CN111000825A - 一种具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体及其制备方法与应用。本发明提供的仿生纳米载体包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的有机金属骨架,有机金属骨架上负载有功能化SOD酶和β‑拉帕醌。该仿生纳米载体到达肿瘤细胞酸性环境后,MOF中的金属‑配体键被水解,产生质子化配体破坏红细胞膜,酶和药物释放;β‑拉帕醌被肿瘤细胞高表达的醌氧化还原酶1催化产生大量的超氧阴离子,经SOD酶催化产生过氧化氢,最后SOD酶中的铁离子通过芬顿反应将过氧化氢催化产生羟基自由基,进而杀死肿瘤细胞。本发明提供的仿生纳米载体通过酶进行治疗不仅不产生抗药性,还可以显著降低因药物施用造成的系统毒性,具有极高的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域,具体涉及一种具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载 体及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。根据世界卫生组织预计,随着全世界 癌症死亡人数的继续增加,到2030年将有1300万死于癌症。中国每年因癌症死亡的人数高 达230万人,癌症死亡率已高居我国城乡死亡率的首位。目前针对肿瘤的临床治疗手段有很 多,其中最主要的仍是手术切除、放射性治疗和化学治疗,但其仍然存在许多不足。手术切 除难以彻底根治肿瘤,容易复发;化疗则有多药耐药性以及高毒性的问题;放疗的放射性以 及高毒副作用给患者造成许多痛苦。寻找高效低毒的肿瘤治疗策略一直是研究的一个热点。 化疗是临床癌症治疗的重要手段,但由于传统的化疗药物具有高毒性和较差的肿瘤靶向性, 其副作用给病人带来了巨大的痛苦。为了提高化疗的治疗效果,减少其毒副作用,化疗药物 的载体设计显得尤为重要。由于肿瘤部位独特的微环境,具有微酸,乏氧,高H2O2表达,部 分酶高表达等特点,可以有针对性的进行载体的设计,例如酸响应载体,酶响应载体,复合 响应载体等。
近几十年来,纳米载体的设计与应用在肿瘤治疗等方面取得了极大的进展。通过载体的 巧妙设计,可以有效改善药物或者生物活性分子在肿瘤治疗过程中存在的低利用度,毒副作 用等缺点。光动力疗法,化学动力学疗法等多种新型疗法的提出,给载体的设计提出了更多 的思路。尤其是一些刺激响应型载体,可以根据肿瘤部位乏氧,微酸等特点,进行针对性设 计以达到在肿瘤部位定点释放的目的。加州大学张良方教授课题组首次尝试用来源于天然红 细胞的细胞膜对纳米颗粒进行包覆,并成功地提升了纳米颗粒体系循环能力。紧接着,利用 天然细胞膜包覆纳米粒子-细胞膜仿生纳米载体系统,以其优良的生物相容性和免疫逃逸的特 征,被广泛用于各种生物医学方面的应用研究。专利CN105769818公开了用于抗体药物递送 的红细胞膜包裹的抗体纳米粒子及制备方法,通过从实验鼠提取血液,在经过处理后去除了 大部分内容物和无关蛋白,并用得到的红细胞膜包裹抗体形成的蛋白纳米粒子。提高了游离 型抗体的稳定性、体内循环时间,并降低机体免疫清除率。Minfeng Huo等(Minfeng Huo, Liying Wang,Yu Chen&Jianlin Shi.Tumor-selectivecatalytic nanomedicine by nanocatalyst delivery.Nature Communications,8,1,2017)使用介孔硅包载葡萄糖氧化酶以及四氧化三铁纳米 粒子,制备出葡萄糖连锁刺激响应纳米药物载体,通过葡萄糖氧化酶与四氧化三铁纳米粒子 的连锁反应在肿瘤部位产生活性氧达到治疗肿瘤的目的。
综上,如何提高药物在肿瘤部位的聚集度以及让载体在肿瘤部位特异性释放是降低毒副 作用的关键;此外,传统化疗药物的耐药性也是影响治疗效果的重要原因。基于目前的现状, 针对肿瘤治疗的药物载体设计与构建显示出至关重要的地位。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种具有氧化与抗氧化双重功 能的仿生纳米载体。
本发明的另一目的在于提供上述具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的 有机金属骨架(MOF),有机金属骨架上负载有功能化超氧化物歧化酶(SOD)和β-拉帕醌 (β-lap);所述的功能化超氧化物歧化酶包括超氧化物歧化酶和包裹在酶内腔中的铁纳米粒子。
所述的红细胞膜优选为O型血红细胞膜,适用于各种血型的病人。
所述的红细胞膜优选为靶向配体修饰的红细胞膜,进一步实现靶向。
所述的靶向配体优选为Angiopep-2、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种;更 优选为叶酸。
所述的有机金属骨架优选为沸石咪唑骨架(ZIF-8);更优选为通过如下方法制备得到: 以二甲基咪唑为有机配体,由六水合硝酸锌提供金属离子,在室温下以水为溶剂反应合成。
所述的功能化超氧化物歧化酶优选通过如下方法制备得到:将超氧化物歧化酶与硫酸亚 铁铵((NH4)2Fe(SO4)2·6H2O)溶于除氧去离子水中,在氮气氛下搅拌,以恒定速率向溶液中 加入硼氢化钠(NaBH4),反应;超滤浓缩,即得到功能化超氧化物歧化酶。该过程通过将铁 纳米粒子矿化至超氧化物歧化酶内腔,获得了具有过氧化物酶功能的功能化超氧化物歧化酶 (Fe-SOD)。
所述的硼氢化钠优选为浓度为10~50mmol/L的硼氢化钠;更优选为50mmol/L的硼氢 化钠。
所述的以恒定速率向溶液中加入硼氢化钠优选为采用微量注射泵实现,速度设置为0.1~ 0.5ml/min;更优选为0.1ml/min。
所述的超氧化物歧化酶、硫酸亚铁铵和硼氢化钠的配比优选为质量比10~30:1:10~ 40。
所述的搅拌的时间优选为20~40min;更优选为30min。
所述的反应的时间优选为1~2h;更优选为1.5h。
所述的超滤浓缩采用的超滤管的截留分子量优选为5~20kDa;更优选为10kDa。
所述的超滤浓缩优选为浓缩至原液体积的1/4~1/6;更优选为1/5。
上述具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)将β-拉帕醌溶解,然后与功能化超氧化物歧化酶、二甲基咪唑共混,搅拌状态下加 入六水合硝酸锌,纯水定容,反应,离心,洗涤,得到负载有功能化超氧化物歧化酶和β-拉 帕醌的沸石咪唑骨架;
(2)将步骤(1)得到的沸石咪唑骨架与红细胞膜共混,通过微型脂质体挤出器挤压成 型,得到具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体。
步骤(1)中所述的溶解使用的溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO),得到的β-拉帕醌溶液 的浓度优选为0.05~0.15mg/μL;更优选为0.1mg/μL。
步骤(1)中所述的二甲基咪唑优选浓度为1~5mol/L的二甲基咪唑;更优选浓度为5mol/L 的二甲基咪唑。
步骤(1)中所述的六水合硝酸锌优选浓度为0.5~2mol/L的六水合硝酸锌;更优选浓度 为0.5mol/L的六水合硝酸锌溶液。
步骤(1)中所述的β-拉帕醌、功能化超氧化物歧化酶、二甲基咪唑和六水合硝酸锌的配 比优选为1~10mg:1~5mL:1~10mL:1~5mL。
步骤(1)中所述的搅拌的时间优选为10~60min;更优选为30min。
步骤(1)中所述的反应的时间优选为10~60min;更优选为20min。
步骤(1)中所述的离心的条件优选为5000~20000rpm离心10~60min;更优选为10000 rpm离心20min。
步骤(1)中所述的洗涤优选为用去离子水洗涤。
步骤(1)中所述的洗涤的次数优选为2~4次;更优选为3次。
步骤(2)中所述的微型脂质体挤出器优选为Avanti微型挤出器,购于AvantiPolar Lipids 公司。
步骤(2)中所述的挤压成型优选为依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体 挤出器中挤压7~15次;更优选为11次。
当所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜时,则所述的步骤(2)为:先将红细胞膜 与靶向配体连接磷脂混合,孵育,得到靶向配体修饰的红细胞膜;再将步骤(1)得到的沸石 咪唑骨架与靶向配体修饰的红细胞膜共混,通过微型脂质体挤出器挤压成型,得到具有氧化 与抗氧化双重功能的仿生纳米载体。
此时,步骤(2)中所述的孵育的时间优选为10~60min;更优选为20min。
上述具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体在医疗领域中的应用。
本发明首先设计了一种功能化的超氧化物歧化酶,通过将铁纳米粒子矿化至SOD酶内腔, 获得了具有过氧化物酶功能的功能化SOD酶,然后在ZIF-8形成的过程中将其与β-拉帕醌共同 包载入仿生金属有机配位聚合物(MOF)中,通过靶向化红细胞膜的修饰使其具有更长的血 液循环时间和肿瘤特异性靶向能力,得到负载功能化SOD酶和β-拉帕醌的仿生纳米载体。纳 米粒子达到肿瘤细胞后,由于溶酶体的酸性环境,MOF中的金属-配体键被水解,产生质子化 配体,利用质子缓冲效应破坏所包覆的红细胞膜,从而释放其中的酶和药物。β-拉帕醌被肿 瘤细胞高表达的醌氧化还原酶1(NQO1)催化产生大量的超氧阴离子,随后SOD酶可以将产 生的超氧阴离子催化产生过氧化氢,2O2 -+2H+→H2O2+O2,最后SOD酶中的铁离子通过芬顿 反应将过氧化氢催化产生羟基自由基,达到杀死肿瘤细胞的目的。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明设计制备的负载功能化SOD酶和β-拉帕醌的仿生纳米载体,利用红细胞膜 对机体组织器官或者细胞类型的生物亲和性,能够使酶和药物随载体一起输送到机体的靶向 位点,实现精确给药。
(2)本发明通过内源性人O型血红细胞膜包裹药物以增长体内循环时间,O型血作为 红细胞膜的原料可以适用于各种血型的病人,具有大规模产业化生产的潜力。
(3)通过酶进行治疗不仅不产生抗药性,还可以显著降低因药物施用造成的系统毒性。 本发明使用功能化SOD酶以及β-拉帕醌联合用药,可以有效避免多药耐药性,有极高的临床 应用前景。
(4)靶向的红细胞膜载体能够将药物有效的靶向至肿瘤部位,提高酶和药物的利用度, 减小对正常组织的损伤,同时提高肿瘤治疗效果。
(5)本发明利用肿瘤部位微酸性的特点,通过MOF水解产生质子缓冲效应破坏红细胞 膜释放酶和药物,β-拉帕醌被肿瘤细胞高表达的醌氧化还原酶1(NQO1)催化产生大量的超 氧阴离子,随后功能化SOD酶可以将产生的超氧阴离子催化产生过氧化氢,最后SOD酶中的铁离子通过芬顿反应将过氧化氢催化产生羟基自由基,达到杀死肿瘤细胞的目的。相比于 传统的纳米药物载体,不仅可以实现体内长循环,极大地提升酶和药物的生物利用度,不产 生抗药性,还可以显著降低因药物施用造成的统毒性。
附图说明
图1为实施例1透射电镜结果图;其中,(a)为ZIF-8透射电镜图,(b)为 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8透射电镜图,(c)为β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F透射电镜图(左上角 为局部放大后图片,标尺=50nm)(图(a)、(b)、(c)中标尺=200nm)。
图2为实施例1扫描电镜结果图;其中,(a)为ZIF-8扫描电镜图,(b)为 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8扫描电镜图,(c)为β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F扫描电镜图(右上角 为局部放大后图片,标尺=100nm)(图(a)、(b)、(c)中标尺=200nm)。
图3为实施例2不同pH下药物释放曲线;其中,(a)为不同pH下 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F中β-lap的药物释放曲线,(b)为不同pH下 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F中铁的药物释放曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:
(1)功能化SOD酶(Fe-SOD)的制备
将5mg SOD酶和0.2mg硫酸亚铁铵溶于5mL除氧去离子水中,在氮气氛下搅拌30min, 随后用微量注射泵以0.1ml/min的速度加入2.5mL的50mmol/L的硼氢化钠(全程通氮气), 反应1.5h,用10kDa的超滤管超滤浓缩,至终体积为2mL,通氮气4℃保存待用,命名为 Fe-SOD。
(2)有机金属骨架(ZIF-8)的制备与检测
将7.5mL的5mol/L浓度的二甲基咪唑溶于水中,搅拌下加入1mL的0.5mol/L浓度的六水合硝酸锌溶液,并加纯水定容至终体积为15mL,反应20min后10000rpm离心20min, 并用去离子水洗涤三次,得到ZIF-8。紫外吸收光谱检测结果表明洗涤三次后上清液中无残留试剂。
(3)人O型血红细胞膜(RBC)的制备
1)取人O型血全血1mL(保存在等体积抗凝剂里),4℃、2500rpm离心5min,除去上层血清和血小板等。
2)下层加入1mL生理盐水,反复吸出,4℃、2500rpm离心5min,洗涤两次,缓慢吸 掉上清。
3)冰浴下向洗涤后的红细胞中加入1mL生理盐水,10mL灭菌水,轻轻混匀,静置30min(15min时取出上下晃一下)。3500rpm离心5min,除去上层清液(血红蛋白)。1mL 生理盐水复溶,冻干保存。
(5)负载功能化SOD酶和β-拉帕醌仿生纳米载体(β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F)的制 备
将1mgβ-拉帕醌溶于10ul DMSO中,与1.5mL的SOD-Fe溶液以及7.5mL的5mol/L浓度的二甲基咪唑共混搅拌30min,搅拌下加入1mL的0.5mol/L浓度的六水合硝酸锌溶液,并加纯水至终体积为15mL。反应20min后,10000rpm离心20min,并用去离子水洗涤三次, 得到负载功能化SOD酶和β-拉帕醌的ZIF-8,命名为β-lap/Fe-SOD@ZIF-8。
将提取的1mL红细胞膜与100μg Folic acid-PEG-DSPE(购于上海拓旸生物科技有限公 司)一起共同孵育20分钟,然后与上述得到的负载功能化SOD酶和β-拉帕醌的ZIF-8共混, 使用Avanti微型挤出机(AvantiPolar Lipids),将混合溶液依次通过400nm以及200nm的聚碳 酸酯多孔膜,来回挤压至少11次,得到负载功能化SOD酶和β-拉帕醌的仿生纳米载体,命名 为β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F。
我们对ZIF-8,β-lap/Fe-SOD@ZIF-8以及β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F分别进行了透射电 镜(TEM)和扫描电镜(SEM)表征,结果分别如图1和图2所示。由扫描电镜结果(图2)可以看到,单纯的ZIF-8粒径大概在150nm左右,且表明比较光滑,而β-lap/Fe-SOD@ZIF-8的粒径大约在200nm左右,表明不太平整。由于有红细胞膜的存在,可以看到 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F的SEM图像与β-lap/Fe-SOD@ZIF-8相比,表面形貌略有不同, 但无法明确看出是否是由于成功包覆了红细胞膜所导致的。因此,我们又进行了TEM表征(图 1),三者的粒径与SEM结果基本一致,同时可以看到β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F相比于 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8,表明具有明显的膜状结构,表明红细胞膜成功的包覆至 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8。
实施例2药物体外释放实验
将实施例1得到的β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F分别溶解在pH=7.4以及pH=5.4的1 mol/L的PBS中。将每组的纳米颗粒溶液密封在截留分子量为3500Da的透析袋中,并在10mL 的PBS中透析。在一定间隔,从透析袋外的溶液中取出100μl等分试样进行HPLC分析或ICP-MS检测,计算其中β-lap以及Fe的含量,得到β-lap和Fe的药物释放曲线。结果如图3 所示。在pH 7.4时,亚铁离子和β-拉帕醌勉强释放,并且在36h内已释放了18.9%和9.4%的亚铁离子和β-拉帕醌。相反,在36h内,pH 7.4时,β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F中亚铁离 子和β-拉帕醌的释放率分别达到72.4%和78.2%。这些结果表明,pH触发的 β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F崩解加速了亚铁离子和β-拉帕醌的释放。这些结果表明,pH诱 导的β-lap/Fe-SOD@ZIF-8@RBC-F分解加速了亚铁离子和β-拉帕醌的释放,表明了其在癌症 治疗中的潜在应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其 他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等 效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的有机金属骨架,有机金属骨架上负载有功能化超氧化物歧化酶和β-拉帕醌;所述的功能化超氧化物歧化酶包括超氧化物歧化酶和包裹在酶内腔中的铁纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:所述的功能化超氧化物歧化酶通过如下方法制备得到:将超氧化物歧化酶与硫酸亚铁铵溶于除氧去离子水中,在氮气氛下搅拌,以恒定速率向溶液中加入硼氢化钠,反应;超滤浓缩,即得到功能化超氧化物歧化酶。
3.根据权利要求2所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:
所述的硼氢化钠是浓度为10~50mmol/L的硼氢化钠;
所述的以恒定速率向溶液中加入硼氢化钠采用微量注射泵实现,速度设置为0.1~0.5ml/min;
所述的超氧化物歧化酶、硫酸亚铁铵和硼氢化钠的配比为质量比10~30:1:10~40;
所述的搅拌的时间为20~40min;
所述的反应的时间为1~2h;
所述的超滤浓缩采用的超滤管的截留分子量为5~20kDa;
所述的超滤浓缩为浓缩至原液体积的1/4~1/6。
4.根据权利要求1所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:
所述的有机金属骨架为沸石咪唑骨架。
5.根据权利要求4所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:
所述的沸石咪唑骨架通过如下方法制备得到:以二甲基咪唑为有机配体,由六水合硝酸锌提供金属离子,在室温下以水为溶剂反应合成。
6.根据权利要求1所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体,其特征在于:
所述的红细胞膜为O型血红细胞膜;
所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜;
所述的靶向配体为Angiopep-2、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种。
7.权利要求1-6任一项所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将β-拉帕醌溶解,然后与功能化超氧化物歧化酶、二甲基咪唑共混,搅拌状态下加入六水合硝酸锌,纯水定容,反应,离心,洗涤,得到负载有功能化超氧化物歧化酶和β-拉帕醌的沸石咪唑骨架;
(2)将步骤(1)得到的沸石咪唑骨架与红细胞膜共混,通过微型脂质体挤出器挤压成型,得到具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体;
当所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜时,则步骤(2)为:先将红细胞膜与靶向配体连接磷脂混合,孵育,得到靶向配体修饰的红细胞膜;再将步骤(1)得到的沸石咪唑骨架与靶向配体修饰的红细胞膜共混,通过微型脂质体挤出器挤压成型,得到具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体。
8.根据权利要求7所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的溶解使用的溶剂为二甲基亚砜,得到的β-拉帕醌溶液的浓度为0.05~0.15mg/μL;
步骤(1)中所述的二甲基咪唑是浓度为1~5mol/L的二甲基咪唑;
步骤(1)中所述的六水合硝酸锌是浓度为0.5~2mol/L的六水合硝酸锌溶液;
步骤(1)中所述的β-拉帕醌、功能化超氧化物歧化酶、二甲基咪唑和六水合硝酸锌的配比为1~10mg:1~5mL:1~10mL:1~5mL。
9.根据权利要求7所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的搅拌的时间为10~60min;
步骤(1)中所述的反应的时间为10~60min;
步骤(1)中所述的离心的条件为5000~20000rpm离心10~60min;
步骤(1)中所述的洗涤为用去离子水洗涤2~4次;
步骤(2)中所述的挤压成型为依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压7~15次;
步骤(2)中所述的孵育的时间为10~60min。
10.权利要求1-6任一项所述的具有氧化与抗氧化双重功能的仿生纳米载体在医疗领域中的应用。
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