CN108324955A - 一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法 - Google Patents

一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，包括：以实心SiO2为硬模板，TEOS和C18TMS混合溶液为硅源，包覆一层介孔SiO2层得到sSiO2@mSiO2；通过碳酸钠刻蚀，得到HMSs；进行巯基化修饰，进一步原位生长CuS，然后修饰靶向多肽cRGD，得到CuS@HMSs‑cRGD；与DOX混合即得CuS@HMSs(DOX)‑cRGD。本发明方法简单，易于操作，反应条件温和，具有产业化实施的前景；终产物具有较好的稳定性和生物相容性，载药量较高，可实现长效缓释；具有三重刺激响应药物释放性能，适合肿瘤组织的微环境；且在较低功率的激光照射下产生过高热，可进行光热治疗。

Description

一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制 备方法
技术领域
本发明属于纳米载体技术领域，特别涉及一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法。
背景技术
目前，在临床上普遍采用的治疗肿瘤的方法主要包括手术治疗、放射治疗、光热治疗、光动力学治疗、免疫治疗、中医治疗和化学治疗等。其中，化疗在肿瘤的综合治疗中占主导地位，有效地抑制了多种癌症对生命的侵袭。然而，化疗药物缺乏特异形，在杀伤癌细胞的同时，对正常细胞的损伤也不可忽视，因而会在治疗过程中对患者造成严重的毒副作用，严重影响了患者的生存质量；此外，长期使用化疗药物往往会对化疗药物产生严重的多耐药性，最终导致治疗的失败。近几十年来，随着纳米技术的发展，将纳米技术与化疗药物相结合成为了当今研究的热点，Doxorubicin、Mitomycin-C、Paclitaxel等纳米药物不断地被开发并应用于临床，有效地降低了其相应小分子药物的毒副作用，提高了治疗效果和患者的生存质量。
光热治疗技术(Photothermal therapy，PTT)是目前一种新型的热疗技术，光热疗法是指利用富集在肿瘤部位的光热转化材料，在一定波长的光照射下诱导产生热量，进而杀死癌细胞治疗癌症的一种方法。因为它可以在时空上可有效控制光热材料靶向地富集在肿瘤部位，从而避免对正常组织造成损伤。这种治疗方法被认为是一种很有前途的抗癌治疗方法，被国际专家学者称之为“绿色疗法”，近年来得到了极大的发展。随着纳米技术的出现，很多种具有强近红外吸收的纳米材料包括有机染料、金纳米颗粒、碳纳米材料、过渡金属硫化物、硫化铜纳米颗粒等可以作为光热试剂用于肿瘤光热治疗，与此同时，将光热治疗与化疗结合对肿瘤进行协同治疗的研究也引起了广大科研工作者的关注。
中空介孔硅是具有巨大空腔结构的介孔二氧化硅纳米粒子(Hollow MesoporousSilica Nanoparticles，HMSs)，近年来在纳米医学上得到了广泛的关注和研究。HMSs中巨大的空腔结构能包裹各类成像材料和药物分子，具有高的药物负载能力；良好的孔道结构可以让药物分子达到缓、控释释放；高的载药量也决定了少量的载体使用量，减少了异物在体内的沉积，因此具有更好的生物相容性，将其作为一个良好的药物载体，更有效地将药物递送至治疗部位，实现刺激响应控释，提高治疗效果、与其他纳米材料结合进行协同治疗、减小耐药性的相关研究逐步引起学者们的浓厚兴趣。
硫化铜等硫属铜基纳米光热治疗材料因其良好的光稳定性和生物相容性，在肿瘤的光热治疗以及多模态成像方面有着巨大的应用潜力。因此，将二硫化钼量子点和中空介孔二氧化硅相结合，有望设计出一个载药量高且多重刺激响应药物释放，同时进行光热治疗结合化疗协同治疗的纳米载药复合物用于肿瘤的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，该方法合成简单、可控，反应条件温和，具有产业化实施的前景，该方法制备得到的纳米材料具备优异的生物相容性和特异性靶向功能，具有应用于肿瘤化-光热协同治疗的前景。
本发明的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，包括：
(1)将实心二氧化硅微球sSiO2加入硅源正硅酸乙酯TEOS和十八烷基三甲基硅烷C18TMS的混合液中，搅拌，水洗，离心，得到介孔硅包裹的实心硅颗粒sSiO2@mSiO2；分散在碳酸钠溶液中，再次搅拌，离心，洗涤，真空干燥，煅烧，得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSs；分散在无水甲苯中，加入(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷MPTMS，回流反应，离心收集，洗涤，真空干燥，得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSs-SH；其中sSiO2、混合液的用量比为0.1～0.8g:5～10ml；sSiO2@mSiO2、碳酸钠溶液的用量比为0.2～0.5g:30～50ml；HMSs、无水甲苯、MPTMS的用量比为0.3g:60～300ml:0.15-0.45ml；
(2)将步骤(1)得到的HMSs-SH超声分散在乙醇中，加入2,2'-二硫二吡啶Py-ss-Py，N2保护下室温搅拌，然后加入醋酸继续反应，水洗，离心，真空干燥，得到HMSs-S-S-Py；分散在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入醋酸搅拌，然后滴加巯基乙酸，室温下反应，经透析，冷冻干燥，得到HMSs-SS-COOH；其中HMSs-SH、乙醇、Py-ss-Py和醋酸的用量比为0.5g:50～100ml:1～2.5g:1.2～3.3ml；HMSs-S-S-Py、DMF、醋酸和巯基乙酸的用量比为0.15～0.42g:75～82.5ml:3～3.5ml:1.5ml；
(3)将步骤(2)得到的HMSs-SS-COOH分散在CuCl2溶液中，室温搅拌，加入Na2S分散液继续搅拌，然后反应，经离心，水洗，得到CuS@HMSs-COOH；分散在DMF中，加入到活化的cRGD中，室温下搅拌过夜，经透析，冷冻干燥，得到CuS@HMSs-cRGD；其中HMSs-SS-COOH、CuCl2溶液、Na2S分散液的用量比为12.5～75mg:25～50ml:5ml；CuS@HMSs-COOH与cRGD的质量比为2～5:1；
(4)将步骤(3)得到的CuS@HMSs-cRGD分散在缓冲溶液中，加入盐酸阿霉素DOX.HCl水溶液，室温下避光搅拌，经透析，冷冻干燥，得到超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物CuS@HMSs(DOX)-cRGD；其中CuS@HMSs-cRGD、DOX的质量比为1～3:1。
所述步骤(1)中的sSiO2是通过将无水乙醇、超纯水和氨水混合，在30～40℃水浴中搅拌30～60min，加入TEOS，继续搅拌1～2h制得。
所述无水乙醇、超纯水、氨水、TEOS的体积比为70～75:10:1.5～2:5～7。
所述步骤(1)中TEOS和C18TMS的体积比为2～4:1。
所述步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度为0.5～0.8mol/L；HMSs的无水甲苯分散液的浓度为1～5mg/ml。
所述步骤(1)中的搅拌的时间为1～2h。
所述步骤(1)中再次搅拌的工艺参数为：再次搅拌温度为70～90℃，再次搅拌时间为30～60min。
所述步骤(1)中煅烧的工艺参数为：煅烧温度为500～600℃，煅烧时间为5～9h。
所述步骤(1)中回流反应的工艺参数为：反应温度为50～80℃，反应时间为12～24h。
所述步骤(2)中HMSs-SH的乙醇分散液的浓度为5～10mg/ml；HMSs-S-S-Py的DMF分散液的浓度为2～5mg/ml。
所述步骤(2)中室温搅拌的时间为4～8h；加入醋酸继续反应的时间为2～4h。
所述步骤(2)中加入醋酸搅拌的时间为0.5～1.5h；室温下反应的时间为24h。
所述步骤(2)中滴加巯基乙酸的速度为1～1.5ml/min。
所述步骤(2)中透析的工艺条件为：将反应液用PBS缓冲溶液透析3天。
所述步骤(3)中活化的cRGD是通过将cRGD溶解在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入EDC和NHS后搅拌1～2.5h制得。
所述cRGD为cRGDfK，序列为Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)，cRGD、EDC和NHS的质量比为6:1～4:1。
所述步骤(3)中CuCl2溶液与Na2S分散液的摩尔浓度比为1:1，摩尔浓度均为20～30mM。
所述步骤(3)中HMSs-SS-COOH的CuCl2分散液的浓度为0.5～1.5mg/ml；CuS@HMSs-COOH的DMF分散液的浓度为0.5～2mg/ml。
所述步骤(3)中室温搅拌的时间为0.5～2h；继续搅拌的时间为5min。
所述步骤(3)中反应的工艺参数为：反应温度为85～90℃，反应时间为10～30min。
所述步骤(4)中CuS@HMSs-cRGD分散液的浓度为0.5～1mg/ml；DOX.HCl水溶液的浓度为0.5～2mg/ml。
所述步骤(4)中CuS@HMSs(DOX)-cRGD的粒径为100～300nm；硫化铜纳米粒子的粒径为1.6～4.0nm；避光搅拌的时间为24～48h。
本发明以实心SiO2纳米粒子为硬模板，TEOS和C18TMS混合溶液为硅源，在乙醇、超纯水和氨水混合液中，通过包覆一层介孔SiO2层形成实心SiO2为核、介孔SiO2为壳的sSiO2@mSiO2纳米粒子，随后通过碳酸钠刻蚀的过程去除模板得到中空介孔二氧化硅；将得到的HMSs巯基化修饰后，进一步通过原位生长的方法将CuS纳米粒子引入载体上；利用巯基乙酸将靶向多肽cRGD修饰到载体上得到CuS@HMSs-cRGD；将所得的CuS@HMSs-cRGD与阿霉素DOX混合在避光的条件下反应过夜，将反应后的溶液离心，冷冻干燥处理得到终产品CuS@HMSs(DOX)-cRGD。
有益效果
(1)本发明的方法简单，易于操作，反应条件温和，具有产业化实施的前景。
(2)本发明制备得到的超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米药物载体(CuS@HMSs-cRGD)具备载药量高、优异的生物相容性和特异性靶向功能，具有应用于肿瘤化-光热协同治疗的前景。
(3)本发明制备得到的超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物CuS@HMSs(DOX)-cRGD具有三重刺激响应(pH、GSH及光照)药物释放的性能，可用于药物的缓、控释研究。
(4)本发明所采用的制备方法可用于制备实现体内化疗和光热治疗为一体的多功能介孔硅基纳米材料，具有很好的潜在实用价值。
附图说明
图1为本发明制备CuS@HMSs(DOX)-cRGD纳米材料的反应示意图。
图2为实施例1中sSiO2@mSiO2(a,b)；HMSs(c,d)和CuS@HMSs-cRGD(e,f)的TEM图以及CuS@HMSs-cRGD的EDX图谱(g)。
图3为实施例1中HMSs-SH、HMSs-SS-COOH及CuS@HMSs的吸附等温线(A)及孔径分布(B)和制备CuS@HMSs(DOX)-cRGD各步骤的紫外吸收图谱(C)。
图4为实施例1中HMSs和CuS@HMSs的X射线粉末衍射结果(A)及HMSs-SH，CuS@HMSs-cRGD及CuS@HMSs(DOX)-cRGD的水动力学粒径变化(B)。
图5为实施例2中CuS@HMSs(DOX)-cRGD纳米材料在不同的浓度(A)以及不同功率(B)的激光照射下的升温曲线。
图6为实施例3中CuS@HMSs(DOX)-cRGD在不同条件及无激光照射(A)和激光照射(B)下的药物释放行为。
图7为实施例4中CuS@HMSs、CuS@HMSs-cRGD在不同浓度下的细胞毒性试验结果。
图8为实施例5中不同DOX浓度的CuS@HMSs(DOX)-cRGD对MDA-MB-231细胞的MTT结果。
图9为实施例6中CuS@HMSs(DOX)-cRGD和单纯DOX化疗的血药浓度曲线。
图10为实施例7中不同治疗组通过尾静脉注射入小鼠体内，记录三周内小鼠肿瘤体积(A)、小鼠体重(B)、第21天的肿瘤照片(C)和瘤体的质量(D)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将71.4ml无水乙醇、10ml超纯水和1.9ml氨水混合并调节pH到9.0，将混合溶剂在30℃水浴中搅拌40min，随后加入6ml TEOS，继续搅拌1h，得到实心二氧化硅微球sSiO2；接着加入预先混合的包含5ml TEOS和2ml十八烷基三甲基硅烷C18TMS的混合液，继续搅拌2h，水洗，离心，得到介孔硅包裹的实心硅颗粒sSiO2@mSiO2。
(2)将上述得到的sSiO2@mSiO2均分8份后分散在0.6M的碳酸钠溶液中，在80℃下搅拌刻蚀30min，冷却后离心，水洗1次，乙醇洗2次，然后真空干燥，随后在550℃下煅烧6h，得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSs。
(3)取0.3g上述得到的HMSs分散在60ml无水甲苯中，加入0.4ml MPTMS，在80℃下回流反应12h，离心收集，洗涤，真空干燥，得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSs-SH。
(4)将0.5g上述得到的HMSs-SH超声分散在100ml乙醇中，加入1g Py-ss-Py，N2保护下室温搅拌4h，随后用注射器加入3.2ml的醋酸，继续反应24h后，水洗，用11000rpm离心，真空干燥，得到HMSs-S-S-Py。
(5)将0.3gHMSs-S-S-Py分散在80ml DMF中，加入3.2ml醋酸搅拌1h，随后以1ml/min的滴速缓缓加入1.5ml巯基乙酸，在室温下反应24h，反应溶液用PBS缓冲溶液透析三天，冷冻干燥，得到HMSs-SS-COOH。
(6)将25mg上述得到的HMSs-SS-COOH分散在50ml 25mM的CuCl2溶液中，室温搅拌0.5h，随后加入5ml 25mM的Na2S分散液搅拌5min，在90℃下反应15min，离心，水洗数次，得到CuS@HMSs-COOH。
(7)将18mg cRGDfK，序列为Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)，溶解在10ml pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入10mg EDC和3.2mg NHS后搅拌2h活化；同时取25mgCuS@HMSs-COOH分散在30ml DMF中，随后加入到活化的cRGD中，室温下搅拌过夜，将产物透析后冷冻干燥，得到CuS@HMSs-cRGD。
(8)取10mg CuS@HMSs-cRGD分散在pH 7.4的PBS缓冲溶液中，加入5ml浓度为1mg/ml的DOX.HCl水溶液中，室温下避光搅拌24h，透析，冷冻干燥，得到载药负载硫化铜的中空介孔二氧化硅纳米载药体系CuS@HMSs(DOX)-cRGD。
本实施例制得的sSiO2@mSiO2的TEM结果如图2a,b所示，表明sSiO2@mSiO2的核心为实心硅，其直径约为185nm，外围包裹的壳为介孔硅，其壳厚约为45nm。HMSs的TEM结果如图2c,d所示，表明中空结构成功合成。CuS@HMSs-cRGD的TEM结果如图2e,f所示，CuS@HMSs-cRGD的EDX图谱如图2g所示，可以看出复合物出现Si、O、Cu、S等元素，表明CuS纳米粒子成功长在中空介孔硅上。
本实施例制得的HMSs-SH、HMSs-SS-COOH、CuS@HMSs的吸附等温线及孔径分布如图3A、B所示，可知合成的HMSs具有高比表面积1141.33m2/g，孔径达到4.5nm。
本实施例制备CuS@HMSs(DOX)-cRGD各步骤的紫外图谱结果如图3C所示，可以看出药物DOX的成功负载。
本实施例制得的HMSs和CuS@HMSs的X射线粉末衍射结果如图4A所示，可知CuS晶体特征结构，有(006),(102),(103),(108),(110)和(116)的衍射峰出现，而HMSs的特征吸收消失，表明材料成功合成。
本实施例制得的HMSs-SH，CuS@HMSs-cRGD及CuS@HMSs(DOX)-cRGD的水动力学粒径变化如图4B所示，可知HMSs-SH具有很强的衍射峰，水动力学粒径为261nm。
实施例2
对实施例1中的CuS@HMSs-cRGD载药体系进行光热转换性能测定：
(1)配制不同浓度(0.02-0.2mg/ml)的CuS@HMSs-cRGD溶液置于离心管中，将纯水置于离心管中做空白对照，组装好激光器及测温装置，用功率为1.0W/cm2的808nm的近红外光照射5分钟，通过热电偶监控溶液的温度变化绘制不同浓度溶液的升温曲线，如图5A所示。
(2)配制一系列浓度为0.1mg/ml的CuS@HMSs-cRGD水溶液置于离心管中，组装好激光器及测温装置，分别用不同功率(0.25-1.5W/cm2)的808nm的近红外光照射5分钟，通过热电偶监控溶液的温度变化绘制不同功率激光照射下溶液的升温曲线，如图5B所示。
图5表明：CuS@HMSs-cRGD表现出优异的光热转化效果，且随着CuS@HMSs-cRGD颗粒浓度的增加，温度升高的越高；同时，当固定浓度不变时，随着照射功率的加大，CuS@HMSs-cRGD的升温幅度亦加大，证明合成的CuS@HMSs-cRGD可以在一定的激光照射下产生过高热，可作为一个良好的光热剂用于光热治疗。
实施例3
对实施例1得到的CuS@HMSs(DOX)-cRGD载药体系进行三重刺激响应药物释放实验：
(1)配制pH值为7.4的含有DOX的PBS缓冲溶液(0.0025～0.08mg/ml)及pH值为5.0的含有DOX的醋酸盐缓冲溶液(0.0025～0.08mg/ml)，于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种pH环境下的DOX标准曲线。
(2)取四份5mg CuS@HMSs(DOX)-cRGD分别溶于10ml PBS缓冲溶液及10ml醋酸盐缓冲溶液中，置于四个透析袋中，其中两个透析袋中加入10mM GSH，然后分别将透析袋置于30ml pH值为7.4的PBS缓冲溶液和pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中振荡，于不同时间点取样，补充新鲜缓冲液，得到pH响应及GSH响应药物释放曲线，如图6A所示。
(3)取四份5mg CuS@HMSs(DOX)-cRGD分别溶于10ml PBS缓冲溶液及10ml醋酸盐缓冲溶液中，置于四个透析袋中，其中两个透析袋中加入10mM GSH，然后分别将透析袋置于30ml pH值为7.4的PBS缓冲溶液和pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中振荡，然后分别用808nm、1.5W/cm2的NIR激光照射5min，随后置于摇床中振荡，分别于不同的时间点取样检测，并补充缓冲液，得到光热响应药物释放曲线，如图6B所示。
图6表明：在不同pH值条件下CuS@HMSs(DOX)-cRGD的药物释放存在显著差异，在较低pH值环境下释放率更高，且GSH和光热均可显著提高药物的释放，由于肿瘤组织与正常组织细胞相比其pH值较低，且肿瘤组织的GSH含量明显高于正常组织，该载药材料的释放正好符合这一特性。表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的pH/GSH/光多重刺激响应型药物载体。
实施例4
将MDA-MB-231细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板，培养24h。随后移除培养基，加入100μl含不同浓度梯度CuS@HMSs-cRGD的培养基，每个梯度做5个平行孔，培养2h。移除培养基，加入新鲜培养基继续在5％CO2 37℃恒温饱和湿度培养中培养。24h后，每孔加入10μl 5mg/ml MTT，继续孵育4h，移除培养基，每孔加入150ml DMSO，待孔内甲臜晶体完全溶解后，置于自动酶标平板阅读仪读取每孔在570nm波长的吸光度。
采用MTT法检测细胞活力结果如图7所示，表明CuS@HMSs-cRGD纳米颗粒无明显细胞毒性，表现出良好的细胞相容性。
实施例5
在96孔细胞培养板中种入MDA-MB-231细胞，每孔细胞密度大约为10000个，并补足每孔200μl的培养液，在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。培养24h后倒掉旧培养基，加入含有不同DOX浓度的实施例1中CuS@HMSs(DOX)-cRGD的20μl PBS溶液，以相同DOX浓度的纯DOX的PBS溶液做对照，并补足180μl新鲜培养基，孵育24h。随后，每孔加20μl的0.5％的MTT溶液，置37℃恒温箱中静置4h，吸去孔内培养液，并添加200μl DMSO，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪检测在570nm处各孔的紫外吸收值。
不同DOX浓度的CuS@HMSs(DOX)-cRGD对MDA-MB-231细胞的MTT结果如图8所示，表明：随着CuS@HMSs(DOX)-cRGD中DOX浓度的增加，可以产生明显的细胞毒性，同时，仅以化疗而言，CuS@HMSs(DOX)-cRGD的抗肿瘤效果强于单纯的药物治疗，也验证了CuS@HMSs(DOX)-cRGD能将抗肿瘤药物靶向地递送至肿瘤组织。
实施例6
采用实施例1制得的CuS@HMSs(DOX)-cRGD进行动物试验，所有动物实验操作均获得了复旦大学浦东医院医学中心及复旦大学动物保护和使用委员会批准。
血液循环是通过在不同时间点从注射有实施例1得到的CuS@HMSs(DOX)-cRGD和纯阿霉素三组小鼠的尾静脉取约10μl血液进行测定的。每一个血液样品都加入0.1ml裂解液(1％SDS，1％Triton X-100，40mM tris acetate)超声裂解，再加入0.5ml HCl-IPA于-20℃静置过夜，血样中DOX含量通过离心(14.8krpm，12min)的方式提取，随后通过荧光(激发波长为480nm)测定。每组血液循环实验平行进行三次，最终显示的是实验所得的平均值。血液循环遵循典型的两室模型，第一相是分布相，第二相是消除相。采用以下公式计算两相的半衰期(分布相为t1；消除相为t2)
y=A1×exp(X/t1)+A2×exp(-X/t2)+y0
t1/2α＝0·693×t1
CuS@HMSs(DOX)-cRGD和单纯DOX化疗的血药浓度曲线如图9所示，可知CuS@HMSs(DOX)-cRGD较自由DOX相比，能明显提高药物在血液中的循环时间，从而证明该制备工艺得到的纳米载药复合物在血液循环中有较好的稳定性。
实施例7
将4-6周龄雌性裸鼠右后肢皮下接种2×107MDA-MB-231细胞，待肿瘤体积长到100mm3左右时，进行治疗。荷瘤裸鼠随机分为6组，每组5-6只鼠：生理盐水组、DOX治疗组、CuS@HMSs-cRGD加激光治疗组、CuS@HMSs(DOX)-cRGD治疗组、CuS@HMSs(DOX)加激光治疗组及CuS@HMSs(DOX)-cRGD加激光治疗组。每只裸鼠肿瘤内注射100μl含不同纳米粒子的生理盐水溶液，DOX剂量为5mg/kg。激光治疗组裸鼠置于808nm激光下照射5min，治疗后第3天与第6天重复上述操作。治疗后每两天测量肿瘤大小与裸鼠体重。肿瘤体积根据如下公式计算：V＝(肿瘤宽)2×肿瘤长/2。
不同治疗组通过尾静脉注射入小鼠体内，结果如图10所示，记录三周内小鼠肿瘤体积(A)、小鼠体重(B)、第21天的肿瘤照片(C)和瘤体的质量(D)，可知注射组未见肿瘤发生明显变化；CuS@HMSs(DOX)治疗组中，肿瘤生长速度一定程度上被抑制，主要是由于肿瘤摄取纳米诊疗颗粒较少，并不能维持化疗疗效；而在CuS@HMSs(DOX)及CuS@HMSs(DOX)-cRGD加激光照射治疗组中，肿瘤生长速度、肿瘤大小较其他四组(生理盐水对照组、CuS@HMSs-cRGD加激光照射组、单独DOX组、CuS@HMSs(DOX)-cRGD治疗组)均有显著抑制，说明化疗协同光热治疗对肿瘤有显著的治疗效果，重要的是，CuS@HMSs(DOX)-cRGD加激光照射治疗组小鼠并无明显体重下降，说明CuS@HMSs(DOX)-cRGD具有很好的生物相容性。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Asp Pro His Glu Leu Tyr Ser
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，包括：
(1)将实心二氧化硅微球sSiO2加入硅源正硅酸乙酯TEOS和十八烷基三甲基硅烷C18TMS的混合液中，搅拌，水洗，离心，得到介孔硅包裹的实心硅颗粒sSiO2@mSiO2；分散在碳酸钠溶液中，再次搅拌，离心，洗涤，真空干燥，煅烧，得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSs；分散在无水甲苯中，加入(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷MPTMS，回流反应，离心收集，洗涤，真空干燥，得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSs-SH；其中sSiO2、混合液的用量比为0.1～0.8g:5～10ml；sSiO2@mSiO2、碳酸钠溶液的用量比为0.2～0.5g:30～50ml；HMSs、无水甲苯、MPTMS的用量比为0.3g:60～300ml:0.15-0.45ml；
(2)将步骤(1)得到的HMSs-SH超声分散在乙醇中，加入2,2'-二硫二吡啶Py-ss-Py，N2保护下室温搅拌，然后加入醋酸继续反应，水洗，离心，真空干燥，得到HMSs-S-S-Py；分散在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入醋酸搅拌，然后滴加巯基乙酸，室温下反应，经透析，冷冻干燥，得到HMSs-SS-COOH；其中HMSs-SH、乙醇、Py-ss-Py和醋酸的用量比为0.5g:50～100ml:1～2.5g:1.2～3.3ml；HMSs-S-S-Py、DMF、醋酸和巯基乙酸的用量比为0.15～0.42g:75～82.5ml:3～3.5ml:1.5ml；
(3)将步骤(2)得到的HMSs-SS-COOH分散在CuCl2溶液中，室温搅拌，加入Na2S分散液继续搅拌，然后反应，经离心，水洗，得到CuS@HMSs-COOH；分散在DMF中，加入到活化的cRGD中，室温下搅拌过夜，经透析，冷冻干燥，得到CuS@HMSs-cRGD；其中HMSs-SS-COOH、CuCl2溶液、Na2S分散液的用量比为12.5～75mg:25～50ml:5ml；CuS@HMSs-COOH与cRGD的质量比为2～5:1；
(4)将步骤(3)得到的CuS@HMSs-cRGD分散在缓冲溶液中，加入盐酸阿霉素DOX.HCl水溶液，室温下避光搅拌，经透析，冷冻干燥，得到超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物CuS@HMSs(DOX)-cRGD；其中CuS@HMSs-cRGD、DOX的质量比为1～3:1。
2.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的sSiO2是通过将无水乙醇、超纯水和氨水混合，在30～40℃水浴中搅拌30～60min，加入TEOS，继续搅拌1～2h制得；其中无水乙醇、超纯水、氨水、TEOS的体积比为70～75:10:1.5～2:5～7。
3.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中TEOS和C18TMS的体积比为2～4:1；碳酸钠溶液的浓度为0.5～0.8mol/L；HMSs的无水甲苯分散液的浓度为1～5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的搅拌的时间为1～2h；再次搅拌的工艺参数为：再次搅拌温度为70～90℃，再次搅拌时间为30～60min；煅烧的工艺参数为：煅烧温度为500～600℃，煅烧时间为5～9h；回流反应的工艺参数为：反应温度为50～80℃，反应时间为12～24h。
5.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中HMSs-SH的乙醇分散液的浓度为5～10mg/ml；HMSs-S-S-Py的DMF分散液的浓度为2～5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中室温搅拌的时间为4～8h；加入醋酸继续反应的时间为2～4h；加入醋酸搅拌的时间为0.5～1.5h；室温下反应的时间为24h；滴加巯基乙酸的速度为1～1.5ml/min；透析的工艺条件为：将反应液用PBS缓冲溶液透析3天。
7.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中活化的cRGD是通过将cRGD溶解在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入EDC和NHS后搅拌1～2.5h制得；其中cRGD为cRGDfK，序列为Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)，cRGD、EDC和NHS的质量比为6:1～4:1。
8.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中CuCl2溶液与Na2S分散液的摩尔浓度比为1:1，摩尔浓度均为20～30mM；HMSs-SS-COOH的CuCl2分散液的浓度为0.5～1.5mg/ml；CuS@HMSs-COOH的DMF分散液的浓度为0.5～2mg/ml。
9.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中室温搅拌的时间为0.5～2h；继续搅拌的时间为5min；反应的工艺参数为：反应温度为85～90℃，反应时间为10～30min。
10.根据权利要求1所述的一种超小硫化铜负载的中空介孔硅靶向纳米载药复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中CuS@HMSs-cRGD分散液的浓度为0.5～1mg/ml；DOX.HCl水溶液的浓度为0.5～2mg/ml；CuS@HMSs(DOX)-cRGD的粒径为100～300nm；硫化铜纳米粒子的粒径为1.6～4.0nm；避光搅拌的时间为24～48h。
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