CN108175857A - 用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料及制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋‑锌原卟啉复合材料及制法和应用，属于复合材料领域。解决硫化铋在光动力学治疗时光生电子‑空穴的复合以及细胞中血红素氧合酶(HO‑1)的、抗氧化应激能力导致PDT效率较低的问题。所述复合材料是通过合成聚N‑异丙基丙烯酰胺‑丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋纳米材料，然后利用羧基和氨基的缩合反应合成的硫化铋‑锌原卟啉复合材料。制备的复合材料通过抑制血红素氧合酶活性和促进电子‑空穴分离两种途径增强光动力学治疗效率，同时上述材料具有良好的生物兼容性、光稳定性、CT成像能力以及增强的PDT效率，为新型纳米诊疗一体化系统的设计提供了思路，对癌症早期诊断与治疗有重要意义。

Description

用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋- 锌原卟啉复合材料及制法和应用
技术领域
本发明属于复合材料技术领域，具体涉及一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料及制法和应用。
背景技术
光动力学疗法(Photodynamic therapy，PDT)作为一种非侵入性医疗技术，与手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，具有低毒、副作用小、广谱抗癌、靶向性高等优势。铋元素与金和钽相比，具有相对最高的原子序数(钽，73；金，79；铋，83)和X射线衰减系数(在100keV加速电压下：钽，4.30；金，5.16；铋，5.74cm2/g)，明显大于碘元素(53和1.94cm2/g)，因此铋可以作为X射线电子计算机断层扫描技术(Computed Tomography，CT)造影剂，并且造影效果比较好。同时临床使用含铋药物已有两百多年的历史，具有长期残留时间、低毒性、在器官中无残留等优点。
由于N型半导体硫化铋(Bi2S3)的带隙较窄(约为1.3eV，对应波长为950nm)，具有高的近红外吸收系数，因此可以被808nm激光激发。目前已有报道发现Bi2S3具有近红外光(808nm)激发所引起的光热现象，并用于光热治疗，但是没有关于其光动力治疗方面的报道。考虑到其半导体特性，当用能量大于其带隙宽度的光激发Bi2S3时，其价带的电子会跃迁到导带，由于Bi2S3的导带位置略高于标准氢电势，使其跃迁的自由电子与水中的溶解O2反应生成超氧阴离子(O2·-)，而留在价带上的空穴则和H2O反应生成羟基自由基(OH·)，进而杀死细胞达到光动力学治疗作用。然而硫化铋中光生电子-空穴的复合以及细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)的抗氧化应激能力导致PDT效率较低。血红素氧合酶-1(HO-1)是一种广泛存在的微粒体酶，凡引起细胞活性氧物种(ROS)水平增加的外来刺激，如氧化应激、光照、高温、重金属、毒素等，大都能使HO-1的表达增加。HO-1作为血红素分解的起始和限速酶，可以将血红素分解为一氧化碳(CO)、胆绿素和游离的Fe2+。CO通过诱导细胞中三磷酸腺苷的产生，参与丝裂原活化蛋白激酶信号通路中p38的激活，并诱导抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，从而使细胞免于凋亡。胆绿素通过胆绿素还原酶被还原为胆红素。CO、Fe2+和胆红素是血红素代谢的终产物，它们可以通过减轻氧化应激产生的ROS以降低机体的炎性反应，起到细胞保护作用。因此如何阻止电子-空穴复合并降低HO-1活性对提高PDT效率非常重要。
发明内容
本发明要解决现有技术中硫化铋中光生电子-空穴的复合以及细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)的抗氧化应激能力导致PDT效率较低的技术问题，提供一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料及制法和应用，所述复合材料在提高硫化铋产出活性氧物种的同时降低了肿瘤细胞内的血红素氧合酶-1活性，从而提高肿瘤光动力学治疗效率。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料，是首先通过合成聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋纳米材料，然后利用羧基和氨基的缩合反应合成的硫化铋-锌原卟啉复合材料，其中硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为(98-99.5)％：(0.5-2)％。
在上述技术方案中，所述硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为99％：1％。
一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，包括以下步骤：
(1)称取15-20mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到上述硫化铋分散水溶液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取0.5-2mL、摩尔浓度为500μM的氨基化锌原卟啉加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌5-10小时，离心或者透析去除未反应的锌原卟啉，透析得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
在上述技术方案中，所述制得的硫化铋-锌原卟啉复合材料中硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为99％：1％。
在上述技术方案中，所述EDC的质量浓度为5mg/mL，用量为1mL。
在上述技术方案中，所述NHS的质量浓度为5mg/mL，用量为1mL。
在上述技术方案中，所述聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋是通过下述方法制得：
(1)在反应瓶中依次加入2g异丙基丙烯酰胺、0.2g丙烯酰胺、0.1g三硫代碳酸酯、0.1g偶氮二异丁氰和100mL的1,4二氧六环，通入氮气鼓泡30min除去反应瓶中的氧气，密封后将反应瓶置于70℃油浴反应24h；反应结束后，将反应瓶置于冰水中冷却至室温，用无水乙醚沉淀产物，然后将沉淀后的产物用四氢呋喃溶解，重复四氢呋喃溶解-乙醚沉淀操作3次后将产物置于40℃真空干燥，得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物；
(2)称取200mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物置于反应瓶，加20mL水中分散后将反应瓶置于油浴加热至50℃，然后加入4mL硫化铋的氯仿溶液(5mg/mL)，继续搅拌12h，离心、水洗、冻干得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋。
在上述技术方案中，所述氨基化锌原卟啉是通过下述方法制得：
(1)称取原卟啉溶于四氢呋喃，加入2.45mL三乙胺，冷却至，滴加1.7mL氯甲酸乙酯，搅拌2小时，过滤除去三乙胺盐酸盐；在滤液中加入乙二胺室温反应24小时，真空蒸干溶剂，水洗后冻干得到氨基化原卟啉；
(2)称取氨基化原卟啉并分散在氯仿中，加入乙酸锌，室温搅拌1小时后将产物旋转蒸发，得到的固体分散在去离子水中透析，最后冻干得到氨基化锌原卟啉。
一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料用于肿瘤光动力学治疗。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的硫化铋-锌原卟啉复合材料是利用在硫化铋纳米材料中引入锌原卟啉形成的复合材料，通过锌原卟啉的空穴传递能力使得硫化铋材料的光生电子和空穴分离，有效地增加硫化铋纳米材料产生活性氧的能力；通过锌原卟啉对血红素氧合酶-1的结合能力抑制了血红素氧合酶-1对细胞的保护作用；因此，本发明提供的硫化铋-锌原卟啉复合材料通过抑制血红素氧合酶活性和促进电子-空穴分离两种途径增强光动力学治疗效率。同时硫化铋-锌原卟啉复合材料具有良好的生物兼容性、光稳定性、CT成像能力以及增强的PDT效率，为新型纳米诊疗一体化系统的设计提供了崭新的思路，对癌症的早期诊断与治疗有重要意义。
(2)本发明提供的硫化铋-锌原卟啉复合材料具有肿瘤光动力学治疗性质，可以应用于肿瘤光动力学治疗。
(3)本发明提供的硫化铋-锌原卟啉复合材料对4T1细胞杀伤程度大于80％。
(4)本发明提供的硫化铋-锌原卟啉复合材料经尾静脉注射到小鼠肿瘤模型中，经NIR照射后15天内肿瘤可以完全清除并不复发。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为原卟啉和氨基化原卟啉红外透过谱。
图2a为氨基化原卟啉和氨基化锌原卟啉的紫外可见吸收光谱。
图2b为氨基化原卟啉和氨基化锌原卟啉的荧光光谱。
图3为硫化铋-锌原卟啉复合材料的透射电子显微镜照片。
图4为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料在近红外光照射下DCF荧光曲线。
图5为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料的体外细胞毒性MTT比色法测细胞存活率结果。
图6为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料的近红外光照射下细胞损伤MTT比色法测细胞存活率结果。
图7为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料(100μg/mL)在近红外光照射下细胞活死染图片。
图8为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料(20mg/kg小鼠)经尾静脉注射后小鼠的肿瘤生长曲线。
图9为治疗结束后小鼠主要器官的苏木精-伊红染色图。
具体实施方式
本发明提供一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料，是首先通过合成聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋纳米材料，然后利用羧基和氨基的缩合反应合成的硫化铋-锌原卟啉复合材料，其中硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为(98-99.5)％：(0.5-2)％；优选质量百分比为99％：1％。
本发明提供的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法具体步骤如下：
1、氨基化原卟啉的合成：
称取100mg原卟啉溶于20mL四氢呋喃，加入2.45mL三乙胺，冷却至，滴加1.7mL氯甲酸乙酯，搅拌2h，过滤除去三乙胺盐酸盐。在滤液中加入1.2mL乙二胺室温反应24h，真空蒸干溶剂，水洗后冻干得到氨基化原卟啉。
图1为原卟啉和氨基化原卟啉红外透过谱，该图表明可以成功的获得氨基化原卟啉材料。
2、氨基化锌原卟啉的合成：
称取50mg氨基化原卟啉分散在20mL氯仿中，加入20mg乙酸锌，室温搅拌1h后将产物旋转蒸发，得到的固体分散在去离子水中透析，最后冻干得到氨基化锌原卟啉。
图2为氨基化原卟啉和氨基化锌原卟啉的紫外可见吸收光谱(2a)和荧光光谱(2b)，该图表明可以成功的合成氨基化锌原卟啉。
3、聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋的合成
(1)在反应瓶中依次加入2g异丙基丙烯酰胺、0.2g丙烯酰胺、0.1g三硫代碳酸酯、0.1g偶氮二异丁氰和100mL的1,4二氧六环，通入氮气鼓泡30min除去反应瓶中的氧气，密封后将反应瓶置于70℃油浴反应24h；反应结束后，将反应瓶置于冰水中冷却至室温，用大量的无水乙醚沉淀产物，然后将沉淀后的产物用四氢呋喃溶解，重复四氢呋喃溶解-乙醚沉淀操作3次后将产物置于40℃真空干燥，得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物；
(2)称取200mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物置于反应瓶，加20mL水中分散后将反应瓶置于油浴加热至50℃，然后加入4mL硫化铋的氯仿溶液(5mg/mL)，继续搅拌12h，离心、水洗、冻干得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋。
4、硫化铋-锌原卟啉复合材料的合成：
(1)称取15-20mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到20mL超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，5mg/mL)加入到上述硫化铋分散水溶液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取1mL N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS，5mg/mL)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取0.5-2mL氨基化锌原卟啉(500μM)加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌5-10小时，离心或者透析去除未反应的锌原卟啉，得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
图3为硫化铋-锌原卟啉复合材料的透射电子显微镜照片，该图表明合成的硫化铋-锌原卟啉复合材料具有较好的分散性。
本发明提供一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料用于肿瘤光动力学治疗。
上述硫化铋-锌原卟啉复合材料的性能评价试验：
1、体外细胞毒性测试方法
取对数生长期4T1细胞，用胰酶消化后配成105个/mL细胞悬液，后以每孔100μL接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料进行培养24小时，利用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔OD值/对照孔OD值)×100％)，重复三次实验；
2、近红外光照射下细胞损伤实验
(1)MTT方法：取对数生长期4T1细胞，用胰酶消化后配成105个/mL细胞悬液，后以每孔100μL接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料孵育6小时后用808nm近红外光照射进行实验，功率密度为0.75W/cm2，照射10min。然后在37℃培养箱继续孵育18小时，利用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔OD值/对照孔OD值)×100％)，重复三次实验；
(2)活死染方法：4T1细胞以每孔8×104个(800μL)的密度接种到12孔板中。24小时后分别加入硫化铋及硫化铋-锌原卟啉复合材料进行培养。孵育6小时后用808nm近红外光照射进行实验，功率密度为0.75W/cm2，照射10min。然后在37℃培养箱继续孵育18小时后，利用钙黄绿素-AM(2μM)和碘化丙啶(4μM)对细胞进行染色，2小时后用PBS洗去游离的染料，在荧光显微镜下观察。
3、近红外光照射下动物体肿瘤的光热和光动力治疗
在雌性小鼠的右侧背部进行碘酒/乙醇消毒，皮下移植0.1mL(1-2)×107的4T1细胞PBS悬液，直到肿瘤的体积生长接近待小鼠皮下实体肿瘤长到体积约70mm3时，将小鼠随机分成6组，每6只小鼠一组。小鼠经麻醉后经尾静脉注射PBS(A和B)、硫化铋(C和D)及硫化铋-锌原卟啉复合材料(E和F)，其中注射终浓度为20mg/kg小鼠。在注射24小时后对A、C和E三组小鼠进行808nm近红外光照射10min，功率0.75W/cm2，其它三组不进行近红外光照射，每天记录肿瘤变化情况，连续记录15天，绘制肿瘤生长曲线。实验结束后，处死小鼠，获得主要器官，经苏木精-伊红染色后观察肿瘤病理及主要器官变化情况，研究硫化铋-锌原卟啉复合材料对肿瘤及其他器官的影响。
实施例1：质量比为99％：1％的硫化铋-锌原卟啉复合材料的合成：
(1)称取20mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到20mL超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，5mg/mL)加入到上述硫化铋分散水溶液中，超声、室温搅拌4小时，透析去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取1mL N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS，5mg/mL)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌4小时，透析去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取1mL氨基化锌原卟啉(500μM)加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌10小时，透析去除未反应的锌原卟啉，得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
实施例2：质量比为99.5％：0.5％的硫化铋-锌原卟啉复合材料的合成：
(1)称取20mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到20mL超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，5mg/mL)加入到上述硫化铋分散液中，超声、室温搅拌4小时，离心去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取1mL N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS，5mg/mL)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌4小时，离心去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取0.8mL氨基化锌原卟啉(500μM)加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌10小时，透析去除未反应的锌原卟啉，得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
实施例3：质量比为98％：2％的硫化铋-锌原卟啉复合材料的合成：
(1)称取15mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到20mL超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，5mg/mL)加入到上述硫化铋分散液中，超声、室温搅拌2小时，透析去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取1mL N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS，5mg/mL)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌2小时，透析去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取0.5mL氨基化锌原卟啉(500μM)加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌5小时，离心去除未反应的锌原卟啉，得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
实施例1制备的硫化铋-锌原卟啉复合材料的性能评价试验：
1、近红外光激发下硫化铋及硫化铋-锌原卟啉活性氧物种产生测试
使用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCF)对体系总活性氧物种进行检测，取10μL储存液(10mg/mL)加入到1384μL氢氧化钠溶液(10mM)中裂解30min，然后加入7mL PBS缓冲液。取80μL DCF溶液加入到20μL硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料的PBS溶液中(500μg/mL)，混匀，用808nm激光照射10min，激光照射的功率密度为0.75W/cm2。用酶标仪检测DCF的荧光谱线，其中激发波长为490nm，检测波长范围为500-600nm。
图4为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料在近红外光照射下DCF荧光曲线，该图表明在近红外光照射下硫化铋和硫化铋-锌原卟啉均能产生活性氧，并且硫化铋-锌原卟啉产生较多。
2、硫化铋及硫化铋-锌原卟啉的细胞兼容性测试
取对数生长期4T1细胞，用胰酶消化后配成105个/mL细胞悬液，后以每孔100μL接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料(浓度为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)进行培养24小时，利用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔OD值/对照孔OD值)×100％)，重复三次实验；
图5为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料的体外细胞毒性MTT比色法测细胞存活率结果，该图表明硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料具有较好的细胞兼容性。
3、硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料在近红外光照射下细胞损伤实验
(1)MTT方法：取对数生长期4T1细胞，用胰酶消化后配成105个/mL细胞悬液，后以每孔100μL接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料(浓度为0、25、50、100μg/mL)孵育6小时后用808nm近红外光照射进行实验，功率密度为0.75W/cm2，照射10min。然后在37℃培养箱继续孵育18小时，利用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔OD值/对照孔OD值)×100％)，重复三次实验；
(2)活死染方法：4T1细胞以每孔8×104个(800μL)的密度接种到12孔板中。24小时后分别加入硫化铋及硫化铋-锌原卟啉复合材料(浓度为100μg/mL)进行培养。孵育6小时后用808nm近红外光照射进行实验，功率密度为0.75W/cm2，照射10min。然后在37℃培养箱继续孵育18小时后，利用钙黄绿素-AM(2μM)和碘化丙啶(4μM)对细胞进行染色，2小时后用PBS洗去游离的染料，在荧光显微镜下观察。
图6为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料的近红外光照射下细胞损伤MTT比色法测细胞存活率结果，该图表明硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料均可以杀伤细胞，并且硫化铋-锌原卟啉的杀伤能力较强，对4T1细胞杀伤程度大于80％。
图7为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉复合材料(100μg/mL)在近红外光照射下细胞活死染图片，该结果表明硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料均可以杀伤细胞，并且硫化铋-锌原卟啉的杀伤能力较强。
4、硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料在近红外光照射下动物体肿瘤的光热和光动力治疗
在雌性小鼠的右侧背部进行碘酒/乙醇消毒，皮下移植0.1mL(1-2)×107的4T1细胞PBS悬液，直到肿瘤的体积生长接近待小鼠皮下实体肿瘤长到体积约70mm3时，将小鼠随机分成6组，每6只小鼠一组。小鼠经麻醉后经尾静脉注射PBS(A和B组)、硫化铋(C和D组)及硫化铋-锌原卟啉复合材料(E和F组)，其中注射终浓度为20mg/kg小鼠。在注射24小时后对A、C和E三组小鼠进行808nm近红外光照射10min，功率0.75W/cm2，其它三组不进行近红外光照射，每天记录肿瘤变化情况，连续记录15天，绘制肿瘤生长曲线。实验结束后，处死小鼠，获得主要器官，经苏木精-伊红染色后观察肿瘤病理及主要器官变化情况，研究硫化铋-锌原卟啉复合材料对肿瘤及其他器官的影响。
图8为硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉材料(20mg/kg小鼠)经尾静脉注射后小鼠的肿瘤生长曲线，该结果表明硫化铋和硫化铋-锌原卟啉复合材料均可以抑制肿瘤生长，并且硫化铋-锌原卟啉的抑制能力较强，在注射后6天基本消除肿瘤。
图9为治疗结束后小鼠主要器官的苏木精-伊红染色图，该结果表明硫化铋以及硫化铋-锌原卟啉具有较好的生物兼容性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料，其特征在于，是首先通过合成聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋纳米材料，然后利用羧基和氨基的缩合反应合成的硫化铋-锌原卟啉复合材料，其中硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为(98-99.5)％：(0.5-2)％。
2.根据权利要求1所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料，其特征在于，所述硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为99％：1％。
3.一种权利要求1所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取15-20mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋粉末加入到超纯水中，超声分散，得到硫化铋分散水溶液；
(2)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到上述硫化铋分散水溶液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的EDC，得到EDC修饰的硫化铋分散液；
(3)取N-羟基丁二酰亚胺乙醇(NHS)加入到上述EDC修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌2-4小时，离心或者透析去除未反应的NHS，得到NHS修饰的硫化铋分散液；
(4)取0.5-2mL、摩尔浓度为500μM的氨基化锌原卟啉加入到上述NHS修饰的硫化铋分散液中，超声、室温搅拌5-10小时，离心或者透析去除未反应的锌原卟啉，透析得到硫化铋-锌原卟啉复合材料的分散液，冻干得到该复合材料的粉末样品。
4.根据权利要求3所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，所述制得的硫化铋-锌原卟啉复合材料中硫化铋和锌原卟啉的质量百分比为99％：1％。
5.根据权利要求3所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，所述EDC的质量浓度为5mg/mL，用量为1mL。
6.根据权利要求3所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，所述NHS的质量浓度为5mg/mL，用量为1mL。
7.根据权利要求3所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，所述聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋是通过下述方法制得：
(1)在反应瓶中依次加入2g异丙基丙烯酰胺、0.2g丙烯酰胺、0.1g三硫代碳酸酯、0.1g偶氮二异丁氰和100mL的1,4二氧六环，通入氮气鼓泡30min除去反应瓶中的氧气，密封后将反应瓶置于70℃油浴反应24h；反应结束后，将反应瓶置于冰水中冷却至室温，用无水乙醚沉淀产物，然后将沉淀后的产物用四氢呋喃溶解，重复四氢呋喃溶解-乙醚沉淀操作3次后将产物置于40℃真空干燥，得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物；
(2)称取200mg聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物置于反应瓶，加20mL水中分散后将反应瓶置于油浴加热至50℃，然后加入4mL、浓度为5mg/mL的硫化铋的氯仿溶液，继续搅拌12h，离心、水洗、冻干得到聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚物修饰的硫化铋。
8.根据权利要求3所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料的制法，其特征在于，所述氨基化锌原卟啉是通过下述方法制得：
(1)称取原卟啉溶于四氢呋喃，加入2.45mL三乙胺，冷却至0℃，滴加1.7mL氯甲酸乙酯，搅拌2小时，过滤除去三乙胺盐酸盐；在滤液中加入乙二胺室温反应24小时，真空蒸干溶剂，水洗后冻干得到氨基化原卟啉；
(2)称取氨基化原卟啉并分散在氯仿中，加入乙酸锌，室温搅拌1小时后将产物旋转蒸发，得到的固体分散在去离子水中透析，最后冻干得到氨基化锌原卟啉。
9.权利要求1或2所述的用于近红外光激发下具有肿瘤光动力学治疗性质的硫化铋-锌原卟啉复合材料用于肿瘤光动力学治疗。
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