CN108836949B - Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物化学的合成领域，更具体地涉及制备从普鲁士蓝、红细胞膜囊泡和最终嵌有光敏剂的红细胞膜囊泡包裹普鲁士蓝纳米颗粒及各步骤的具体方法。嵌入光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡包裹普鲁士蓝纳米颗粒制备方法具体包括以下步骤：（1）普鲁士蓝纳米颗粒的制备，（2）红细胞膜囊泡的制备，（3）光敏剂Ce6嵌入红细胞膜囊泡，（4）嵌有光敏剂的红细胞膜囊泡包裹普鲁士蓝纳米颗粒。所得到的复合纳米药物递送系统具有增加药物在体内的循环时间、高的药物上载量、良好的生物相容性等优点。

Description

Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法
技术领域
本发明涉及化学药物领域，具体涉及Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒制备与用途。
背景技术
光触发方法的疗效与光敏材料的选择有直接关系。开发具有优良特性的光热转化制剂及光敏剂是实现高效的光热治疗和光动力治疗的关键。在近红外区具有较强的光吸收和较高的光热转化效率，普鲁士蓝纳米颗粒作为一种光热制剂在肿瘤的光热治疗方面具有重要潜力。除此之外，普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法简单，且具有良好的光热稳定性。然而，普鲁士蓝纳米颗粒表面没有具有化学活性的官能团，所以难以在其表面通过化学键合的方法修饰诊疗型的功能分子。因此，目前迫切需要研究新方法实现对普鲁士蓝纳米颗粒表面进行改性，从而实现对肿瘤的高效治疗。
Ce6是叶绿素稳定降解产物中与生物活性联系最广的成分之一，属于第二代光敏剂，并且已成为光动力治疗癌症新药研究中备受瞩目的研究对象，有研究报道表明，Ce6具有两亲性能（亲水性和亲脂性），能产生良好的肿瘤/正常组织比率，且吸收波长红移到了红光区（664nm），且产生单线态氧量子产率的能力高，暗毒性低。因此可以很好的用于肿瘤的光动力治疗。
近年来，红细胞膜作为一种生物功能材料，逐步用于纳米材料的表面修饰。研究表明具有磷脂双分子层和膜周边蛋白的细胞膜可以有效提高纳米材料的生物相容性，并逃避免疫系统的识别和攻击，实现对纳米药物的长循环运载。2017年，李亚萍团队将红细胞膜包裹在载有化疗药物和光敏剂的多孔硅纳米颗粒上显著延长了纳米颗粒的血液循环时间，同时实现了化疗药物和光敏剂的可控释放。2017年，刘庄课题组通过物理嵌入的手段将二氢卟吩e6（Ce6）高效嵌入红细胞膜的磷脂双层中，且不会破坏细胞膜的功能和结构的完整性。因此，将Ce6修饰后的红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒，能够有效提高其生物亲和性，并在实现肿瘤的光热/光动力治疗方面具有重大潜力。
发明内容
由于目前用于治疗肿瘤的药物递送载体其作用单一，生物相容性、降解性较差，在体内循环时间较短，本发明旨在合成一种具有较好生物相容性，能够有效增加药物在体内循环时间并实现光热和光动力协同治疗的新型药物递送平台。
本发明的技术方案具体如下：
Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒，制备方法包括以下步骤：
（1）将一定量的柠檬酸分别溶解在三氯化铁溶液和亚铁氰化钾溶液中，分别得到含柠檬酸的三氯化铁混合溶液和含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液；
（2）将步骤（1）得到的含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液逐滴加到含柠檬酸的三氯化铁混合溶液中，在60°C条件下剧烈搅拌，冷却到室温后继续搅拌半个小时，离心后用去离子水洗涤三次即可得到普鲁士蓝纳米颗粒 (PB)；
（3）将从小鼠眼球中取出的小鼠全血用PBS洗涤数次，加入灭菌的二次水在四度冰箱溶血一个小时,离心洗涤得到纯的红细胞膜；
（4）将步骤（3）得到的红细胞膜超声后先后通过孔径尺寸400纳米和200纳米的碳酸脂膜数次，即可得到红细胞膜囊泡（RBC）；
（5）将步骤（4）得到的红细胞膜囊泡分散在一定浓度的Ce6溶液中室温下缓和搅拌1小时，通过离心去除游离的Ce6，即可得到嵌有光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡（RBC/Ce6）；
（6）将步骤（1）得到的普鲁士蓝纳米颗粒分散在步骤（5）得到的嵌有光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡中，通过数次孔径尺寸100纳米的碳酸脂膜，即可得到最终的Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝复合纳米颗粒（PB@RBC/Ce6）。
进一步的，所述步骤（1）中的含柠檬酸的三氯化铁混合溶液中的柠檬酸的浓度为25mM以及三氯化铁的浓度为1.0mM；所述步骤（1）中的含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液中的柠檬酸的浓度为25mM以及亚铁氰化钾的浓度为1.0mM。
进一步的，所述步骤（2）中的含柠檬酸的三氯化铁混合溶液和含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液体积比为1:1。
进一步的，所述步骤（3）中小鼠全血洗涤到上清液无色后进行溶血。
进一步的，所述步骤（4）中红细胞膜超声后先后通过孔径尺寸400纳米和200纳米的碳酸脂膜不少于7次。
进一步的，所述步骤（5）中Ce6浓度为50-200μg/ml。
进一步的，所述步骤（6）中普鲁士蓝纳米颗粒浓度为50-400μg/ml；所述步骤（6）中通过孔径尺寸100纳米的碳酸脂膜不少于七次。
本发明主要优点有：
针对目前纳米药物载体存在的问题，本项目创造性地提出能够实现多种治疗方法协同治疗同时又具有较好生物相容性的纳米药物递送平台。本项目中， 普鲁士蓝纳米颗粒用于光热治疗，RBC能很好的运载光敏剂Ce6，同时能显著提高纳米递送系统的生物相容性延长纳米颗粒在生物体内的循环时间，增加纳米药物在肿瘤区域的富集。整个纳米药物递送系统能有效提高治疗效果，减小对正常组织的毒害作用，解决纳米递送系统的稳定性和协同性等问题，实现肿瘤的高效治疗。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为本发明实施例1复合纳米颗粒（PB@RBC/Ce6）的合成及作用示意图。
图2为本发明实施例1中复合纳米颗粒的TEM图。
图3为本发明实施例1中纳米颗粒的DLS图。
图4为本发明实施例1中纳米颗粒红外光谱图。
图5为本发明实施例1中复合纳米颗粒在有光照下对4T1癌细胞24h的体外毒性图。
图6为本发明实施例1中复合纳米颗粒在没有光照下对4T1癌细胞24h的体外毒性图。
图7为本发明实施例1中复合纳米颗粒的体内抗肿瘤效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1制备光敏剂Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒
Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的合成及作用如图1所示。包含以下制备步骤：
（1）普鲁士蓝纳米颗粒的制备：将96 mg的柠檬酸溶解在20ml浓度均为1.0mM三氯化铁和亚铁氰化钾溶液中，得到相应的混合溶液；然后将含有柠檬酸的亚铁氰化钾溶液逐滴加到含有柠檬酸的三氯化铁溶液中，在60°C条件下剧烈搅拌，冷却到室温后继续搅拌半个小时，离心后用去离子水洗涤三次，即可得到普鲁士蓝纳米颗粒（PB）。
（2）红细胞膜囊泡的制备：将从小鼠眼球中取出的小鼠全血用PBS洗涤数次，直到上清液为无色，加入灭菌的二次水在四度冰箱溶血一个小时，离心洗涤得到纯的红细胞膜。然后将红细胞膜超声5分钟后先后通过孔径尺寸400纳米和200纳米的碳酸脂膜10次，即可得到红细胞膜囊泡（RBC）；
（3）Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备：将红细胞膜囊泡分散在一定浓度的Ce6溶液中室温下缓和搅拌1小时，离心去除游离的Ce6， 将普鲁士蓝纳米颗粒分散在嵌有光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡中，通过7次孔径尺寸100纳米的碳酸脂膜，即可得到最终的光敏剂Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝复合纳米颗粒（PB@RBC/Ce6）。
其透射电镜（TEM）见图2， TEM结果显示纳米颗粒直径约为50.66 ± 4.52 nm。其DLS图见图3，结果显示其水合粒径为61.4 ± 7.32 nm，稍微大于TEM的测试结果。其红外光谱见图4，结果显示PB、RBC、Ce6的特征峰在PB@RBC/Ce6上均存在，说明PB@RBC/Ce6已成功的合成。图5、图6分别是在有光照和无光照条件下纳米颗粒对4T1肿瘤细胞24h的体外毒性示意图，从图中可以看出通过不同的处理，对4T1肿瘤细胞的毒性表现出一个很好的协同作用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）将一定量的柠檬酸分别溶解在三氯化铁溶液和亚铁氰化钾溶液中，分别得到含柠檬酸的三氯化铁混合溶液和含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液；
（2）将步骤（1）得到的含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液逐滴加到含柠檬酸的三氯化铁混合溶液中，在60°C条件下剧烈搅拌，冷却到室温后继续搅拌半个小时，离心后用去离子水洗涤三次即可得到普鲁士蓝纳米颗粒PB；
（3）将从小鼠眼球中取出的小鼠全血用PBS洗涤数次，加入灭菌的二次水在四度冰箱溶血一个小时，离心洗涤得到纯的红细胞膜；
（4）将步骤（3）得到的红细胞膜超声后分别通过孔径尺寸为400纳米和200纳米的碳酸脂膜数次，即可得到红细胞膜囊泡RBC；
（5）将步骤（4）得到的红细胞膜囊泡分散在一定浓度的Ce6溶液中室温下缓和搅拌1小时，通过离心去除游离的Ce6，即可得到嵌有光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡RBC/Ce6；
（6）将步骤（2）得到的普鲁士蓝纳米颗粒分散在步骤（5）得到的嵌有光敏剂Ce6的红细胞膜囊泡中，通过数次孔径尺寸为100纳米的碳酸脂膜，即可得到最终的光敏剂Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝复合纳米颗粒PB@RBC/Ce6;
所述步骤（1）中的含柠檬酸的三氯化铁混合溶液中的柠檬酸的浓度为25mM以及三氯化铁的浓度为1.0mM；所述步骤（1）中的含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液中的柠檬酸的浓度为25mM以及亚铁氰化钾的浓度为1.0mM;
所述步骤（5）中Ce6浓度为50-300μg/ml。
2.根据权利要求1所述的Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的含柠檬酸的三氯化铁混合溶液和含柠檬酸的亚铁氰化钾混合溶液体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中小鼠全血洗涤到上清液无色后进行溶血。
4.根据权利要求1所述的Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中红细胞膜超声后先后通过孔径尺寸400纳米和200纳米的碳酸脂膜分别不少于7次。
5.根据权利要求1所述的Ce6嵌入型红细胞膜包裹普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中普鲁士蓝纳米颗粒浓度为50-400μg/ml；所述步骤（6）中通过孔径尺寸100纳米的碳酸脂膜不少于七次。
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