CN109248316A - 一种a7r肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂及其制备和应用。该纳米诊疗剂包括Ag2S、A7R肽、DOX和中空介孔二氧化硅颗粒。制备方法包括:sSiO2@mSiO2纳米粒子的制备,中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs制备,巯基修饰的中空介孔二氧化硅制备,HMSNs@Ag2S制备,HMSNs@Ag2S‑A7R制备,HMSNs@Ag2S‑A7R(DOX)制备。该方法简单,易于操作,反应条件温和,具有产业化实施的前景。该纳米诊疗剂具备载药量高、优异的生物相容性和特异性靶向功能,具有应用于肿瘤化‑光热协同治疗的前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米诊疗剂及其制备和应用领域,特别涉及一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症严重危害着人类的健康,已经成为全球关注的热点问题之一。传统的治疗模式中,化疗依旧占主导地位,有效地抑制了多种癌症对生命的侵袭。然而,化疗药物缺乏特异性以及长期使用化疗药物往往会对化疗药物产生严重的多耐药性等种种原因限制了其广泛应用。近几十年来,随着纳米技术的发展,一些新兴的治疗手段蓬勃发展,如光热治疗、光动力治疗、磁热疗和免疫治疗等。然而,对癌症的预防、诊断仍然为全球生物医学领域研究者的重点关注点,尤其是提高癌症早期诊断的灵敏度,进行高效治疗以及实现诊疗一体化。
光热治疗技术(Photothermal therapy,PTT)是一种新兴的肿瘤治疗方法,主要是依靠光热转换试剂在激光照射的作用产生局部高温,从而杀死癌细胞,被国际专家学者称之为“绿色疗法”,近年来得到了极大的发展。在光热治疗中,能够有效地将NIR光能转换为局部热能的材料或者化合物统称为光热转换试剂。随着纳米技术的出现,很多种具有强近红外吸收的纳米材料包括有机化合物染料、贵金属基光热试剂、碳纳米材料、无机半导体光热转换试剂等可以作为光热试剂用于肿瘤光热治疗。其中,半导体化合物因其制备工艺较为简单、价格比较低廉、性能相对稳定以及易于功能化修饰等特点而备受关注。如铜基化合物,如硫化铜,由于铜缺陷而形成的空穴掺杂结构,使其具有表面等离子体共振效应,从而有较强的近红外光吸收的能力而产生光热转换性能。硫化银也是其中一种,近年来,许多不同纳米结构的硫化银纳米晶开发出来用于细胞成像,光热治疗等,但是由于其光热转换效率而限制了其进一步应用。因此开发出光热转换效率高的硫化银纳米颗粒用于肿瘤的诊疗一体化是很有意义的。与此同时,将光热治疗与化疗结合对肿瘤进行协同治疗也是提高其肿瘤治疗效率的手段之一。
中空介孔硅是具有巨大空腔结构的介孔二氧化硅纳米粒子(Hollow MesoporousSilica Nanoparticles,HMSNs),近年来在纳米医学上得到了广泛的关注和研究。具有巨大空腔结构的HMSNs纳米粒子具有低的密度、大的比表面积、高的孔容、以及高的客体分子的负载量,在催化、纳米反应器、吸附、分离、以及纳米生物技术领域具有广阔的应用前景。同时,在药物输送、细胞标记、基因转染、分子影像等医学领域都展现出优异的性能。因此具有更好的生物相容性,将其作为一个良好的药物载体,更有效地将药物递送至治疗部位,实现刺激响应控释,提高治疗效果、与其他纳米材料结合进行协同治疗、构建出诊疗一体化平台的相关研究逐步引起学者们的浓厚兴趣。
Lu等(Lu,N.et.al.Biomaterials.2017;126:39-48)利用原位生长的方法将中空周期性介孔有机硅与硫化铜纳米粒子结合构建出一种三重刺激响应的纳米载药体系用于肿瘤的化疗-光热治疗协同治疗,发现了半导体纳米粒子引发的光热效应可以促进纳米载体的摄取。Shi等(Shi,X.et.al.ACS Appl.Mater.Interfaces.2017;9:5817-5827)进一步将中空介孔硅负载纳米金星,空腔内包裹全氟化碳PFH,构建一种具有多模态成像性能与光热治疗一体的诊疗剂用于肿瘤的诊疗一体化研究。进一步地,Chen等(Chen,X.ACS Nano2018;12:1580-1591)利用在中空介孔硅表面原位生长硫化铜纳米颗粒,随后标记放射性同位素64Cu构建出一种纳米诊疗剂用于光声/超声/SPECT三模态成像及氧气辅助的放疗增敏。检索国内外有关中空介孔硅及其用于诊疗一体化研究的文献及专利,还未发现关于硫化银原位生长中空介孔硅纳米诊疗剂的制备及应用的相关报道。基于此,将硫化银纳米点和中空介孔二氧化硅相结合,有望设计出一个可以实现多模态成像介导下光热治疗结合化疗协同治疗的纳米诊疗剂用于肿瘤的诊疗一体化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂及其制备方法和应用,以克服现有技术中肿瘤治疗效率低的缺陷。
本发明的一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂,所述诊疗剂包括Ag2S、A7R肽、DOX和中空介孔二氧化硅颗粒,其中Ag2S和A7R肽均修饰在中空介孔二氧化硅颗粒的表面,中空介孔二氧化硅颗粒的空腔内部包覆DOX。
所述Ag2S原位生长在中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs上得到中空介孔二氧化硅-硫化银纳米颗粒HMSNs@Ag2S,A7R肽、DOX和HMSNs@Ag2S的质量比为5-20:4-10:12.5~60。
本发明的一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂的制备方法,包括:
(1)将实心二氧化硅纳米粒子sSiO2分散在溶剂中,搅拌下加入硅源溶液反应,得到实心SiO2为核、介孔SiO2为壳的sSiO2@mSiO2纳米粒子,其中sSiO2与溶剂的比例为0.1~0.8g:20~80mL,sSiO2与硅源的比例为0.1~0.8g:5~10mL;
(2)将步骤(1)中sSiO2@mSiO2纳米粒子洗涤,离心,分散在碳酸钠溶液中,搅拌,离心,洗涤,真空干燥,煅烧,得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs,分散在溶剂中,加入(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷MPTMS反应,离心,洗涤,真空干燥,得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSNs-SH;其中sSiO2@mSiO2与碳酸钠溶液的比例为0.2g:10~20mL;HMSNs、溶剂与MPTMS的比例为0.1~0.5g:30-150mL:0.15-0.45mL;
(3)将步骤(2)中HMSNs-SH超声分散在硝酸银溶液中,室温搅拌,加入硫化钠溶液继续反应,洗涤,离心,干燥,得到HMSNs@Ag2S;其中HMSNs-SH、硝酸银和硫化钠的质量比为0.02g:85~430mg:5~30mg;
(4)将步骤(3)中HMSNs@Ag2S分散于溶剂中,加入巯基封端的A7R肽,搅拌,经透析、冷冻干燥,得到HMSNs@Ag2S-A7R,其中HMSNs@Ag2S、溶剂、A7R肽的比例为12.5~60mg:30~120mL:5~20mg;
(5)将步骤(4)中HMSNs@Ag2S-A7R分散在溶剂中,得到HMSNs@Ag2S-A7R分散液,加入盐酸阿霉素DOX.HCl,避光搅拌,离心,透析,冷冻干燥,得到A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂HMSNs@Ag2S-A7R(DOX),其中HMSNs@Ag2S-A7R分散液的浓度为0.5~2mg/mL,HMSNs@Ag2S-A7R与DOX.HCl的质量比为1~5:1。
所述步骤(1)中溶剂为乙醇;硅源为体积比为2~5:1的正硅酸乙酯TEOS和十八烷基三甲基硅烷C18TMS。
所述步骤(1)中反应温度为30-60℃,反应时间为1-2h。
所述步骤(1)中sSiO2的制备方法为:在无水乙醇和超纯水混合液中加入氨水,40-50℃混合,搅拌中加入TEOS或C18TMS,继续搅拌1~2h即得;其中无水乙醇、超纯水、氨水与TEOS或C18TMS的体积比为60~75:10:1.5~2.5:3-8。
所述步骤(2)中碳酸钠溶液的浓度为0.5~0.8mol/L。
所述步骤(2)中搅拌温度为50~80℃,搅拌时间为40min~2.5h。
所述步骤(2)中煅烧温度为500~600℃,煅烧时间为5~10h。
所述步骤(2)中溶剂为无水甲苯;反应温度为50~80℃,反应时间为6~10h。
所述步骤(2)中HMSNs的粒径在120~200nm。
所述步骤(3)中硝酸银溶液的浓度为10~25mM;硫化钠溶液的浓度为10~25mM。
所述步骤(3)中硝酸银溶液与硫化钠溶液的摩尔浓度比为1:1。
所述步骤(3)中继续反应温度为40~70℃,继续反应时间为10~60min。
所述步骤(4)中溶剂为DMF。
所述步骤(4)中A7R肽序列为ATWLPPRC-SH。
所述步骤(4)中搅拌为:室温搅拌过夜。
所述步骤(5)中溶剂为pH值为7-8的PBS缓冲液。
所述步骤(5)中避光搅拌时间为24~48h,避光搅拌温度为室温。
所述步骤(5)中HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的粒径为100~300nm;硫化银纳米点的粒径为1.2~4.5nm。
本发明的一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂的生物学应用。
本发明将介孔二氧化硅纳米球sSiO2(作为模板)分散在乙醇中,搅拌中加入正硅酸乙酯TEOS和十八烷基三甲基硅烷C18TMS(硅源)反应形成实心SiO2为核、介孔SiO2为壳的sSiO2@mSiO2纳米粒子;随后通过碳酸钠刻蚀的过程去除模板得到中空介孔二氧化硅,随后巯基化修饰后,进一步通过原位生长的方法将Ag2S纳米点引入载体上;利用二硫键反应将靶向多肽A7R修饰到载体上得到HMSNs@Ag2S-A7R;将所得的HMSNs@Ag2S-A7R与阿霉素DOX混合在避光的条件下反应得到终产品HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)。
有益效果
(1)本发明的方法简单,易于操作,反应条件温和,具有产业化实施的前景。
(2)本发明所采用的制备方法可用于制备实现体内肿瘤多模态成像介导下化-光热协同治疗的多功能介孔硅基纳米诊疗一体化平台,具有很好的潜在实用价值。
(3)本发明制备得到的A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂具备载药量高、优异的生物相容性和特异性靶向功能,具有应用于肿瘤化-光热协同治疗的前景。
(4)本发明制备得到的A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂具备强的光声成像性能,具有应用于肿瘤多模态成像的前景。
附图说明
图1为本发明制备HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米诊疗剂的反应示意图。
图2为实施例1中sSiO2@mSiO2(A)和HMSNs(B)的TEM图;HMSNs@Ag2S的HAADF-STEM的暗场图谱(C)、亮场图谱(D)和相应的元素mapping(E-I),其中E-I分别为Si,O,Ag,S,C。
图3为实施例1中HMSNs-SH和HMSNs@Ag2S的X射线粉末衍射结果(A),HMSNs-SH和HMSNs@Ag2S-A7R的红外光谱图(B),HMSNs-SH、HMSNs@Ag2S-A7R及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的紫外图谱(C)和水动力学粒径变化图(D)。
图4为实施例2中HMSNs@Ag2S-A7R纳米诊疗剂在不同的浓度(A)以及不同功率(B)的激光照射下的升温曲线。
图5为实施例3中HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)在不同pH,有无GSH及无激光照射(A)和激光照射(B)下的药物释放行为。
图6为实施例4中ICP-OES检测不同细胞对HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的吞噬量(以银的含量评价)。
图7为实施例5中不同DOX浓度下HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)在有无光照条件下的细胞毒性试验结果。
图8为实施例6中注射HMSNs@Ag2S-A7R后不同时间的体内光声成像图(A)及相应的光声信号(B)。
图9为实施例7中HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)和单纯DOX化疗的血药浓度曲线。
图10为实施例8中不同治疗组通过尾静脉注射入小鼠体内,记录两周内小鼠肿瘤体积(A)、第21天的肿瘤照片(B)、小鼠体重(C)和瘤体的质量(D)。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将65mL无水乙醇与10mL超纯水混合,随后搅拌中加入2.0mL氨水并在40℃水浴中搅拌1h,搅拌中向体系中加入5mL TEOS,继续剧烈搅拌1h,得到实心二氧化硅纳米粒子sSiO2;随后将离心后的sSiO2分散在60mL的乙醇中,搅拌中能加入预先混合的包含4mL TEOS(国药集团化学试剂有限公司)和2mL十八烷基三甲基硅烷C18TMS(Sigma-Aldrich)的混合液,在40℃下继续搅拌1h,水洗,离心,得到实心SiO2为核、介孔SiO2为壳的sSiO2@mSiO2纳米粒子。
(2)将步骤(1)得到的sSiO2@mSiO2均分6份后分别分散在40mL,0.6M的碳酸钠溶液中,在60℃下搅拌刻蚀1h,冷却后离心,水洗3次,然后真空干燥,随后在500℃下煅烧5h,得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs。取0.3g上述得到的HMSNs分散在80mL无水甲苯中,加入0.3mL MPTMS(Sigma-Aldrich),在60℃下回流反应6h,离心收集,洗涤,真空干燥,得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSNs-SH。
(3)取20mg上述得到的HMSNs-SH超声分散在60mL,15mM AgNO3溶液(国药集团化学试剂有限公司)中,室温搅拌1h,然后加入5mL,15mM Na2S溶液(国药集团化学试剂有限公司),在70℃继续反应30min,水洗,离心,真空干燥,得到HMSNs@Ag2S。
(4)将20mg步骤(3)得到的HMSNs@Ag2S分散在80mL DMF中,搅拌中加入10mg巯基封端的A7R肽,序列为ATWLPPRC-SH(上海强耀生物科技),室温下搅拌过夜,离心,重新分散在水中后透析,冷冻干燥,得到HMSNs@Ag2S-A7R。
(5)取10mg HMSNs@Ag2S-A7R分散在10mL PBS缓冲溶液(pH 7.4)中,随后加入5mg盐酸阿霉素DOX.HCl,避光环境中搅拌24h,离心,透析后冷冻干燥得到A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)。
本实施例制得的sSiO2@mSiO2的TEM结果如图2A所示,表明sSiO2@mSiO2的核心为实心硅,其粒径为185nm。HMSNs的TEM结果如图2B所示,可以看到明显的中空结构,表明HMSNs的成功合成。HMSNs@Ag2S的HAADF-STEM结果如图2C所示,可以看到硫化银超小的结构负载在HMSNs的表面;图2D为HMSNs@Ag2S相应的元素的mapping图谱,可以看出HMSNs@Ag2S-A7R中出现Si、O、Ag、S、C等元素,表明Ag2S纳米粒子成功长在中空介孔硅上。
本实施例制得的HMSNs和HMSNs@Ag2S-A7R的X射线粉末衍射结果如图3A所示,在图上可以看出Ag2S的特征衍射峰(111),(112),(103),(220),and(121)出现,而HMSNs的特征吸收消失,表明材料成功合成。
本实施例制备HMSNs-SH和HMSNs@Ag2S-A7R的红外光谱图如图3B所示,图中可以看出,与HMSNs相比,HMSNs@Ag2S-A7R的红外光谱中出现酰胺I(1660cm-1)和酰胺II(1554cm-1)带的特征峰,表明A7R肽成功接枝到HMSNs@Ag2S上。
本实施例制备HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)各步骤的紫外图谱结果如图3C所示,可以证明Ag2S成功负载在HMSNs上及药物DOX的成功负载。
本实施例制得的HMSNs-SH,HMSNs@Ag2S-A7R及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的水动力学粒径变化如图3D所示,可知HMSs-SH与HMSNs@Ag2S-A7R为261nm和307nm,载药后,水动力学直径增加到320nm,这是由于DOX的上载后,纳米颗粒表面形成了双电子层导致水动力粒径增加。
实施例2
对实施例1中制备的HMSNs@Ag2S-A7R纳米颗粒的光热转换性能进行测试:
(1)配制不同浓度(5-100μg/mL)的HMSNs@Ag2S-A7R分散液置于离心管中,同时取相同体积的蒸馏水做空白对照,将不同的离心管用功率为1.0W/cm2的808nm的近红外光照射5分钟,并通过连接的热电偶监控分散液的温度变化绘制不同浓度分散液的升温曲线,如图4A所示。
(2)配制一系列浓度为100μg/mL的HMSNs@Ag2S-A7R分散液置于离心管中,将不同的离心管分别用不同功率(0.25-1.5W/cm2)的808nm的近红外光照射5分钟,并通过连接的热电偶监控分散液的温度变化绘制不同浓度分散液的升温曲线,如图4B所示。
图4表明:合成的HMSNs@Ag2S-A7R纳米颗粒表现出良好的光热转化性能;图4A显示出随着HMSNs@Ag2S-A7R浓度的增加,体系的温度越高;同时,当固定浓度为100μg/mL时,随着照射功率的加大,HMSNs@Ag2S-A7R的升温幅度亦加大,证明制备的HMSNs@Ag2S-A7R具有光热转换性能,可作为一个良好的光热剂用于光热治疗。
实施例3
对实施例1制备的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米颗粒进行刺激响应药物释放实验:
(1)分别在容量瓶中配制含DOX的PBS缓冲溶液(pH 7.4,0.0025~0.1mg/mL)及含有DOX的醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0,0.0025~0.08mg/mL),超声完全溶解后,取适当体积不同浓度的溶液,通过紫外分光光度计中检测吸光度,拟合两种pH环境下的DOX标准曲线。
(2)分别配制四份HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的PBS溶液(0.5mg/mL)及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)醋酸盐溶液(0.5mg/mL),取5mL置于四个透析袋(Mw:3500Da)中,分别在其中一个PBS或醋酸盐缓冲溶液透析袋中加入1mL 10mM的GSH溶液,然后分别将每一个透析袋置于pH值为7.4的PBS缓冲溶液和pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中振荡,分别于不同时间点取出透析液,并补充相同体积的缓冲液,将取出的透析液于紫外分光光度计下测试吸光度,结合DOX标准曲线,计算出释放的DOX的量得到不同pH条件下及有无GSH条件下药物释放曲线,如图5A所示。
(3)分别配制四份HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的PBS溶液(0.5mg/mL)及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)醋酸盐溶液(0.5mg/mL),取5mL置于四个透析袋(Mw:3500Da)中,分别在其中一个PBS或醋酸盐缓冲溶液透析袋中加入1mL 10mM的GSH溶液,然后分别将每一个透析袋置于pH值为7.4的PBS缓冲溶液和pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液,然后分别用808nm、1.0W/cm2的NIR激光照射5min,随后置于摇床中振荡,分别于不同时间点取出透析液,并补充相同体积的缓冲液,将取出的透析液于紫外分光光度计下测试吸光度,结合DOX标准曲线,计算出释放的DOX的量得到不同pH条件下及有无GSH条件下在激光照射下的药物释放曲线,如图5B所示。
如图5所示,在较低pH值环境下药物释放量更多,且在含有GSH的条件下及激光照射均可显著提高药物的释放,由于肿瘤组织的特点为:弱酸性且GSH含量较正常组织细胞更高,HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)在不同条件下的药物释放行为正好符合这一特性。该结果表明合成的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)适合用于肿瘤治疗。
实施例4
通过ICP-OES评价不同的乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)对实施例1HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米颗粒的摄取量。
取HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米颗粒用PBS缓冲液配制成浓度为20、50和100μg/mL的溶液。分别将MDA-MB-231和MCF-7细胞接种于24孔板(2×105个/孔),用500μL的DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)在5%CO2和37℃培养过夜。随后将100μl含有不同DOX浓度的实施例1中HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的PBS溶液,并补足新鲜的培养基,每个梯度做5个平行孔,孵育24h。每个梯度做5个平行孔,以PBS缓冲液作为空白对照。培养结束后用PBS清洗3次,再胰酶消化离心后收集细胞,加入2m L王水消化24h,然后通过ICP-OES检测细胞中Ag元素的吞噬量。
由图6可知,随着HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)浓度的增加(25-100μg/mL),两种细胞对纳米颗粒的吞噬量也随之增加,与此同时,从图中可以看出MDA-MB-231细胞对HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的吞噬量比MCF-7细胞要多,这是由于MDA-MB-231细胞的表面有过表达的NRP-1蛋白,可以特异性结合A7R多肽,由此可以看出HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)具有靶向NRP-1蛋白过表达的细胞。
实施例5
对实施例1制备的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米颗粒进行MTT实验考察细胞毒性:
将MDA-MB-231细胞以1×104细胞/孔的密度接种于24孔板,用500μL的DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)在5%CO2和37℃培养过夜。随后加入100μl含有不同DOX浓度(0、0.5、1、2、5、10、15μg/mL)的实施例1中HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)的PBS溶液,并补足新鲜的培养基,每个梯度做5个平行孔,孵育24h。对于激光照射组,培养4h后用808nm、1.0W/cm2的NIR激光照射5min继续孵育20h,随后移除培养基,每孔加20μl的0.5%的MTT溶液(5mg L-1),置37℃恒温箱中静置4h,吸去孔内培养液,并添加200μl DMSO,置摇床上避光低速振荡15-20min,使用酶联免疫检测仪检测在570nm处各孔的紫外吸收值。
MTT法检测细胞活力结果如图7所示,表明随着HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)中DOX浓度的增加,产生的细胞毒性也随之提高;同时,在光照的情况下,细胞活力明显低于非光照条件下,充分验证了HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)能实现有效的化疗,并且在激光照射的情况下,能实现化疗-光热治疗协同治疗,有效地抑制肿瘤。
实施例6
对实施例1制备的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米诊疗剂进行体内光声成像性能测定:
采用实施例1制得的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)进行动物试验,所有动物实验操作均获得了上海交通大学上海市第一人民医院及上海交通大学动物保护和使用委员会批准。将3×106个MDA-MB-231细胞接种到裸鼠右后腿,当肿瘤体积达到0.1-0.2cm3时,肿瘤造模成功即可用于裸鼠肿瘤部位的PA成像。用无菌PBS缓冲液将HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米诊疗剂配制成分散液,取200μL通过尾部静脉注射进裸鼠体内,之后在0、1、8和24h分别利用PA成像系统(808nm激光激发)扫描获得裸鼠肿瘤部位的PA成像图片和信号强度值。
如图8所示,肿瘤部位的PA成像图和信号值都在8h达到峰值。HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)在注射8h后在肿瘤部位能达到最大富集量,并实现增强肿瘤部位的PA成像。
实施例7
对实施例1制得的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)进行体内的药物代谢动力学进行检测。
体内血液循环是通过在不同时间点从注射HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)和单纯阿霉素三组小鼠的尾静脉取约10μl血液进行测定的。每个样品都加入0.1mL裂解液(1%SDS,1%Triton X-100,40mM tris acetate)超声裂解,再加入0.5mL HCl-IPA于-20℃静置过夜。离心萃取得到血液样品中的DOX,随后通过荧光(激发波长为490nm)测定。每组血液循环实验平行进行三次,最终显示的是实验所得的平均值。血液循环遵循典型的两室模型,第一相是分布相,第二相是消除相。采用以下公式计算两相的半衰期(分布相为t1;消除相为t2)
y=A1×exp(-X/t1)+A2×exp(-X/t2)+y0
t1/2α=0.693×t1
HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)和单纯DOX化疗的血药浓度曲线如图9所示,可知HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)较单纯DOX相比,能明显提高药物在血液中的循环时间,从而证明该制备工艺得到的纳米载药复合物在血液循环中有较好的稳定性。
实施例8
对实施例1制得的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)进行体内的化疗-光热治疗效果考察。
将4-6周龄雌性裸鼠右后肢皮下接种2×106MDA-MB-231细胞,待肿瘤体积长到100mm3左右时,进行体内治疗。将荷瘤裸鼠随机分为6组,每组4只鼠:生理盐水组、DOX治疗组、HMSNs@Ag2S-A7R加激光治疗组、HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)治疗组、HMSNs@Ag2S(DOX)加激光治疗组及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)加激光治疗组。每只裸鼠尾静脉注射100μl纳米颗粒的生理盐水溶液,所有纳米粒子中含DOX剂量为5mg/kg。对于激光治疗组,将注射不同纳米颗粒的裸鼠用808nm、1.0W/cm2的NIR激光照射5min,并同时在第3天与第6天重复上述操作。治疗后每两天测量肿瘤大小与裸鼠体重。肿瘤体积根据如下公式计算:V=(肿瘤宽)2×肿瘤长/2。
不同治疗模式后的结果如图10所示,记录三周内小鼠肿瘤体积(A)、第21天的肿瘤照片(B)、小鼠体重(C)和瘤体的质量(D),可知注射组未见肿瘤发生明显变化;单纯化疗和HMSNs@Ag2S-A7R加激光照射治疗组中,肿瘤生长速度一定程度上被抑制,同时HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)化疗组对肿瘤治疗也有一定的抑制作用,但是不足以彻底遏制肿瘤,主要是由于肿瘤摄取纳米诊疗颗粒较少,并不能维持化疗疗效;而在HMSNs@Ag2S(DOX)及HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)加激光照射治疗组中,肿瘤生长速度、肿瘤大小较其他四组均有显著抑制,说明化疗协同光热治疗对肿瘤有显著的治疗效果,重要的是,HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)加激光照射治疗组小鼠并无明显体重下降,说明本法制备的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)纳米诊疗剂具有很好的生物相容性。
对比例1
Lu等利用原位生长的方法将中空周期性介孔有机硅与硫化铜纳米粒子结合构建出一种三重刺激响应的纳米载药体系。简言之,将0.12g CTAB溶解于乙醇、水、氨水(75:25:1,v/v/v)的混合溶液中,35℃下搅拌半个小时后加入TEOS(0.25mL)and TESPTS(0.1mL)的混合溶液,继续反应24h,水洗离心后干燥得到白色固体。随后将白色固体分散在30mL水中,将分散液转移至反应釜中升温至150℃下反应24h。去除模板CTAB后得到蛋黄-壳结构的中空介孔有机硅。将得到的15mg的中空介孔有机硅分散在40mL乙醇中,加入0.15mL MPTMS和0.2mL氨水,搅拌过夜,乙醇清洗后离心得到PMOs-SH。将5mgPMOs-SH分散在10mL CuCl2中,室温下搅拌过夜。随后在搅拌中加入5mL Na2S溶液在80℃反应15min后得到PMOs@CuS。载药后得到DOX-CuS@PMOs。
通过本对比例得到的纳米载药体系DOX-CuS@PMOs与本发明的制备方法类似,均是通过在巯基化的介孔硅材料表面原位生长半导体纳米材料,随后负载抗癌药物DOX后得到,本对比例得到的纳米载药体系展示出载药量为370mg/g,而本发明得到的材料载药量达到445mg/g,在载药量上本发明材料具备优势;其次,本对比例得到的材料虽然具有良好的光热转换效率,但是本发明中得到的HMSNs@Ag2S-A7R(DOX)载药体系不仅可以用于光热治疗,而且可以用于光声成像的潜力(图8)。最后,本发明将A7R多肽引入到纳米诊疗剂,赋予了其靶向能力,有利于肿瘤的靶向摄取。基于此,本发明得到的一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂具备用于多模态成像介导下的化疗-光热治疗的性能,有望实现肿瘤的诊疗一体化。
Claims (10)
1.一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂,其特征在于,所述诊疗剂包括Ag2S、A7R肽、DOX和中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs,其中Ag2S和A7R肽均修饰在中空介孔二氧化硅颗粒的表面,中空介孔二氧化硅颗粒的空腔内部包覆DOX。
2.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂,其特征在于,所述Ag2S原位生长在中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs上得到中空介孔二氧化硅-硫化银纳米颗粒HMSNs@Ag2S,A7R肽、DOX和HMSNs@Ag2S的质量比为5-20mg:4-10mg:12.5~60mg。
3.一种A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂的制备方法,包括:
(1)将实心二氧化硅纳米粒子sSiO2分散在溶剂中,搅拌下加入硅源溶液反应,得到实心SiO2为核、介孔SiO2为壳的sSiO2@mSiO2纳米粒子,其中sSiO2与溶剂的比例为0.1~0.8g:20~80mL,sSiO2与硅源的比例为0.1~0.8g:5~10mL;
(2)将步骤(1)中sSiO2@mSiO2纳米粒子洗涤,离心,分散在碳酸钠溶液中,搅拌,离心,洗涤,真空干燥,煅烧,得到中空介孔二氧化硅颗粒HMSNs,分散在溶剂中,加入(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷MPTMS反应,离心,洗涤,真空干燥,得到巯基修饰的中空介孔二氧化硅HMSNs-SH;其中sSiO2@mSiO2与碳酸钠溶液的比例为0.2g:10~20mL;HMSNs、溶剂与MPTMS的比例为0.1~0.5g:30-150mL:0.15-0.45mL;
(3)将步骤(2)中HMSNs-SH超声分散在硝酸银溶液中,搅拌,加入硫化钠溶液继续反应,洗涤,离心,干燥,得到HMSNs@Ag2S;其中HMSNs-SH、硝酸银和硫化钠的质量比为0.02g:85~430mg:5~30mg;
(4)将步骤(3)中HMSNs@Ag2S分散于溶剂中,加入巯基封端的A7R肽,搅拌,经透析、冷冻干燥,得到HMSNs@Ag2S-A7R,其中HMSNs@Ag2S、溶剂、A7R肽的比例为12.5~60mg:30~120mL:5~20mg;
(5)将步骤(4)中HMSNs@Ag2S-A7R分散在溶剂中,得到HMSNs@Ag2S-A7R分散液,加入盐酸阿霉素DOX.HCl,避光搅拌,离心,透析,冷冻干燥,得到A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂HMSNs@Ag2S-A7R DOX,其中HMSNs@Ag2S-A7R分散液的浓度为0.5~2mg/mL,HMSNs@Ag2S-A7R与DOX.HCl的质量比为1~5:1。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中溶剂为乙醇;硅源为体积比为2~5:1的正硅酸乙酯TEOS和十八烷基三甲基硅烷C18TMS;反应温度为30-60℃,反应时间为1-2h。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中sSiO2的制备方法为:在无水乙醇和超纯水混合液中加入氨水,40-50℃混合,搅拌中加入TEOS或C18TMS,继续搅拌1~2h即得;其中无水乙醇、超纯水、氨水与TEOS或C18TMS的体积比为60~75:10:1.5~2.5:3-8。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中碳酸钠溶液的浓度为0.5~0.8mol/L;搅拌温度为50~80℃,搅拌时间为40min~2.5h;煅烧温度为500~600℃,煅烧时间为5~10h;溶剂为无水甲苯;反应温度为50~80℃,反应时间为6~10h。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中硝酸银溶液的浓度为10~25mM;硫化钠溶液的浓度为10~25mM;硝酸银溶液与硫化钠溶液的摩尔浓度比为1:1;继续反应温度为40~70℃,继续反应时间为10~60min。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中溶剂为DMF;A7R肽序列为ATWLPPRC-SH;搅拌为:室温搅拌过夜。
9.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中溶剂为pH值为7-8的PBS缓冲液;避光搅拌时间为24~48h,避光搅拌温度为室温。
10.一种如权利要求1所述的A7R肽修饰的硫化银掺杂中空介孔硅靶向纳米诊疗剂的生物学应用。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190122 |
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