於HepG2肝癌細胞上進行螢光活化細胞分選(FACS)；且使用PE共軛之單株小鼠抗人類CD24及APC共軛之單株小鼠抗人類CD44(BD Biosciences)於MCF7乳癌細胞上進行該FACS。同型IgG1k-PE、IgG2B-PE及IgG2Akappa-APC(Coulter有限公司)充當對照組。在FACS Aria II(BD Biosciences)上分析及分選樣品。將25%最明亮染色或底部25%最昏暗染色之細胞選作陽性及陰性群體。藉由後續西方墨點法及CD133、Oct 4及Sox2多能性標記物之染色驗證分選之細胞之幹性。
隨後將分選之LCSC轉移至補充有人類Mammocult增殖補充物(Stem Cell Technology有限公司)、0.48μg/mL新鮮溶解之氫皮質酮及4μg/mL在使用之前新鮮之肝素之人類Mammocult基礎培養基(Stem Cell Technology有限公司)中之非貼壁培養條件。未添加抗生素至培養基。使用0.2μm低蛋白結合過濾器(Millipore有限公司)過濾新鮮製備之培養基。使LCSC橢球體於懸浮液中生長直至其達至直徑為約70μm之尺寸。藉由於1000rpm下離心3min，接著藉由胰蛋白酶-EDTA物理解離1min及於新穎培養基中之後續再懸浮對超過70μm之尺寸之LCSC橢球體進行次培養。
實施例15
癌細胞中之活細胞時移顯微法
癌細胞(例如HepG2肝癌細胞)接種於玻璃底部微孔碟(MatTek公司)上。使用配備有大氣/溫度控制室及用於多位置採集之電動平台的Zeiss Observer Z1寬場顯微鏡獲得在限定放縮(63×，20×)下之活細胞。在用0.1% O2及5% CO2(預混合)淨化之封閉活細胞成像系統中進行培育。細胞曝露於(1)藉由一種螢光染料標記之Hb-5FU-烷基(不可分裂)-FL共軛物及(2)藉由兩種螢光染料標記之Hb-5Fu-Dan-TAM共軛物15min，隨後持續2h之時段每3min獲取影像。使用MetaMorph軟體(Molecular
Device)，影像經去捲積且壓縮至時移影片中。影像顯示於圖23A、23B及23C中。
實施例16
癌細胞系之細胞毒性分析
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴(MTT)增殖分析來量測細胞活力。簡言之，癌細胞系(例如HepG2或Huh7肝癌細胞)接種於96孔平底微量盤(6000細胞/孔)中且在37℃及5% CO2下之100μL生長培養基中培養24h。隨後藉由不含藥物、僅含有5FU或含有基於經修飾血紅素之5FU(Hb-FU)與另一化學治療劑(在其IC50濃度下)之100μL細胞生長培養基替換各孔中之細胞培養基。在37℃下培育5FU或Hb-FU 24h，再持續4h向各孔中添加20μL MTT標記試劑(PBS溶液中之5mg/mL)。輕輕地移除生長培養基，且隨後向各孔中添加200μL DMSO作為溶解劑以完全溶解甲[月朁]晶體。藉由Multiskan EX(Thermo Electron公司)量測570nm波長下之吸收率，且各資料點表示來自一式三份之孔的平均值±SD。
實施例17
在免疫缺陷裸體及NOD/SCID小鼠中建立各種腫瘤異種移植模型及給藥方案
將人類癌細胞接種至balb/c裸小鼠中以建立兩種皮下腫瘤模型。動物經隨機化且分配至9個不同組(每組4-8隻小鼠)中，隨後進行處理。動物接受(1)RA緩衝液，(2)僅0.4g/kg(對於人類：0.03g/kg)之穩定血紅素(4次給藥，每週1次給藥)(靜脈內注射，i.v.)，(3)80mg/kg之5FU(4次給藥，每週1次給藥)(i.v.)，(4)共投予5FU及穩定血紅素(在5FU處理之前1h提供穩定血紅素)，(5)多次給藥穩定血紅素(持續4週於第1天及第4天提供穩定血紅素)，(6)與5FU共軛之穩定血紅素之不可分裂形式(4次給藥，每週1次給藥)，0.4g/kg(i.v.)，及(7)與5FU共
軛之穩定血紅素之可分裂形式(4次給藥，每週1次給藥)，0.4g/kg(i.v.)。
藉由皮下注射1-5×106之癌細胞至5週齡balb/c裸小鼠之肋部中來測定癌細胞之致瘤性。對於癌症前驅細胞，將1×105成功分離之前驅細胞皮下注射至NOD/SCID小鼠中以建立異種移植。各組含有4至8隻動物。在偵測到約0.3-0.5cm3之腫瘤之後，藉由測徑規每3天量測腫瘤尺寸，且如下計算腫瘤體積：體積(cm3)=(LxWxW)/2。在宰殺當天對小鼠進行稱重且緊接著宰殺之後對收穫之腫瘤進行稱重及成像。
<110> 視界全球控股有限公司
黃炳鏐
<120> 用於癌症標靶治療及診斷成像之包含經修飾的基於血紅素之治療劑的醫藥組成物
<130> P7009US01
<140> 103116929
<141> 2014-05-13
<150> US 61/822,463
<151> 2013-05-13
<150> US 14/275,885
<151> 2014-05-13
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 141
<212> PRT
<213> 牛
<400> 1
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 141
<212> PRT
<213> 犬
<400> 3
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 豬
<400> 4
<210> 5
<211> 142
<212> PRT
<213> 馬
<400> 5
<210> 6
<211> 145
<212> PRT
<213> 牛
<400> 6
<210> 7
<211> 147
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
<210> 8
<211> 141
<212> PRT
<213> 犬
<400> 8
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<211> 147
<212> PRT
<213> 豬
<400> 9
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<211> 147
<212> PRT
<213> 馬
<400> 10
Claims (20)
- 一種用於標靶癌症及治療該標靶之癌症之基於血紅素之治療劑，該治療劑包含以下經化學修飾之交聯的血紅素分子，
- 一種用於標靶癌症及治療該標靶之癌症之基於血紅素之治療劑，該治療劑包含選自以下所組成之群的經化學修飾之交聯的血紅素分子，
- 一種用於標靶癌症及治療該標靶之癌症之基於血紅素之治療劑，該治療劑包含以下經化學修飾之交聯的血紅素分子，
- 一種組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第2項之治療劑，其係用於藉由投予該組成物至罹患癌症之有需要的個體來治療該癌症。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該治療劑之治療有效量為每公斤該個體0.03公克的該治療劑。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、鹽、緩衝液、水或其組合。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該投予之途徑包含靜脈內注射、腹膜內注射及皮下注射。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該癌症包含胰臟癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該癌症為腫瘤，該腫瘤包含肝細胞癌之腫瘤、肝癌前驅細胞誘發之腫瘤、神經膠母細胞瘤及三陰性前驅細胞誘發之腫瘤。
- 一種組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第3項之治療劑，其係用於藉由投予該組成物至罹患癌症之有需要的個體來治療該癌症。
- 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該治療劑之治療有效量為每公斤該個體0.03公克該治療劑。
- 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該投予之途徑包含靜脈內注射、腹膜內注射及皮下注射。
- 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該癌症包含胰臟癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。
- 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該癌症為腫瘤，該腫瘤包含肝細胞癌之腫瘤、肝癌前驅細胞誘發之腫瘤、神經膠母細胞瘤及三陰性前驅細胞誘發之腫瘤。
- 一種組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1項之治療劑，其係用於藉由投予該組成物至罹患癌症之有需要的個體來治療該癌症。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其中該治療劑之治療有效量為每公斤該個體0.03公克。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、鹽、緩衝液、水或其組合。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其中該投予之途徑包含靜脈內注 射、腹膜內注射及皮下注射。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其中該癌症包含胰臟癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其中該癌症為腫瘤，該腫瘤包含肝細胞癌之腫瘤、肝癌前驅細胞誘發之腫瘤、神經膠母細胞瘤及三陰性前驅細胞誘發之腫瘤。
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