CN107737336A - 一种制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,主要是利用种子生长法,先制备金种子,再在金种子的基础下形成金纳米星的形态,然后在外部链接上硫基化的聚乙二醇,再在金纳米星外部覆盖上致密的硅层,然后采用氢氧化钠对硅层进行刻蚀,最后在复合材料表面覆盖甲氧基硅烷化的聚乙二醇。本发明方法不需要CTAB作为模板,而是通过氢氧化钠蚀刻致密硅层实现,该纳米复合材料具有低细胞毒性和良好的生物相容性,并且具有良好的光热效果,GNS@mSiO2@PEG@DOX可以被肿瘤细胞内化,红外激光可以促进DOX药物的释放并且适度的加热可以增加细胞膜的渗透性,促进药物在细胞内的转移,是有潜力的抗癌药物剂型。
Description
技术领域
本发明涉及一种在金纳米星表面形成介孔硅的新技术,尤其是利用了金纳米材料的光热效应用来制备化学与光热协同治疗的抗癌新型药物剂型,属于医药技术领域。
背景技术
使用近红外光(NIR)来切除固体肿瘤的光照疗法在近年来引起了大量的注意。这项技术可以提供一种选择性微创治疗方法来治疗实体肿瘤或转移性癌症。与其他治疗方法相比,光照疗法使用相对简单并提供了许多优点,比如恢复时间短,减少并发症,住院时间缩短等。然而,这种方法具有非特异性组织加热和破坏正常细胞及肿瘤细胞的局限性。为了解决这个问题,各种新颖的纳米材料包括电浆纳米材料,碳纳米材料,半导体纳米材料和纳米材料聚合物相继开发,可用作靶向的光热治疗药物,在这些材料中,金纳米粒子的局部表面电浆共振(SPR)可以表现出高效率和将光转化为热量的优点。各种形态的金纳米粒子比如金纳米棒,金纳米星,金纳米笼,金纳米球等已经被合成出来并且可以利用光照治疗杀死癌细胞而不损害正常细胞,然而,目前让大家最感兴趣是概念模型可以提供近红外光谱吸收特性。GNS(金纳米星)有许多优点,其合成方法简单,可以用于大规模生产,容易进行针对性的功能化和在近红外光谱区有SPR高峰。多种多样的纳米载体可用作药物,干扰核糖核酸或基因的转运系统,从而用于癌症的光热协同治疗。
介孔二氧化硅由于其独特的性质可以用作常见的药物载体材料,它具有良好的生物相容性、药物装载能力高以及功能多样性。介孔二氧化硅组合光照治疗材料已成为目前流行的纳米复合材料,可以实现化学和光热的协同治疗。这种纳米复合材料的药物释放可以通过光线来控制,并且不具有侵害性。此外,证明化学与光热协同治疗相对单独化疗或光照疗法对于癌症的破坏效率更高。直到现在,纳米复合材料包括金纳米棒包裹介孔硅层,铜包裹介孔硅层和石墨烯包裹介孔硅层都已经研究出来并且用于化学与光热的协同治疗。但是,介孔结构的形成通常需要使用表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板,而CTAB具有较高的毒性,所以在体内使用之前需要从孔内完全清除,但不幸的是,这个目标是特别难以实现。目前,关于GNS包裹介孔二氧化硅的研究很少,有报道称:GNS@SiO2@mSiO2纳米复合材料合成了化学与光热的协同治疗,然而,这个合成过程被证明是很复杂的,它会涉及到两个关键步骤:在第一步中,GNS表面会包裹上致密的二氧硅层;第二步涉及到利用有毒的CTAB在GNS@SiO2上包裹介孔材料。因此,在金纳米星表面包裹上介孔材料仍然是一个技术难题,加强这方面的研究,对于纳米材料用于癌症的化学-光热协同治疗研究,具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,该方法不需要十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为模板来形成介孔纳米结构,而是通过氢氧化钠蚀刻致密硅层实现,该纳米复合材料具有低细胞毒性和良好的生物相容性,并且连接PEG后,纳米复合物的分散性得到改善,具有良好的光热效果,药物也具有良好pH敏感和光敏感的释放性能。
技术方案
本发明主要是利用种子生长法,先准备好5nm的金种子,再在金种子的基础下形成金纳米星的形态,外部金表面不稳定,所以在外部链接上硫基化的聚乙二醇,同时又可以作为媒介,在TEOS作硅源的情况下,在金纳米星外部覆盖上致密的硅层。氢氧化钠易破坏硅层,故用吡咯聚维酮对外部的硅层进行保护使其保持球状结构,同时又可以使致密硅层变成介孔硅层,最后在复合材料表面覆盖甲氧基硅烷化的聚乙二醇,从而提高其在体内的分散性。具体方案如下:
一种制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体(GNS@mSiO2@PEG)的方法,包括如下步骤:
(1)制备金种子溶液:室温下,在80-90mL水中加入0.025-0.027mmol氯金酸,剧烈搅拌后,加0.06-0.08mmol柠檬酸钠继续搅拌均匀,然后加入新配的硼氢化钠溶液后剧烈搅拌,直至溶液颜色明显变成紫红色,得到尺寸为5nm的金种子溶液;
(2)制备金纳米星:将0.002-0.003mmol氯金酸加入到9-11mL水中,再加入8-15μL浓度为1M的盐酸溶液和100μL步骤(1)制得的金种子溶液,室温下剧烈搅拌,同时快速加入0.0005-0.0007mmol硝酸银和0.005mmol抗坏血酸,持续搅拌直至溶液颜色转变为灰蓝色,即合成出了金纳米星(GNS);
(3)制备实心硅包覆的金纳米星:往步骤(2)制得的金纳米星中加入巯基化聚乙二醇溶液,水浴加热至50-70℃,维持此温度搅拌0.5-3h,反应液反复离心水洗2-5次,浓缩后分散到5mL乙醇中,然后加入2ml去离子水、5-10ml乙醇和0.1-0.25ml氨水,缓慢滴加30-40μL正硅酸四乙酯,然后缓慢搅拌3-10h,再将反应液反复离心水洗2-5次,得到实心硅包覆的金纳米星(GNS@dSiO2);
(4)制备GNS@mSiO2@PEG:取5mL步骤(3)制得的实心硅包覆的金纳米星和5mL说聚吡咯维酮溶液,混合后缓慢搅拌过夜,然后往混合液中加入NaOH水溶液,继续搅拌10-60分钟,再将反应液反复离心水洗2-5次,得到的产物用乙醇超声水洗后离心去上清液,如此反复3-8次,得到介孔硅包覆的金纳米星(GNS@mSiO2)溶液,取2-5mL介孔硅包覆的金纳米星溶液,加入10-50μL氨水和10mL的乙醇,搅拌均匀,在搅拌过程中缓慢滴加甲氧基聚乙二醇硅烷溶液,10-15小时后,将反应液反复离心水洗,得到产物GNS@mSiO2@PEG。
进一步,步骤(1)和(2)中,所述剧烈搅拌的转速为600-900rpm。
进一步,步骤(1)中,硼氢化钠溶液的浓度为0.075wt%,硼氢化钠溶液的加量为1mL。
进一步,步骤(3)中,巯基化聚乙二醇溶液浓度为1mg/mL,加量为1-5ml。
进一步,步骤(3)中,所述缓慢搅拌的转速为100-200rpm。
进一步,步骤(4)中,聚吡咯维酮溶液的浓度为80-200mg/mL。
进一步,步骤(4)中,NaOH水溶液浓度为5mg/mL,用量为0.5-2mL。
进一步,步骤(4)中,所述甲氧基聚乙二醇硅烷溶液浓度为1mg/mL,用量为1.5-5ml。
有益效果:本发明方法不需要十六烷基三甲基溴化铵作为模板来形成介孔纳米结构,而是通过氢氧化钠蚀刻致密硅层实现,该纳米复合材料(GNS@mSiO2@PEG)具有低细胞毒性和良好的生物相容性,并且具有良好的光热效果;GNS@mSiO2@PEG@DOX可以被肿瘤细胞内化,GNS@mSiO2@PEG进入到胞质、溶酶体,并且释放DOX进入细胞核,GNS@mSiO2@PEG@DOX具有化学与光热的协同治疗作用,红外激光可以促进DOX药物的释放并且适度的加热可以增加细胞膜的渗透性,促进药物在细胞内的转移。GNS@mSiO2@PEG@DOX对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用,是有潜力的抗癌药物剂型,具有很大的开发应用前景。
附图说明
图1为实施例1制得的GNS@mSiO2@PEG的电镜图;
图2为实施例1制得的GNS@mSiO2@PEG的红外光谱图;
图3为不同浓度GNS@mSiO2@PEG在同一激光照射强度下的升温曲线;
图4为GNS@mSiO2@PEG载入抗癌药DOX后的紫外图谱;
图5为GNS@mSiO2@PEG载入抗癌药DOX后药物的释放曲线;
图6为采用不同浓度的GNS@mSiO2@PEG孵育细胞24h后细胞的存活率图;
图7为用GNS@mSiO2@PEG@DOX处理的Hela细胞在光照前后的细胞存活率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,对本发明作进一步说明。
实施例1
GNS@mSiO2@PEG的制备
室温下,在88mL水中加入2.54mL的10mM氯金酸,剧烈搅拌(转速为700rpm)1分钟后,加2mL的38.8mM柠檬酸钠继续搅拌1分钟,加入新配0.075%硼氢化钠溶液1ml后剧烈搅拌(转速为700rpm)5分钟,颜色明显变成紫红色可得5nm的金种子溶液。103μL(1%)四氯金酸加入到9.75mL水中,再加入10μL(1M)盐酸和100μL的金种子在室温的条件下剧烈搅拌(转速为700rpm),同时快速加入200μL硝酸银(3mM)和50μL抗坏血酸(0.1M),搅拌30s后溶液颜色转变为灰蓝色,合成出了金纳米星。加入1mL硫基化聚乙二醇溶液(1mg/mL),水浴加热至50℃,并维持此温度正常搅拌1h,反应液反复离心水洗2次,浓缩后分散到到5mL乙醇中;加入2mL去离子水,6.8mL乙醇和160μL氨水,缓慢滴加30μL的正硅酸四乙酯,在室温下(28℃)缓慢搅拌(转速为150rpm)3h后,反应液反复离心水洗2次。5mL包硅后的金纳米星和5mL吡咯聚维酮(80mg/mL)混合后室温下缓慢搅拌(转速为150rpm)过夜,利用吡咯聚维酮对硅壳表面进行保护。在混合液中直接加入1mLNaOH水溶液(5mg/mL)对硅壳进行刻蚀25分钟,反应液反复离心水洗2次后,产物用乙醇超声水洗后离心去上清液,如此反复6次,从而保证去除PVP对接下来实验的干扰。接下来,将25μL氨水、10mL的乙醇加入到2mL的GNS@mSiO2混合液中温和搅拌,在搅拌过程中2mL甲氧基硅烷化聚乙二醇(1mg/mL)在室温下缓慢滴加,12小时后,反应液反复离心水洗2次,从而获得产物GNS@mSiO2@PEG。
实施例1制得的产物GNS@mSiO2@PEG的电镜图见图1,红外光谱图见图2,BET法测得GNS@mSiO2@PEG表面积为126m2/g,孔平均尺寸为4.5nm,证明所覆盖的硅层为介孔结构。
性能测试:
1、GNS@mSiO2@PEG的光热效应测试
观察不同浓度下的光热效应:取GNS@mSiO2@PEG溶液稀释成不同的浓度,分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL,另取0.6mL的PBS备用记为0μg/mL的GNS@mSiO2@PEG溶液,808光纤耦合激光器的输出功率设置为1W cm-2,取200μL的溶液加入到96孔板,用数字温度计测量照射前溶液的温度,将溶液放置在光圈的正下方30s,测得溶液的温度,如此反复持续10min,每个浓度测3组数据,取较好的两组进行分析,计算两组数据的平均值和偏差。结果见图3,图3为不同浓度GNS@mSiO2@PEG在同一激光照射强度下的升温曲线。
2、药物的载入及释放测试
取1mL浓度为1mg/mL的GNS@mSiO2@PEG溶液,加入1mL的DOX水溶液(1mg/mL)离心管混合并用锡箔纸包裹避光,将离心管放置摇床2天后,将混合液离心去上清液,将底部浓缩液用PBS稀释,稀释液、DOX溶液及GNS@mSiO2@PEG溶液利用紫外图谱扫描后合并,结果见图4,图4为GNS@mSiO2@PEG载入抗癌药DOX后的紫外图谱,由图5可以看出并证明药物的载入;由标准曲线和材料上清液测得的吸光度可推算出材料中游离的阿霉素,用阿霉素的总重量减去游离的重量可知进入硅孔的阿霉素重量,载药率的计算如下方公式所示:
将0.2mL金纳米星载完药后的壳核结构材料加入约3mL左右的PBS(pH=7.4)进行稀释,材料重0.95mg,取17个2mL的离心管每个加入150μL的材料离心去上清液并加入pH=7.4的PBS缓冲液,有8个管在时间为0、1、2、3、4、6、12、24h时间段直接加入到37℃的水浴锅中。另外取8个也在相同时间段加入,但取出时要进行红外激光照射(5分钟,1.5W cm-2),还有一个管子先超声再80℃加热使药物完全释放,所有离心管离心取上清液100μL测荧光。再取17个2mL的离心管每个加入150μL的材料离心去上清液并加入pH=5.0的PBS缓冲液,有8个管在时间为0、1、2、3、4、6、12、24h时间段直接加入到37℃的水浴锅中。另外取8个也在相同时间段加入,但取出时要进行5分钟的红外激光照射(1.5W cm-2),还有一个管子先超声再80℃加热使药物完全释放,随后,离心并收集上清液,利用荧光分光光度计对上清液中药物释放进行测定,结果见图5,图5为GNS@mSiO2@PEG载入抗癌药DOX后药物的释放曲线,其中:横坐标表示释放时间,纵坐标表示不同条件下的药物释放率。
3、GNS@mSiO2@PEG的细胞毒性测试
将Hela细胞接种于96孔板中(大约5000个/每孔),在具有5%二氧化碳温度为37℃的环境中孵化24h,再加入100μL不同浓度(400、200、100、50、20、10、5、0μg/ml)的金纳米星壳核结构37℃孵化24小时,细胞培养基被移除,每孔PBS溶液冲洗两次,之后,每个板加入包含10μL CKK-8溶液100μL混合液孵化4h。离心后,80μL混合液转移到一个新的96孔板,用酶标仪在480nm测试吸光度,每个浓度都是准备3个孔进行测试,结果见图6,图6为采用不同浓度的GNS@mSiO2@PEG孵育细胞24h后细胞的存活率图,其中:接种的细胞为Hela细胞,横坐标表示GNS@mSiO2@PEG的浓度,纵坐标表示细胞存活率。由图6可以看出,存活率高,说明材料的毒性小,甚至无毒性。
4、GNS@mSiO2@PEG@DOX对肿瘤细胞的化学及光热的协同治疗
抗癌药通常通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其作用。为了初步评价GNS@mSiO2@PEG@DOX对肿瘤细胞凋亡的诱导能力,用MTT来分析复合物作用于细胞及发挥光热效应引起肿瘤细胞凋亡的情况。
将人宫颈癌细胞(Hela细胞)接种于96孔板中(大约5000个/每孔)。孵化24h后,移除培养基并用PBS冲洗两次。然后,将含有不同DOX浓度(0.01、0.1、1、5、10、25μM)的DOX溶液及GNS@mSiO2@PEG@DOX(100μL)加入到孔内,不同浓度的GNS@mSiO2@PEG@DOX需要加入两次,其中一组需要在孵化4h后,用波长808nm的红外激光(1.5W cm-2)照射5分钟后孵化20h。作为对比,同时增加一组没有载入药物的空白材料组(GNS@mSiO2@PEG),每组复合材料的浓度与GNS@mSiO2@PEG@DOX的实验组一一对应,孵化4h后,用波长808nm的红外激光(1.5W cm-2)照射5分钟后孵化20h,加入CCK-8孵化4h。离心后,80μL混合液转移到一个新的96孔板,用酶标仪在480nm测试吸光度,每个浓度都是准备3个孔进行测试,对细胞的存活率进行评估,结果见图7,图7为用GNS@mSiO2@PEG@DOX处理的Hela细胞在光照前后的细胞存活率图。由图7可以看出,在化学-光热联合治疗下,癌细胞的存活率最低,这说明化学-光热联合治疗抑癌效果要好于单独的化学药物治疗或单独的光热治疗。
Claims (8)
1.一种制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备金种子溶液:室温下,在80-90mL水中加入0.025-0.027mmol氯金酸,剧烈搅拌后,加0.06-0.08mmol柠檬酸钠继续搅拌均匀,然后加入新配的硼氢化钠溶液后剧烈搅拌,直至溶液颜色明显变成紫红色,得到尺寸为5nm的金种子溶液;
(2)制备金纳米星:将0.002-0.003mmol氯金酸加入到9-11mL水中,再加入8-15μL浓度为1M的盐酸溶液和100μL步骤(1)制得的金种子溶液,室温下剧烈搅拌,同时快速加入0.0005-0.0007mmol硝酸银和0.005mmol抗坏血酸,持续搅拌直至溶液颜色转变为灰蓝色,即合成出了金纳米星;
(3)制备实心硅包覆的金纳米星:往步骤(2)制得的金纳米星中加入巯基化聚乙二醇溶液,水浴加热至50-70℃,维持此温度搅拌0.5-3h,反应液反复离心水洗2-5次,浓缩后分散到5ml乙醇中,然后加入2ml去离子水、5-10ml乙醇和100-250μL氨水,缓慢滴加30-40μL正硅酸四乙酯,再缓慢搅拌3-10h,然后将反应液反复离心水洗2-5次,得到实心硅包覆的金纳米星;
(4)制备GNS@mSiO2@PEG:取5mL步骤(3)制得的实心硅包覆的金纳米星和5mL聚吡咯维酮溶液,混合后缓慢搅拌过夜,然后往混合液中加入NaOH水溶液,继续搅拌10-60分钟,再将反应液反复离心水洗2-5次,得到的产物用乙醇超声水洗后离心去上清液,如此反复3-8次,得到介孔硅包覆的金纳米星溶液,取2-5mL介孔硅包覆的金纳米星溶液,加入10-50μL氨水和10mL的乙醇,搅拌均匀,在搅拌过程中缓慢滴加甲氧基聚乙二醇硅烷溶液,10-15小时后,将反应液反复离心水洗,得到产物GNS@mSiO2@PEG。
2.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(1)和(2)中,所述剧烈搅拌的转速为600-900rpm。
3.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(1)中,硼氢化钠溶液的浓度为0.075wt%,硼氢化钠溶液的加量为1mL。
4.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(3)中,巯基化聚乙二醇溶液浓度为1mg/mL,加量为1-5ml。
5.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述缓慢搅拌的转速为100-200rpm。
6.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(4)中,聚吡咯维酮溶液的浓度为80-200mg/mL。
7.如权利要求1所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(4)中,NaOH水溶液浓度为5mg/mL,用量为0.5-2mL。
8.如权利要求1至7任一项所述的制备介孔硅包覆的金纳米星药物载体的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述甲氧基聚乙二醇硅烷溶液浓度为1mg/mL,用量为1.5-5ml。
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