CN111920949B - 一种基于红细胞的光控药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于红细胞的光控药物载体及其制备方法和应用，该基于红细胞的光控药物载体通过在红细胞表面共价接枝光敏剂分子获得，其合成步骤简单，安全性好，可以对不同类型药物进行有效包载，并具有超长的体内循环时间和光控药物释放效果。本发明的红细胞载体在静脉注射入体内后能够在体内长时间循环，载体表面共价修饰的光敏剂能够在光照条件下产生单线态氧并增加红细胞载体的通透性，因此可以通过激光照射调控其药物释放的时间和部位，使药物有效富集在肿瘤区域。此外，该载体的生物安全性良好，可以广泛应用于制备超长体内循环时间的光调控智能载药体系。

Description

一种基于红细胞的光控药物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物药物载体，具体涉及一种基于红细胞的光控药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
红细胞是自然界的长循环运输工具。它们具有许多显著的特性，并且对于药物递送系统的设计具有很好的指导作用。红细胞非常适合用于药物的血管内递送，具有生物相容性、生物降解性和非免疫原性。它们自然形成的腔室可以很好地保护其封装的货物，从而赋予它们同样的在血液中长循环的效果。若以不损害其生物功能的方式装载货物，有可能利用红细胞的长循环实现药物递送的应用。尽管红细胞作为药物载体具有各种优异的性质，然而其在肿瘤选择性靶向和可控药物释放方面却依旧存在着缺陷。包裹在红细胞中的药物可能会随着红细胞的体内循环过程在全身无差别的释放，因而虽然红细胞赋予了药物更长的循环时间，却并没有从本质上解决药物的肿瘤富集及系统毒性等问题。因此如何解决红细胞作为药物载体的可控和精准的药物释放是一个亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于红细胞的光控药物载体。该药物载体是一种表面修饰有光敏剂的红细胞载体，可以很好地保留红细胞本身的特性，从而实现超长的血液循环，此外，该红细胞载体可以实现多种药物的包封，具有很好的稳定性并且可以通过激光照射触发药物快速释放，从而实现光控的药物递送和释放，提高药物的肿瘤或其他病灶区域的富集效率。
本发明还提供所述基于红细胞的光控药物载体的制备方法和应用
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种基于红细胞的光控药物载体，所述载体通过在红细胞表面共价接枝光敏剂分子获得。作为优选，所述的红细胞为哺乳动物红细胞或者其他动物的红细胞。
作为优选，所述光敏剂为二氢卟吩e6、碳菁染料cypate、原卟啉、5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉、孟加拉玫瑰红或光克洛。
本发明所述的基于红细胞的光控药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将光敏剂先溶解于二甲基亚砜中，稀释后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺后进行反应；反应结束后，离心去沉淀，洗涤后得到活化后的光敏剂；
(2)将步骤(1)制得的活化后的光敏剂重悬后的悬液，与含红细胞悬液混合进行反应；反应结束后，离心取沉淀得到红细胞，洗涤至上清无颜色，得到表面修饰有光敏剂的红细胞载体，即基于红细胞的光控药物载体。
其中，步骤(1)所述光敏剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的物质的量比为1：(3-20)：(3-20)。
作为优选，步骤(1)所述进行反应为将调节pH至6.0-6.5，室温反应0.5-1小时。
其中，步骤(2)所述活化后的光敏剂重悬后的悬液与红细胞悬液混合的体积比为1：(1-200)；所述光敏剂重悬后的悬液浓度为1-2mg/mL，含红细胞悬液中红细胞与磷酸缓冲液体积比为1：9-10。
作为优选，步骤(2)所述进行反应为室温反应1-2小时。
本发明所述的基于红细胞的光控药物载体在包载及递送药物中的应用。
作为优选，所述药物包括小分子药物、蛋白药物、基因药物及纳米药物。
本发明通过在红细胞载体表面共价接枝光敏剂，在保证红细胞本身形态和性质不改变的前提下实现了基于红细胞的光控药物载体的制备。首先，通过本发明步骤(1)对光敏剂进行活化，再通过本发明步骤(2)共价接枝的方法将活化后的光敏剂共价接枝到红细胞上，进行光敏剂修饰，确保了光敏剂修饰的稳定性，并且保证了光敏剂不会在该红细胞载体的储存和应用中大量脱落。此外，该载体可以实现各种药物的包裹，实现超长时间的体内循环，并且可以通过光敏剂在光照条件下产生的单线态氧增大红细胞载体的通透性，实现药物的光控释放。该红细胞载体制备简单，可以实现包括小分子药物、蛋白药物、基因药物及纳米药物等多种药物的包裹和递送，延长药物的体内循环时间并通过在肿瘤区域施加局部光照触发药物释放，实现高效的药物肿瘤递送。
设计原理：本发明将光敏剂通过共价接枝的方式稳固的负载在红细胞膜上(如图1)，并在红细胞内部负载药物，在需要药物释放的位置和时间施加光照，从而促使药物快速释放，实现光控的药物递送。位于红细胞膜表面的光敏剂在光照条件下可以产生单线态氧破坏红细胞膜，增大其通透性，从而实现内部药物的释放，同时利用红细胞载体可以有效避免药物被机体清除，从而实现更长的体内循环时间。在无光照的条件下，药物可以稳定的包封于红细胞中避免泄露。而在病灶区域可以通过激光照射实现药物的迅速释放，起到较好的治疗效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)合成简便：反应时间短，反应条件温和，全程在水相、室温条件下反应。仅需要离心清洗即可完成纯化。
(2)良好的药物装载效果：可以实现各种药物的包裹，具有较高的包封率和较好的稳定性并且几乎不会产生药物泄露。
(3)超长的体内循环：由于具有与红细胞相同的形貌和表面性质，该基于红细胞的光控药物载体可以实现超长的体内循环而不被免疫系统捕获和清除。
(4)快速的光控释放：在光照条件下可以有效增大基于红细胞的光控药物载体的通透性，实现药物的快速释放，增加其如在肿瘤部位或其他病灶区域的富集，实现光控的药物递送和释放。
综上，本发明的基于红细胞的光控药物载体其合成步骤简单，安全性好，可以对不同类型药物进行有效包载，并具有超长的体内循环时间和光控药物释放效果。本发明的红细胞载体在静脉注射入体内后能够在体内长时间循环，载体表面共价修饰的光敏剂能够在光照条件下产生单线态氧并增加红细胞载体的通透性，因此可以通过激光照射调控其药物释放的时间和部位，使药物有效富集在如肿瘤区域。此外，该载体的生物安全性良好，可以广泛应用于制备超长体内循环时间的光调控智能载药体系。
附图说明
图1是本发明的基于红细胞的光控药物载体构建原理示意图；
图2是本发明的基于红细胞的光控药物载体30天内的稳定性评价结果。
图3是本发明的基于红细胞的光控药物载体包裹荧光标记的凝血酶的荧光成像图片。
图4是本发明的基于红细胞的光控药物载体用于光控凝血酶释放的荧光成像图片。
图5是本发明的基于红细胞的光控药物载体用于光控凝血酶释放的定量结果。
图6是本发明的基于红细胞的光控药物载体包裹凝血酶后在光照下诱发凝血的照片。
图7是本发明的基于红细胞的光控药物载体包裹替拉扎明后的光控药物释放曲线。
图8是本发明的基于红细胞的光控药物载体包裹凝血酶和替拉扎明后在体内光照引发肿瘤血管堵塞的成像结果。
图9是本发明的基于红细胞的光控药物载体包裹凝血酶和替拉扎明后的组织切片H&E染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
光克洛(HPPH)修饰的基于红细胞的光控药物载体的具体制备方式如下：
步骤1、取2mL小鼠全血1500rpm离心，弃去上清。沉淀经PBS(pH 7.4，以下均相同)清洗三次后得到小鼠红细胞。得到的红细胞加入10mL PBS重悬并再次1500rpm离心弃去上清，重复三次。将得到的小鼠红细胞与PBS按照体积比1：9重悬待用。
步骤2、取1mg HPPH加入10μL二甲基亚砜(DMSO)溶解。与1.5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.7mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺在pH6.0的条件下室温反应1h。反应结束后12000rpm离心10min取沉淀，用超纯水洗涤5次后得到活化后的HPPH。
步骤3、将步骤2得到的活化后的HPPH重悬于PBS(pH＝7.4)得到1mg/mL的HPPH悬液，经过水浴超声至完全分散后与步骤1得到的红细胞悬液按体积比1：19混合，室温反应1h。反应液经1500rpm离心5min后弃去上清，得到基于红细胞的光控药物载体(HRBCs)，得到的HRBCs加入10mL PBS重悬并再次1500rpm离心弃去上清，重复三次，将HRBCs用等体积的红细胞保存液重悬在4℃条件下保存。
实施例2
实施例2制备方法与实施例1相同不同之处在于，仅将其中的HPPH替换为孟加拉玫瑰红(RB)。
实施例3
观察实施例1制备的HRBCs的稳定性。
步骤1、将1mL实施例1中得到的HRBCs悬液放置于4℃；
步骤2、在30天内每隔两天取10μL HRBCs悬液，用PBS稀释10倍后，通过流式细胞仪对其荧光强度进行统计，结果见图2，图2中的荧光强度在30天基本未发生变化，说明本发明的载体可以实现药物的包裹，具有较高的包封率和较好的稳定性并且几乎不会产生药物泄露，确保了光敏剂修饰的稳定性，并且保证了光敏剂不会在该红细胞载体的储存和应用中大量脱落。
实施例4
基于红细胞的光控药物载体对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的凝血酶(Th)的包载。
步骤1、将100μL实施例1中得到的基于红细胞的光控药物载体(HRBCs)与1mL浓度为100U/mL的Th的PBS溶液混合，在4℃条件下，过量的低渗缓冲液(10mM碳酸氢钠、10mM磷酸二氢钠、20mM葡萄糖、2mM三磷酸腺苷和3mM还原型谷胱甘肽)中透析1h。
步骤2、将透析袋内液体取出，加入其1/9体积的高渗缓冲液(100mM丙酮酸钠、100mM肌酐、10mM葡萄糖、4mM氯化镁、190mM氯化钠、1666mM氯化钾、33mM磷酸二氢钠和20mM三磷酸腺苷)，在37℃下放置30min后离心去掉上清，并用1mL PBS重悬，清洗三次后得到包裹有Th的HRBCs(Th@HRBCs)，用1mL PBS重悬保存。
共聚焦荧光显微镜成像观测：HPPH在552nm激发光下发出红色荧光，经过异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Th在488nm的激发光下得到绿色荧光，结果见图3，说明制备的Th@HRBCs可以很好地保持红细胞的双凹圆饼的形态，并且HPPH稳定修饰于红细胞表面，而Th可以大量包裹于红细胞内腔。
实施例5
观察实施例4中得到的Th@HRBCs的光控释放情况。
取100μL Th@HRBCs悬液加入共聚焦板中，利用激光(638nm，30mW/cm2，20s)进行局部照射，观察光照前以及光照后不同时间的荧光分布情况。
共聚焦荧光显微镜成像观测：HPPH在552nm激发光下发出红色荧光，荧光标记的Th在488nm的激发光下得到绿色荧光，结果见图4，光照前所有红细胞内均均匀分布着绿色荧光，表示Th被较为稳定的包封于红细胞内部。局部光照后，光照的区域(虚线方框内代表光照区域)内绿色荧光随时间逐渐变弱，表明光照后可以促进内部包裹的Th快速释放，同时未经过光照的区域荧光分布没有变化。
定量结果显示：Th的释放由酶联免疫吸附法测定，在无光照的条件下，Th的释放速度非常慢，24h内仅释放不到10％的药物，而施加光照后Th表现出了非常迅速的药物释放，可以在5min内实现80％以上的药物释放，结果见图5。
上述实施例2-5均能证明在不光照的条件下无药物泄露，在需要药物释放的位置和时间施加光照，从而促使药物快速释放，实现光控的药物递送，同时在光照条件下可以有效增大基于红细胞的光控药物载体的通透性。
实施例6
实施例4的Th@HRBCs的凝血效果评价。
将实施例4的Th@HRBCs悬液(含Th总量为1U的悬液)与100μL的小鼠血浆混合，在光照(671nm，30mW/cm2,1min)前后分别观察其促进血浆凝集的情况。同时采用游离的Th(1U)与经过0.1％曲拉通处理后的Th@HRBCs(Th：1U)作为对照。结果见图6。
通过倒置离心管的方式评价管内血浆的流动性，可以看到，光照组的血浆在倒置离心管后依旧凝结与管底不会流动。而无光照组的血浆依旧具有较好的流动性，说明没有发生明显的凝结。证明了Th@HRBCs可以实现很好的光控药物释放及光照触发的血液凝集。
实施例7
实施例1所制备的基于红细胞的光控药物载体对小分子化疗药物替拉扎明(TPZ)的包载。
步骤1、将100μL HRBCs与1mL浓度为200μg/mL的TPZ的PBS溶液混合，在4℃条件下，过量的低渗缓冲液中透析1h。
步骤2、将透析袋内液体取出，加入其1/9体积的高渗缓冲液，在37℃下放置30min后离心去掉上清，并用PBS重悬，清洗三次后得到包裹有TPZ的HRBCs(TPZ@HRBCs)，用1mLPBS重悬保存。
实施例8
观察实施例7中得到的TPZ@HRBCs的光控释放情况。
取100μL TPZ@HRBCs悬液，在光照和不光照的情况下通过紫外-可见吸收光谱测定TPZ的释放速度。
定量结果显示：TPZ的释放量由紫外-可见吸收光谱测定，在无光照的条件下，TPZ的释放速度非常慢，24h内仅释放不到10％的药物，而施加光照后TPZ表现出了非常迅速的药物释放，可以在5min内实现80％以上的药物释放，结果见图7。
实施例9
基于红细胞的光控药物载体对Th和TPZ的共同包载。
步骤1、将实施例1制备的100μL HRBCs与1mL含有100U/mL Th和200μg/mL的TPZ的PBS溶液混合，在4℃条件下，过量的低渗缓冲液中透析1h。
步骤2、将透析袋内液体取出，加入其1/9体积的高渗缓冲液，在37℃下放置30min后离心去掉上清，并用PBS重悬，清洗三次后得到共同包裹有Th和TPZ的HRBCs(Th/TPZ@HRBCs)，用1mL PBS重悬保存。
实施例10
实施例9制备的Th/TPZ@HRBCs的体内肿瘤血管堵塞情况。
取健康状况良好的4周龄BALA/c无胸腺的雌性裸鼠若干只，并在其皮下注射鼠源乳腺癌细胞(4T1)。当肿瘤体积达到100mm3左右时，将实施例9所得的纳米试剂通过尾静脉注射的方式注射到裸鼠体内(Th：500U/kg体重，TPZ：3mg/kg体重)。注射后4h后，在肿瘤部位进行局部激光照射(30mW/cm2,20min)，并在不同的时间点(1、3、7天)对经过光照及未经过光照的小鼠肿瘤区域的血流情况进行评价，结果见图8。经过光照的小鼠肿瘤区域的血流量明显减少，说明了在光照的条件下可以有效的触发凝血酶在肿瘤区域的快速释放，从而堵塞肿瘤血管，实现肿瘤饥饿治疗的目的。
实施例11
实施例9制备的Th/TPZ@HRBCs的安全性评价。
取健康状况良好的4周龄BALA/c无胸腺的雌性裸鼠若干只，将实施例9所得的纳米试剂通过尾静脉注射的方式注射到裸鼠体内(Th：500U/kg体重或100U/kg体重，TPZ：3mg/kg体重)。14天后对其主要组织进行切片及H&E染色。结果见图9，与对照组(注射等量PBS)相比，注射实施例9制备的Th/TPZ@HRBCs的小鼠主要器官的染色结果并无显著区别，证明该载体及药物安全性和生物相容性良好。
实施例12
实施例12与实施例1制备方法相同，不同之处在于：光敏剂为二氢卟吩e6，步骤2中光敏剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的物质的量比为1：3：3，在pH 6.5，室温反应0.5小时；步骤3中活化后的光敏剂重悬后的悬液与红细胞悬液混合的体积比为1：1，光敏剂重悬后的悬液浓度为1.5mg/mL，含红细胞悬液中红细胞与磷酸缓冲液体积比为1：10，室温反应1.5小时。
实施例13
实施例13与实施例1制备方法相同，不同之处在于：光敏剂为碳菁染料cypate，步骤2中光敏剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的物质的量比为1：20：20，在pH 6.0，室温反应2小时；步骤3中活化后的光敏剂重悬后的悬液与红细胞悬液混合的体积比为1：200，光敏剂重悬后的悬液浓度为2mg/mL，含红细胞悬液中红细胞与磷酸缓冲液体积比为1：10，室温反应2小时。
实施例14
实施例14与实施例1制备方法相同，不同之处在于：光敏剂为原卟啉。
实施例15
实施例15与实施例1制备方法相同，不同之处在于：光敏剂为卟啉。
实施例16
实施例16与实施例1制备方法相同，不同之处在于：光敏剂为5,10,15,20-四(4-羧基苯基)。

Claims (7)

1.一种基于红细胞的光控药物载体，其特征在于，所述载体通过在红细胞表面共价接枝光敏剂分子获得；所述光敏剂分子为光克洛；
所述基于红细胞的光控药物载体的制备方法为：
（1）将光敏剂先溶解于二甲基亚砜中，与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺后进行反应；反应结束后，离心去沉淀，洗涤后得到活化后的光敏剂；
（2）将步骤（1）制得的活化后的光敏剂重悬后的悬液，与含红细胞悬液混合进行反应；反应结束后，离心取沉淀得到红细胞，洗涤至上清无颜色，得到表面修饰有光敏剂的红细胞载体，即基于红细胞的光控药物载体；
步骤（1）所述进行反应为将调节pH至6.0-6.5，室温反应0.5–1小时；步骤（2）所述进行反应为室温反应1-2小时。
2.根据权利要求1所述的基于红细胞的光控药物载体，其特征在于，所述红细胞为哺乳动物红细胞。
3.一种权利要求1-2任一项所述的基于红细胞的光控药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将光敏剂先溶解于二甲基亚砜中，与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺后进行反应；反应结束后，离心去沉淀，洗涤后得到活化后的光敏剂；
（2）将步骤（1）制得的活化后的光敏剂重悬后的悬液，与含红细胞悬液混合进行反应；反应结束后，离心取沉淀得到红细胞，洗涤至上清无颜色，得到表面修饰有光敏剂的红细胞载体，即基于红细胞的光控药物载体；
步骤（1）所述进行反应为将调节pH至6.0-6.5，室温反应0.5–1小时；步骤（2）所述进行反应为室温反应1-2小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述光敏剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的物质的量比为1：3-20：3-20。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述活化后的光敏剂重悬后的悬液与红细胞悬液混合的体积比为1：1-200，所述光敏剂重悬后的悬液浓度为1-2 mg/mL，含红细胞悬液中红细胞与磷酸缓冲液体积比为1：9-10。
6.权利要求1-2任一项所述的基于红细胞的光控药物载体在制备包载及递送药物材料中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括小分子药物、蛋白药物。
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