CN103316340A - 一种具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子及其制备方法，其结构中含有用于光动力学治疗的金纳米颗粒、附于金纳米颗粒上的等离子光热治疗的光敏剂以及表面修饰亲水性聚合物聚乙二醇。本发明还涉及所述金纳米复合粒子作为光动力学/等离子光热协同治疗的用途，其具有制备简单、价格便宜以及疗效显著的优点。

Description

一种具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病的光动力学/等离子光热协同治疗应用，属于生物医药材料以及纳米医学领域。

背景技术

根据目前肿瘤的发病趋势，2020年全世界肿瘤发病率将比现在增加50％，全球每年新增肿瘤患者人数将达到1500万人（世界卫生组织(WHO)近期发表《世界癌症报告》）。恶性肿瘤已成为我国居民的主要死因，不仅严重危害我国人民健康，而且大幅度增加了政府和个人的医疗费用负担我国肿瘤的高效特异诊断、治疗不仅对广大患者，乃至整个国家医疗卫生事业的发展和社会和谐稳定，以及小康社会的实现都具有极其重要的意义和十分迫切的需求。在治疗方面，手术、放疗和化疗是恶性肿瘤治疗三种主要手段。然而，手术治疗造成大量正常组织或器官结构及功能的损失，且无法彻底根治，更严重的是可能促进肿瘤细胞的播散。化疗和放疗常产生心脏毒性、肝肾功能损害、骨髓抑制等毒副作用，危及患者生命或导致生存质量严重降低。因此，如何提高恶性肿瘤治疗效果、降低毒副作用成为人们长期以来追求的目标。

光动力疗法是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术。其作用基础是光动力效应。这是一种有氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应。其过程是，特定波长的激光照射使组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。与手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，光动力疗法具有如下重要优点：创伤很小，选择性好，毒性低微，作为一种局部治疗的方法，光动力疗法的主要攻击目标是光照区的病变组织，对病灶周边的正常组织损伤轻微。光动力疗法对不同细胞类型的癌组织都有效，可重复治疗。然而，在激光照射下光敏剂容易发生自毁。另外，光敏剂一旦被激活后，光动力学治疗就会很快的因为耗尽组织氧和扰乱肿瘤血流而导致组织缺氧，进而降低局部肿瘤组织活性氧物质的产生。这些问题影响了光动力学治疗的治疗效果，很大程度上限制了其在临床中的应用。

目前多功能纳米粒子（如光响应纳米粒子、磁响应纳米粒子和电响应纳米粒子）已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。例如，超顺磁氧化铁纳米粒子已经作为磁共振显影剂和药物载体使用，量子点在细胞标记成像上的使用已得到充分证实和肯定，金纳米粒子有望作为新一代X射线显影剂等。其中，纳米金棒、纳米金笼、纳米金星具有独特的光热转化性质使得其有望在等离子光热治疗中广泛应用。

为了同时实现单连续波激光进行光热/光动力协同治疗并克服光动力学治疗的局限性，本项目将光敏剂二氢卟吩螯合在金纳米粒子表面，调整金纳米颗粒的局部表面等离子共振，使之与光敏剂的表面等离子共振相同。一旦受到激光辐射后，纳米复合物中金纳米颗粒能够产生强大的热量杀灭光照细胞。因为等离子光热治疗效果不受氧含量的依赖，因此光动力治疗反应导致的低氧环境不会影响到等离子光热治疗。同时金纳米颗粒对连续波激光照射很稳定，进而促进等离子光热治疗效果。通过调整激光照射时间，实现等离子光热/光动力协同治疗并显著增强治疗效果。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子；

本发明的另一目的在于提供一种新的具有等离子光热/光动力治疗性能金纳米复合粒子的制备方法；

本发明的再一目的是提供一种所述的金纳米复合粒子作为肿瘤等疾病的等离子光热/光动力治疗的应用。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种新的具有等离子光热/光动力治疗性能金纳米复合粒子，其结构中含有用于光动力学治疗的金纳米颗粒、附于金纳米颗粒上的等离子光热治疗的光敏剂以及表面修饰亲水性聚合物。

其中，所述的金纳米颗粒包括纳米金粒子、纳米金棒、纳米金星、纳米金囊，纳米金笼或纳米金壳等中的至少一种。

其中，所述的光敏剂包括二氢卟吩、甲基嗜焦素烷基醚衍生物（（2-［1-hexyloxyethyl］-2-devinyl pyropheophorbide-a，HPPH），还有血卟啉单甲醚等中的至少一种。

其中，所述的表面修饰亲水性聚合物包括聚乙二醇（PEG）、还有甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯等。PEG的分子量范围为5-20kDa，分子量的单位为道尔顿。

其中，该金纳米复合物的局部表面等离子共振与光敏剂的表面等离子共振相同，通过调整硝酸银的投料比进行可控调节。其中，按质量比，所述的硝酸银与金纳米粒子的投料比范围为1：10-300。

本发明所述的金纳米复合粒子可通过如下步骤制取

1）加入1-5毫升0.5-2％的柠檬酸钠溶液于80-120毫升沸腾的0.5-2mM的氯金酸溶液并快速搅拌，时间为1-3小时，制取柠檬酸盐稳定的种子溶液；

2）将冷却后的40-60μL柠檬酸盐稳定的种子溶液加入到5-15毫升0.1-0.5毫摩尔的氯金酸溶液中；加入50-200μL的0.5-3mM硝酸银和30-70μL的0.05-0.2M抗坏血酸。搅拌该溶液直到其颜色由浅红变成深蓝色；

3）加入5-20μL的5-15mM的HS-PEG-NH2溶液，并将反应混合物在室温下搅拌1-3小时；对金纳米复合物溶液进行离心分离，以除去过量的HS-PEG-NH2，并重新悬浮于水中；

4）将1-3mg PEG修饰的金纳米粒子加入到0.5-1.5mL二甲基甲酰胺溶液中，按体积比1:2-4的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），室温下反应20-40min；

5）N-羟基丁二酰亚胺（NHS）及光敏剂（如Ce6-NH2）按体积比1:0.5-2比例混合，然后溶于2-4倍体积范围的二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应20-40min后，缓慢滴加入金纳米粒子和EDC混合液中，滴加溶液的量与金纳米粒子和EDC混合液的体积比范围为1:0.5-2。磁力搅拌反应1-3小时后对金纳米复合物溶液进行离心分离，获得多功能金纳米复合粒子。

更佳的，本发明所述的金纳米复合粒子可通过如下步骤制取：

加入3毫升1％的柠檬酸钠溶液于100毫升沸腾的1.0mM的氯金酸溶液并快速搅拌。将冷却的50μL柠檬酸盐稳定的种子溶液加入到10毫升0.25毫摩尔的氯金酸溶液中。加入100μL的0.5-3mM硝酸银和50μL的0.1M抗坏血酸。搅拌该溶液直到其颜色由浅红变成深蓝色；加入10μL的10mM的HS-PEG-NH2溶液，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。将PEG修饰的金纳米粒子加入到二甲基甲酰胺溶液中，加入EDC，室温下反应30min。NHS及光敏剂如Ce6-NH2按体积比1:1混合，然后溶于3倍体积的二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应30min后，缓慢滴加入金纳米粒子和EDC混合液中，滴加溶液的量与金纳米粒子和EDC混合液的体积比为1:1磁力搅拌反应2小时后对金纳米复合物溶液进行离心分离，获得多功能金纳米复合粒子。

本发明研制出的一种新的具有等离子光热/光动力治疗性能的金纳米复合粒子，不需要采用两个不同波长的激光而可以实现同时进行等离子光热/光动力治疗。表面PEG修饰增加了纳米复合物定向富集到肿瘤部位，提高了抗肿瘤疗效并降低毒副作用。本发明所述的金纳米复合物制备过程简便，价格便宜，对连续波激光照射稳定，等离子光热/光动力治疗协同增效，更加有利于在临床上推广应用。

本发明的有益效果：

1.本发明在纳米金复合物表面进行光敏剂如二氢卟吩修饰，使其具有等离子光热/光动力治疗性能。

2.本发明所述的纳米金复合物的局部表面等离子共振与光敏剂的表面等离子共振相同，不需要采用两个不同波长的激光而同时进行离子光热/光动力治疗。

3.本发明所述的纳米金复合物对连续波激光照射稳定，通过调整激光照射时间，使得等离子光热/光动力治疗协同增效，从而获得更好的治疗效果。

附图说明

图1金纳米复合粒子电镜及紫外可见光谱表征结果

图1a为金纳米复合粒子在水相溶剂中分散情况的电镜图；

图1b为金纳米复合粒子紫外可见光谱表征图。

图2为金纳米复合物光热效应结果

图3为金纳米复合粒子在含10%血清的DMEM培养基中的紫外可见光谱图。

图4肿瘤细胞吞噬不同材料结果

A为未修饰纳米金粒子；B为光敏剂C为金纳米光敏剂复合物。

图5金纳米复合粒子肿瘤分布及抗肿瘤效果。

A向荷瘤小鼠体内注射金纳米-光敏剂复合物。注射四小时后，荧光成像显示在肿瘤区域可以观察到很强的荧光信号（图5A）。

B注射一周后，金纳米-光敏剂复合物处理组的肿瘤体积与对照组。肿瘤组织HE染色显示在PBS对照组肿瘤切片没有观察到明显的肿瘤坏死。

C注射一周后，在金纳米-光敏剂复合物处理组HE染色观察到明显广泛的肿瘤坏死。

具体实施方式

以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明：

一、制备例：以下合成步骤中的所使用的化学物质为市售商品。

金纳米复合粒子的制备方法，包括以下步骤：

1）加入3毫升1％的柠檬酸钠溶液于100毫升沸腾的1.0mM的氯金酸溶液并快速搅拌。

2）将冷却的50μL柠檬酸盐稳定的种子溶液加入到10毫升0.25毫摩尔的氯金酸溶液中。

3）加入100μL的0.5-3mM硝酸银和50μL的0.1M抗坏血酸。搅拌该溶液直到其颜色由浅红变成深蓝色。

4）加入10μL的10mM的HS-PEG-NH2溶液，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。

5）对金纳米复合物溶液进行离心分离，以除去过量的HS-PEG-NH2，并重新悬浮于水中。

6）将2mg PEG修饰的金纳米粒子加入到1mL二甲基甲酰胺溶液中，按1:3比例加入3ml EDC，室温下反应30min。0.5ml的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）及0.5ml的光敏剂氨基化二氢卟吩（Ce6-NH2）混合，然后溶于3ml的二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应30min后，缓慢滴加入金纳米粒子和EDC混合液中，磁力搅拌反应2小时后对金纳米复合物溶液进行离心分离，获得多功能金纳米复合粒子。

二、实施例：

1.金纳米复合粒子物理学性能表征：

应用电镜对金纳米复合粒子进行形貌表征。如图1a电镜所示，金纳米复合粒子在水相溶剂中可单一分散，粒度大小较为均匀（50纳米左右）。紫外可见光谱显示金纳米复合粒子在404nm处有Ce6特征性吸收峰和658nm处的Q带（图1b），表明光敏剂被成功修饰到金纳米粒子上。

激光（671nm）照射不同浓度的金纳米复合物溶液，溶液的温度在照射4min后开始迅速上升，并迅速达到稳定状态，与金纳米复合物的浓度呈正相关（图2）。

金纳米复合粒子可进一步转移到超纯水、含10%血清的DMEM、含15%血清的L-15培养基中。紫外可见光谱显示其在10%血清的培养基中极其稳定（图3）。

2.金纳米复合粒子体外生物学性能评价：

首先确定肿瘤细胞摄入光敏剂的含量，乳腺癌细胞株MDA-MB-435分别和光敏剂，金纳米颗粒及金纳米-光敏剂复合物共培养24小时后，金纳米-光敏剂复合物处理后的平均荧光强度比游离光敏剂处理的细胞中显示更高的荧光信号（图4）。

金纳米-光敏剂复合物处理细胞后，在激光照射下产生单态氧效果明显。当加入单态氧清除剂后，游离光敏剂Ce6和金纳米-光敏剂复合物处理细胞单态氧探针的荧光信号都被明显抑制，进一步说明了金纳米-光敏剂复合物在激光照射过程中产生了单态氧。

培养乳腺癌细胞株MDA-MB-435和肺癌细胞株A549并进行游离光敏剂Ce6、金纳米粒子和金纳米-Ce6复合物光毒性检测。Ce6激光照射三分钟后会发生光漂白作用，而金纳米仍然保留等离子治疗活性。激光照射10min后，金纳米-Ce6复合物杀灭肿瘤细胞效果明显强于其他组。

6.构建MDA-MB-435荷瘤小鼠模型，向荷瘤小鼠体内注射金纳米-光敏剂复合物。注射四小时后，荧光成像显示在肿瘤区域可以观察到很强的荧光信号（图5A）。单激光照射后，肿瘤的温度会迅速上升至50℃,此时足以杀死肿瘤细胞。而周围健康组织缓慢升高到35-40℃。小鼠的其他部位没有观察到温度变化。一周后，金纳米-光敏剂复合物处理组的肿瘤体积与对照组（游离光敏剂Ce6处理组和金纳米颗粒处理组相比具有显著的统计学差异。肿瘤组织HE染色显示在PBS对照组肿瘤切片没有观察到明显的肿瘤坏死（图5B）。而仅在金纳米-光敏剂复合物处理组HE染色观察到明显广泛的肿瘤坏死（图5C），游离Ce6处理组和金纳米粒子处理在核异型细胞周围有散发性坏死区，说明治疗后残余的肿瘤又开始重新生长。该结果表明了与任何的单独治疗相比，金纳米-光敏剂复合物可以获得更好的抗癌效果。

金纳米复合物是本发明研制出的一种新的金纳米-光敏剂复合粒子并用于肿瘤治疗，与现有常用光动力治疗相比，同时实现了单连续波激光进行光热/光动力协同治疗并克服光动力学治疗的局限性。本发明所述的金纳米复合物制备简单、性能稳定、价格便宜更加有利于在临床上推广应用。

本发明所用金纳米颗粒还可以包括：纳米金囊，纳米金笼，纳米金壳等金纳米颗粒，其它更多可选光动力学治疗用光敏剂包括并不限于甲基嗜焦素烷基醚衍生物等，金纳米颗粒表面的聚乙二醇修饰及纳米级的尺寸分布实现其肿瘤被动靶向功能，也可以同时进行多肽修饰实现肿瘤主动靶向功能，制备方法类似。

Claims (9)

1.一种用于等离子光热/光动力治疗的金纳米复合粒子，其特征在于，该纳米复合粒子含有用于光动力学治疗的金纳米颗粒、附于金纳米颗粒上的等离子光热治疗的光敏剂以及表面修饰亲水性聚合物。

2.如权利要求1所述的一种用于等离子光热/光动力治疗的金纳米复合粒子，其特征在于，所述的金纳米颗粒包括纳米金粒子、纳米金棒、纳米金星、纳米金囊，纳米金笼或纳米金壳中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种用于等离子光热/光动力治疗的金纳米复合粒子，其特征在于，所述的光敏剂包括二氢卟吩、血卟啉单甲醚或甲基嗜焦素烷基醚衍生物中的至少一种。

4.如权利要求1所述的一种用于等离子光热/光动力治疗的金纳米复合粒子，其特征在于，所述的表面修饰亲水性聚合物包括聚乙二醇或甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯。

5.如权利要求1所述的金纳米复合粒子，其特征在于该金纳米复合物的局部表面等离子共振与光敏剂的表面等离子共振相同，通过调整硝酸银的投料比进行可控调节。

6.如权利要求5所述的金纳米复合粒子，其特征在于，按质量比，所述的硝酸银与金纳米颗粒的投料比范围为10-300。

7.如权利要求1所述的金纳米复合粒子的制备方法，包括如下步骤：

1）加入1-5毫升0.5-2％的柠檬酸钠溶液于80-120毫升沸腾的0.5-2mM的氯金酸溶液并快速搅拌，时间为1-3小时，制取柠檬酸盐稳定的种子溶液；

2）将冷却后的40-60μL柠檬酸盐稳定的种子溶液加入到5-15毫升0.1-0.5毫摩尔的氯金酸溶液中；加入50-200μL的0.5-3mM硝酸银和30-70μL的0.05-0.2M抗坏血酸。搅拌该溶液直到其颜色由浅红变成深蓝色；

3）加入5-20μL的5-15mM的HS-PEG-NH2溶液，并将反应混合物在室温下搅拌1-3小时；对金纳米复合物溶液进行离心，以除去过量的HS-PEG-NH2，并重新悬浮于水中；

4）将1-3mg PEG修饰的金纳米粒子加入到0.5-1.5mL二甲基甲酰胺溶液中，按体积比1:2-4加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温下反应20-40min；

5）N-羟基丁二酰亚胺及光敏剂按体积比1:0.5-2的比例混合，然后溶于2-4倍体积的二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应20-40min后，缓慢滴加入金纳米粒子和EDC混合液中，磁力搅拌反应1-3小时后对金纳米复合物溶液进行离心分离，获得多功能金纳米复合粒子。

8.如权利要求1所述的金纳米复合粒子的制备方法，包括如下步骤：

加入3毫升1％的柠檬酸钠溶液于100毫升沸腾的1.0mM的氯金酸溶液并快速搅拌。将冷却的50μL柠檬酸盐稳定的种子溶液加入到10毫升0.25毫摩尔的氯金酸溶液中。加入100μL的0.5-3mM硝酸银和50μL的0.1M抗坏血酸。搅拌该溶液直到其颜色由浅红变成深蓝色；加入10μL的10mM的HS-PEG-NH2溶液，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。将2mg PEG修饰的金纳米粒子加入到1mL二甲基甲酰胺溶液中，按体积比1:3比例加入EDC，室温下反应30min；NHS及光敏剂按体积比1:1比例混合，然后溶于3倍体积的二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应30min后，缓慢滴加入金纳米粒子和EDC混合液中，滴加溶液的量与金纳米粒子和EDC混合液的体积比为1:1，磁力搅拌反应2小时后对金纳米复合物溶液进行离心分离，获得多功能金纳米复合粒子。

9.如权利要求1所述的金纳米复合粒子的用途，其用于肿瘤的光动力学/等离子光热协同治疗应用。

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