ES2527608T3 - Composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno estable a temperatura elevada - Google Patents

Abstract

Método para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno altamente purificada y estable a temperatura elevada, incluyendo la composición farmacéutica que contiene un vehículo de oxígeno hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, y comprendiendo el método las etapas siguientes: a) proporcionar sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma; b) separar los eritrocitos del plasma en la sangre completa de mamífero; c) filtrar los eritrocitos que se separaron del plasma para obtener una fracción de eritrocitos filtrados; d) lavar la fracción de eritrocitos filtrados para eliminar las impurezas proteínicas plasmáticas, dando como resultado eritrocitos lavados; e) disgregar los eritrocitos lavados mediante una lisis hipotónica controlada durante un tiempo suficiente para lisar los eritrocitos sin lisar los leucocitos en un aparato de citólisis instantánea a un caudal de 50-1000 litro/h para crear una disolución que comprende un lisado de eritrocitos disgregados; f) llevar a cabo una filtración para eliminar al menos una porción del retenido de desecho del lisado; g) extraer una primera disolución de hemoglobina del lisado; h) llevar a cabo un primer procedimiento de ultrafiltración utilizando un filtro de ultrafiltración configurado para eliminar las impurezas que presentan un peso molecular mayor que la hemoglobina tetramérica para eliminar además cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina para obtener una segunda disolución de hemoglobina; i) llevar a cabo una cromatografía en columna de flujo continuo sobre la segunda disolución de hemoglobina para eliminar los fosfolípidos, las impurezas proteínicas y la hemoglobina dimérica y para formar una disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros; j) llevar a cabo un segundo procedimiento de ultrafiltración sobre la disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros utilizando un filtro configurado para eliminar las impurezas, dando como resultado una disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos, baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros; k) bloquear los grupos sulfhidrilo de las moléculas de hemoglobina en la disolución de hemoglobina purificada concentrada exenta de fosfolípidos baja en impurezas proteínicas y baja en dímeros mediante un reactivo de sulfhidrilo en un entorno completamente oxigenado de manera que las moléculas de hemoglobina presenten cada una al menos un resto de cisteína que incluye un grupo protector de tiol de manera que las moléculas de hemoglobina no puedan unirse al factor relajante derivado del endotelio en el sitio de cisteína; l) reticular la hemoglobina tiol protegida mediante fumarato de bis-3,5-dibromosalicilo (DBSF) con una relación molar de la hemoglobina tiol protegida a DBSF mayor que 1:2,5 a menor que 1:5,0 en un entorno desoxigenado para formar hemoglobina tetramérica reticulada estable a temperatura elevada sin la formación de hemoglobina polimérica, de manera que el peso molecular de la hemoglobina tetramérica reticulada resultante es 60-70 kDa y consiste esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica; m) intercambiar un tampón fisiológico adecuado por la hemoglobina tetramérica reticulada; n) eliminar cualquier hemoglobina tetramérica no reticulada residual y cualesquiera sustancias químicas residuales mediante lavado; o) añadir N-acetilcisteína a una concentración de 0,2-0,4% a la hemoglobina tetramérica reticulada para mantener un nivel de metahemoglobina inferior a 5%; y p) añadir la hemoglobina tetramérica reticulada baja en dímeros, exenta de fosfolípidos, tiol protegida, estable a temperatura elevada hasta una temperatura de 80ºC, libre de hemoglobina polimérica, a un vehículo farmacéuticamente aceptable

Description

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Claims (1)

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