CN102510753B

CN102510753B - 一种制备热稳定的包含氧载体的组合物的方法

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Publication number: CN102510753B
Application number: CN2011800012889A
Authority: CN
Inventors: 黄炳镠; 郭瑞仪
Original assignee: Billion King International Ltd
Current assignee: Billion King International Ltd
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: EA201101155A1; CL2012003523A1; WO2011162863A1; AP2012006230A0; EA023689B1; HK1191028A1; US20110319332A1; CN103421109B; WO2011162863A8; CN102510753A; MX2012000592A; AP3080A; CN103421109A; HK1166719A1; MA34310B1

Abstract

本发明提供了一种高度纯化和热稳定的交联非聚合四聚体血红蛋白，其适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除不合乎需要的二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白和血浆蛋白杂质。在热处理后和任选地在热处理前添加N-乙酰半胱氨酸保持了低水平的高铁血红蛋白。该热稳定的交联四聚体血红蛋白可以改善和延长正常和低氧组织中的氧合。在另一方面，该产品用于治疗多种类型的癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本发明的四聚体血红蛋白还可以用来预防手术切除肿瘤后的肿瘤转移和复发。此外，本发明的四聚体血红蛋白可以在化疗和放疗之前施用于患者。

Description

一种制备热稳定的包含氧载体的组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求美国申请号12/821,214、12/957,430和13/013,850的优先权，这些申请的公开内容通过引用并入。

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技术领域

本发明涉及一种制备热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法和由该方法制备的组合物。本发明还涉及所述热稳定的包含氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-deprivation disorder)以及器官保存中的用途。

背景技术

血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。

天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了功能性血红蛋白在循环系统中的持久性。

为了解决所述问题，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。

现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括：产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物机体的严重肾损伤；此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有检测不到的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。

现有技术血红蛋白产品的另一个问题是在施用后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。例如，如由Katz等，2010公开的那样，产品(Biopure Co.，USA)导致较高的平均动脉压(124±9mmHg)或比基线(96±10mmHg)高30％。过去解决此问题的尝试依赖于巯基试剂与血红蛋白巯基反应，据说能防止内皮衍生舒张因子与巯基的结合。然而，巯基处理的使用增加了加工步骤，导致成本和杂质的增加，这些杂质以后必须从血红蛋白组合物中去除。因此，在本领域中存在着对当施用于哺乳动物时不导致血管收缩和高血压的血红蛋白的制备方法的需求。

现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括：蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的四聚体血红蛋白同时不含蛋白杂质的工艺的需求。

除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白不含二聚体、不含磷脂并且能够以工业规模生产。

发明内容

本发明提供了一种加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法，所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响和严重的不良事件包括死亡。本发明去除了二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白、磷脂和蛋白杂质。另外，本发明使用(1)快速细胞裂解设备，所述设备用于精确的和可控的低渗裂解，(2)流通柱色谱(flowthrough column chromatography)，(3)短时间高温(HTST)设备，所述设备在纯化过程中用于热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可以避免肾损伤、血管不利影响和其他毒性反应，和(4)气密输液袋包装以避免氧侵入至产品中。

该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来破裂所述洗涤过的红细胞足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。

使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂的血红蛋白溶液。使用滤器对所述无磷脂的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，所述滤器被配置成去除杂质，产生浓缩纯化的无磷脂的血红蛋白溶液。

通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(bis-3，5-dibromosalicyl fumarate)至少交联纯化的血红蛋白的α-α亚单位从而形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa。本文中使用的表达“非聚合的”是指未与其他血红蛋白分子或任何其他非血红蛋白分子诸如PEG通过分子间交联的四聚体血红蛋白。用合适的生理缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乳酸盐林格溶液、乙酸盐林格溶液或Tris缓冲液交换交联四聚体血红蛋白。使用切向流过滤去除任何残留的化学物质。

在此步骤后，将交联血红蛋白热处理以去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何不稳定的血红蛋白，例如，二聚体形式的血红蛋白，和任何其他蛋白杂质。在热处理之前，任选地向所述交联四聚体血红蛋白加入约0.2％浓度的N-乙酰半胱氨酸从而防止形成高铁血红蛋白。热处理和冷却后立即加入约0.2-0.4％浓度的N-乙酰半胱氨酸以进一步防止高铁血红蛋白的形成。热处理优选地是在约70℃-95℃下进行30秒至3小时的短时间高温处理，然后冷却至25°C。之后将在热处理期间形成的任何沉淀物通过离心或过滤设备去除以形成澄清溶液。

然后将所述无二聚体、无磷脂、无蛋白杂质、热稳定的非聚合的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体。

此后，将所述热稳定的交联四聚体血红蛋白配制并包装在定制的和气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EVOH)输液袋中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。

通过上述方法制备的热稳定的交联四聚体血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善了低氧条件下肿瘤的氧合，从而提高了对放射线和化疗剂的敏感性。该热稳定的交联四聚体血红蛋白也可用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保存心脏。

附图说明

图1描绘了不同血红蛋白的氨基酸序列比对；

图2描绘了本发明的方法概述的流程图；

图3示意性描绘了本发明的方法中使用的快速细胞裂解设备(instantcytolysis apparatus)；

图4描绘了对于(a)未经热处理的交联四聚体血红蛋白和(b)已经在90℃下经历了45秒至2分钟的热处理或在80℃下经历了30分钟的热处理的热稳定的交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析；

图5描绘了对热稳定的交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析；

图6显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)热稳定的交联四聚体血红蛋白的圆二色性光谱分析；

图7显示了在正常组织中氧合的改善。注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致(A)血浆血红蛋白浓度和(B)至肌肉的氧输送的显著增加。与血浆血红蛋白水平相比，观察到氧合显著增加持续更长的时间；

图8显示了在低氧的肿瘤组织中氧合的改善。注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物的氧输送的显著增加；

图9显示了在(A)鼻咽癌(NPC)和(B)肝肿瘤的啮齿动物模型中部分肿瘤缩小；

图10证明了在用热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化；

图11是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中；

图12示意性描绘了用于工业规模操作的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统；

图13是用于HTST热处理加工步骤的设备的示意图；

图14证明HTST加工设备中的温度曲线图，和在该系统中在本发明的85℃和90℃下去除不稳定的四聚体(二聚体)所需的时间；

图15证明在图13的HTST加工设备中在85℃和90℃下该系统中高铁血红蛋白形成的速率；

图16是用于本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图；

图17显示了概括肝切除过程中手术和血红蛋白产品施用步骤的示意图；

图18显示了在肝切除术和缺血/再灌注操作后IR损伤组大鼠中诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移的代表性实施例以及使用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的预防作用；以及

图19显示了在肝切除和IR损伤操作后4周时试验组和对照组中的组织学检查。

具体实施方式

血红蛋白是哺乳动物和其他动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白。血红蛋白显示蛋白质的三级和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋部分，产生其分子内的吸引力，将各个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子由四个球状蛋白亚单位组装而成。每个亚单位由排列成一组α-螺旋结构段的多肽链构成，所述α-螺旋结构段具有包埋的血红素基团的“肌红蛋白折叠”排列方式连接。

血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与位于一个平面中的环中心中所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。

在成人中，最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体，其由称为α2β2的两个α和两个β非共价结合的亚单位组成，每个亚单位分别由141和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14％；β链中的同一性为84.35％)。不同之处在于牛血红蛋白中位于βCys 93处的两个巯基，而人血红蛋白中的巯基分别位于αCys 104、βCys 93和βCys 112处。图1显示分别标记为B、H、C、P和E的牛、人、犬、猪和马血红蛋白的氨基酸序列比对。各种来源的不同氨基酸用阴影表示。图1表明当比较其氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马具有高度的相似性。

在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个αβ二聚体与另一个αβ二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个αβ二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而能够被肾脏过滤和分泌，结果造成潜在的肾损伤并导致其在血管内存留时间实质性减少。

因此，从功效和安全性两方面来看，稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法；本发明的方法的概况呈现在图2的流程图中。

首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括，但不限于，人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤，和洗涤以去除血浆蛋白杂质。

为了从红细胞释放血红蛋白，裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞，但本发明利用精确可控的低渗裂解技术，其规模适合于工业规模制备。为此，用来裂解红细胞的快速细胞裂解设备可见图3。低渗裂解形成裂解产物溶液，其包含血红蛋白和废截留物。为了能够进行工业规模制备，小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在2至30秒内或足以裂解红细胞的时间内，和优选30秒内穿越该设备。所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。去离子水和蒸馏水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时限不同。由于可控的裂解步骤仅裂解红细胞，不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA从白细胞的释放或其它细胞性物质的释放最小化。在30秒后，即，在含有红细胞的溶液已经穿越快速细胞裂解设备的静态混合器部分后，立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限＝64pg)和高效液相色谱(HPLC，检出限＝1μg/ml)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。

进行两个超滤过程：一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质，另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，100kDa滤器用于第一超滤过程，而30kDa滤器用于第二超滤过程。

流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱，所述离子交换柱诸如DEAE柱，CM柱，羟磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8.5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH 8.0下去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现用于工业规模制备的连续分离方案。ELISA结果显示在洗脱的血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G：44.3ng/ml；白蛋白：20.37ng/ml；碳酸酐酶：81.2μg/ml)。使用不同类型的柱采用不同的pH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表1中。

表1

在柱色谱过程后，血红蛋白经由富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)进行交联。为了防止聚合血红蛋白的形成，在缺氧环境(优选小于0.1ppm溶解氧水平)中小心地控制反应在环境温度(15-25℃)下优选地在8-9左右的pH下进行3-16个小时的时间，同时血红蛋白与DBSF的摩尔比控制在1∶2.5-1∶4.0之间，使得得到的交联血红蛋白是分子量为60-70kDa的四聚体血红蛋白，证明不存在聚合血红蛋白。DBSF反应的收率很高，＞99％且终产物中的二聚体浓度低。任选地，本发明的方法在交联之前不需要如多种现有技术方法中那样使用巯基处理试剂诸如碘乙酰胺与血红蛋白反应。

在这一点上，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(一种生理缓冲液)交换交联溶液并且通过切向流过滤去除任何残留的化学物质。

在缺氧条件下通过DBSF交联血红蛋白的过程后，本发明提供了在缺氧环境中热加工交联四聚体血红蛋白溶液的步骤。在热处理前，任选地加入N-乙酰半胱氨酸以防止形成高铁血红蛋白(无活性的血红蛋白)。在热加工步骤后，将该溶液冷却，立即加入N-乙酰半胱氨酸以保持低水平的高铁血红蛋白。如果N-乙酰半胱氨酸在热处理之前和之后加入，则在热处理之前加入的量为约0.2％，而在热处理之后加入的量为约0.2-0.4％。然而，如果N-乙酰半胱氨酸仅在热处理后加入，则加入的量为0.4％。

在一些实施方案中，交联四聚体血红蛋白溶液在缺氧环境(小于0.1ppm溶解氧水平)中在50℃-95℃的温度范围内加热持续0.5分钟至10小时。在一些实施方案中，交联四聚体血红蛋白溶液在70℃-95℃的温度范围内加热持续30秒至3小时。在一些优选的实施方案中，交联四聚体血红蛋白溶液在80℃下加热30分钟。并且还在其他优选的实施方案中，交联血红蛋白溶液加热至90℃持续30秒至3分钟，然后在约15至30秒内快速地冷却至约25℃，并且如上所述加入N-乙酰半胱氨酸。产生极少量的高铁血红蛋白，例如，小于3％。不使用N-乙酰半胱氨酸，形成的高铁血红蛋白的量为约16％，对于药物应用这是不可接受的高百分比。

高效液相色谱(HPLC)法、电喷雾电离质谱(ESI-MS)法、圆二色性(CD)光谱法和用于p50测量的血氧分析仪此后用来分析和表征热稳定的交联四聚体血红蛋白。对于牛血来源产生的血红蛋白，图4显示对于在90℃下经受45秒至2分钟的热处理或在80℃下经受30分钟热处理的血红蛋白，在HPLC系统中检测不到二聚体形式的血红蛋白(检出限：2.6μg/ml或0.043％)。发现交联的非聚合的四聚体血红蛋白在80或90℃下在一段时间内是热稳定的。热加工(短时间高温，HTST)步骤是将天然的未反应的四聚体形式和二聚体形式的血红蛋白变性的有效步骤。

为了分析此HTST步骤的结果，HPLC分析法用来检测此热加工步骤后二聚体的量。用于HPLC分析的流动相含有氯化镁(0.75M)和热稳定的交联四聚体血红蛋白，氯化镁可以分离二聚体(不稳定的四聚体)。对于促进血红蛋白解离成二聚体，在相同的离子强度下氯化镁的有效性比氯化钠多约30倍。热加工步骤另一作用为变性步骤，该步骤大幅度地去除交联四聚体血红蛋白中那些不需要的蛋白杂质(检测不到免疫球蛋白-G；检测不到白蛋白；碳酸酐酶减少99.99％)。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测样品中的蛋白杂质。因此，纯化的、热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液具有检测不到的水平的二聚体(低于检出限：0.043％)，和免疫球蛋白-G、以及极少量的白蛋白(0.02μg/ml)和碳酸酐酶(0.014μg/ml)。表2显示了关于通过HTST热加工步骤去除蛋白杂质和二聚体的试验结果。此HTST加热步骤能够选择性地将热稳定的交联四聚体与不稳定的四聚体和二聚体分离。

表2

在缺氧条件下交联血红蛋白的热加工步骤后，热稳定的交联四聚体血红蛋白准备进行药物配制和包装。本发明描述了热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液在缺氧环境中的气密包装步骤。在本发明中热稳定的交联四聚体血红蛋白在缺氧条件下稳定两年以上。

在本发明中，包含氧载体的药物组合物主要旨在用于静脉注射应用。传统上，现有产品使用常规的具有高透氧性的PVC血袋或Stericon血袋，其将最终缩短产品的寿命，因为产品在氧合条件下快速地转变成无活性的高铁血红蛋白(在几天内)。

本发明中使用的包装使得热稳定的交联四聚体血红蛋白稳定两年以上。EVA/EVOH材料的多层包装用来使透气性最小化并且避免形成无活性的高铁血红蛋白。设计与本发明的纯化的和热稳定的交联四聚体血红蛋白一起使用的100ml输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，其透氧性为在室温下每个大气压每24小时每100平方英寸0.006-0.132cm³(0.006-0.132cm³/100平方英寸/24小时/大气压)。此材料是VI类塑料(由USP<88>定义)，其满足体内生物学反应试验和物理化学试验并且适合于制造静脉注射用输液袋。此初级袋可特别地用于保护热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液免于长期暴露氧，长期暴露氧导致其不稳定并且最终影响其治疗性能。

对于血液产品的二次保护，已经知道使用铝外包装以防止潜在的漏气并且将产品保持在缺氧状态。然而，在铝外包装中有存在针孔的可能性，使其气密性受损并且使产品变得不稳定。因此，本发明使用铝外包装袋作为二次包装，其防止氧合并且还防止暴露于光。外包装袋的组成包括0.012mm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、0.007mm铝(Al)、0.015mm尼龙(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧传递速率为在室温下0.006cm³/100平方英寸/24小时/大气压。此二次包装延长了血红蛋白的稳定时间，从而延长了产品保存期限。

本发明的血红蛋白通过多种技术分析，包括ESI-MS。ESI-MS能够分析非常大的分子。其是一种电离技术，该技术通过电离蛋白质，然后基于质量/电荷比分离电离的蛋白质来分析高分子量化合物。因此，可以准确地确定分子量和蛋白相互关系。在图5中，ESI-MS分析结果表明热稳定的交联四聚体血红蛋白的大小为65kDa(非聚合的血红蛋白四聚体)。190-240nm的远紫外CD光谱揭示了血红蛋白的珠蛋白部分的二级结构。在图6中，纯化的血红蛋白溶液和热稳定的交联四聚体血红蛋白的光谱的一致性揭示血红蛋白链即使在90℃下热处理以后也被正确地折叠。CD结果显示热稳定的交联四聚体血红蛋白具有大约42％α-螺旋、38％β-折叠、2.5％β-转角和16％无规卷曲。其进一步确定该交联四聚体血红蛋白是热稳定的。

本发明中的方法适用于热稳定的交联四聚体血红蛋白的大规模工业制备。另外，热稳定的交联四聚体血红蛋白与药用载体(例如，水、生理缓冲液、以胶囊的形式)的组合适合于哺乳动物应用。

本发明进一步公开了包含氧载体的药物组合物在改善组织氧合、癌症治疗、治疗缺氧病症诸如失血性休克，和在低氧含量环境下的心脏保存(例如，心脏移植)中的用途。剂量选择为具有约0.2-1.3g/kg的浓度范围，输液速率小于10ml/小时/kg体重。

为了用于癌症治疗，本发明的包含氧载体的药物组合物作为组织氧合剂起作用，以改善肿瘤组织中的氧合，从而提高化学敏感性和放射敏感性。

另外，在本发明中证明了热稳定的交联四聚体血红蛋白改善正常组织中(图7)和极度低氧的肿瘤(图8)(人鼻咽癌(使用CNE2细胞系))中的氧合的能力。沿人CNE2异种移植物的组织轨迹的代表性氧分布图显示在图8中。肿瘤块内的氧分压(pO₂)通过与微定位系统(DTI Limited)耦联的光纤氧传感器(OxfordOptronix Limited)直接监测。静脉注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白后，中位数pO₂值在15分钟内从基线升高至相对平均氧分压的约2倍并持续至6小时。此外，输液后24-48小时平均氧水平仍然保持在基线值之上25％-30％的水平。与本发明中制备的包含氧载体的药物组合物相比，没有市售产品或现有的技术显示如此高的功效。

对于肿瘤组织氧合，人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物(FaDu)的代表性氧分布图显示在图8中。静脉注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白后，在3小时和6小时分别观察到平均pO₂的超过6.5倍和5倍的显著增加(图8)。

对于癌症治疗中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为组织氧合剂起作用，以改善肿瘤组织中的氧合，从而提高化学敏感性和放射敏感性。结合X-线照射和热稳定的交联四聚体血红蛋白，使得肿瘤生长延迟。在图9A中，代表性曲线显示在鼻咽癌的啮齿动物模型中肿瘤明显缩小。带有CNE2异种移植物的裸鼠用X-线单独(2Gy)治疗或与热稳定的交联四聚体血红蛋白(2Gy+Hb)联合治疗。在X-线照射前约3-6小时将1.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白经静脉注射至小鼠中，并导致鼻咽癌异种移植物的部分缩小。

在一个实施方案中，在注射该组合物以及化疗剂后观察到明显的肝肿瘤缩小。在图9B中，代表性的图显示了在大鼠原位肝癌模型中肿瘤明显缩小。带有肝肿瘤原位移植物(CRL1601细胞系)的水牛鼠(Buffalo rats)用3mg/kg顺铂单独治疗，或与0.4g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白(顺铂+Hb)联合治疗。在注射顺铂前施用热稳定的交联四聚体血红蛋白导致肝肿瘤部分缩小。

对于在治疗缺氧病症和在心脏保存中的应用，本发明的包含氧载体的药物组合物作为将氧提供至靶器官的血液代用品起作用。

在用0.5g/kg的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化显示在图10中。在严重失血性休克的大鼠模型中，在用热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至安全和稳定的水平，并且保持在基线或大约基线处。在用热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，平均动脉压恢复至正常所需的时间甚至比施用充当阳性对照的大鼠自体血还短。该结果表明在输注热稳定的交联四聚体血红蛋白后未发生血管收缩事件。

实施例

以描述本发明的具体实施方案的方式提供下面的实施例，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

方法概述

本发明的方法的示意性流程图图示在图2中。牛全血采集在封闭的无菌容器/袋中，该容器/袋含有作为抗凝剂的3.8％(w/v)枸橼酸钠溶液。然后将血液与枸橼酸钠溶液立即充分混合以抑制血液凝固。通过单采机制(apheresismechanism)，将红细胞(RBC)从血浆和其他较小的血细胞分离并收集。为此步骤“细胞洗涤机”与γ灭菌的一次性离心机转筒(centrifuge bowl)一起使用。用等体积的0.9％(w/v氯化钠)盐水洗涤RBC。

通过对红细胞(RBC)细胞膜施加低渗冲击，裂解洗涤过的RBC，以释放血红蛋白内容物。对于此目的，使用描绘于图3中的一种用于RBC裂解装置的专用快速细胞裂解设备。在RBC裂解后，使用100kDa膜通过切向流超滤将血红蛋白分子与其他蛋白分离。收集滤液中的血红蛋白用于流通柱色谱，并且通过30kDa膜进一步浓缩至12-14g/dL。进行柱色谱法以去除蛋白杂质。

浓缩的血红蛋白溶液首先在缺氧条件下与DBSF反应以形成热稳定的交联四聚体血红蛋白分子。然后在缺氧条件下在90℃下进行热处理步骤30秒至3分钟，然后进行最终的配制和包装。

实施例2

时间&可控的低渗裂解和过滤

采集新鲜牛全血并在冷却条件(2-10℃)下运输。经细胞洗涤机将红细胞与血浆分离，随后用0.65μm过滤。在用0.9％盐水洗涤红细胞(RBC)滤液后，通过低渗裂解破裂滤液。通过使用图3中绘制的快速细胞裂解设备来进行低渗裂解。该快速细胞裂解设备包括静态混合器以辅助细胞裂解。具有可控的血红蛋白浓度(12-14g/dL)的RBC悬浮液与4体积的纯净水混合从而对RBC细胞膜产生低渗冲击。控制低渗冲击的时间以避免不希望的对白细胞和血小板的裂解。低渗溶液经过该快速细胞裂解设备的静态混合器部分持续2-30秒或否则足以裂解红细胞的时间，且优选30秒。在30秒后当裂解产物离开静态混合器时通过将裂解产物与1/10体积的高渗缓冲液混合而终止冲击。使用的高渗溶液为0.1M磷酸盐缓冲液，7.4％NaCl，pH 7.4。图3的快速细胞裂解设备可以连续地处理50-1000升裂解产物/小时，和优选地至少300升/小时。

在RBC裂解后，红细胞的裂解产物通过0.22μm滤器过滤以获得血红蛋白溶液。通过聚合酶链式反应法(检出限＝64pg)和HPLC法(检出限＝1μg/ml)在该血红蛋白溶液中分别都没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。进行第一次100kDa超滤以去除分子量大于血红蛋白的杂质。紧接着进行流通柱色谱以进一步纯化该血红蛋白溶液。然后进行第二次30kDa超滤以去除分子量比血红蛋白小的杂质，并用于浓缩。

实施例3

对无基质血红蛋白溶液的病毒清除研究

为了证明本发明产品的安全性，通过病毒验证研究证明了(1)0.65μm渗滤步骤和(2)100kDa超滤步骤的病毒清除能力。我们用按比例缩小的小规模反应体系来实施这两种方法，人为地向反应体系中添加不同模型的病毒，如脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus)和牛细小病毒(bovine parvovirus)。此研究中，使用了四种类型的病毒(见表3)。这些病毒的生物物理学和结构特征不同，并且它们在对物理和化学药剂或治疗的抗性方面显示出差异。

表3

验证方案简要地显示在下表4中。

表4

下面的表5总结了在(1)0.65μm渗滤和(2)100kDa超滤中4种病毒的对数(log)减少的结果。通过0.65μm渗滤和100kDa超滤有效地去除所有4种病毒，BVDV、BPV、EMCV和PRV。

表5

注释：

≥没有测定到残留的感染性

实施例4

流通柱色谱

CM柱(商购自GE healthcare)用来进一步去除任何蛋白杂质。起始缓冲液为20mM乙酸钠(pH 8.0)，且洗脱缓冲液为20mM乙酸钠、2M NaCl(pH 8.0)。用起始缓冲液平衡CM柱后，蛋白样品加样至柱中。用至少5个柱体积的起始缓冲液洗涤未结合的蛋白杂质。使用处于8个柱体积中的25％洗脱缓冲液(0-0.5MNaCl)进行洗脱。洗脱图显示在图11中；血红蛋白溶液处于流过级分中。流过级分的纯度通过ELISA分析。结果显示在下表6中。

表6

由于血红蛋白溶液在pH8下处于来自CM柱色谱的流过级分中(不在洗脱液中)，因此这是一种用于连续的工业规模操作的好方法。第一超滤装置直接连接至流通CM柱色谱系统，并且流通管可以连接至用于工业规模操作的第二超滤装置。示意性的工业工艺配置显示在图12中。

实施例5

热稳定的交联四聚体血红蛋白的制备

(5a)与DBSF的交联反应

在缺氧条件下进行交联反应。DBSF加入至血红蛋白溶液以形成交联四聚体血红蛋白，而不形成聚合血红蛋白。DBSF稳定步骤稳定四聚体形式的血红蛋白(65kDa)并且防止解离成二聚体(32kDa)，该二聚体通过肾脏排泄。在此实施方案中，使用的血红蛋白与DBSF的摩尔比为1∶2.5，pH为8.6。此过程在环境温度(15-25℃)下在氮气的惰性气氛中进行3-16个小时的时间以防止血红蛋白氧化形成高铁血红蛋白(溶解氧水平保持在小于0.1ppm)，高铁血红蛋白在生理学上是无活性的。DBSF反应的完成度通过使用HPLC测量残留DBSF来监测。DBSF反应的收率很高，＞99％。

(5b)HTST热加工步骤

短时间高温(HTST)加工设备显示在图13中。使用HTST加工设备对交联四聚体血红蛋白进行热加工。在此实施例中，热处理的条件为90℃持续30秒至3分钟，且优选45-60秒，尽管可以如上所讨论的那样选择其他条件并相应地对设备进行改动。将任选地加入0.2％N-乙酰半胱氨酸的含有交联血红蛋白的溶液以1.0升/分钟的流速泵入至HTST加工设备(HTST热交换器的第一区段被预加热并且保持在90℃)中，该设备的第一区段的保留时间为45-60秒，然后该溶液以相同的流速通过进入至该热交换器的另一区段中，该另一区段保持在25℃。冷却所需的时间为15-30秒。冷却至25℃后，立即加入0.2％-0.4％、优选0.4％的浓度的N-乙酰半胱氨酸。在HTST加热过程后添加此化学物质对于将高铁血红蛋白(无活性血红蛋白)保持在低水平是非常重要的。容易地控制加工设备的配置以进行工业操作。二聚体含量-温度曲线图显示在图14中。如果血红蛋白没有交联，则其对热不稳定且在加热步骤后形成沉淀物。此后通过离心或过滤设备去除该沉淀物以形成澄清溶液。

在90℃下的HTST加热过程期间，高铁血红蛋白(无活性血红蛋白)增加(显示在图15中)。在立即添加N-乙酰半胱氨酸后，可以保持低水平的高铁血红蛋白，约小于3％。

下表7显示在热处理步骤后蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白、碳酸酐酶和不合乎需要的不稳定的四聚体或二聚体被去除。使用ELISA法测量免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶的量，而二聚体的量通过HPLC法测定。在HTST热加工步骤后热稳定的交联四聚体血红蛋白的纯度非常高，在98.0-99.9％的范围内。在整个HTST热加工步骤期间，通过血氧分析仪测量的氧分压p50值(在该值处血红蛋白溶液为半(50％)饱和)保持在约30-40mmHg，因此热处理的交联四聚体血红蛋白在90℃是稳定的。

表7

实施例6

包装

因为本发明的产品在缺氧条件下是稳定的，因此用于该产品的包装使透气性最小化是重要的。对于静脉应用，定制设计的100ml输液袋由厚度为0.4mm的5层EVA/EVOH层压材料制成，其透氧性为在室温下0.006-0.132cm³/100平方英寸/24小时/大气压。此特殊材料是VI类塑料(由USP<88>定义)，其满足体内生物学反应试验和物理化学试验并且适合于制造静脉注射用容器(需注意也可以由此材料制成其他形式的包装，取决于所需的应用)。二次包装的铝外包装袋也应用于该初级包装输液袋，其提供额外的屏障以使光暴露和氧扩散最小化。该袋的各层包括：0.012mm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，0.007mm铝(Al)，0.015mm尼龙(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包装薄膜的厚度为0.14mm且其氧传递速率为在室温下0.006cm³/100平方英寸/24小时/大气压。输液袋的示意图绘制在图16中。根据本发明的每个输液袋的总透氧性为在室温下0.0025cm³/24小时/大气压。

实施例7

氧合的改善

(7a)正常组织中氧合的改善

进行一些热稳定的交联四聚体血红蛋白对正常组织氧合的研究(显示在图7中)。在水牛鼠中进行比较药代动力学和药效学研究。通过大鼠的阴茎静脉推注，雄性近交水牛鼠各自施用0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液或林格氏乙酸盐缓冲液(ringer’s acetate buffer)(对照组)。通过Hemocue^TM光度计在1、6、24、48小时确定血浆血红蛋白的浓度-时间分布曲线并与基线读数比较。该方法基于血红蛋白的光度计测量值，其中血红蛋白的浓度以g/dL直接读数。水牛鼠后足肌肉中的氧分压(pO₂)通过Oxylab^TM组织氧合和温度监测仪(OxfordOptronix Limited)直接测量。大鼠通过腹腔内注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液进行麻醉，接着将氧传感器插入至肌肉中。所有pO₂读数通过Datatrax2数据采集系统(World Precision Instrument)以实时的方式记录。结果证明在静脉注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白后，平均pO₂值在15分钟内从基线升高至相对平均氧分压的约2倍并持续至6小时。此外，注射后24-48小时平均氧水平仍然保持在基线值之上25％-30％的水平(图7B)。

(7b)极度低氧的肿瘤区域中氧合的显著改善

通过人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物模型评价极度低氧的肿瘤区域中氧合的改善。下咽鳞状细胞癌(FaDu细胞系)获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。约1x10⁶个癌细胞经皮下注射至4-至6-周龄近交BALB/c AnN-nu(裸鼠)小鼠中。当肿瘤异种移植物达到8-10mm的直径时，通过Oxylab^TM组织氧合和温度监测仪(Oxford Optronix Limited)直接监测肿瘤块内的氧分压(pO₂)。所有pO₂读数通过Datatrax2数据采集系统(WorldPrecision Instrument)以实时的方式记录。当pO₂读数稳定时，通过小鼠的尾静脉静脉注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液，并测量组织氧合。结果证明在静脉注射0.2g/kg所述热稳定的交联四聚体血红蛋白后，在3小时和6小时内分别观察到平均pO₂的超过6.5倍和5倍的显著增加(图8)。

实施例8

癌症治疗研究：鼻咽癌中显著的肿瘤缩小

在施用热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液结合X-线照射后观察到显著的肿瘤缩小(图9A)。采用人鼻咽癌异种移植物模型。约1x10⁶个癌细胞(CNE2细胞系)皮下注射至4至6-周龄近交BALB/c AnN-nu(裸鼠)小鼠中。当肿瘤异种移植物达到8-10mm的直径时，荷瘤小鼠如下随机化至三组中：

1组：林格氏乙酸盐缓冲液(Ctrl)

2组：林格氏乙酸盐缓冲液+X-线照射(2Gy)

3组：热稳定的交联四聚体血红蛋白+X-线照射(2Gy+Hb)

带有CNE2异种移植物的裸鼠用单独X-线照射(2组)或结合热稳定的交联四聚体血红蛋白(3组)。对于X-线照射(2组和3组)，小鼠通过腹腔内注射50mg/kg戊巴比妥溶液进行麻醉。2Gy X-线通过直线加速器系统(Varian MedicalSystems)递送至荷瘤小鼠的异种移植物。对于3组，在X-线治疗前将1.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白通过尾静脉静脉注射至小鼠中。从治疗的第一天开始隔日记录肿瘤尺寸和体重。使用等式1/2LW2计算肿瘤重量，其中L和W代表每次测量时通过数显卡尺(Mitutoyo Co，Tokyo，Japan)测量的肿瘤块的长度和宽度。1组是未治疗的对照组。结果(显示在图9中)证明在用热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液结合X-线照射治疗的小鼠中观察到CNE2异种移植物的显著缩小(3组，图9A)。

实施例9

癌症治疗研究：肝肿瘤显著缩小

另外，在热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液与顺铂联合施用后观察到显著的肿瘤缩小(图9B)。采用大鼠原位肝脏癌症模型。约2x 10⁶个用荧光素酶基因标记的大鼠肝肿瘤细胞(CRL1601-Luc)注射至水牛鼠的肝左叶中。通过Xenogen体内成像系统监测肿瘤生长。注射后2-3周，获取肿瘤组织，切成小块并原位移植至第二组大鼠的肝左叶中。带有肝肿瘤的大鼠如下随机化至三组中：

1组：林格氏乙酸盐缓冲液(对照)

2组：林格氏乙酸盐缓冲液+顺铂(顺铂)

3组：热稳定的交联四聚体血红蛋白+顺铂(顺铂+Hb)

移植了肝肿瘤组织的大鼠用3mg/kg顺铂单独治疗(2组)或与热稳定的交联四聚体血红蛋白联合治疗(3组)。对于2组和3组，大鼠通过腹腔内注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液进行麻醉，并经左门静脉施用顺铂。对于3组，在顺铂治疗前，通过大鼠的阴茎静脉静脉注射0.4g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白。1组是未治疗的对照组。重要的是，在治疗后3周观察到显著的肝肿瘤缩小(图9B)。

实施例10

大鼠急性严重失血性休克的治疗

热稳定的交联四聚体血红蛋白也在大鼠的急性严重失血性休克模型中用作复苏剂。50只Sprague-Dawley大鼠根据复苏剂随机地分成3组，每组16-18只大鼠。

1组：乳酸盐林格溶液(阴性对照，16只大鼠)

2组：动物自体血(阳性对照，16只大鼠)

3组：热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗组(0.5g Hb/kg体重，18只大鼠)

通过抽取50％的动物全血，估计为体重的7.4％，造成急性严重失血性休克。造成失血性休克10分钟后，将乳酸盐林格溶液、动物自体血、或0.5g Hb/kg的热稳定的交联四聚体血红蛋白输注至动物体内。热稳定的交联四聚体血红蛋白的输液速率设置为5mL/h，之后，所有试验动物观察24小时。在研究期间观察和分析一组参数，包括存活、血流动力学、心肌力学、心输出量、心功能、血气、组织氧输送和氧耗量、组织灌注和氧分压(肝、肾和脑)、肝功能和肾功能、血液流变学(血液粘度)、线粒体呼吸控制速率(肝、肾和脑)。其中，存活是主要终点指标。观察24小时后，热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗组与乳酸盐林格溶液或阴性对照组和自体血组相比具有高得多的存活率(显示在下表8中)。

表8

^*Hb＝热稳定的交联四聚体血红蛋白

实施例11：预防手术后肝肿瘤复发和转移的方法

手术切除肝肿瘤是肝癌的一线治疗方法。然而，癌症的手术后复发和转移仍然是这些患者中不良预后的主要因素。例如，以前的研究报道肝切除获得的5年存活率为50％但也存在70％的复发率。对肝细胞癌(HCC)患者的随访研究也表明在约15％的HCC患者中检测到来自原发HCC的肝外转移灶，其中肺是肝外转移的最常见部位。已经提议手术应激，尤其是肝脏手术期间引入的缺血/再灌注(IR)损伤是肿瘤进展的主要原因。外科医生常规上普遍地使用肝血流阻断来预防肝切除术期间的大出血。例如，通过夹闭门管三联(portal triad)阻断血流(Pringle maneuer法)已经用来使失血最小化，并且减少手术期间输液的需求。一项最近的日本研究显示25％外科医生常规地采用Pringle法。然而，Pringle法诱发残肝中不同程度的缺血损伤，并且与癌症复发和转移相关。

以前的动物研究也支持了IR损伤和肿瘤进展的相关性。首先，在一个最近的采用原位肝癌模型的研究中证明了IR损伤和肝切除对肝癌复发和转移的影响。肝IR损伤和肝切除术导致显著的肝肿瘤复发和转移。在小鼠结直肠癌肝转移模型中获得了类似的结果，在该模型中IR损伤的引入加速了结直肠癌肝转移灶的生长。

以前，已经研究了几种保护性策略用于减少切除期间的IR损伤。例如，在较长时间夹闭之前进行短期缺血的操作，称为缺血预处理(Ischemicpreconditioning，IP)，被提议用于触发肝细胞防御机制并且已经用来减少肝切除期间的IR损伤。其他人采用间歇夹闭(Intermittent clamping，IC)操作，该操作允许多个周期的阻断血流然后再灌注。两种方法均被提议有效地使经历肝脏大手术的非肝硬化患者免于发生手术后肝损伤。然而，在肿瘤的情况下，动物研究还显示IP不能使肝脏免于发生由IR损伤诱发的加速肿瘤生长。另外，一些小组尝试使用抗氧化剂诸如α-生育酚和抗坏血酸来使肝脏免于发生IR损伤，从而阻止肝转移。然而，两种抗氧化剂均不能限制由IR刺激的肝内肿瘤生长。

从机理来说，不同范围的证据表明出于许多原因缺氧与肿瘤复发和转移相关：(1)研究显示低氧的肿瘤对放射治疗和化学治疗更有抗性，在治疗中存活的肿瘤细胞易于复发；临床证据还表明具有较多低氧的肿瘤区域的患者具有较高的转移率；(2)在低氧条件下，癌细胞通过低氧诱导因子-1(HIF-1)途径的活化变得更有侵袭性。这再触发补充反应，该补充反应涉及促血管生成因子(pro-angiogenic factor)血管内皮细胞生长因子(VEGF)和受体诸如c-Met和CXCR4，它们增强细胞运动性和归巢至特异性的远处器官；(3)最近的研究也证明循环系统中的癌细胞(CTC)在低氧条件下变得更有侵袭性。在癌症患者的外周血中检测到的循环肿瘤细胞被显示为具有远处转移灶的患者中疾病进展的指标，而低氧使这些细胞具有侵袭性更强的表型并且凋亡潜能减小。特别地，在脑肿瘤中在降低的氧水平下富含抗放射性更强的癌症干细胞群。

因此，鉴于上述观察和研究，本发明的非聚合的交联四聚体血红蛋白用来预防肝切除后的手术后肝肿瘤复发和转移。建立大鼠原位肝癌模型。肝细胞癌细胞系(McA-RH7777细胞)用来在水牛鼠(雄性，300-350g)中建立原位肝癌模型。图17显示概述手术和血红蛋白产品施用步骤的示意图。McA-RH7777细胞(3×10⁵/100μl)注射至水牛鼠的肝囊中以诱发实体肿瘤生长。2周后(当肿瘤体积达到约10×10mm时)，收集肿瘤组织，切成1-2mm³的方块并植入至新一组水牛鼠的肝左叶中。原位肝肿瘤植入后2周，大鼠接受肝切除(带有肝肿瘤的左叶)和部分肝脏IR损伤(右叶缺血30分钟)。

两组植入肿瘤组织的大鼠用于比较肿瘤复发和转移。在1组中，大鼠用戊巴比妥麻醉，并在缺血前1小时经静脉施用0.2g/kg本发明的非聚合的热稳定的交联四聚体血红蛋白。通过用动脉夹夹闭肝脏门静脉的右支和肝动脉的右支，从而在肝脏的右叶中引入缺血。随后，在肝左叶中进行结扎，接着切除带有肝肿瘤的肝左叶。缺血后30分钟时，通过下腔静脉注射另外的0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白，接着进行再灌注。在2组中，林格氏乙酸盐缓冲液作为载体对照、采用相同的步骤注射。在肝切除术操作后4周处死所有大鼠。

为了检查肿瘤生长和转移，在缺血/再灌注和肝切除术操作后4周时采集水牛鼠的肝和肺用于形态学检查。收集组织，石蜡包埋并切片，然后进行苏木精和伊红(H&E)染色。通过组织学检查确认局部复发/转移(肝内)和远处转移(肺)。表9概括了观察结果。

表9：在大鼠原位肝癌模型中在肝切除和IR损伤后4周时肿瘤复发/转移的比较。

为了检查非聚合的热稳定的交联四聚体血红蛋白对肝肿瘤复发和转移的预防作用，在肝切除术和IR操作后4周处死所有大鼠。收集肺和肝组织；比较两组中肝肿瘤复发/转移和肺中的远处转移。结果显示血红蛋白治疗减少了两个器官中复发和转移的发生。

图18显示在肝切除术和缺血/再灌注操作后在IR损伤组的大鼠中诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移的代表性实施例和施用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的保护作用。在图18A中，在IR损伤组中观察到广泛的肝内肝癌复发/转移。在同一大鼠中也出现了远处肺转移(由实线箭头指示)。在图18B中，在IR损伤组的另一实例中观察到肝内肝癌复发/转移(由虚线箭头指示)。在同一实例中观察到广泛的肺转移(由实线箭头指示)。相比，图18C显示了在本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗的大鼠中免于发生肝内肝癌复发/转移和肺部远处转移的代表性实例。

图19显示了在肝切除和IR损伤操作后4周时两组中的组织学检查。对IR损伤和血红蛋白治疗组中的肝组织和肺组织进行组织学检查(H&E染色)以确认肿瘤结节的特性。图中显示了代表性的视野，其显示血红蛋白治疗组(T3)和IR损伤组(T1和T2)中的肝内复发/转移。为进行比较，显示治疗组中的正常肝结构的组织学检查被包括在内(N1)。另外，在IR损伤组(M)中的同一大鼠中发现肺中有远处转移。为进行比较，在治疗组(N2)中显示没有转移的肺组织。

根据研究的结果，得出结论：用本发明的非聚合的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗对肝肿瘤的复发和对其他器官中的转移均有预防作用。

尽管已经就多个实施方案描述了本发明，但这些实施方案并非限制性的。本领域普通技术人员将理解大量的变动和修饰。这样的变动和修饰被认为包括在下列权利要求的范围内。

Claims

1.一种制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；

c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；

d)洗涤所述滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质，得到洗涤过的红细胞；

e)在快速细胞裂解设备中通过精确控制的低渗裂解方法破裂所述洗涤过的红细胞2-30秒或足以裂解所述红细胞的时间，从而以50-1000升/小时的流速形成包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

h)使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除分子量比血红蛋白高的杂质，以从第一血红蛋白溶液中进一步去除任何病毒和残留废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液；

i)对该纯化的血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除蛋白杂质；

j)使用超滤滤器进行第二超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除杂质和浓缩所述纯化的血红蛋白溶液；

k)在缺氧环境中通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯至少交联所述血红蛋白的α-α亚单位以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是非聚合的交联四聚体血红蛋白；

1)用合适的生理缓冲液交换在步骤k)中形成的交联溶液；

m)通过切向流过滤去除任何残留的化学物质；

n)在缺氧环境中热处理所述交联血红蛋白从而使任何残留的未反应的血红蛋白、不稳定的血红蛋白和任何其他蛋白杂质变性并沉淀，使得得到的热稳定的交联四聚体血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成；

o)在热处理所述交联四聚体血红蛋白后立即加入N-乙酰半胱氨酸从而保持低水平的高铁血红蛋白；

p)通过离心或过滤设备去除沉淀物以形成澄清溶液；和

q)将纯化的和热稳定的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中步骤n)所述的不稳定的血红蛋白是血红蛋白二聚体。

3.根据权利要求1或2所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述热处理是在70℃-95℃下进行30秒至3小时的短时间高温过程，然后立即冷却并且在冷却后立即加入0.2-0.4％的量的N-乙酰半胱氨酸。

4.根据权利要求1或2所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是人、牛、猪、犬或马全血。

5.根据权利要求1或2所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述柱色谱包含一个或多个阳离子交换柱或阴离子交换柱。

6.根据权利要求5所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述色谱柱为一个或多个DEAE柱、CM柱和/或羟磷灰石柱。

7.根据权利要求1或2所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述药学可接受的载体为生理缓冲液或水。

8.一种高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物，其包含血红蛋白，所述血红蛋白由通过权利要求1或2的方法形成的非聚合的交联四聚体血红蛋白组成。

9.一种制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；

c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

l)用合适的生理缓冲液交换在步骤k)中形成的交联溶液；

m)通过切向流过滤去除任何残留的化学物质；

n)在90℃至95℃的温度下热处理所述交联血红蛋白从而使任何残留的未反应的血红蛋白、不稳定的血红蛋白和任何其他蛋白杂质变性并沉淀，使得得到的热稳定的交联四聚体血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成，并且立即冷却至25℃；

p)通过离心或过滤设备去除沉淀物以形成澄清溶液；和

10.根据权利要求9所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中步骤n)所述的不稳定的血红蛋白是血红蛋白二聚体。

11.根据权利要求9或10所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述热处理在缺氧环境中进行。

12.根据权利要求9或10所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述热处理进行30秒至3分钟，然后立即冷却并且在冷却后立即加入0.2-0.4％的量的N-乙酰半胱氨酸。

13.根据权利要求9或10所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是人、牛、猪、犬或马全血。

14.根据权利要求9或10所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述柱色谱包含一个或多个阳离子交换柱或阴离子交换柱。

15.根据权利要求14所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述色谱柱为一个或多个DEAE柱、CM柱和/或羟磷灰石柱。

16.一种高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物，其包含血红蛋白，所述血红蛋白由通过权利要求9或10的方法形成的非聚合的交联四聚体血红蛋白组成。

17.一种制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；

c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；

e)在快速细胞裂解设备中通过精确控制的低渗裂解破裂所述洗涤过的红细胞2-30秒或足以裂解所述红细胞的时间，从而以50-1000升/小时的流速形成包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

l)用合适的生理缓冲液交换在步骤k)中形成的交联溶液；

m)通过切向流过滤去除任何残留的化学物质；

n)将N-乙酰半胱氨酸加入至所述交联四聚体血红蛋白并在缺氧环境中在70℃至95℃的温度下热处理所述交联血红蛋白从而使任何残留的未反应的血红蛋白、不稳定的血红蛋白和任何其他蛋白杂质变性并沉淀，使得得到的热稳定的交联四聚体血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成；

p)通过离心或过滤设备去除沉淀物以形成澄清溶液；和

18.根据权利要求17所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中步骤n)所述的不稳定的血红蛋白是血红蛋白二聚体。

19.根据权利要求17或18所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述热处理进行30秒至3小时，然后立即冷却至25℃并且在冷却后立即加入0.2-0.4％的量的N-乙酰半胱氨酸。

20.根据权利要求17或18所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中在热处理前加入的N-乙酰半胱氨酸的量为0.2％。

21.根据权利要求17或18所述的制备高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是人、牛、猪、犬或马全血。

22.一种高度纯化的和热稳定的包含氧载体的药物组合物，其包含血红蛋白，所述血红蛋白由通过权利要求17或18的方法形成的非聚合的交联四聚体血红蛋白组成。