CN109172821A - 碳酸钙包覆纳米金星荧光探针、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,包括纳米金星、碳酸钙壳层和光敏剂,碳酸钙壳层包覆在纳米金星外,光敏剂负载在碳酸钙壳层中,纳米金星的直径为95nm~115nm,碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm。还提供了由其制成的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,包括免疫细胞以及上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,碳酸钙包覆纳米金星荧光探针位于免疫细胞中。还提供了相关制备方法和应用。本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针能与免疫细胞结合形成靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域,特别涉及荧光探针及靶向免疫型荧光探针技术领域,具体是指一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针、靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针、相关制备方法及应用。
背景技术
环境的变化以及人口老龄化的加快,导致人类面临各种疾病危险、癌症风险的系数在上升,随着纳米技术和现代医学技术的迅速发展,大量新型纳米粒子在医学中的应用越来越广泛,例如靶向给药、CT成像检测、肿瘤的光热治疗、光动力治疗等。纳米粒子结合生物技术不仅可以在细胞和分子水平上进行疾病研究,也可以应用于临床的治疗疾病。
纳米金星因其独特的星型结构,在近红外区能产生较高的共振吸收峰,具有很好的光热转换效率,而且在生物体内结构稳定,对细胞几乎没有毒性,这些物理、化学、光学等特性,奠定了纳米金星在纳米医学领域的重要地位。目前已经被广泛地应用到光热治疗、CT成像、PA成像、荧光成像等。美国FDA已经批准纳米金星应用于肿瘤等疾病的体外诊断、临床试验中。
免疫细胞NK(自然杀伤细胞)是人体重要的免疫细胞,与人体的抗肿瘤、抗病毒感染关系密切,其主要特点为NK细胞在血液中循环时,能够主动识别靶细胞(肿瘤细胞),不受MHC限制,无需抗原递呈,不依赖抗体,其表面受体被肿瘤细胞活化后,可通过分泌穿孔素、颗粒霉素等来主动杀伤靶细胞(肿瘤细胞),也能分泌相关免疫因子如TNF-alpha、IFN-gama、GM-CSF等进行免疫调节,还能分泌趋化因子,召集并刺激T细胞的增殖,激活体内的免疫系统。
因此,希望提供一种治疗物质,其能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点,本发明的一个目的在于提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其中纳米金星可通过胞吞作用进入细胞到达溶酶体,在激光照射后可以实现光热治疗,在酸性条件下,碳酸钙壳层遇到H+离子会逐渐被降解,使其中的光敏剂缓慢释放,光敏剂既可以实现激光照射后的光热治疗和光动力治疗,也能荧光成像实时跟踪,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,由其制备的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的纳米金星可通过胞吞作用进入细胞到达溶酶体,在激光照射后可以实现光热治疗,在酸性条件下,碳酸钙壳层遇到H+离子会逐渐被降解,使其中的光敏剂缓慢释放,光敏剂既可以实现激光照射后的光热治疗和光动力治疗,也能荧光成像实时跟踪,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其设计巧妙,操作简便,成本低,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,由其制备的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其设计巧妙,操作简便,成本低,适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针在免疫治疗中的应用,其可以用于靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
为达到以上目的,在本发明的第一方面,提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,包括纳米金星、碳酸钙壳层和光敏剂,所述碳酸钙壳层包覆在所述纳米金星外,所述光敏剂负载在所述碳酸钙壳层中,其特点是,所述纳米金星的直径为95nm~115nm,所述碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm。
在本发明的第二方面,提供一种上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特点是,包括以下步骤:
(1)纳米金星种子溶液的制备:将柠檬酸三钠溶液加入煮沸腾的氯金酸(HAuCl4)溶液中,搅拌反应,然后冷却至室温,即得到所述纳米金星种子溶液;
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将所述纳米金星种子溶液加入含盐酸的氯金酸溶液中,搅拌反应,然后加入硝酸银溶液与抗坏血酸溶液形成混合溶液,待所述混合溶液颜色变深蓝色后,加入HS-PEG-COOH溶液,室温搅拌反应,即得到所述纳米金星粒子溶液;
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:在所述纳米金星粒子溶液中加入氯化钙溶液和光敏剂,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子;
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子复溶于去离子水中,加入碳酸钠溶液,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
较佳地,在所述步骤(1)中,所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量百分含量为10%,所述氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为1mM,所述柠檬酸三钠与所述氯金酸溶液的体积比为1~1.5:80~100,所述搅拌反应的时间为10分钟~20分钟,所述搅拌反应的转速为300rpm。
较佳地,在所述步骤(2)中,所述的含盐酸的氯金酸溶液中盐酸的摩尔浓度为10M,所述的含盐酸的氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为10mM,所述硝酸银溶液中硝酸银的摩尔浓度为30M,所述抗坏血酸溶液中抗坏血酸的摩尔浓度为10M,所述纳米金星种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液和所述抗坏血酸溶液的体积比为8~12:100:1:0.5,所述搅拌反应的时间为1分钟,所述搅拌反应的转速为300rpm,所述HS-PEG-COOH溶液中HS-PEG-COOH的摩尔浓度为10mM,所述HS-PEG-COOH的分子量为5000Da,所述HS-PEG-COOH溶液与所述混合溶液的体积比为10~100:1095~1135,所述室温搅拌反应的时间为12小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述纳米金星粒子溶液中所述纳米金星的直径为95nm~115nm。
较佳地,在所述步骤(3)中,所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度为10mg/ml,所述光敏剂加入后所述光敏剂的终浓度为1μg/ml~5μg/ml,所述氯化钙溶液和所述纳米金星粒子溶液的体积比为5~10:250,所述室温搅拌反应的时间为24小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子中所述光敏剂的载药率为8%重量~15%重量。
较佳地,在所述步骤(3)中,所述氯化钙溶液替换为硫酸钙溶液、氢化钙溶液、氧化钙溶液或氢氧化钙溶液,或者,所述光敏剂是吲哚青绿。
较佳地,在所述步骤(4)中,所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量浓度为10mg/ml,所述碳酸钠溶液与所述去离子水的体积比为5~10:100,所述室温搅拌反应的时间为24小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针中所述碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm。
在本发明的第三方面,提供一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特点是,采用上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法制备而成。
在本发明的第四方面,提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特点是,包括免疫细胞以及上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针位于所述免疫细胞中。
较佳地,所述免疫细胞包括NK细胞、CIK细胞、CTL细胞、TIL细胞、DC细胞中的至少一种。
在本发明的第五方面,提供一种上述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特点是,将所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针和所述免疫细胞共孵育从而获得所述靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
较佳地,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的终浓度为10μg/ml~40μg/ml,所述免疫细胞的密度为1~3*106个/ml,所述共孵育的时间为12小时,所述共孵育的培养条件为:37℃、95%湿度、5%体积的二氧化碳。
在本发明的第六方面,提供上述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针在免疫治疗中的应用。
本发明的有益效果主要在于:
1、本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针包括纳米金星、碳酸钙壳层和光敏剂,碳酸钙壳层包覆在纳米金星外,光敏剂负载在碳酸钙壳层中,纳米金星的直径为95nm~115nm,碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm,其中纳米金星可通过胞吞作用进入细胞到达溶酶体,在激光照射后可以实现光热治疗,在酸性条件下,碳酸钙壳层遇到H+离子会逐渐被降解,使其中的光敏剂缓慢释放,光敏剂既可以实现激光照射后的光热治疗和光动力治疗,也能荧光成像实时跟踪,适于大规模推广应用。
2、本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针包括纳米金星、碳酸钙壳层和光敏剂,碳酸钙壳层包覆在纳米金星外,光敏剂负载在碳酸钙壳层中,纳米金星的直径为95nm~115nm,碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm,设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
3、本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法包括以下步骤:(1)纳米金星种子溶液的制备;(2)纳米金星粒子溶液的制备;(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备;(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备,由其制备的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的纳米金星可通过胞吞作用进入细胞到达溶酶体,在激光照射后可以实现光热治疗,在酸性条件下,碳酸钙壳层遇到H+离子会逐渐被降解,使其中的光敏剂缓慢释放,光敏剂既可以实现激光照射后的光热治疗和光动力治疗,也能荧光成像实时跟踪,适于大规模推广应用。
4、本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法包括以下步骤:(1)纳米金星种子溶液的制备;(2)纳米金星粒子溶液的制备;(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备;(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备,设计巧妙,操作简便,成本低,适于大规模推广应用。
5、本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针包括免疫细胞以及上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,碳酸钙包覆纳米金星荧光探针位于免疫细胞中,其能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
6、本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针包括免疫细胞以及上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,碳酸钙包覆纳米金星荧光探针位于免疫细胞中,其设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
7、本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法是将碳酸钙包覆纳米金星荧光探针和免疫细胞共孵育从而获得靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,由其制备的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
8、本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法是将碳酸钙包覆纳米金星荧光探针和免疫细胞共孵育从而获得靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,设计巧妙,操作简便,成本低,适于大规模推广应用。
9、本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针在免疫治疗中的应用,可以用于靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势,通过下述的详细说明,附图和权利要求得以充分体现,并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针一实施例的结构示意图;
图2是本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的一具体实施例的扫描电镜图;
图3是图2所示的具体实施例的吸收光谱示意图;
图4是图2所示的具体实施例与NK细胞共孵育的显微照片,放大倍数为100倍;
图5是本发明的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的结构示意图;
其中:1纳米金星;2碳酸钙壳层;3光敏剂;4免疫细胞;5碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
为了制备靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,本发明首先提供了一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5,如图1所示,包括纳米金星1、碳酸钙壳层2和光敏剂3,所述碳酸钙壳层2包覆在所述纳米金星1外,所述光敏剂3负载在所述碳酸钙壳层2中,所述纳米金星1的直径为95nm~115nm,所述碳酸钙壳层2的厚度为5nm~15nm。
“所述纳米金星1的直径为95nm~115nm”意味着所述纳米金星1的大小位于直径为95nm~115nm的球形范围内。
本发明还提供了一种上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法。
首先是制备纳米金星种子溶液,接着利用还原法得到纳米金星粒子溶液,接着利用HS-PEG-COOH与纳米金星1形成Au-S键作用进行化学修饰,提高纳米金星1的亲水性,然后利用物理吸附作用,将氯化钙与光敏剂3一起吸附到纳米金星1表面;接着加入碳酸钠溶液,利用碳酸钠与氯化钙的置换反应生成碳酸钙、氯化钠,在形成碳酸钙壳层2的过程中,光敏剂3被固化在碳酸钙壳层2里,通过生理盐水漂洗后得到的沉淀即为碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5。
具体地,本发明的上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法包括以下步骤:
(1)纳米金星种子溶液的制备:将柠檬酸三钠溶液加入煮沸腾的氯金酸溶液中,搅拌反应,然后冷却至室温,即得到所述纳米金星种子溶液;优选地,所述纳米金星种子溶液采用0.22μm的滤器进行过滤。
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将所述纳米金星种子溶液加入含盐酸的氯金酸溶液中,搅拌反应,然后加入硝酸银溶液与抗坏血酸溶液形成混合溶液,待所述混合溶液颜色变深蓝色后,加入HS-PEG-COOH溶液,室温搅拌反应,即得到所述纳米金星粒子溶液;
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:在所述纳米金星粒子溶液中加入氯化钙溶液和光敏剂,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子,或称为氯化钙包覆纳米金星荧光探针;
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子复溶于去离子水中,加入碳酸钠溶液,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
在所述步骤(1)中,所述柠檬酸三钠溶液和所述氯金酸溶液的浓度、用量,以及反应条件可以根据需要确定,较佳地,所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量百分含量为10%,所述氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为1mM,所述柠檬酸三钠与所述氯金酸溶液的体积比为1~1.5:80~100,所述搅拌反应的时间为10分钟~20分钟,所述搅拌反应的转速为300rpm。
在所述步骤(2)中,所述纳米金星种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液、所述抗坏血酸溶液和所述HS-PEG-COOH溶液的浓度、用量,以及反应条件可以根据需要确定,较佳地,所述的含盐酸的氯金酸溶液中盐酸的摩尔浓度为10M,所述的含盐酸的氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为10mM,所述硝酸银溶液中硝酸银的摩尔浓度为30M,所述抗坏血酸溶液中抗坏血酸的摩尔浓度为10M,所述纳米金星种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液和所述抗坏血酸溶液的体积比为8~12:100:1:0.5,所述搅拌反应的时间为1分钟,所述搅拌反应的转速为300rpm,所述HS-PEG-COOH溶液中HS-PEG-COOH的摩尔浓度为10mM,所述HS-PEG-COOH的分子量为5000Da,所述HS-PEG-COOH溶液与所述混合溶液的体积比为10~100:1095~1135,所述室温搅拌反应的时间为12小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述纳米金星粒子溶液中所述纳米金星1的直径为95nm~115nm。这里所述纳米金星1的直径的控制是通过加入的还原剂(即抗坏血酸)的量来实现的。
在所述步骤(3)中,所述纳米金星粒子溶液和所述氯化钙溶液浓度、用量,所述光敏剂的用量,以及反应条件可以根据需要确定,较佳地,所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度为10mg/ml,所述光敏剂3加入后所述光敏剂3的终浓度为1μg/ml~5μg/ml,所述氯化钙溶液和所述纳米金星粒子溶液的体积比为5~10:250,所述室温搅拌反应的时间为24小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子中所述光敏剂3的载药率为8%重量~15%重量。
在所述步骤(3)中,所述氯化钙溶液可以替换为其它无机钙化合物溶液,较佳地,所述氯化钙溶液替换为硫酸钙溶液、氢化钙溶液、氧化钙溶液或氢氧化钙溶液。
在所述步骤(3)中,所述光敏剂可以是任何合适的光敏剂,较佳地,所述光敏剂是吲哚青绿,也称为ICG或心脏绿。光敏剂ICG在激光照射后,既具有光热治疗的作用,也具有释放单线态氧杀伤癌细胞的功能,同时在近红外区域(激发波长:633nm)还可以发出红色荧光,可以起到荧光示踪的作用。纳米金星1也具有很好的光热治疗作用,使用808nm激光照射水溶液中纳米金星1时间6分钟后,可以使水温升高至53度。本发明中的纳米金星1的光热作用可以与光敏剂ICG的光热作用叠加,发挥更好的光热治疗效果。
在所述步骤(4)中,所述碳酸钠溶液的浓度、用量,所述去离子水的用量,以及反应条件可以根据需要确定,较佳地,所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量浓度为10mg/ml,所述碳酸钠溶液与所述去离子水的体积比为5~10:100,所述室温搅拌反应的时间为24小时,所述室温搅拌反应的温度为28℃,所述室温搅拌反应的转速为200rpm,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5中所述碳酸钙壳层2的厚度为5nm~15nm。这里所述碳酸钙壳层2的厚度是通过加入的碳酸钠的量以及转速来控制的。
本发明还提供采用上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法制备而成的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5。
本发明还提供一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,如图5所示,包括免疫细胞4以及上述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5位于所述免疫细胞4中。
所述免疫细胞4可以是任何合适的免疫细胞,可以根据需要确定,较佳地,所述免疫细胞4包括NK细胞、CIK细胞、CTL细胞、TIL细胞、DC细胞中的至少一种。
优选的,在所述免疫细胞4包括NK细胞的情况下,所述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法还包括对NK细胞的高纯度培养,经高纯度培养后,纯度可达到90%以上,所述NK纯度是指NK细胞表面CD3-CD56+的表达。NK细胞属于自然杀伤细胞,能够主动识别靶细胞(肿瘤细胞),不受MHC限制,无需抗原递呈,不依赖抗体,其表面受体如NKG2D等被肿瘤细胞表面的受体如MICA/B等活化后,可通过分泌穿孔素、颗粒霉素等直接来主动杀伤靶细胞(肿瘤细胞),或者通过FASL、TRAIL等凋亡通路引起靶细胞(肿瘤细胞)的凋亡,NK细胞能分泌多种免疫相关因子如TNF-alpha、IFN-gama、GM-CSF等进行免疫调节,激活体内的免疫系统,此外,NK细胞还能分泌多种趋化因子,如CCL3、CCL4等,召集体内更多的T细胞聚集到肿瘤部位,刺激T细胞的增殖,对靶细胞(肿瘤细胞)进行更好的杀伤。NK细胞对多种癌细胞均具有很好的杀伤效果,例如肺癌细胞A549、胃癌细胞MGC-803等。
本发明还提供上述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其是将所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5和所述免疫细胞4共孵育从而获得所述靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5的浓度、所述免疫细胞4的密度以及共孵育的条件可以根据需要确定,较佳地,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5的终浓度为10μg/ml~40μg/ml,所述免疫细胞4的密度为1~3*106个/ml,所述共孵育的时间为12小时,所述共孵育的培养条件为:37℃、95%湿度、5%体积的二氧化碳。
本发明还提供上述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针在免疫治疗中的应用。
本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针5进入免疫细胞4例如NK细胞后,聚集到溶酶体内,在溶酶体的酸性条件下,探针中的碳酸钙壳层2遇到H+离子会逐渐被降解,生成钙离子、释放二氧化碳等,碳酸钙壳层2降解后,光敏剂3与纳米金星1的物理吸附作用就减弱了,光敏剂3就会逐渐游离到免疫细胞4的细胞质中。
纳米金星1在激光照射后可以实现光热治疗;碳酸钙壳层2可以有效地保护光敏剂3在免疫细胞4内部的缓慢释放;免疫细胞4具有免疫靶向性,可以主动靶向到达肿瘤部位并杀伤癌细胞;光敏剂3既可以实现激光照射后的光热治疗和光动力治疗,也能荧光成像实时跟踪。
与传统探针相比,本发明的探针可实现荧光实时跟踪下的靶向免疫治疗、光热治疗及光动力治疗,具有靶向效率高,缓慢释放药物、荧光成像、综合治疗效果优异等特点,同时,还具有优良的生物相容性。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。
实施例1
(1)纳米金星种子溶液的制备:将1ml 10%的柠檬酸三钠溶液加入80ml煮沸腾的1mM HAuCl4溶液中,搅拌10min,转速300rpm,冷却至室温后,采用0.22μm的滤器过滤,即得到纳米金星种子溶液。
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将8ml纳米金星种子溶液加入含10M盐酸的100ml10mM氯金酸溶液中,搅拌1分钟,转速300rpm,随后加入1000μl 30M硝酸银溶液与500μl 10M抗坏血酸溶液形成混合溶液,待混合溶液颜色变深蓝色后,加入1ml HS-PEG-COOH(分子量为5000Da,10mM,购自Sigma公司),搅拌反应12小时,转速200rpm,反应温度为28℃,得到的纳米金星粒子溶液中纳米金星的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm~115nm。
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:取25ml纳米金星粒子溶液中加入0.5ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液,同时加入25.5μg光敏剂ICG(中文名称:心脏绿,购自Sigma公司),终浓度为1μg/ml,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子,其中所述光敏剂的载药率为8%重量~15%重量,通过紫外分光光度计测量上清中残留的光敏剂,然后总加入量减去上清中的残留量,就是实际的载药量。
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:用10ml去离子水复溶上述收集的沉淀,加入0.5ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm~15nm。
获得的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的扫描电镜图如图2所示,吸收光谱如图3所示。纳米金星在825nm处有一个明显的吸收峰,碳酸钙包覆纳米金星(负载光敏剂)后,吸收峰移动了50nm左右,即在775nm处有一个明显的吸收峰。这说明成功制备了碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
(5)NK细胞的制备
从人外周血中分离得到PBMC后,加入细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15,IL-18,IL-21,购自美国Peprotech公司)进行连续培养16天,获得CD3-CD56+表达量大于90%的NK细胞,用作后续复合探针的制备。
(6)靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备
将10μg/ml的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针加入到NK细胞(细胞密度为:1*106个/ml)中,在37度,5%二氧化碳的培养箱中进行共孵育,如图4所示,12小时后,用PBS漂洗,离心除去NK细胞外的纳米探针,即得到靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
实施例2
(1)纳米金星种子溶液的制备:将1.2ml 10%的柠檬酸三钠溶液加入90ml煮沸腾的1mM HAuCl4溶液中,搅拌15min,转速300rpm,冷却至室温后,采用0.22μm的滤器过滤,即得到纳米金星种子溶液。
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将10ml纳米金星种子溶液加入含10M盐酸的100ml10mM氯金酸溶液中,搅拌1分钟,转速300rpm,随后加入1000μl 30M硝酸银溶液与500μl 10M抗坏血酸溶液形成混合溶液,待混合溶液颜色变深蓝色后,加入5ml HS-PEG-COOH(分子量为5000Da,10mM,购自Sigma公司),搅拌反应12小时,转速200rpm,反应温度为28℃,得到的纳米金星粒子溶液中纳米金星的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm~115nm。
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:取25ml步骤(2)制备的纳米金星粒子溶液中加入0.75ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液,同时加入64.4μg光敏剂ICG(中文名称:心脏绿,购自Sigma公司),终浓度为2.5μg/ml,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子,其中所述光敏剂的载药率为8%重量~15%重量,通过紫外分光光度计测量上清中残留的光敏剂,然后总加入量减去上清中的残留量,就是实际的载药量。
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:用10ml去离子水复溶上述收集的沉淀,加入0.75ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm~15nm。
获得的碳酸钙包覆的纳米金星探针的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金星探针的扫描电镜图和吸收光谱。
(5)NK细胞的制备
从人外周血中分离得到PBMC后,加入细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15,IL-18,IL-21,购自美国Peprotech公司)进行连续培养16天,获得CD3-CD56+表达量大于90%的NK细胞,用作后续复合探针的制备。
(6)靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备
将20μg/ml的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针加入到NK细胞(细胞密度为:2*106个/ml)中,在37度,5%二氧化碳的培养箱中进行共孵育,孵育照片类似实施例1的孵育照片,12小时后,用PBS漂洗,离心除去NK细胞外的纳米探针,即得到靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
实施例3
(1)纳米金星种子溶液的制备:将1.5ml 10%的柠檬酸三钠溶液加入100ml煮沸腾的1mM HAuCl4溶液中,搅拌20min,转速300rpm,冷却至室温后,采用0.22μm的滤器过滤,即得到纳米金星种子溶液。
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将12ml纳米金星种子溶液加入含10M盐酸的100ml10mM氯金酸溶液中,搅拌1分钟,转速300rpm,随后加入1000μl 30M硝酸银溶液与500μl 10M抗坏血酸溶液形成混合溶液,待混合溶液颜色变深蓝色后,加入10ml HS-PEG-COOH(分子量为5000Da,10mM,购自Sigma公司),搅拌反应12小时,转速200rpm,反应温度为28℃,得到的纳米金星粒子溶液中纳米金星的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm~115nm。
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:取25ml纳米金星粒子溶液中加入1ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液,同时加入130μg光敏剂ICG(中文名称:心脏绿,购自Sigma公司),终浓度为5μg/ml,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子,其中所述光敏剂的载药率为8%重量~15%重量,通过紫外分光光度计测量上清中残留的光敏剂,然后总加入量减去上清中的残留量,就是实际的载药量。
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:用10ml去离子水复溶上述收集的沉淀,加入1ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液,反应条件为:水浴,反应温度28℃,转速200rpm,反应时间24小时,离心收集沉淀,即得到碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm~15nm。
获得的碳酸钙包覆的纳米金星探针的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金星探针的扫描电镜图和吸收光谱。
(5)NK细胞的制备
从人外周血中分离得到PBMC后,加入细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15,IL-18,IL-21,购自美国Peprotech公司)进行连续培养16天,获得CD3-CD56+表达量大于90%的NK细胞,用作后续复合探针的制备。
(6)靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备
将40μg/ml的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针加入到NK细胞(细胞密度为:2*106个/ml)中,在37度,5%二氧化碳的培养箱中进行共孵育,孵育照片类似实施例1的孵育照片,12小时后,用PBS漂洗,离心除去NK细胞外的纳米探针,即得到靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
因此,本发明结合纳米技术与生物细胞培养技术,创新性的将碳酸钙包覆纳米金星荧光探针与免疫细胞相结合,从而得到靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。既可以利用纳米金星、光敏剂的光热治疗作用,也可以利用光敏剂释放单线态杀伤癌细胞的光动力治疗作用,也可以利用免疫细胞的主动靶向癌细胞的免疫治疗作用和免疫调节能力,此外,光敏剂还具有荧光成像能力,可以实时跟踪。
相对于传统探针,本发明的探针由于结合了免疫细胞的靶向免疫性,能高效的靶向到肿瘤部位,免疫细胞还可以杀伤癌细胞,由于纳米金星的存在,在激光照射肿瘤部位时,可以产生很好的光热治疗效果;同时激光照射光敏剂后不仅可以产生光热治疗效果,也可以释放单线态氧杀伤癌细胞,还可以进行荧光成像,另外,本发明的探针还具有非常好的生物相容性,具体如下:
(1)本发明的复合探针,提高了光敏剂的载药率,还可以实现胞内缓释的作用;
(2)本发明的复合探针,经激光照射,可以产生优良的光热治疗效果;
(3)本发明的复合探针,经激光照射,可以产生优良的光动力治疗效果;
(4)本发明的复合探针,具有免疫治疗作用,主动杀伤癌细胞;
(5)本发明的复合探针,在近红外区(NIR)可进行荧光成像实时跟踪;
(6)相对于传统的光敏剂探针、纳米材料探针、荧光探针,本发明的探针,创新性的结合了免疫细胞的免疫靶向性,将光敏剂负载到碳酸钙包覆纳米金星探针中,既改善了光敏剂的不稳定性和低载药率,还可以在免疫细胞内缓慢释放光敏剂,同时利用NK细胞的靶向杀伤作用,可以携带探针靶向深入到肿瘤部位,进行荧光成像并直接杀伤肿瘤细胞,而且,在48小时~72小时后,用激光照射肿瘤部位,利用本发明复合探针的光热、光动力治疗作用,更好的发挥本发明复合探针的多功能性。
从而,本发明的复合探针将光热治疗、光动力治疗、免疫治疗以及荧光成像有机结合,实现优良的综合治疗效果。
综上,本发明的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针能与免疫细胞结合形成靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,能够靶向肿瘤细胞,并实现良好的治疗效果,设计巧妙,结构简洁,制备简便,成本低,适于大规模推广应用。
由此可见,本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明,在不背离所述原理下,实施方式可作任意修改。所以,本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
Claims (13)
1.一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特征在于,包括纳米金星、碳酸钙壳层和光敏剂,所述碳酸钙壳层包覆在所述纳米金星外,所述光敏剂负载在所述碳酸钙壳层中,所述纳米金星的直径为95nm~115nm,所述碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm。
2.一种如权利要求1所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)纳米金星种子溶液的制备:将柠檬酸三钠溶液加入煮沸腾的氯金酸溶液中,搅拌反应,然后冷却至室温,即得到所述纳米金星种子溶液;
(2)纳米金星粒子溶液的制备:将所述纳米金星种子溶液加入含盐酸的氯金酸溶液中,搅拌反应,然后加入硝酸银溶液与抗坏血酸溶液形成混合溶液,待所述混合溶液颜色变深蓝色后,加入HS-PEG-COOH溶液,室温搅拌反应,即得到所述纳米金星粒子溶液;
(3)氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子的制备:在所述纳米金星粒子溶液中加入氯化钙溶液和光敏剂,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子;
(4)碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备:所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子复溶于去离子水中,加入碳酸钠溶液,室温搅拌反应,离心收集沉淀,即得到所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
3.如权利要求2所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(1),具有如下一种或多种特征:
-所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量百分含量为10%;
-所述氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为1mM;
-所述柠檬酸三钠与所述氯金酸溶液的体积比为1~1.5:80~100;
-所述搅拌反应的时间为10分钟~20分钟;
-所述搅拌反应的转速为300rpm。
4.如权利要求2所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2),具有如下一种或多种特征:
-所述的含盐酸的氯金酸溶液中盐酸的摩尔浓度为10M;
-所述的含盐酸的氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为10mM;
-所述硝酸银溶液中硝酸银的摩尔浓度为30M;
-所述抗坏血酸溶液中抗坏血酸的摩尔浓度为10M;
-所述纳米金星种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液和所述抗坏血酸溶液的体积比为8~12:100:1:0.5;
-所述搅拌反应的时间为1分钟;
-所述搅拌反应的转速为300rpm;
-所述HS-PEG-COOH溶液中HS-PEG-COOH的摩尔浓度为10mM;
-所述HS-PEG-COOH的分子量为5000Da;
-所述HS-PEG-COOH溶液与所述混合溶液的体积比为10~100:1095~1135;
-所述室温搅拌反应的时间为12小时;
-所述室温搅拌反应的温度为28℃;
-所述室温搅拌反应的转速为200rpm;
-所述纳米金星粒子溶液中所述纳米金星的直径为95nm~115nm。
5.如权利要求2所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(3),具有如下一种或多种特征:
-所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度为10mg/ml;
-所述光敏剂加入后所述光敏剂的终浓度为1μg/ml~5μg/ml;
-所述氯化钙溶液和所述纳米金星粒子溶液的体积比为5~10:250,
-所述室温搅拌反应的时间为24小时;
-所述室温搅拌反应的温度为28℃;
-所述室温搅拌反应的转速为200rpm;
-所述的氯化钙包覆的负载有光敏剂的纳米金星粒子中所述光敏剂的载药率为8%重量~15%重量。
6.如权利要求2所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,所述氯化钙溶液替换为硫酸钙溶液、氢化钙溶液、氧化钙溶液或氢氧化钙溶液,和/或,所述光敏剂是吲哚青绿。
7.如权利要求2所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(4),具有如下一种或多种特征:
-所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量浓度为10mg/ml;
-所述碳酸钠溶液与所述去离子水的体积比为5~10:100;
-所述室温搅拌反应的时间为24小时;
-所述室温搅拌反应的温度为28℃;
-所述室温搅拌反应的转速为200rpm;
-所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针中所述碳酸钙壳层的厚度为5nm~15nm。
8.一种碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特征在于,采用如权利要求2~7中任一项所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法制备而成。
9.一种靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特征在于,包括免疫细胞以及如权利要求1~7中任一项所述的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法制备而成的碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针位于所述免疫细胞中。
10.如权利要求9所述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针,其特征在于,所述免疫细胞包括NK细胞、CIK细胞、CTL细胞、TIL细胞、DC细胞中的至少一种。
11.一种如权利要求9所述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,将所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针和所述免疫细胞共孵育从而获得所述靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针。
12.如权利要求11所述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法,其特征在于,具有如下一种或多种特征:
-所述碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的终浓度为10μg/ml~40μg/ml;
-所述免疫细胞的密度为1~3*106个/ml;
-所述共孵育的时间为12小时;
-所述共孵育的培养条件为:37℃、95%湿度、5%体积的二氧化碳。
13.如权利要求9~12中任一项所述的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针的制备方法制备而成的靶向免疫型碳酸钙包覆纳米金星荧光探针在免疫治疗中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190111 |
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