CN112206220B - 一种血小板膜衍生囊泡包被的aie纳米颗粒酶及其制备方法 - Google Patents

一种血小板膜衍生囊泡包被的aie纳米颗粒酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于光敏剂技术领域，提供了一种血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶及其制备方法。包括制备空心MnO2纳米粒子；制备负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶；制备血小板膜衍生囊泡；将血小板膜衍生囊泡包裹在MnO2纳米颗粒酶的表面，形成由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶。本发明制备的血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶，将AIE光敏剂集中递送到肿瘤部位，定点集体释放，同时对抗瘤内缺氧，解决了光动力疗法临床治疗癌症过程中的难题；并且本发明的由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶制备方法简单，可实现批量生产。

Description

一种血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种光敏剂，尤其是涉及一种血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶及其制备方法。
背景技术
光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是一种治疗肿瘤或其他疾病的新方法，通过在氧气(O2)存在条件下，利用特定波长光源照射肿瘤组织中的光敏剂(Photosensitizer,PS)产生具有生物毒性的自由基和活性氧(ROS)，如单线态氧等，进而氧化损伤肿瘤、病毒感染细胞及其他过度增殖细胞、激活抗肿瘤抗病毒免疫、损伤血管，杀伤细菌、真菌、病毒，消除炎症等。具有聚集诱导发射(AIE)靶向定位在肿瘤组织中，以聚集体的形式存在时，在特定波长光源照射下，则产生更强烈的发射，很容易地产生ROS，进而促进抗肿瘤反应，从而发挥治疗作用。
大多数具聚集诱导发射特性的光敏剂(AIE-PS化合物)非常疏水，不能很好的溶解于体内生物环境中。PDT治疗具有氧气依赖性，而大量研究表明肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)高度缺氧。此外，体内靶向肿瘤组织的能力,也是PS在PDT临床应用中的关键因素。因此，具备临床应用潜力的光敏剂必需具备以下条件：具有良好生物相容性、靶细胞/肿瘤组织穿透能力、以及在缺氧肿瘤微环境(TME)可发挥作用。
因此，如何提高光敏剂的性能已达到临床应用的要求，是国内外积极研究的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高PDT治疗效果的光敏剂及其制备方法，具体为一种血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备空心MnO2纳米粒子；
(2)制备负载AIE光敏剂(DCPy)的MnO2纳米颗粒酶(MD)；
(3)制备血小板膜衍生囊泡；
(4)将血小板膜衍生囊泡包裹在MnO2纳米颗粒酶的表面，形成由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶(PMD)。
所述步骤(1)中，具体包括以下步骤：
1-1.采用Stober法合成固体二氧化硅纳米颗粒sSiO2；
1-2.在超声处理下，将100-300mg/LKMnO4的水溶液滴加到30-50mg/L的sSiO2的悬浮液中；
1-3.静置超过4小时，获得沉淀物；
1-4.将上述沉淀物溶于1-3M/L Na2CO3水溶液中，离心并用去离子水洗涤数次，获得空心MnO2纳米颗粒。
所述步骤(2)中，制备负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶的具体步骤为：
2-1.将空心MnO2纳米颗粒溶解在DCPy-DMSO饱和溶液中；
2-2.避光搅拌20小时以上；
2-3.离心收集纳米颗粒，并溶解在超纯水中，得到负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶。
所述步骤(3)中，将血小板用PBS缓冲液洗涤后进行裂解，获得血小板膜衍生囊泡。
所述步骤(4)中，将1:1的0.5-2g/L的血小板膜衍生囊泡和负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶进行混合，并用聚碳酸酯多孔膜Avanti挤出机将混合物挤出5-20次，进行PV外膜修饰，获得由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶。
本发明还提供了一种由以上方法制备的血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶。
采用本发明的方法制备的由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶，至少具有以下有益效果：
(1)二氧化锰(MnO2)纳米酶可催化最丰富的内源性H2O2以产生氧气和水，从而减少局部组织的缺氧；空心二氧化锰(MnO2)纳米材料具有很好的生物相容性和包封率，负载AIEgen的MnO2纳米酶能够弥补光敏剂溶解性差的不足，同时对抗瘤内缺氧，从而协同提高了PDT的治疗效果；
(2)血小板覆盖在空心二氧化锰纳米粒子上，可以屏蔽免疫系统的响应，同时使纳米粒子具有血小板的特性，对特定组织和细胞靶向，因而更有效地靶向肿瘤组织；
(3)本发明制备的由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶，将AIE光敏剂集中递送到肿瘤部位，定点集体释放，同时对抗瘤内缺氧，解决了光动力疗法临床治疗癌症过程中的难题；
(4)本发明的由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶制备方法简单，可实现批量生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶的制备流程图；
图2是本发明中实施例1的样品的形貌表征图；
图3是本发明中的本发明实施例1制备的样品与MD、DCPy对比的发射光谱图；
图4是本发明实施例1制备的样品与MD、DCPy对比的产氧能力检测图(4A)；及其在酸性(4B)和中性(4C)条件下DCPy的析出量对比图；
图5是本发明实施例1制备样品与DCPy、PBS的荧光定量对比图；
图6是本发明实施例1制备样品与MD的靶向性对比图。
具体实施方式
以下的说明提供了许多不同的实施例、或是例子，用来实施本发明的不同特征。以下特定例子所描述的元件和排列方式，仅用来精简的表达本发明，其仅作为例子，而并非用以限制本发明。
实施例1
根据图1所示的流程图制备PMD，具体为：
采用Stober法以正硅酸乙酯，浓氨水和无水乙醇为原料合成固体二氧化硅纳米颗粒sSiO2。然后，在超声处理下，将300mgKMnO4的水溶液滴加到40mg的sSiO2悬浮液中。静置6小时后，以14800rpm离心获得沉淀物。再于60℃的2M/L Na2CO3水溶液中溶解12小时后，离心，用去离子水洗涤数次后干燥获得空心MnO2纳米颗粒。
用空心MnO2纳米颗粒酶包封AIE光敏剂DCPy，形成负载DCPy的纳米酶(MD)：将1mg空心MnO2纳米颗粒酶溶解在6mL的DCPy-DMSO饱和溶液中，避光搅拌24小时后，12000rmp离心25min收集纳米颗粒，并溶解在超纯水中。
将新鲜的小鼠血液按200g离心20分钟，吸取上层的富血小板血浆重悬在等体积的柠檬酸-葡萄糖酸溶液中，再800g离心20分钟获得血小板。血小板用PBS缓冲液洗涤三次后进行裂解，获得血小板膜衍生囊泡(PV)。分别取5mL 1mg/mL的PV和1mg/mL的MD进行混合，并用孔径为200nm的聚碳酸酯多孔膜Avanti小型挤出机将混合物挤出11次，进行PV外膜修饰，获得PMD。
实施例2
采用Stober法以正硅酸乙酯，浓氨水和无水乙醇为原料合成固体二氧化硅纳米颗粒sSiO2。然后，在超声处理下，将100mgKMnO4的水溶液滴加到50mg的sSiO2悬浮液中。静置6小时后，以14800rpm离心获得沉淀物。再于60℃的1M/L Na2CO3水溶液中溶解12小时后，离心并用去离子水洗涤数次后获得空心MnO2纳米颗粒。
用空心MnO2纳米颗粒酶包封AIE光敏剂DCPy，形成负载DCPy的纳米酶(MD)：将3mg空心MnO2纳米颗粒酶溶解在6mL的DCPy-DMSO饱和溶液中，避光搅拌24小时后，12000rmp离心25min收集纳米颗粒，并溶解在超纯水中。
将血小板用PBS缓冲液洗涤三次后进行裂解，获得血小板膜衍生囊泡(PV)。分别取5mL 0.5mg/mL的PV和0.5mg/mL的MD进行混合，并用孔径为200nm的聚碳酸酯多孔膜Avanti小型挤出机将混合物挤出5次，进行PV外膜修饰，获得PMD。
实施例3
采用Stober法以正硅酸乙酯，浓氨水和无水乙醇为原料合成固体二氧化硅纳米颗粒sSiO2。然后，在超声处理下，将200mgKMnO4的水溶液滴加到30mg的sSiO2悬浮液中。静置6小时后，以14800rpm离心获得沉淀物。再于60℃的3M/L Na2CO3水溶液中溶解12小时后，离心并用去离子水洗涤数次后获得空心MnO2纳米颗粒。
用空心MnO2纳米颗粒酶包封AIE光敏剂DCPy，形成负载DCPy的纳米酶(MD)：将2mg空心MnO2纳米颗粒酶溶解在6mL的DCPy-DMSO饱和溶液中，避光搅拌24小时后，12000rmp离心25min收集纳米颗粒，并溶解在超纯水中。
将血小板用PBS缓冲液洗涤三次后进行裂解，获得血小板膜衍生囊泡(PV)。分别取5mL 2mg/mL的PV和2mg/mL的MD进行混合，并用孔径为200nm的聚碳酸酯多孔膜Avanti小型挤出机将混合物挤出20次，进行PV外膜修饰，获得PMD。
以上三个实施例都能获得空心MnO2由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶，其形貌图如图2所示(由于三个样品的形貌区别不大，仅示出了实施例1的样品形貌图)。图2是实施例1样品的透射电子显微镜表征图，其结果显示，PMD的大小与MnO2纳米颗粒大小相似，平均直径约为100纳米左右，MnO2 NPs(96.0±11.5nm)和MDs(99.0±12.3nm)大小相当，PMDs稍微大一些(116.0±11.8nm)。同时生成的PMD外壳厚度为10nm。
以下对实施例1的所得的PMD样品进行性能表征。
图3是PMD(PBS)、MD和自由DCPy的发射光谱图，可以看到，PMD(PBS)和自由DCPy(99％的水溶液聚合中包含1％ DMSO)的发射波长，最大发射峰值分别为633nm和698nm，这表明PMD加载并没有显著改变DCPy的光谱属性。因此，使用空心MnO2纳米酶和PV对DCPy进行修饰，仍保留其AIE光敏剂性能。
进一步对PMD的功能进行验证。对MnO2纳米酶功能的进行验证，结果表明DCPy无法介导H2O2分解，而MD和PMD纳米颗粒均以时间依赖的方式促进了H2O2的生成和相关O2的生成(如图4A)，表明PV外膜不会对PMD产生不利影响。在酸性条件下，在H2O2和H+的存在下，DCPy很容易从PMDs中释放出来(如图4B所示)，而在中性的PBS溶液中释放的很少。Mn2+的释放也不受影响(图4C)。
使用DCFH-DA探针来检测肿瘤细胞4T1内的ROS水平，并用image J软件对相应荧光强度进行定量(图5)，结果表明，激光照射下DCPy处理的低氧细胞呈弱绿色荧光，而PMD NPs处理的细胞的荧光更强，即产生更多的ROS。
综上所述，PMD NPs在低氧条件下可产生氧气，在酸性条件下能充分释放出DCPy，也具备MnO2纳米酶功能，同时可以促进细胞在缺氧条件下产生强劲的ROS，能够显著增强PDT的功效。
图6是对试验小鼠注射了MD和PMD后检测肿瘤组织DCPy的含量结果图，试验的方法为：4T1细胞在BALB/c小鼠腹腔成瘤后，尾静脉注射的方式分别注射浓度为5mg/kg MD或PMD各100μl，注射后6小时后，剥离肿瘤组织测量其DCPy含量。其结果表明，相对于MD，PMD更有效地运输到肿瘤组织并保留在肿瘤组织中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备空心MnO2纳米粒子；
(2)制备负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶；
(3)制备血小板膜衍生囊泡：
将血小板用PBS缓冲液洗涤后进行裂解，获得血小板膜衍生囊泡；
(4)将血小板膜衍生囊泡包裹在MnO2纳米颗粒酶的表面，形成由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶；
步骤(2)中，具体包括以下步骤：
2-1.将空心MnO2纳米颗粒溶解在DCPy-DMSO饱和溶液中；
2-2.避光搅拌20小时以上；
2-3.离心收集纳米颗粒，并溶解在超纯水中，得到负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶；
步骤(4)中，具体包括以下步骤：
将1:1的0.5-2g/L的血小板膜衍生囊泡和负载AIE光敏剂的MnO2纳米颗粒酶进行混合，并用聚碳酸酯多孔膜Avanti挤出机将混合物挤出5-20次，进行血小板膜衍生囊泡修饰，获得由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，具体包括以下步骤：
1-1.采用Stober法合成固体二氧化硅纳米颗粒sSiO2；
1-2.在超声处理下，将100-300mg/LKMnO4的水溶液滴加到30-50mg/L的sSiO2的悬浮液中；
1-3.静置超过4小时，获得沉淀物；
1-4.将上述沉淀物溶于1-3M/L Na2CO3水溶液中，离心并用去离子水洗涤数次，获得空心MnO2纳米颗粒。
3.一种由血小板膜衍生囊泡包被的AIE纳米颗粒酶，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的方法制备。
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