CN108456302A - 一种富勒烯酞菁类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种富勒烯酞菁类衍生物及其制备方法和应用。该富勒烯酞菁类衍生物结构新颖，在光照条件下更稳定，不易发生光漂白、光降解和聚集，光毒性强，暗毒性低。

Description

一种富勒烯酞菁类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及富勒烯衍生物领域，特别涉及一种富勒烯酞菁类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤具有浸润性、易转移性、易复发性，目前传统癌症治疗手段仍无法保证根治各种类型的肿瘤或提高患者的生存质量，因此研发新的癌症治疗方法仍具有现实意义。
光动力疗法(Photodynamic therapy,简称PDT)与传统癌症治疗手段(如手术、放疗、化疗)相比，具有选择性高、毒性低、副作用低、创伤小、适用范围广、易与其他肿瘤治疗方法结合等优点，近年来在肿瘤及其它临床治疗领域广泛应用。其中，可在光动力疗法中使用的酞菁类光敏剂由于其具有更大的共轭结构、合适的光动力治疗窗口(600-700nm)而成为目前的研究热点。但不足之处是，酞菁类光敏剂稳定性差，易发生光降解和光漂白，且小分子酞菁多为平面结构，分子间易发生强烈的π-π相互作用，导致其容易聚集，在各类溶剂中溶解度较差，这大大影响了其活性氧的产生效率和生物相容性，从而降低了光动力治疗效果。
富勒烯是由不同数目碳原子组成的笼状碳原子簇，其是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。近年来富勒烯由于其稳定独特的纳米碳球结构得到广泛关注。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
为了解决现有酞菁类光敏剂用于光动力治疗时稳定性差、易发生光降解和光漂白、溶解度低的问题，本发明的目的在于提供一种富勒烯酞菁类衍生物及其制备方法和应用。该富勒烯酞菁类衍生物结构新颖，在光照条件下更稳定，不易发生光漂白、光降解和聚集。
解决方案
为了实现发明目的，本发明实施例提供了以下技术方案：
一种富勒烯酞菁类衍生物，其结构式如式1所示：
式1中，代表富勒烯；
M代表过渡金属元素；
n为重复单元的平均数量，n的数值选自4-200；
R包括(即羧基，-COOH)、(即磺酸基，-SO3H)、(即磷酸基，-H2PO3)或(亚磷酸基，-H2PO2)；可选的为进一步可选的为
R’代表R基团脱羟基后的可选的为 进一步可选的为
上述富勒烯酞菁类衍生物在一种可能的实现方式中，所述富勒烯包括空心富勒烯和金属内嵌富勒烯中的至少一种，可选的所述富勒烯包括空心富勒烯。
上述富勒烯酞菁类衍生物在一种可能的实现方式中，所述空心富勒烯的结构式为C2m，其中m为15-50；可选的m为30或35。
上述富勒烯酞菁类衍生物在一种可能的实现方式中，所述过渡金属元素包括Gd、Zr、Y、As、Tc、In、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，可选的所述过渡金属元素包括Gd、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，进一步可选的为Zn。
上述富勒烯酞菁类衍生物在一种可能的实现方式中，所述n的数值选自4-30，可选的选自10-20，进一步可选的为15。关于n的选值的讨论，如果重复单元过低，链长太短，富勒烯和酞菁分子间距离太近，由于两者之间存在电荷转移，因此对酞菁分子本身的荧光猝灭效果较为严重；如果重复单元过多，式1所示产物中重复单元的质量分数过高，相应的富勒烯的有效浓度降低，因此影响光动力效果的发挥。
上述富勒烯酞菁类衍生物在一种可能的实现方式中，式1所示的富勒烯酞菁类衍生物中富勒烯为C70，M为Zn，R为R’为n为15。即式1所示的富勒烯钛菁类衍生物为：
本发明实施例还提供了一种式1所示富勒烯酞菁类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
富勒烯、N-乙基甘氨酸和对羟基苯甲醛通过1,3偶极环加成(即Prato反应)后得到式4所示化合物，式4所示化合物与酰氯类化合物进行酰化反应得到式5所示化合物，反应式如下：
式5所示化合物与式6所示的(本申请中也称为NH2-PEG-NH2)发生酰胺化反应，得到式3所示结构，反应式如下：
将式3所示结构与式2所示的酞菁类衍生物反应，得到式1的富勒烯酞菁类衍生物，反应式如下：
代表富勒烯；
M代表过渡金属元素；
n为重复单元的平均数量，n的数值选自4-200；
R包括(即羧基，-COOH)、(即磺酸基，-SO3H)、(即磷酸基，-H2PO3)或(亚磷酸基，-H2PO2)；可选的为进一步可选的为
R’代表R基团脱羟基后的可选的为 进一步可选的为
本发明实施例中将式5所示的富勒烯衍生物通过两侧端基修饰有-NH2的PEG与式2所示的酞菁类衍生物进行化学键合，生成式I所示的稳定的富勒烯酞菁类衍生物。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，富勒烯、N-乙基甘氨酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1-20:1-20，可选的为1:10-15:10-15。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，式4所示化合物与酰氯类化合物的摩尔比为1:(1-80)，可选的为1:(30-60)，进一步可选的为1:40-50。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，式5所示化合物与式6所示结构的摩尔比为1:(1-20)，可选的为1:(5-12)，进一步可选为1:10。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，式3所示结构与式2的化合物的摩尔比为(1-25):1，可选的为(1-10):1，进一步可选为1.7:1。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述富勒烯包括空心富勒烯和金属内嵌富勒烯中的至少一种，可选的所述富勒烯包括空心富勒烯。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述空心富勒烯的结构式为C2m，其中m为15-50，可选的m为30或35。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，n的数值选自4-30，可选的选自10-20，进一步可选的为15。关于n的选值的讨论，如果重复单元过低，链长太短，富勒烯和酞菁分子间距离太近，由于两者之间存在电荷转移，因此对酞菁分子本身的荧光猝灭效果较为严重；如果重复单元过多，重复单元的质量分数过高，相应的富勒烯的有效浓度降低，因此影响光动力效果的发挥。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，式1所示的富勒烯酞菁类衍生物中富勒烯为C70，M为Zn，R为R’为n为15。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述过渡金属元素包括Gd、Zr、Y、As、Tc、In、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，可选的所述过渡金属元素包括Gd、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，进一步可选的为Zn。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，式5所示化合物与式6所示结构发生酰胺化反应的催化剂为吡啶，式3所示结构与式2所示的酞菁类衍生物反应的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明实施例还提供了式1所示的富勒烯酞菁类衍生物在制备光动力治疗剂、抗氧化剂、荧光探针、药物载体和放射性核素成像中的应用。
上述应用在一种可能的实现方式中，所述光动力治疗剂为光动力肿瘤治疗剂，可选的为光动力恶性肿瘤治疗剂。
上述应用在一种可能的实现方式中，所述抗氧化剂为细胞抗氧化保护剂。
本发明实施例还提供了一种光动力治疗剂，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物。
本发明实施例还提供了一种抗氧化剂，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物。
本发明实施例还提供了一种荧光探针，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物。
本发明实施例还提供了一种药物载体，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物。由于式1所示富勒烯酞菁类衍生物具有高分子的PEG链，该聚合物是已被FDA认可的注射药物，并且本发明实施例中其两端还连接了氨基，在式1结构的基础上，还可以包覆一些抗癌药物DOX，靶向分子，抗体，多肽等，因此式1结构可以作为一种药物载体。
本发明实施例还提供了一种放射性核素，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物。由于式1所示富勒烯酞菁类衍生物可以含Gd、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe等，65Zn、64Cu等是医用同位素，可以用作医用放射性同位素成像的放射源，示踪核素等。
式1所示的富勒烯酞菁类衍生物进行靶向运输、药物治疗的具体过程包括：式1所示的富勒烯酞菁类衍生物通过实体瘤的高渗透性和滞留效应(EPR效应)被动靶向富集于肿瘤部位；通过活体荧光成像或者放射性核素可以观察给药前后，各个脏器荧光强度或者放射活度的变化，进而得到式1所示的富勒烯酞菁类衍生物的活体代谢情况；富集在肿瘤部位的式1所示的富勒烯酞菁类衍生物或其药物通过光照产生具有生物毒性的单线态氧，该单线态氧可以有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
有益效果
(1)本发明实施例提供的式1所示的富勒烯酞菁类衍生物在光照条件下更稳定，不易发生光漂白和光降解。式1的富勒烯酞菁类衍生物溶液在650nm红光照射90分钟的条件下，685nm处吸收相对强度依然保持97.7％以上，而式2的四羧酸酞菁(PCC4)的溶液经过相同条件照射后，685nm处吸收相对强度已经下降到58％左右。
(2)本发明实施例提供的式1所示的富勒烯酞菁类衍生物在水溶液中的Zeta电势近乎为中性，可以减少富勒烯酞菁类衍生物纳米粒子和血液中蛋白的相互作用，延长在血液中的循环时间，不容易发生聚集。另外聚乙二醇(PEG)和富勒烯作为稳定的载体减缓了酞菁小分子间强烈的π-π相互作用引起的聚集，提高了其生物相容性。
(3)本发明实施例提供的式1所示的富勒烯酞菁类衍生物在光动力最佳治疗窗口650-700nm有吸收，因此组织穿透深度深，活体光动力治疗效果好。
(4)本发明实施例提供的式1的富勒烯酞菁类衍生物的光毒性强，暗毒性低，式1的富勒烯酞菁类衍生物或含有其的药物组合物在肿瘤部位通过EPR效应富集后，使用光照作用于肿瘤部位，在杀死肿瘤细胞的同时，不会对正常组织产生生物毒性，选择性好，副作用低，生物相容性好。黑暗条件下，式1的富勒烯酞菁类衍生物可以猝灭自由基，降低氧化损伤，对损伤的体细胞具有修复保护的效果。
(5)本发明实施例提供的式1的富勒烯酞菁类衍生物可以用于荧光成像和放射性核素成像，通过观察药物在肿瘤富集量随时间的变化，可以指导最佳治疗时间，对实现药物靶向运输、活体示踪、药物治疗具有重要的临床价值。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1(a)是本发明实施例1合成的式4-1所示化合物的质谱图。
图1(b)是本发明实施例1合成的式3-1所示结构的质谱图。
图1(c)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的质谱图。
图2是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物与式2-1所示化合物、式3-1所示结构的红外吸收光谱。
图3(a)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的粒径分布图。
图3(b)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的Zeta电势分布图。
图4是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物与式2-1所示化合物的荧光发射光谱图。
图5(a)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物在经过不同时间红光照射后的紫外-可见吸收光谱图。
图5(b)是本发明实施例1合成的式2-1所示化合物在经过不同时间红光照射后的紫外-可见吸收光谱图。
图5(c)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物与式2-1所示化合物在经过不同时间红光照射后，在685纳米的特征吸收强度随光照时间的变化图。
图6(a)是本发明实施例1合成的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物在不同浓度梯度下的暗毒性。
图6(b)是本发明实施例1合成的富勒烯酞菁类衍生物在不同浓度梯度下光照30分钟的光毒性结果。
图7(a)是本发明实施例1合成的式2-1所示的四羧酸酞菁在不同浓度梯度下的暗毒性。
图7(b)是本发明实施例1合成的式2-1所示的四羧酸酞菁在不同浓度梯度下光照30分钟的光毒性结果。
图8是本发明实施例1合成的富勒烯酞菁类衍生物在不同浓度梯度下对双氧水损伤的HEK-α细胞的修复实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
实施例1
当富勒烯为C70，M为锌(Zn)，n＝15时，富勒烯酞菁类衍生物即如式1-1所示，其制备方法包括：
(1)将0.12毫摩的C70、1.4毫摩的N-乙基甘氨酸(购于Alfa；作为反应原料)、1.4毫摩的对羟基苯甲醛(购于Alfa；作为反应原料)溶于150毫升的甲苯溶液中(购于百灵威；作为溶剂)中，氩气氛围保护，110℃搅拌反应6小时后，旋蒸除去大部分溶剂，通过硅胶柱分离，得到式4-1所示化合物，将0.048毫摩的式4-1所示化合物和10微升N,N-二甲基甲酰胺(购于百灵威；作为催化剂)加入20毫升无水二氯甲烷(购于百灵威；作为溶剂)中，0℃条件下，加入2.3毫摩草酰氯(购于伊诺凯；作为酰化试剂)，搅拌10分钟后，恢复至室温反应24小时，旋蒸除去二氯甲烷，再加入10毫升二氯甲烷，旋蒸除去溶剂，真空干燥得到式5-1所示化合物，反应式如下：
(2)取上述得到的式5-1所示化合物0.01毫摩溶解在10毫升无水二氯甲烷(购于百灵威；作为溶剂)中，再加入20微升吡啶(购于伊诺凯；作为酰胺化反应催化剂)，向上述溶液中加入10毫升溶有0.1毫摩(mmol)的式6-1所示结构的溶液，室温反应24小时，旋蒸除去二氯甲烷，加入超纯水溶解离心，将上清液过0.22微米滤膜，用截留分子量为3500透析袋进行透析，得到式3-1所示结构，反应式如下：
(3)将0.03毫摩的式2-1所示的四羧酸酞菁溶于6毫升的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液(pH＝6.0)中，加入各3倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(购于百灵威；用作催化剂)，搅拌30分钟后，加入0.1克(相当于0.051mmol)的式3-1所示结构，室温反应3天。将上述反应液离心，过滤，加入盐酸调节pH值为2-3后，通过G25凝胶柱分离得到粗产物，用截留分子量为3500透析袋进行透析，冷冻干燥，得到式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物，反应式如下：
因为式5-1化合物是一个非常活泼的酰氯结构，该结构在质谱仪中不稳定，因此选用它的前驱物式4-1进行质谱检测。式4-1所示化合物，式3-1所示结构与式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的质谱图分别如图1(a)-图1(c)所示。
图1(a)的质谱峰为1032，与式4-1所示化合物理论计算值一致。
3-1所示结构的质谱图由图1(b)所示，由于3-1所示结构含有多个重复单元，重复单元的平均数量为15，产物在分子量1800到2750左右出现正态分布峰，与式3-1相符合，说明式5-1所示化合物与NH2-PEG-NH2已经共价连接，得到式3-1所示结构；另外由于在质谱仪中一些基团可能会被激光打碎，因此还会出现另一个分子质量较低的正态峰。
式3-1所示结构与式2-1所示四羧酸酞菁酰胺化反应得到的式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的质谱图由图1(c)所示，由于1-1所示结构含有多个重复单元，重复单元的平均数量为15，产物在3500到4500出现正态分布峰，与式1-1相符合；另外由于在质谱仪中一些基团可能会被激光打碎，因此还出现两个分子质量较低的正态峰，通过结合图2的红外数据，说明得到式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物。
式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物与式2-1所示化合物、式3-1所示结构的红外吸收光谱图如图2所示。式2-1所示化合物红外特征峰为3435cm-1，1707cm-1，1513cm-1，1345cm-1，1244cm-1，1083cm-1，1044cm-1，918cm-1，732cm-1；式3-1所示结构红外特征峰为3440cm-1，2863cm-1，1629cm-1，1448cm-1，1104cm-1；所得富勒烯酞菁类衍生物红外特征峰为3341cm-1，3184cm-1，2863cm-1，1656cm-1，1513cm-1，1348cm-1，1090cm-1，923cm-1，832cm-1，742cm-1。由此可知，所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物在2863cm-1处表现出PEG骨架饱和烷烃C-H伸缩振动峰和在1513cm-1处表现出酞菁环内C＝N伸缩振动峰，说明式2-1所示化合物与式3-1所示结构进行酰胺反应共价结合得到了式1-1富勒烯酞菁类衍生物。
所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的平均水合粒径分布图与Zeta电势分布图分别如图3(a)和图3(b)所示，平均水合粒径为83.58纳米，该粒径可以避开内皮网状系统识别和摄取(粒径小于7nm的纳米粒子，主要被内皮网状系统识别和摄取，无法到达其他组织部位)，提高样品在肿瘤通过EPR效应的富集量；并且所得富勒烯酞菁类衍生物的Zeta电势为0.197毫伏，接近中性，因此通过静脉给药后与血液中的负电成分通过静电作用发生聚集的可能性大大降低，生物毒性低，治疗效果更明显。
所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物与式2-1所示化合物的荧光发射光谱如图4所示，式2-1所示化合物荧光发射光谱位于700纳米处，而式1-1所得富勒烯酞菁类衍生物荧光发射光谱偏移至698纳米左右，这可能由于富勒烯酞菁类衍生物中富勒烯碳球表面的共轭结构与连接的酞菁发生了电子转移，导致荧光发射光谱发生了偏移。由于式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的荧光光谱在698纳米左右存在发射峰，可以有效发出荧光，因此可以作为荧光探针使用。
酞菁环中的过渡金属选择比较多，但比较经典的有Zn,Mn,Co，都具有相应的光动力效果，可以达到本申请的目的。
实施例2
对实施例1所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物进行光降解稳定性测试，步骤和结果如下：
(1)配制10微摩/升实施例1所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物的DMSO溶液(a)和10微摩/升式2-1所示的四羧酸酞菁的DMSO溶液(b)，置于650纳米红光分别照射不同时间后(0,10,20,30,40,50,60,90分钟)，测量其紫外-可见吸收光谱和在紫外-可见吸收光谱中685nm处的特征吸收强度随光照时间的变化，结果分别如图5(a)、图5(b)和图5(c)所示。
随着光照时间延长，如果紫外-可见吸收强度变化越小，则样品越稳定，抗光漂白能力越强。由图5(b)和图5(c)中可以看出，式2-1所示的四羧酸酞菁对光照敏感，经过90分钟650纳米红光照射后，685nm处吸收强度已经下降至58％；由图5(a)和图5(c)中可以看出，实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物对长时间照射表现出更高的抗光漂白性能和稳定性，90分钟650纳米红光照射后，685nm处吸收强度稳定保持在97.7％。因此，在相同光照条件下，实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物具有更高效的抗光漂白性和更持久的光动力有效治疗时间。
实施例3
对实施例1所得式1-1所示富勒烯酞菁类衍生物进行暗毒性测试，步骤和结果如下：
(1)复苏Hela细胞(中国科学院上海生命研究院细胞资源中心)，待细胞进入对数期，生长稳定时，将细胞密度调整至5×104/毫升，种到96孔板中，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(2)待细胞贴壁后，将DMEM溶液(Corning R10-013-CV，购买公司：拜尔迪)换成200微升浓度分别为0(作为对照)、4.5、9、13.5、18、22.5、27微摩/升的实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，37℃，5％CO2，避光孵育24小时；
(3)弃去含有实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，加入10％CCK-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc)的无色DMEM溶液，孵育20分钟后，置于酶标仪中测量其细胞活度。
由图6(a)可以看出，细胞活度随着实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度升高而提高，当实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度为27微摩/升时，细胞活度为1.17，即加入实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物后在避光条件下其细胞活度反而上升，表明其暗毒性很低。
实施例4
对实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物进行光毒性测试，步骤和结果如下：
(1)复苏Hela细胞(中国科学院上海生命研究院细胞资源中心)，待细胞进入对数期，生长稳定时，将细胞密度调整至5×104/毫升，种到96孔板中，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(2)待细胞贴壁后，将DMEM溶液(Corning R10-013-CV，购买公司：拜尔迪)换成100微升浓度分别为0(作为对照)、4.5、9、13.5、18、22.5、27微摩/升的实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育3小时；
(3)弃去含有实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，加入100微升无色DMEM溶液，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟；
(4)弃去无色DMEM溶液，加入200微升DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育24小时后，换成10％CCK-8的无色DMEM溶液，孵育15分钟后，置于酶标仪中测量其细胞活度。
由图6(b)可以看出，实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度为13.5微摩/升，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟时，细胞活度下降至0.47；实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度为27微摩/升，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟时，细胞活度下降至0.09；表明不同浓度的实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物在光照条件下对恶性肿瘤细胞表现出显著的光毒性。
实施例5
对式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)进行暗毒性测试，步骤和结果如下：
(1)复苏Hela细胞(中国科学院上海生命研究院细胞资源中心)，待细胞进入对数期，生长稳定时，将细胞密度调整至5×104/毫升，种到96孔板中，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(2)待细胞贴壁后，将DMEM溶液(Corning R10-013-CV，购买公司：拜尔迪)换成200微升浓度分别为0(作为对照)、4.5、9、13.5、18、22.5、27微摩/升的式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM溶液，37℃，5％CO2，避光孵育24小时；
(3)弃去含有式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM溶液，加入10％CCK-8的无色DMEM溶液，孵育15分钟后，置于酶标仪中测量其细胞活度。
由图7(a)可以看出，随着式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)浓度升高，细胞活度呈现先增加后降低的趋势，当式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)浓度为22.5微摩/升时，细胞活度增长到1.16；当式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)浓度为27微摩/升时，细胞活度为1.12，表明式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)暗毒性较低。
实施例6
对式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)进行光毒性测试，步骤和结果如下：
(1)复苏Hela细胞(中国科学院上海生命研究院细胞资源中心)，待细胞进入对数期，生长稳定时，将细胞密度调整至5×104/毫升，种到96孔板中，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(2)待细胞贴壁后，将DMEM溶液(Corning R10-013-CV，购买公司：拜尔迪)换成100微升浓度分别为0(作为对照)、4.5、9、13.5、18、22.5、27微摩/升的式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育3小时；
(3)弃去含有式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM溶液，加入100微升无色DMEM溶液，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟；
(4)弃去无色DMEM溶液，加入200微升DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育24小时后，换成10％CCK-8的无色DMEM溶液，孵育15分钟后，置于酶标仪中测量其细胞活度。
由图7(b)可以看出，与实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物相比，四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM浓度为13.5微摩/升，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟时，细胞活度为0.73；四羧酸酞菁(PCC4)的DMEM浓度为27微摩/升，白光(30毫瓦/平方厘米)照射30分钟时，细胞活度为0.2；由此可以看出，与式2-1所示的四羧酸酞菁(PCC4)相比，实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度在光照条件下表现出更显著的光毒性和更低的暗毒性。
实施例7
对实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物进行细胞水平抗氧化保护实验，步骤和结果如下：
(1)复苏HEK-α细胞(中国科学院上海生命研究院细胞资源中心)，待细胞进入对数期，生长稳定时，将细胞密度调整至5×104/毫升，种到96孔板中，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(2)待细胞贴壁后，将DMEM溶液(Corning R10-013-CV，购买公司：拜尔迪)换成100微升含有实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度分别为0(作为对照)、40、60、80、100、120微摩/升的实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，黑暗条件下，37℃，5％CO2，孵育6小时；取出含有不同浓度实施例1所得实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物的DMEM溶液，加入含有1毫摩/升双氧水的DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育1小时；
(3)弃去含有双氧水的DMEM溶液，加入200微升DMEM溶液，37℃，5％CO2，孵育24小时；
(4)弃去DMEM溶液，加入10％CCK-8的无色DMEM溶液，孵育20分钟后，置于酶标仪中测量其细胞活度。
实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物细胞水平抗氧化修复实验结果如图8所示，实施例1所得富勒烯酞菁类衍生物浓度为40微摩/升时，经过孵育后的HEK-α细胞对双氧水损伤表现出抗氧化保护的效果，细胞活度提高了16％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (15)

1.一种富勒烯酞菁类衍生物，其结构式如式1所示：
式1中，代表富勒烯；
M代表过渡金属元素；
n为重复单元的平均数量，n的数值选自4-200；
R包括可选的为进一步可选的为
R’代表R基团脱羟基后的可选的为 进一步可选的为
2.一种式1所示富勒烯酞菁类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
富勒烯、N-乙基甘氨酸和对羟基苯甲醛通过1,3-偶极环加成反应后得到式4所示化合物，式4所示化合物与酰氯类化合物进行酰化反应得到式5所示化合物，反应式如下：
式5所示化合物与式6所示的发生酰胺化反应，得到式3所示结构，反应式如下：
将式3所示结构与式2所示的酞菁类衍生物反应，得到式1的富勒烯酞菁类衍生物，反应式如下：
代表富勒烯；
M代表过渡金属元素；
n为重复单元的平均数量，n的数值选自4-200；
R包括可选的为进一步可选的为
R’代表R基团脱羟基后的可选的为 进一步可选的为
3.根据权利要求1所述的富勒烯酞菁类衍生物或权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述富勒烯包括空心富勒烯和金属内嵌富勒烯中的至少一种，可选的所述富勒烯包括空心富勒烯。
4.根据权利要求3所述的富勒烯酞菁类衍生物或权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述空心富勒烯的结构式为C2m，其中m为15-50；
可选的m为30或35。
5.根据权利要求1所述的富勒烯酞菁类衍生物或权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述过渡金属元素包括Gd、Zr、Y、As、Tc、In、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，可选的所述过渡金属元素包括Gd、Cu、Ga、Co、Zn、Mn或Fe，进一步可选的为Zn。
6.根据权利要求1所述的富勒烯酞菁类衍生物或权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述n的数值选自4-30，可选的选自10-20，进一步可选的为15。
7.根据权利要求1所述的所示富勒烯酞菁类衍生物或权利要求2所述的制备方法，其特征在于：式1所示的富勒烯酞菁类衍生物中富勒烯为C70，M为Zn，n为15，R为R’为
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
富勒烯、N-乙基甘氨酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1-20:1-20，可选的为1:10-15:10-15；
和/或，式4所示化合物与酰氯类化合物的摩尔比为1:(1-80)，可选的为1:(30-60)，进一步可选的为1:40-50；
和/或，式5所示化合物与式6所示结构的摩尔比为1:(1-20)，可选的为1:(5-12)，进一步可选为1:10；
和/或，式3所示结构与式2的化合物的摩尔比为(1-25):1，可选的为(1-10):1，进一步可选为1.7:1。
9.式1所示的富勒烯酞菁类衍生物在制备光动力治疗剂、抗氧化剂、荧光探针、药物载体或放射性核素成像中的应用；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述抗氧化剂为细胞抗氧化保护剂；
和/或，所述光动力治疗剂为光动力肿瘤治疗剂，可选的为光动力恶性肿瘤治疗剂。
11.一种光动力治疗剂，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物；
12.一种抗氧化剂，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物；
13.一种荧光探针，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物；
14.一种药物载体，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物；
15.一种放射性核素，其包括式1所示的富勒烯酞菁类衍生物；
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