CN110974978B - 一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂及其制备方法与应用。本发明提供的纳米催化剂包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的复合纳米酶和光敏剂；复合纳米酶包括葡萄糖氧化酶和包裹在葡萄糖氧化酶内腔中的铁纳米粒子。该纳米催化剂通过靶向仿生递送优先累积在靶肿瘤位点，并在近红外光照射下实现复合纳米酶的释放；基于肿瘤部位高葡萄糖摄取和弱酸性环境，葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为H2O2，诱导铁纳米颗粒启动原位芬顿反应，顺序催化后产生羟基自由基，诱导肿瘤细胞氧化损伤，进而杀死肿瘤细胞。该纳米催化剂不仅能够实现对催化剂的高效负载，还能够有效延长体内循环时间，实现在肿瘤病灶部位精准、持续释放，为肿瘤治疗提供新的思路和平台。

Description

一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域，具体涉及一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前，癌症已成为全球第二大人类致死病因。众所周知，在癌症的常见治疗中，如化学疗法，光动力疗法和光热疗法都存在各种限制其治疗效率或者容易诱导不希望的肿瘤转移等问题。因此，许多研究者通过探索不同的治疗策略来提高肿瘤治疗方法的效率，实现更集中、更有效的肿瘤特异性治疗。
肿瘤病灶区的微环境具有其特殊性，如弱酸性、高谷胱甘肽(GSH)水平、乏氧等，在肿瘤发生、发展及转移方面起到极其重要的影响作用。能够响应肿瘤特点微环境的纳米制剂往往具有更小的侵袭性和更高的特异性去杀伤肿瘤细胞。化学动力学治疗(Chemodynamic Therapy,CDT)是目前比较热门的一种肿瘤治疗策略，定义为使用芬顿反应或类芬顿反应在肿瘤部位催化产生羟基自由基(·OH)以原位治疗肿瘤。简单地说，铁基纳米材料在肿瘤微环境的温和酸性条件下，其中的亚铁离子引发芬顿反应以消耗肿瘤部位过量产生的H2O2，产生·OH以触发细胞凋亡并抑制肿瘤(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH)。·OH是一种具有极强氧化能力的活性氧，能够引起肿瘤细胞的蛋白变性、DNA断裂、磷脂膜损伤和线粒体破坏等一系列氧化损伤，最终引起肿瘤细胞的凋亡，且不产生耐药性(Bystrom L M,Guzman M L,Rivella S.2014,20(12):1917-1924.)。最重要的是，这种方法在一定程度上确保了正常的组织安全性，因为在轻微碱性条件下和在正常微环境中H2O2不足的情况下，芬顿反应基本上被抑制。在酸性和中性pH条件下，氧化铁纳米颗粒分别具有类似过氧化物酶和过氧化氢酶的活性。氧化铁纳米颗粒的过氧化物酶样活性歧化反应产生的·OH可用于癌症治疗(芬顿反应)。施建林等人(Zhang C,Bu W,Ni D,et al.Angew Chem Int Ed Engl,2016,55(6):2101-2106.)报道了无定形铁纳米颗粒子的制备，其可以在肿瘤的微酸环境中转化为二价铁离子，以催化过氧化氢产生·OH。瘤内注射动物后发现肿瘤完全消失，提出了纳米催化药物肿瘤治疗的新策略。Chang等人(Chang K,Liu Z,Fang X,et al.NanoLetters,2017,17(7):4323-4329.)通过葡萄糖氧化酶与小聚合物点的共价缀合形成纳米平台。在光照下，原位产生的H2O2被光解产生羟基(·OH)，可以杀死癌细胞并抑制肿瘤生长。Minfeng Huo等(Huo M F,Wang L Y,Chen Y,et al.Nature Communications,2017,8:357)使用介孔硅包载葡萄糖氧化酶以及四氧化三铁纳米粒子，制备出葡糖糖连锁刺激响应纳米药物载体，通过葡萄糖氧化酶与四氧化三铁纳米粒子的连锁反应在肿瘤部位产生活性氧达到治疗肿瘤的目的。
基于目前的现状，针对肿瘤治疗的药物载体设计与构建显示出至关重要的地位。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂。该纳米催化剂能够在肿瘤原位释放纳米酶进行化学动力学治疗，以提高癌症治疗效率并减少毒副作用。
本发明的另一目的在于提供上述用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述用于肿瘤治疗的纳米催化剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂，包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的复合纳米酶和光敏剂；所述的复合纳米酶包括葡萄糖氧化酶(GOx)和包裹在葡萄糖氧化酶内腔中的铁纳米粒子。
所述的红细胞膜优选为靶向配体修饰的红细胞膜，进一步实现靶向。
所述的靶向配体优选为Angiopep-2、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种；更优选为Angiopep-2。
所述的复合纳米酶的制备方法包括如下步骤：将葡萄糖氧化酶和硫酸亚铁铵溶解在去离子水中，在氮气氛下，磁力搅拌，然后以恒定速率向溶液中滴加硼氢化钠(NaBH4)，反应；超滤离心，得到复合纳米酶。
所述的硫酸亚铁铵优选为浓度为20～30mmol/L的硫酸亚铁铵；更优选为浓度为25mmol/L的硫酸亚铁铵。
所述的磁力搅拌的时间优选为25～35min；更优选为30min。
所述的滴加硼氢化钠的速度优选为0.1～1mL/min；更优选为0.1mL/min。
所述的硼氢化钠优选浓度为7～8mmol/L的硼氢化钠；更优选浓度为7.5mmol/L的硼氢化钠。
所述的葡萄糖氧化酶、硫酸亚铁铵和硼氢化钠的配比优选为质量比1～10：2～20：1。
所述的反应的时间优选为1～3h；更优选为2h。
所述的光敏剂优选为吲哚菁绿(ICG)。
一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取红细胞膜，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到红细胞膜囊泡；
(2)将复合纳米酶、光敏剂和步骤(1)得到的红细胞膜泡囊在磷酸盐缓冲液(PBS)中混合均匀，搅拌，离心去除上清，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到用于肿瘤治疗的纳米催化剂。
步骤(1)中所述的红细胞膜优选为小鼠红细胞膜；更优选通过如下方法制备得到：取小鼠全血，离心去掉上清和白细胞层，然后对下层细胞进行低渗处理以除去细胞内基质，即得红细胞膜。
步骤(1)中所述的挤压成型优选为依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压7～15次；更优选为11次。
步骤(2)中所述的复合纳米酶、光敏剂和红细胞膜的用量优选按质量比4～6：1～1.5：4～6计；更优选为按质量比5：1：5计。
步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液优选为pH＝7.4、5mol/L的磷酸盐缓冲液。
步骤(2)中所述的搅拌的时间优选为7～9h；更优选为8h。
步骤(2)中所述的离心的条件优选为转速3000～4000rpm、时间4～6min；更优选为转速3500rpm、时间5min。
步骤(2)中所述的挤压成型优选为在100nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压7～15次；更优选为11次。
步骤(1)、步骤(2)中所述的微型脂质体挤出器优选为Avanti微型挤出器，购于Avanti Polar Lipids公司。
当所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜时，则所述的用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)取红细胞膜，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到红细胞膜囊泡；
(2)将步骤(1)得到的红细胞膜囊泡与靶向配体连接磷脂混合，孵育，得到靶向配体修饰的红细胞膜囊泡；
(3)将复合纳米酶、光敏剂和步骤(2)得到的靶向配体修饰的红细胞膜囊泡在磷酸盐缓冲液中混合均匀，搅拌，离心去除上清，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到用于肿瘤治疗的纳米催化剂。
上述用于肿瘤治疗的纳米催化剂在医疗领域中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)传统的化疗药物和光热疗法虽然在肿瘤治疗中取得较显著的效果，但仍然不可避免的会带来一些不利影响和有限的治疗效果。本发明设计的一种纳米催化剂，用于肿瘤治疗，并通过包裹红细胞膜，实现靶向仿生递送，该纳米催化剂能够在肿瘤原位释放纳米酶进行化学动力学治疗，以提高癌症治疗效率并减少毒副作用。
(2)葡萄糖氧化酶作为一种内源性的天然酶，具有催化效率高、作用条件温等特点。本发明设计合成超小型的铁纳米颗粒(零价铁)，作为潜在的肿瘤治疗性纳米催化剂，在肿瘤酸性条件下可以变为二价铁进而发生催化。受两种酶催化性能的启发，本发明将天然酶与纳米酶相结合，设计构建了两种酶活性于一体的纳米酶，将铁纳米粒子作为类芬顿催化剂，锚定在葡萄糖氧化酶的内腔中，因此具备了葡萄糖氧化酶和过氧化物酶两种酶活性。
(3)在体内肿瘤治疗中，为了防止了纳米酶的生物降解，本发明将纳米催化剂包裹在红细胞膜内，以延长纳米催化剂在体内的循环时间。同时，在红细胞膜上引入靶向试剂，使得红细胞膜纳米催化体系具备了特异性靶向肿瘤的目的，有效控制纳米催化剂在组织和细胞内的分布，实现高效精准释放纳米催化剂的功效。
(4)本发明将超小型铁纳米颗粒锚定在葡萄糖氧化酶的内腔中(GOx-Fe)，然后将GOx-Fe和光敏试剂嵌入肿瘤靶向配体功能化的红细胞膜中。在靶向配体介导的内吞作用下仿生纳米催化系统将优先累积在靶肿瘤位点。此时，在近红外光照射下影响红细胞膜的通透性并增强药物释放。基于肿瘤部位高葡萄糖摄取和弱酸性环境，GOx将葡萄糖转化为H2O2，用于诱导铁纳米颗粒启动原位芬顿反应，顺序催化后产生活性最高的氧物质羟基自由基，通过诱导肿瘤细胞氧化损伤，进而杀死肿瘤细。.
(5)现阶段研究结果表明，这种仿生的纳米催化剂不仅能够实现对催化剂的高效负载，还能够有效延长体内循环时间，实现在肿瘤病灶部位精准、持续释放，这种新型纳米催化体系将为肿瘤治疗提供新的思路和平台。
附图说明
图1为实施例1不同粒子的透射电镜结果图；其中，A为GOx-Fe(标尺＝20nm)；B为GOx-Fe@RI-A(标尺＝100nm)(右上角为局部放大后图片，标尺＝50nm)；C为808nm近红外光照射5min后的GOx-Fe@RI-A，标尺＝100nm)。
图2为实施例2药物体外释放实验结果图。
图3为实施例3羟基自由基的测定结果图；其中，A为pH＝7.4的结果，B为pH＝6.5的结果，C为pH＝5.4的结果。
图4为实施例4活死细胞染色实验结果图；其中，A为对照组，B为加入终浓度为3μg/mL的GOx-Fe@RI后808nm近红外照射的结果，C为加入终浓度为3μg/mL的GOx-Fe@RI-A后未808nm近红外照射结果，D为加入终浓度为3μg/mL的GOx-Fe@RI-A后未808nm近红外照射结果，E为加入终浓度为6μg/mL的GOx-Fe@RI-A后808nm近红外照射结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1纳米催化剂的制备
1.葡萄糖氧化酶中包裹铁核的复合纳米酶制备：
在25℃下，将5mg葡萄糖氧化酶和1mL的25mmol/L硫酸亚铁铵溶解在除氧去离子水中，并将溶液在氮气保护下磁力搅拌30min。然后，以恒定速率0.1mL/min向溶液中滴加2.5mL的7.5mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)。反应2h后，用超滤管将产物纯化，超滤膜的截留分子量为10000KDa，离心的速度为4000rpm，离心时间为10min，取超滤管中的液体，即得到葡萄糖氧化酶包裹铁核的复合纳米酶，命名为GOx-Fe。
2.红细胞膜的制备：
取小鼠全血5mL，4℃、2500rpm离心5min，移除上层液体；下层加入5mL生理盐水，反复吹打，4℃、2500rpm离心5min，移除上清，重复用生理盐水洗涤下层细胞、吹打、离心的操作两次，收集下层细胞膜。接下来将收集的细胞膜进行低渗处理，首先将细胞膜悬浮在1/4×PBS中，并在冰上放置20min，800rcf下离心5min。移去上层，底层的细胞膜用1×PBS清洗2次然后将清洗后的细胞膜在53kHz、100W条件下进行超声处理8min，依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机(Avanti微型挤出器)中挤压11次，即成功制备出红细胞膜囊泡(RI)。
3.靶向配体连接磷脂的制备：
将20mg的靶向多肽Angiopep-2(购买于耀强生物技术有限公司)溶解于0.5mL含有0.5mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)的pH＝7.4、1mol/L的PBS溶液中。然后，将2mL含有80mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(DSPE-PEG-MAL，分子量为5000，上海拓旸生物科技有限公司)的pH＝7.4、1mol/L的PBS溶液加入上述混合溶液中室温搅拌4h。将所得反应液于4℃置于超滤离心管中离心超滤，超滤膜的截留分子量为10000KDa，离心的速度为4000rpm，离心时间为20min，收集超滤管中的产品，冻干，即得修饰红细胞膜用的靶向配体连接磷脂Angiopep-2-PEG-DSPE。
4.靶向配体修饰的红细胞膜的制备：
将步骤3中的Angiopep-2-PEG-DSPE 5mg与步骤2中的红细胞膜囊泡1g在室温下混合，800rpm涡旋80s，再在4℃下静置1h，即得靶向配体修饰的红细胞膜囊泡(RI-A)。
5.红细胞膜包裹的纳米催化剂的制备：
将步骤1制备得到的复合纳米酶(葡萄糖氧化酶中包裹铁核)5mg、吲哚菁绿1mg与步骤4制备得到的靶向配体修饰的红细胞膜囊泡5mg在pH＝7.4、1mol/L的PBS中混合均匀，并将混合物在4℃下磁力搅拌8h，然后上清液以3500rpm离心5min除去。在100nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压11次，即得到红细胞膜包裹的纳米催化剂，并命名为GOx-Fe@RI-A。
通过透射电镜显微镜(TEM)检测制备的粒子，结果如图1所示。其中A为纳米催化剂即葡萄糖氧化酶矿化铁核(GOx-Fe)的透射电镜图，TEM图像所示，GOx-Fe的平均尺寸为12nm左右；B为红细胞膜包裹纳米催化剂的GOx-Fe@RI-A的透射电镜图，从TEM图上可以看到其粒径约为100nm左右；C为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米纳米催化剂GOx-Fe@RI-A经808nm激光光照后的透射电镜图，从TEM图可以看到在808nm激光照射后红细胞膜明显破裂，表明其能有效释放出纳米催化剂。
实施例2药物体外释放实验
将制备的GOx-Fe@RI-A分别溶解在pH＝7.4以及pH＝5.4的1mol/L的PBS中。将每组的纳米颗粒溶液密封在截留分子量为3500Da的透析袋中，并在10ml的PBS中透析。在一定间隔，从透析袋外的溶液中取出100μl等分试样进行ICP-MS检测，计算其中Fe的含量，得到Fe的药物释放曲线，结果如图2所示。观察到在光照射下，pH 7.4的亚铁离子释放速率非常慢，48小时后，仅释放12.5％。然而，在pH 6.5和pH 5.4的光照射下，亚铁离子的释放增加至77.3％和82.7％，呈现出明显的pH依赖性电离。值得注意的是，在pH 5.4无光照条件下，展现出亚铁离子的不情愿释放。这些结果表明，光激发可以加速纳米催化剂的释放，并且GOx-Fe@RI-A在酸性条件下的释放才可以加速Fe向亚铁离子的转变，其中的红细胞膜经光照后细胞膜发生破裂，有助于释放包覆的纳米催化剂GOx-Fe，并且其在酸性条件下有助于加速亚铁离子的释放。
实施例3羟基自由基的产生与测定
将苯甲酸(BA)溶解在不同pH(7.4、6.5和5.4)的1mol/L的PBS中。将GOx-Fe@RI-A(0.3mL，100μg/mL)加入到含有葡萄糖(2mmol/L)和不同pH的BA(2mmol/L)的混合物溶液(3mL)中。在808nm(1W/cm2)光照射后，监测60分钟内BA的荧光光谱变化，并且将410nm的OHBA发射强度对时间作图。结果如图3所示。如图3A所示，GOx-Fe@RI-A与葡萄糖混合后在pH7.4加光照条件下，混合物溶液的荧光光谱显示可忽略不计的变化。值得注意的是，在相同光照射下，在葡萄糖存在下，GOx-Fe@RI-A在pH 6.5和pH 5.4条件下(图3B和3C)，溶液中具有显著增强的羟基苯甲酸荧光，表明GOx-Fe@RI-A在酸性条件下，能发生催化级联反应，生成了羟基自由基。
实施例4活死细胞染色实验
工作液配制:取1mL 10×染色缓冲液(Assay Buffer)加9ml去离子水稀释，混合成1×染色缓冲液。在10mL 1×染色缓冲液中加入10μL Calcein AM和5μL PI，混合均匀，即得染色工作液。
将胶质瘤细胞C6细胞(ATCC)以1×105细胞/孔的密度接种到12孔板中并培养24小时，培养基为含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的DMEM培养基。将GOX-Fe@RI和GOX-Fe@RI-A分别加入C6细胞，与其一起孵育6小时，移除培养基并用新鲜培养基替换。随后，用808nm近红外激光灯(1W/cm2)照射细胞5min。再继续孵育18小时，然后用pH＝7.4、1mol/L的PBS洗涤细胞三次，每孔加入300uL染色工作液，37℃孵育20min，然后用倒置荧光显微镜检测，结果如图4所示。在pH 6.5条件下，对照组和GOx-Fe@RI-A孵育的C6细胞大多数存活，表现出强绿色荧光。另外，与GOx-Fe@RI加光照组相比，GOx-Fe@RI-A和光照射处理后观察到更明显的细胞受损，表现出强红色荧光。结果表明GOx-Fe@RI-A在光照和酸性条件下，表明能够特异性靶向肿瘤细胞的GOx-Fe@RI-A通过释放红细胞膜内的纳米催化剂产生羟基自由基来杀伤肿瘤细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于肿瘤治疗的纳米催化剂，其特征在于：包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的复合纳米酶和光敏剂；所述的复合纳米酶包括葡萄糖氧化酶和包裹在葡萄糖氧化酶内腔中的铁纳米粒子；所述的复合纳米酶的制备方法包括如下步骤：将葡萄糖氧化酶和硫酸亚铁铵溶解在去离子水中，在氮气氛下，磁力搅拌，然后以恒定速率向溶液中滴加硼氢化钠，反应；超滤离心，得到复合纳米酶；
所述的硫酸亚铁铵是浓度为20～30 mmol/L的硫酸亚铁铵；
所述的磁力搅拌的时间为25～35 min；
所述的滴加硼氢化钠的速度为0.1～1 mL/min；
所述的硼氢化钠是浓度为7～8 mmol/L的硼氢化钠；
所述的反应的时间为1～3 h；
所述的葡萄糖氧化酶、硫酸亚铁铵和硼氢化钠的配比为质量比1:2:1～1:2:3；
所述的光敏剂为吲哚菁绿；
所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜；
所述的靶向配体为Angiopep-2、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种。
2.权利要求1所述的肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取红细胞膜，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到红细胞膜囊泡；
（2）将复合纳米酶、光敏剂和步骤（1）得到的红细胞膜泡囊在磷酸盐缓冲液中混合均匀，搅拌，离心去除上清，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到用于肿瘤治疗的纳米催化剂；
当所述的红细胞膜为靶向配体修饰的红细胞膜时，则所述的用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）取红细胞膜，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到红细胞膜囊泡；
（2）将步骤（1）得到的红细胞膜囊泡与靶向配体连接磷脂混合，孵育，得到靶向配体修饰的红细胞膜囊泡；
（3）将复合纳米酶、光敏剂和步骤（2）得到的靶向配体修饰的红细胞膜囊泡在磷酸盐缓冲液中混合均匀，搅拌，离心去除上清，通过微型脂质体挤出器挤压成型，得到用于肿瘤治疗的纳米催化剂。
3.根据权利要求2所述的用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的复合纳米酶、光敏剂和红细胞膜的用量按质量比4～6：1～1.5：4～6计；
步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲液为pH= 7.4、1 mol/L的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的用于肿瘤治疗的纳米催化剂的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的红细胞膜通过如下方法制备得到：取小鼠全血，离心去掉上清和白细胞层，然后对下层细胞进行低渗处理以除去细胞内基质，即得红细胞膜；
步骤（1）中所述的挤压成型为依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压 7～15次；
步骤（2）中所述的搅拌的时间为7～9 h；
步骤（2）中所述的离心的条件为转速3000～4000 rpm、时间4～6 min ；
步骤（2）中所述的挤压成型为在100 nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压 7～15次。
5.权利要求1所述的用于肿瘤治疗的纳米催化剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111558032B (zh) * 2020-05-19 2023-08-22 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种蛋白纳米药物及其制备方法与应用
CN111939270A (zh) * 2020-08-19 2020-11-17 西南大学 一种具有持续抗菌效果的双纳米酶抗菌剂及其制备方法
CN112206220B (zh) * 2020-10-13 2023-08-01 深圳市人民医院 一种血小板膜衍生囊泡包被的aie纳米颗粒酶及其制备方法
CN112516110B (zh) * 2020-10-13 2022-05-13 北京化工大学 一种细胞膜包覆纳米酶的方法
CN113368254B (zh) * 2021-04-29 2022-10-28 重庆医科大学 一种pH响应型尺寸自调控纳米药物递送系统及其制备方法
CN113577279A (zh) * 2021-08-19 2021-11-02 中国药科大学 一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物、制法及应用
CN113648288A (zh) * 2021-08-19 2021-11-16 中国药科大学 一种红细胞膜包被功能性分子的纳米复合物、制法及应用
CN114106354B (zh) * 2021-12-20 2023-04-11 暨南大学 可原位自催化产生过氧化氢并持续释放no和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用
CN114652819A (zh) * 2022-03-21 2022-06-24 滨州医学院 一种靶向肿瘤微环境可降解的多功能纳米材料及其制备方法
CN114908046B (zh) * 2022-06-16 2024-01-02 四川大学 一种线粒体膜囊泡的制备方法
CN116531493B (zh) * 2023-04-25 2024-04-26 国科温州研究院(温州生物材料与工程研究所) 一种脂质体/细胞膜杂化游动纳米机器人及其制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1411386A (en) * 1972-07-12 1975-10-22 Pfizer Immobilized enzyme composites
WO2003009702A1 (en) * 2001-07-20 2003-02-06 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed with antimicrobial reactive oxygen species
CN101387606A (zh) * 2008-08-01 2009-03-18 中国科学院长春应用化学研究所 基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶检测双氧水或葡萄糖的方法
CN103224925A (zh) * 2013-03-29 2013-07-31 中南大学 二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法
CN105178081A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 河北吉藁化纤有限责任公司 一种醋化级棉浆粕制备方法及其制备的浆粕
CN108273059A (zh) * 2018-02-27 2018-07-13 山东大学 一种光热与活性氧联合治疗肿瘤的复合纳米材料的制备方法及应用
CN108815520A (zh) * 2018-06-19 2018-11-16 暨南大学 一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用
CN108998014A (zh) * 2018-08-21 2018-12-14 温州医科大学 一种基于石墨烯量子点的肿瘤催化纳米反应器的制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1411386A (en) * 1972-07-12 1975-10-22 Pfizer Immobilized enzyme composites
WO2003009702A1 (en) * 2001-07-20 2003-02-06 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed with antimicrobial reactive oxygen species
CN101387606A (zh) * 2008-08-01 2009-03-18 中国科学院长春应用化学研究所 基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶检测双氧水或葡萄糖的方法
CN103224925A (zh) * 2013-03-29 2013-07-31 中南大学 二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法
CN105178081A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 河北吉藁化纤有限责任公司 一种醋化级棉浆粕制备方法及其制备的浆粕
CN108273059A (zh) * 2018-02-27 2018-07-13 山东大学 一种光热与活性氧联合治疗肿瘤的复合纳米材料的制备方法及应用
CN108815520A (zh) * 2018-06-19 2018-11-16 暨南大学 一种仿生二元协同纳米载体及其制备方法与应用
CN108998014A (zh) * 2018-08-21 2018-12-14 温州医科大学 一种基于石墨烯量子点的肿瘤催化纳米反应器的制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Formation of core–shell particles by interfacial radical polymerization initiated by a glucose oxidase-mediated redox system;Shenoy R, Tibbitt M W, Anseth K S, et al.;Chemistry of Materials;第25卷;全文 *

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