CN105497894B - 用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白-光敏剂试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白‑光敏剂试剂及其应用，所述的血红蛋白‑光敏剂试剂包括一种血红蛋白与光敏剂的非共价结合物，该血红蛋白与光敏剂的非共价结合物是按照以下方法制备得到的：将血红蛋白溶液与光敏剂溶液混合，向混合液中充氧，得到充氧的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物。本发明通过血红蛋白供氧，采用激光为光源，在光敏剂和氧气富集于肿瘤后照射，能大大提高光动力治疗中活性氧的产量，抑制肿瘤生长，疗效增强显著。

Description

用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白-光敏剂试剂及其应用
技术领域
本发明是关于一种用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白-光敏剂试剂及其应用，具体而言，本发明是关于一种血红蛋白与光敏剂非共价结合的试剂，其可用于肿瘤光动力治疗方法，以血红蛋白提供充足氧气，增强光动力治疗的效果，以应用于抑制肿瘤的生长。
背景技术
针对肿瘤的治疗手段有很多，但目前最基本也是最主要的方法仍是手术、放疗和化疗。探索新的、毒副作用小的治疗方法，或者在目前治疗方法的基础上增加一些辅助手段，进而提高疗效、减轻毒副作用，是目前肿瘤治疗亟待解决的问题。
近年来，光动力治疗由于纳米技术的发展引起了人们的广泛关注。光动力治疗，主要是将吲哚菁绿(ICG)、卟啉衍生物和二氢卟吩-e6(Ce6)等光敏剂呈递到肿瘤部位，在外部光源照射下，光敏剂能够吸收光能，并将氧气转化为有细胞毒性的活性氧。该疗法具有非侵入性、安全无毒和高效率等特点，随着光纤技术的发展，从理论上说光动力疗法可以应用于各种肿瘤的治疗。然而，实际应用中，肿瘤光动力疗法的治疗效果却不是令人很满意。
发明内容
本发明主要是对肿瘤光动力疗法进行研究，提供一种相关的治疗试剂及其制备方法与应用，以增强光动力治疗的效果。
本案发明人在研究中发现，光动力疗法中，氧气作为反应物对于肿瘤光动力治疗效果具有一定影响，肿瘤组织中由于血管的不规则生长而具有缺氧的特点，肿瘤缺氧限制了光动力治疗活性氧的产生，影响了治疗效果。
一方面，本发明提供了一种血红蛋白-光敏剂试剂，其可用于肿瘤光动力治疗方法，以血红蛋白提供充足氧气，增强光动力治疗的效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂，包括一种血红蛋白与光敏剂的非共价结合物。
目前血红蛋白作为运氧载体在肿瘤方面的临床应用，主要体现在对放射疗法的细胞增敏作用(缺氧肿瘤细胞对放疗不敏感)；现有技术中尚未在肿瘤光动力治疗领域发现利用含氧血红蛋白提供氧气以增强肿瘤光动力治疗的相关报道。本发明中将血红蛋白与光敏剂非共价结合，用于肿瘤的光动力治疗，其中通过血红蛋白供氧，可使肿瘤中有丰富的氧来源，能大大增强光动力的疗效。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂中，所述血红蛋白与光敏剂的非共价结合物是按照以下方法制备得到的：
将血红蛋白溶液与光敏剂溶液混合，得到血红蛋白与光敏剂的非共价结合物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物在制备时，血红蛋白溶液与光敏剂溶液的混合在常压、室温条件下进行即可。血红蛋白溶液与光敏剂溶液后，血红蛋白与光敏剂在溶液中接触立即即可形成非共价结合物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂中，所述血红蛋白与光敏剂的非共价结合物为充氧的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物，其是按照以下方法制备得到的：
将血红蛋白溶液与光敏剂溶液混合；向混合液中充氧，得到充氧的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物。
根据本发明的具体实施方案，血红蛋白与光敏剂的非共价结合物在制备时，血红蛋白的终浓度为0.4～15mg/mL；光敏剂的终浓度为10～500μg/mL。优选地，充氧时，溶解氧浓度达到30mg/L以上，更优选为30～35mg/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂中，所述血红蛋白来源为动物血液，不会引起交叉感染和凝集反应。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂中，所述光敏剂选自吲哚菁绿、Ce6、血卟啉衍生物中的一种或多种。
血红蛋白在充氧后能将氧气释放至缺氧的肿瘤中。血红蛋白能与光敏剂分子进行非共价结合，血红蛋白携带的氧气分子可以得到高效利用。采用激光为光源，在光敏剂和氧气富集于肿瘤后照射，产生大量活性氧抑制肿瘤生长。
根据本发明的具体实施方案，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂为包括血红蛋白与光敏剂的非共价结合物的溶液。更具体地，该溶液中，血红蛋白的终浓度为5～15mg/mL；光敏剂优选为吲哚菁绿，其在溶液中的终浓度为10～500μg/mL。进一步优选地，本发明的血红蛋白-光敏剂试剂为充氧后的包括血红蛋白与光敏剂的非共价结合物的溶液，该溶液中溶解氧浓度达到30～35mg/L。
另一方面，本发明还提供了所述的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物在制备用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白-光敏剂试剂中的应用。具体应用时，是将充氧的血红蛋白-光敏剂试剂注射至肿瘤中，然后通过近红外激光照射分布血红蛋白-光敏剂试剂的肿瘤区域，肿瘤细胞将被增强的光动力毒性杀死，肿瘤被破坏。
另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤光动力治疗的系统，该系统包括：
本发明所述的血红蛋白-光敏剂试剂或制备所述血红蛋白-光敏剂试剂的试剂材料；
激光光源(或称激光器)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于肿瘤光动力治疗的系统中，其中制备所述血红蛋白-光敏剂试剂的试剂材料例如包括血红蛋白、光敏剂，还可进一步包括充氧设备等。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于肿瘤光动力治疗的系统中，所述激光光源为提供光敏剂激发波长的光源，具体可根据光敏剂不同提供不同激发波长，可分为可见激光和近红外激光。考虑到光对于组织的穿透能力，选择近红外激光更有利于临床应用，如吲哚菁绿一般采用808nm近红外激光作为光源。光源一般采用单波长激光，较连续普通光源能量更为集中，功率易控制。激光的能量密度与光动力活性氧的产生为正相关，但超过一定能量密度后，光动力反应的效率将达到稳定。优选地，激光器的激发光波长为600～820nm。具体应用时，能量密度范围为0.05～0.5W/cm2。此外，治疗时长范围为300～1800s。
另一方面，本发明还提供了一种利用本发明所述的系统进行肿瘤光动力治疗的方法，该方法包括：
将本发明所述的血红蛋白-光敏剂试剂注入待治疗的肿瘤内；优选地，所述血红蛋白-光敏剂试剂的注入量以其中的血红蛋白计为75～100mg/kg；
利用激光光源发出光敏剂激发波长的激光，照射注入所述血红蛋白-光敏剂试剂的肿瘤区域，激发光波长为600～820nm，能量密度范围为0.05～0.5W/cm2；单次治疗时长范围为300～1800s。
本发明的方法，通过充足的氧气供应，能大大提高光动力治疗中活性氧的产量，疗效增强显著；另可通过调控激光光源的输出能量密度和输出时间，能将激光能量集中在肿瘤区域，减少对正常机体的影响。
本发明的有益技术效果：
本发明通过充足的氧气供应，能大大提高光动力治疗中活性氧的产量，疗效增强显著；
血红蛋白中氧气结合点与光敏剂距离小，氧气得以充分转化为活性氧；
活性氧能对肿瘤细胞造成不可逆的氧化损伤，导致肿瘤被破坏；
本发明的血红蛋白-光敏剂的制备方法简便易行，便于操作推广；
可多次治疗，灵活配置治疗方案。
附图说明
图1为血红蛋白与吲哚菁绿分子的相互作用计算分析示意图。
图2显示ROS探针(DCFH-DA)检测不同溶液在激光照射下ROS产量的结果。
图3显示以充氧血红蛋白供氧的增强光动力疗法的细胞存活率检测结果。
图4显示以充氧血红蛋白供氧的增强光动力疗法的细胞坏死分析结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案、目的和效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例以及附图对发明进行详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
血红蛋白水溶液(终浓度为5mg/mL)与吲哚菁绿溶液混合(终浓度为100μg/mL)。通过导气管将纯氧通入混合溶液中，使血红蛋白充氧，溶液中溶解氧浓度达到35mg/L。
图1为血红蛋白与吲哚菁绿分子的相互作用计算分析示意图。血红蛋白中的四个血红素分子可载氧，通过生物分子计算分析，吲哚菁绿分子与血红蛋白分子非共价结合后，与四个载氧位点的距离分别为17.3、18.4、21.3、25.4埃米，则氧气分子与光敏剂分子十分接近，光动力反应中氧气的利用率得到提高。
直径35mm、高12mm的带盖培养皿，将充氧后的血红蛋白-吲哚菁绿混合溶液(血红蛋白浓度为5mg/mL，吲哚菁绿浓度为100μg/mL)加入培养皿中。培养皿上方放置808nm激光器，控制其能量输出密度为0.1W/cm2。在溶液中还加入活性氧探针DCFH-DA，检测光动力反应后活性氧的产量。另，该实验还用吲哚菁绿溶液作为对照组。
图2显示ROS探针(DCFH-DA)检测不同溶液在激光照射下ROS产量的结果。结果显示，有血红蛋白为光动力供氧的混合溶液组，其活性氧产量是单纯吲哚菁绿溶液的9.5倍。
实施例2：
在96孔板以5000个/孔的密度接种MCF-7肿瘤细胞过夜，将充氧血红蛋白(终浓度为5mg/mL，充氧至溶氧量为30mg/L以上)与吲哚菁绿(终浓度为100μg/mL)混合溶液替换细胞培养基，孵育30分钟，然后将808nm激光器通过调节功率和聚焦，使光斑以0.1W/cm2的功率密度照射肿瘤区域5分钟进行治疗。治疗完毕后继续培养细胞24小时，对细胞存活率进行分析。
实验结果参见图3所示，图中从左至右组别依次为：未处理血红蛋白+吲哚菁绿(该组为无光照组，之后四组均有激光照射处理)、吲哚菁绿(脱氧溶液)、脱氧血红蛋白+吲哚菁绿、吲哚菁绿(充氧溶液)、充氧血红蛋白+吲哚菁绿。未处理血红蛋白+吲哚菁绿组别结果说明，在未发生光动力作用时，无论是血红蛋白还是光敏剂都无法造成细胞杀伤作用；有血红蛋白为光动力供氧的混合溶液组，细胞存活率降至10％以下。
实施例3：
在裸鼠背侧接种MCF-7肿瘤细胞，当移植瘤生长至体积为100mm3时，将充氧(充氧至溶氧量为30mg/L以上)血红蛋白(终浓度为15mg/mL)与吲哚菁绿(终浓度为500μg/mL)混合溶液120μL注射至肿瘤内，将808nm激光器通过调节功率和聚焦，使光斑以0.1W/cm2的功率密度照射肿瘤区域30分钟。
图4显示为以充氧血红蛋白供氧的增强光动力疗法的细胞坏死分析。通过对治疗裸鼠的观察，治疗后6天肿瘤区域坏死结痂，肿瘤生长得到明显抑制。
实施例4：
在96孔板以5000个/孔的密度接种MCF-7肿瘤细胞过夜，将充氧血红蛋白(终浓度为5mg/mL，充氧至溶氧量为30mg/L以上)与二氢卟吩-e6(终浓度为10μg/mL)混合溶液替换细胞培养基，孵育30分钟，然后将660nm激光器通过调节功率和聚焦，使光斑以0.5W/cm2的功率密度照射肿瘤区域5分钟。治疗完毕后继续培养细胞24小时，对细胞存活率进行分析。相比于对照组，治疗组细胞存活率降至8.1％。

Claims (8)

1.一种血红蛋白-光敏剂试剂，该血红蛋白-光敏剂试剂包括一种血红蛋白与光敏剂的非共价结合物；
其中，所述血红蛋白与光敏剂的非共价结合物为充氧的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物，其是由以下方法制备得到的：将血红蛋白溶液与光敏剂溶液混合；向混合液中充氧，得到充氧的血红蛋白与光敏剂的非共价结合物；充氧时，溶解氧浓度达到30～35mg/L；
其中，血红蛋白与光敏剂的非共价结合物在制备时，血红蛋白的终浓度为0.4～15mg/mL；光敏剂的终浓度为10～500μg/mL；
所述光敏剂为吲哚菁绿。
2.根据权利要求1所述的血红蛋白-光敏剂试剂，其中，所述血红蛋白来源为动物血液。
3.根据权利要求1所述的血红蛋白-光敏剂试剂，该血红蛋白-光敏剂试剂为包括血红蛋白与光敏剂的非共价结合物的溶液；该溶液中，血红蛋白的终浓度为5～15mg/mL；光敏剂在溶液中的终浓度为10～500μg/mL。
4.根据权利要求3所述的血红蛋白-光敏剂试剂，其中，血红蛋白-光敏剂试剂为充氧后的包括血红蛋白与光敏剂的非共价结合物的溶液，该溶液中溶解氧浓度达到30～35mg/L。
5.一种血红蛋白与光敏剂的非共价结合物在制备用于肿瘤光动力治疗的血红蛋白-光敏剂试剂中的应用，其中，所述血红蛋白-光敏剂试剂为权利要求1～4任一项所述的血红蛋白-光敏剂试剂。
6.一种用于肿瘤光动力治疗的系统，该系统包括：
权利要求1～4任一项所述的血红蛋白-光敏剂试剂；
激光光源。
7.根据权利要求6所述的用于肿瘤光动力治疗的系统，其中，所述激光光源为提供光敏剂激发波长的光源。
8.根据权利要求7所述的用于肿瘤光动力治疗的系统，其中，激光光源的激发光波长为600～820nm，能量密度范围为0.05～0.5W/cm2。
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