CN110893237A - 铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用。该铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。本发明首次通过调控不同铜钯比例来有效调控铜钯合金四角叉纳米颗粒的自噬效应,利用自噬抑制剂联合光声成像及光热治疗实现耐药肿瘤的诊疗一体,因此,可将铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂共同用于诊断和治疗乳腺癌和胃癌等肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域,特别涉及铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
背景技术
近年来,恶性肿瘤的发病率节节攀升。作为恶性肿瘤的主要治疗手段,放疗和化疗目前仅仅起到了极低的治疗效果,却伴随较高的毒副作用,这使得癌症治癒率维持在一个极低的水平。光热治疗(photothermal therapy,PTT)是利用具有高光热转换效率的纳米材料,注射到体内后,利用EPR效应(enhanced permeability and retention effect)或者靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近,并近红外光的照射下将光能转化为热能,达到杀死局部肿瘤细胞的一种治疗方法,为肿瘤治疗提供了新思路新方法。目前,光热治疗的纳米材料主要有:CuS纳米粒子(CN104784691A)、水溶性FeNi3纳米合金颗粒(CN104606676A)、Cu7S4纳米晶体(CN105236466A)、生物素化还原性氧化石墨烯(CN106075440A)、PEG-PLGA与卟啉类化合物共价键连接的纳米颗粒(CN105327348A)、金纳米星(CN105031647A)、海胆状空心金银合金纳米颗粒(CN103357887B)等。
然而,由于目前光热治疗存在热传递的非专属性,这极易造成肿瘤周围正常的组织器官的损伤,因此实际应用中热疗的温度不能太高,这也制约了其治疗功效。此外,由于合成方法的限制,多数纳米颗粒很难达到较高的光热转换效率;加之,通过EPR效应进入肿瘤组织的纳米颗粒,光热治疗后,会导致肿瘤组织受热不均,造成肿瘤杀伤不完全,治疗效果差等缺陷,严重制约着光热治疗的应用。化疗联合光热治疗是利用纳米颗粒携带抗癌药物小分子到达肿瘤组织,实现化疗联合热疗,来弥补光热治疗中肿瘤组织受热不均引起的肿瘤杀伤不完全,可以更好的达到肿瘤杀伤效果。目前,有作为热化疗药物中的药物载体碲化铜纳米颗粒(CN105963712A)、基于聚合物纳米粒子载体的药物组合物(CN103861112A)、基于普鲁士蓝的脂质体结构(CN106039311A)、载药TAT-CS修饰碳纳米管(CN105535985A)、包裹阿霉素的中空硅-金星核/壳纳米材料(CN106177948A)、纳米金棒(CN104368000A)、具有肝癌细胞靶向性的二硫化钼载药纳米片(CN104800845A)、介孔硅-石墨烯纳米片(CN104056269A)等。化疗联合光热治疗一直面临着耐药性问题,限制了其肿瘤治疗的应用。
近年来,诊疗一体及诊断/成像导向光热治疗方法迅速发展,通过成像导向可以更加准确的对肿瘤部位进行光热治疗,有效避免对正常组织的损伤。目前主要由用于MRI成像及光热治疗于一体的硫化铜纳米颗粒(CN106237346A)、光声成像导向光热治疗于一体的硫化铜纳米颗粒(CN104491882A)、超声造影联合光热治疗的二氧化硅纳米球(CN104288792A)、用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子(CN105194693A)、用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒(CN105535973A)、用于肿瘤MRI/CT成像和光热治疗的GNRs@PPy@Fe3O4多功能纳米探针(CN104689346A)、核磁成像和光热治疗的配位聚合物纳米点(CN105288624A)等。此外,对于纳米颗粒光热效应与自噬抑制剂联合杀伤肿瘤细胞的方法仅有CN104353074A报道了纳米金颗粒的这一方法,对于铜钯合金光热联合自噬抑制剂化疗进行肿瘤治疗的研究国内外一片空白。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
所述的自噬抑制剂为3-MA(3-甲基腺嘌呤)、Baf A1(巴伐洛霉素A1)和CQ(氯喹)中的至少一种。
所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
所述的四角棒铜钯合金纳米颗粒为平均粒径80nm,分支长度50nm的四角棒铜钯合金纳米颗粒;优选为通过如下方法制备得到:将氯钯酸钠、氯化亚铜、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、癸胺和N,N-二甲基甲酰胺混合均匀后,在70~80℃的油浴锅中搅拌反应,待反应结束后,将其冷却至室温,离心,洗涤,得到四角棒铜钯合金纳米颗粒。
所述的氯钯酸钠、氯化亚铜、聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖的质量比为3.5~11.2:3.1~5.7:300:250;质量比优选为:3.5:5.7:300:250或11.2:3.1:300:250。
所述的聚乙烯吡咯烷酮优选为聚乙烯吡咯烷酮K30,其Mw为40000。
所述的癸胺和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50。
所述的N,N-二甲基甲酰胺的用量优选为按每3.5mg氯钯酸钠配比5mL N,N-二甲基甲酰胺计算。
所述的混合均匀为采用超声的方式混合均匀。
所述的超声的时间优选为2~10分钟;优选为2分钟。
所述的油浴锅的温度优选为80℃。
所述的搅拌反应的时间为2~6h;优选为2h。
所述的离心的条件为:15000转/分钟离心20分钟。
所述的洗涤为采用乙醇和去离子水进行洗涤,具体为:先用乙醇洗涤3次,再用去离子水洗涤2次。
所述的球型铜钯合金纳米颗粒通过如下方法制备得到:将H2PdCl4、CuCl2·H2O和癸胺(DA)分散到水中,常温搅拌过夜,再加入葡萄糖,在100~110℃油浴锅中搅拌反应,待反应结束后,将其冷却至室温,离心,洗涤,得到球型铜钯合金纳米颗粒。
所述的H2PdCl4、CuCl2·H2O和葡萄糖的摩尔比为3:3:14。
所述的H2PdCl4优选为浓度为0.1mol/L的H2PdCl4溶液。
所述的水的用量优选为按每毫升(mL)H2PdCl4溶液配比15mL水计算。
所述的水优选为去离子水。
所述的CuCl2·H2O优选为浓度0.1mol/L的CuCl2·H2O溶液。
所述的葡萄糖优选为浓度1mol/L的葡萄糖水溶液。
所述的癸胺(DA)与水的体积比为2:45。
所述的油浴锅的温度优选为110℃。
所述的搅拌反应的时间为2~6h;优选为2h。
所述的洗涤为采用乙醇和去离子水进行洗涤,具体为:先用乙醇洗涤3次,再用去离子水洗涤2次。
所述的球型铜钯合金纳米颗粒的平均粒径为25nm。
所述的肿瘤包括乳腺癌和胃癌等;优选为乳腺癌。
一种基于光热效应杀伤肿瘤的药物,包括铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂。
所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
所述的铜钯合金纳米颗粒的浓度为5~20μg/ml,
所述的自噬抑制剂为3-MA(3-甲基腺嘌呤)、Baf A1(巴伐洛霉素A1)和CQ(氯喹)中的至少一种。
所述的3-MA(3-甲基腺嘌呤)优选为2.5~5mM的3-MA。
所述的CQ(氯喹)优选为25mM的CQ。
所述的肿瘤包括乳腺癌和胃癌等;优选为乳腺癌。
铜钯合金纳米颗粒在制备光热治疗的纳米材料(光热材料)中的应用,所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
铜钯合金纳米颗粒在制备提高细胞内ROS水平的药物中的应用,所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
所述的细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明首次通过调控不同铜钯比例来有效调控铜钯合金四角叉纳米颗粒的自噬效应,利用自噬抑制剂联合光声成像及光热治疗实现耐药肿瘤的诊疗一体。
附图说明
图1是实施例1中所得产物的透射电子显微镜照片图。
图2是实施例2中所得产物的透射电子显微镜照片图。
图3是实施例3中所得产物的透射电子显微镜照片图。
图4是实施例1~3所得产物的红外光谱图。
图5是实施例1~3所得产物的温度变化图。
图6是实施例1~3所得产物在细胞中引发自噬强弱的荧光结果图;其中,图A为荧光图;图B为各组荧光强度量化后的统计结果。
图7是实施例1~3所得产物在细胞中引发自噬强的western blot检测结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图8是探究CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起细胞自噬机理的western blot检测结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图9是CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的细胞自噬可被内吞抑制剂Genistein有效抑制的western blot验证结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图10是不同浓度的CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的自噬的能力的测试结果图。
图11是CuPd TNP-1处理HeLa细胞2h、6h、12h、18h、24h后,CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的自噬的能力的测试结果图。
图12是CuPd TNP-1对HeLa细胞内p62的影响的测试结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图13是CuPd TNP-1在HeLa细胞中是否引起完整自噬流的测试结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图14是CuPd TNP-1对溶酶体活性的检测结果图。
图15是CuPd TNP-1对溶酶体功能的检测结果图。
图16是CuPd TNP对细胞内ROS水平的影响结果图。
图17是CuPd TNP-1引起细胞内ROS上升的源头的FACS检测结果图。
图18是CuPd TNP-1处理细胞内ROS水平上升对自噬的的测试结果图;其中,图A为电泳结果图;图B为各样品western blot条带信号强度量化后的统计结果。
图19是两种不同比例的CuPd TNP处理细胞后的细胞活力检测结果图。
图20是两种不同比例的CuPd TNP与3-MA、NIR处理细胞后的细胞活力检测结果图。
图21是两种不同比例的CuPd TNP处理细胞后的细胞活力检测结果图;其中,图A为光照处理各组的细胞活力;图B为未光照处理各组的细胞活力。
图22是CuPd TNP-1对ATG5敲除的Hela细胞和Hela细胞的影响结果图。
图23是CuPd TNP-1与3-MA联合处理细胞后的Annexin-V/PI FACS检测结果图。
图24是CuPd TNP-1处理ATG5敲除的Hela细胞和Hela细胞后的Annexin-V/PI FACS检测结果图。
图25是CuPd TNP-1在病人原代乳腺癌细胞中引发自噬的能力的检测结果图。
图26是CuPd TNP-1在病人原代胃癌细胞中引发自噬的能力的检测结果图。
图27是两种不同比例的CuPd TNP在病人原代乳腺癌细胞上的杀伤情况图。
图28是两种不同比例的CuPd TNP在病人原代胃癌细胞上的杀伤情况图。
图29是CuPd TNP在肿瘤处的的温度变化图。
图30是CuPd TNP-1在肿瘤处的热感图像。
图31是CuPd TNP在动物体内的ICP检测结果图。
图32是小鼠注射CuPd TNP-1和CuPd TNP-2后的血清检测结果图;其中,图A为AST(谷草转氨酶)的浓度;图B ALT(丙氨酸氨基转移酶)的浓度;图C为BUN(血尿素氮)的浓度;图D为SCR(血清肌酐)的浓度。
图33是小鼠注射CuPd TNP-1和CuPd TNP-2后小鼠脏器H&E染色结果图。
图34是CuPd TNP治疗荷瘤鼠后的小鼠体重统计结果图。
图35是CuPd TNP治疗荷瘤鼠后的肿瘤体积变化图。
图36是CuPd TNP治疗荷瘤鼠后的肿瘤拍照图。
图37是CuPd TNP治疗荷瘤鼠后的肿瘤重量图。
图38是CuPd TNP治疗HeLa荷瘤鼠的肿瘤拍照图。
图39是CuPd TNP治疗HeLa荷瘤鼠后的肿瘤重量图。
图40是CuPd TNP治疗荷瘤鼠(MCF7-MDR)后的小鼠体重统计结果图。
图41是CuPd TNP治疗荷瘤鼠(MCF7-MDR)后的肿瘤体积变化图。
图42是CuPd TNP治疗荷瘤鼠(MCF7-MDR)后的肿瘤拍照图。
图43是CuPd TNP治疗荷瘤鼠(MCF7-MDR)后的肿瘤重量图。
图44是uPd TNP动物水平治疗后肿瘤组织的TUNEL染色结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原料以及试剂,除特别指出的以外,均可由市售获得。
实施例1、含铜量为40%的四角棒铜钯合金纳米晶体的制备和表征。
在常温下,依次向20ml的玻璃反应瓶中加入:3.5mg氯钯酸钠、5.7mg氯化亚铜、300mg聚乙烯吡咯烷酮(K30,Mw=40000)、100μL癸胺、250mg葡萄糖、5mL N,N-二甲基甲酰胺以及一粒磁子。瓶盖盖紧后,将该混合液放在超声仪中超声2分钟使原料混合均匀,所得到的装有均匀混合物的20ml玻璃瓶转移到80℃的油浴锅中,加热并磁力搅拌反应2h。待反应结束后,将其冷却至室温,并在离心机中以15000转/分钟离心20分钟,离心所得的产物用乙醇和去离子水分别洗涤3次和2次,以尽可能除去纳米晶体表面吸附着的聚乙烯吡咯烷酮和癸胺,最终可得干净的四角棒铜钯合金纳米晶体(CuPd TNP-1、TNP-1)。
本实施例所得产物的透射电子显微镜照片如图1所示,从图中可以看出所得产物尺寸均匀、分散性好,每个四角棒颗粒的平均粒径为80nm,分支长度为50nm。该四角棒铜钯合金纳米晶体在近红外波段处有吸收,具体紫外可见近红外消光光谱见图4。
实施例2、含铜量为40%的球型铜钯合金纳米晶体的制备和表征
在常温下,在20mL的玻璃瓶中,将0.3mL的0.1M H2PdCl4、0.3mL的0.1M CuCl2·H2O和200μL的癸胺(DA)分散于4.5mL的去离子水中。将装有上述均匀溶液的玻璃瓶密封,常温搅拌过夜。随后,0.14mL的1M葡萄糖水溶液加入到上述溶液中后,将其置于110℃油浴锅中,搅拌反应2h,溶液由蓝绿色变为深棕色,标志着CuPd纳米晶的形成。待反应溶液冷却至室温,用离心(15000转/分钟离心20分钟)分离产物,并用去离子水和乙醇分别洗涤2次和3次,除去多余的癸胺和葡萄糖,最终可得干净的球型铜钯合金纳米晶体(CuPd TNP、TNP)。
本实施例所得产物的透射电子显微镜照片如图2所示,从图中可以看出所得产物尺寸均匀、分散性好,每个球型颗粒的平均粒径为25nm。该球型铜钯合金纳米晶体在近红外波段处有吸收,具体紫外可见近红外消光光谱见图4。
实施例3、含铜量为10%的四角棒铜钯合金纳米晶体的制备和表征
在常温下,依次向20ml的玻璃反应瓶中加入:11.2mg氯钯酸钠、3.1mg氯化亚铜、300mg聚乙烯吡咯烷酮(K30,Mw=40000)、100μL癸胺、250mg葡萄糖、5mL N,N-二甲基甲酰胺以及一粒磁子。瓶盖盖紧后,将该混合液放在超声仪中超声2分钟使原料混合均匀,所得到的装有均匀混合物的20ml玻璃瓶转移到80℃的油浴锅中,加热并磁力搅拌反应2h。待反应结束后,将其冷却至室温,并在离心机中以15000转/分钟离心20分钟,离心所得的产物用乙醇和去离子水分别洗涤3次和2次,以尽可能除去纳米晶体表面吸附着的聚乙烯吡咯烷酮和癸胺,最终可得干净的四角棒铜钯合金纳米晶体(CuPd TNP-2、TNP-2)。
本实施例所得产物的透射电子显微镜照片如图3所示,从图中可以看出所得产物尺寸均匀、分散性好,每个四角棒颗粒的平均粒径为80nm,分支长度为50nm。如紫外可见近红外消光光谱(图4)所示,与实施例1以及2中含铜量为40%的铜钯合金纳米晶体相比,这种含铜量为10%的铜钯合金纳米晶在近红外波段处吸收更强。
实施例4、检测三种不同CuPd纳米颗粒的升温曲线
将实施例1~3中制得的铜钯合金纳米晶体分别配置成浓度为10ug/ml的CuPd水溶液,以等体积的PBS缓冲液为对照。使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理5min。记录过程中温度的变化。如图5所示,因为CuPd TNP-2中Pd含量更高且具有尖端聚光效应,所以在三种CuPd纳米颗粒中升温能力最强。
实施例5、比较三种不同CuPd纳米颗粒在细胞中引发自噬的强弱
将HeLa-LC3细胞{HeLa购自于ATCC,稳定转染GFP-LC3质粒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)获得}接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,分别加入三种浓度为10ug/ml的CuPd纳米颗粒(实施例1~3中制得的铜钯合金纳米晶体),阴性对照(Cont)为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养24h后,荧光显微镜观察EGFP报告基因的荧光,拍照,统计结果。如图6显示,Cu比例含量更高的CuPd TNP-1诱导HeLa-LC3细胞自噬相对于CuPd TNP-2以及球型SNP(CuPd TNP)更强。
将HeLa-LC3细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,分别加入三种浓度为10ug/ml的CuPd纳米颗粒(实施例1~3中制得的铜钯合金纳米晶体),阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养24h后,然后进行western blot检测。如图7所示,CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的细胞自噬相对于CuPd TNP-2以及球型SNP更强。
实施例6、探究CuPd TNP-1引发自噬的机理
将HeLa细胞(HeLa细胞购自于ATCC)接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,分别加入0.1μM Cu2+、1μMCu2+、10μM Cu2+、10ug/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得)。阴性对照为加入等体积的PBS。细胞培养24h后,然后进行western blot检测。如图8所示,CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的细胞自噬不是因为其所释放的Cu2+导致的。
将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,分别加入10μg/mL CuPd TNP-1、10μg/mL CuPdTNP-1+10μM Genistein(酪氨酸蛋白激酶抑制剂,购自于sigma)、10μg/mL CuPd TNP-1+50μM Genistein、10μg/mL CuPd TNP-1+10μM Cytochalasin B(细胞松弛素B,Cyto B,购自于sigma)、10μg/mL CuPd TNP-1+20μM Cytochalasin B、10μg/mL CuPd TNP-1+10μMCytochalasin D(细胞松弛素D,Cyto D,购自于sigma)、10μg/mL CuPd TNP-1+20μMCytochalasin D、50μM Genistein、20μM Cytochalasin B、20μM Cytochalasin D。阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养24h后,然后进行western blot检测。如图9所示,CuPd TNP-1在HeLa细胞中引起的细胞自噬可以被内吞抑制剂Genistein有效抑制,说明细胞的内吞对于CuPd TNP-1引发的自噬是必须的。
实施例7、测试CuPd TNP-1在HeLa细胞中所引起的自噬的能力
将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的CuPdTNP-1(实施例1制得),空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10μg/ml的CuPd TNP-1,分别处理2h、6h、12h、18h、24h,空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。如图10和11所示,CuPdTNP-1在HeLa细胞中引起的细胞自噬具有浓度和时间梯度效应。
实施例8、测试CuPd TNP-1对HeLa细胞内p62的影响
将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10μg/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得),分别处理2h、6h、12h、18h、24h,空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。如图12所示,CuPd TNP-1处理HeLa细胞后泛素结合蛋白p62随时间梯度降解。
实施例9、测试CuPd TNP-1在HeLa细胞中是否引起完整的自噬流
将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10μg/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得)、5mM自噬抑制剂3-MA(3-甲基腺嘌呤)、400nM自噬抑制剂Baf A1(巴伐洛霉素A1,购自于sigma)、10μg/ml CuPd TNP-1+5mM 3-MA、10μg/ml CuPd TNP-1+400nM Baf A1,空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。如图13所示,自噬上游抑制剂3-MA和下游抑制剂Baf A1均能够有效抑制CuPd TNP-1的自噬效应。
实施例10、检测CuPd TNP-1对溶酶体活性及功能的影响
将HeLa细胞接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10ug/ml、20ug/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得),空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理24h后,用PBS缓冲液清洗两次细胞。加入新鲜培养基含有1μM溶酶体绿色荧光探针LysoSensor Green DND-189培养条件下处理30min。胰酶消化,PBS缓冲液清洗后进行FACS检测。如图14所示,CuPd TNP-1并不破坏溶酶体。
将HeLa细胞接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10ug/m、20ug/m的CuPd TNP-1,空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理24h后,用PBS缓冲液清洗两次细胞。加入新鲜培养基含有Magic Red Cathepsin-B(购自于Bio-Rad,货号:ICT937,25tests)培养条件下处理。胰酶消化,PBS缓冲液清洗后进行FACS(流式细胞荧光分选技术)检测。如图15所示,CuPd TNP-1并不影响溶酶体酶Cathepsin-B的功能。
实施例11、检测CuPd TNP对细胞内ROS水平的影响
将Hela细胞接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10ug/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得)、CuPd TNP-2(实施例3制得),空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理24h后,用PBS缓冲液清洗两次细胞。加入新鲜培养基含有10μM DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)培养条件下处理20min。胰酶消化,PBS缓冲液清洗后进行FACS检测。如图16所示,CuPd TNP-1处理组相对于CuPd TNP-2处理组细胞内ROS水平上升。
实施例12、检测CuPd TNP-1引起细胞内ROS上升的源头
将Hela细胞接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10ug/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得)、10ug/ml CuPd TNP-1+抗氧化剂MitoTempo(M:0.5mM,购自于sigma)、10ug/ml CuPd TNP-1+氧化酶抑制剂VAS 2870(V:20μM,购自于sigma),空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理24h后,用PBS缓冲液清洗两次细胞。加入新鲜培养基含有10μM DCFH-DA培养条件下处理20min。胰酶消化,PBS缓冲液清洗后进行FACS检测。如图17所示,抗氧化剂MitoTempo和氧化酶抑制剂VAS 2870都可以抑制CuPd TNP-1处理后导致细胞内ROS水平的上升。
实施例13、检测CuPd TNP-1处理细胞内ROS水平上升对自噬的影响
将HeLa细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入浓度为10μg/ml的CuPd TNP-1(实施例1制得)、10μg/ml CuPd TNP-1+MitoTempo(M;0.2mM,0.5mM)、10μg/ml CuPd TNP-1+VAS 2870(V;10μM,20μM),空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。如图18所示,线粒体来源ROS抑制剂能够有效抑制CuPd TNP-1的自噬效应。
实施例14、检测两种不同比例的CuPd TNP在细胞水平上的杀伤
将HeLa细胞(图19)、4T1细胞(图20,4T1细胞购自于ATCC)、MCF7-MDR(图21,MCF7购自于ATCC,用含DOX(阿霉素)的DMEM梯度培养筛选,最后用含DOX的DMEM维持培养)分别接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,再进行5mM 3-MA(3-Methyladenine)、10μg/ml CuPd TNP-1(实施例1制得)、10μg/ml CuPd TNP-1+5mM 3-MA、10μg/ml CuPd TNP-2(实施例3制得)、10μg/ml CuPd TNP-2+5mM 3-MA、NIR激光处理、5mM 3-MA+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+5mM 3-MA+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-2+NIR激光处理、10μg/mlCuPd TNP-2+5mM 3-MA+NIR激光处理,以不作任何处理为空白对照,光照处理组的使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理3min。两组处理24h,然后进行MTT检测。如图19、20和图21所示,3-MA和NIR单独处理细胞,都不会对细胞活力造成影响,而3-MA和NIR联合处理组对两种细胞都有一点毒性;CuPd TNP-1单独处理不会对细胞造成任何毒性,但是与3-MA联合处理细胞后,会引起37%的HeLa细胞活力下降和32%的4T1细胞活力下降。
将ATG5敲除的Hela细胞{Hela细胞购自于ATCC,转染ATG5相关shRNA(从基因库中寻找并设计相关序列,连接构建到PLKO.1载体(购自于Addgene公司))敲除ATG5}和Hela细胞分别接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,两组细胞加入浓度为10ug/ml的CuPd TNP-1、CuPd TNP-2,并且使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理3min。处理24h,然后进行MTT检测。如图22所示,CuPd TNP-1单独处理对Hela细胞没有任何毒性影响,但对于ATG5-/-细胞却具有一定毒性,联合光照后,ATG5-/-细胞死亡更多。
将Hela细胞接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,一组加入浓度为10ug/ml的CuPd TNP-1、10ug/mlCuPd TNP-1+2.5mM 3-MA。同时另一组加入相同浓度为10ug/ml的CuPd TNP-2、10ug/mlCuPd TNP-2+2.5mM 3-MA,并且使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理3min。两组处理24h,然后进行Annexin-V/PI FACS检测。如图23所示,3-MA、NIR以及CuPd TNP-1单独处理不会对细胞造成任何毒性,但是与3-MA联合处理细胞后,细胞凋亡水平上升。
将ATG5敲除的Hela细胞和Hela细胞分别接种在96孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,两组细胞加入浓度为10ug/ml的CuPd TNP-1,并且使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理3min。处理24h,然后进行Annexin-V/PI FACS检测。如图24所示,CuPd TNP-1单独处理对Hela细胞没有任何毒性影响,但可以引起ATG5-/-细胞凋亡水平上升,联合光照后,ATG5-/-细胞凋亡水平更高。
实施例15、检测CuPd TNP-1在病人原代肿瘤细胞中引发自噬的能力
病人手术后切除获得的肿瘤(乳腺癌、胃癌)浸没在含有5%(w/v)抗体(青霉素-链霉素)的50ml HBSS中,剪切至1~2mm3的小块状。37℃酶震荡消化2h,悬液70μm滤网过滤,1500rpm 5min离心回收消化下的原代肿瘤细胞,DMEM培养基重悬细胞培养条件培养扩增。
将病人来源乳腺癌、胃癌肿瘤细胞分别接种在24孔细胞培养板中,密度约3~5×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,加入10μg/ml CuPdTNP-1、10μg/ml CuPd TNP-1+2.5mM 3-MA、10μg/ml CuPd TNP-1+25mM CQ(chloroquine,氯喹)、2.5mM 3-MA、25mM CQ,空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。如图25和26所示,CuPd TNP-1在病人来源乳腺癌、胃癌肿瘤细胞中均能引发自噬效应,但在乳腺癌细胞中引发自噬效应更强。
实施例16、检测两种不同比例的CuPd TNP在病人原代肿瘤细胞上的杀伤
将病人来源乳腺癌、胃癌肿瘤细胞分别接种在96孔细胞培养板中,密度约1~2×104/孔,过夜培养,待用。在加样前,先将细胞换入新鲜培养基DMEM,进行2.5mM 3-MA、25mMCQ、10μg/ml CuPd TNP-1、10μg/ml CuPd TNP-1+2.5mM 3-MA、10μg/ml CuPd TNP-1+25mMCQ、10μg/ml CuPd TNP-2、10μg/ml CuPd TNP-2+2.5mM 3-MA、10μg/ml CuPd TNP-2+25mMCQ、NIR激光处理、2.5mM 3-MA+NIR激光处理、25mM CQ+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+2.5mM 3-MA+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+25mMCQ+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-1+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-2+2.5mM 3-MA+NIR激光处理、10μg/ml CuPd TNP-2+25mM CQ+NIR激光处理,以不作任何处理为空白对照,光照处理组的使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下处理3min。两组处理24h,然后进行MTT检测。如图27和28所示,CuPd TNP-1联合3-MA在乳腺癌(图27)、胃癌肿瘤细胞(图28)中具有一定的杀伤效果,结合光照处理后,杀伤效果进一步增强。
实施例17、检测CuPd TNP在肿瘤处的升温曲线
在雌性Balb/c小鼠(购自于北京维通利华,体重约20g)的第二个乳垫处注射100μl4T1细胞(5×105),构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。
将获得的荷瘤鼠分为五组,每组六只。尾静脉分别注射PBS缓冲液、3-MA、CuPdTNP-1、CuPd TNP-1+3-MA、CuPd TNP-1+3-MA、CuPd TNP-2、CuPd TNP-2+3-MA;其中,各药物的注射量为:100μmol/kg 3-MA、1.5mg/kg CuPd TNP-1、1.5mg/kg CuPd TNP-2。在PBS缓冲液、3-MA、CuPd TNP-1、CuPd TNP-1+3-MA、CuPd TNP-2、CuPd TNP-2+3-MA组在注射后的24h后,使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下照射肿瘤处理3min。通过热成像仪记录照射过程中肿瘤部位的温度变化。如图29所示,CuPd TNP-2因为其更高的光热转换效率,肿瘤处升温更高。
实施例18、检测CuPd TNP-1在肿瘤处的热感图像
在雌性Balb/c小鼠(体重约20g)的第二个乳垫处注射100μL 4T1细胞(5×105),构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。
将荷瘤鼠分为五组,每组六只。尾静脉注射PBS缓冲液、CuPd TNP-1(1.5mg/kgCuPd TNP-1),注射后的24h后,使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下照射肿瘤处理3min。实时通过热成像仪记录照射过程中肿瘤部位的温度变化并拍摄。如图30所示,相对于阴性对照PBS缓冲液,TNP-1组的肿瘤部分在照射过程中温度持续升高。
实施例19、探究CuPd TNP在动物体内的药代动力学
Balb/c小鼠(体重约20g)分为两组,两组分别注射CuPd TNP-1(1.5mg/kg CuPdTNP-1)和CuPd TNP-2(1.5mg/kg CuPd TNP-2),不同时间(0、2、4、12、18h)点眼眶静脉丛取血,通过ICP检测血液中CuPd TNP-1和CuPd TNP-2的含量。如图31和表1,CuPd TNP-1与CuPdTNP-2在小鼠体内的药代动力学相似,没有明显差异。
表1 ICP检测血液中CuPd TNP-1和CuPd TNP-2的含量(平均值±标准偏差,n=5)
表中:ACU表示曲线面积、CMAX表示最大药物浓度、MRT表示平均滞留时间;所有药代动力学数据均通过DAS 3,0软件中的非房室模型计算得出。
实施例20、检测CuPd TNP对小鼠脏器的影响
Balb/c小鼠(体重约20g)分为两组,两组分别注射CuPd TNP-1(1.5mg/kg CuPdTNP-1)和CuPd TNP-2(1.5mg/kg CuPd TNP-2),阴性对照注射PBS缓冲液。24h后眼眶静脉丛取血,分离血清,检测血清中AST(谷草转氨酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、BUN(血尿素氮)、SCR(血清肌酐)的浓度。如图32所示,CuPd TNP-1与CuPd TNP-2不会对小鼠体内脏器造成明显影响。
Balb/c小鼠(体重约20g)分为两组,两组分别注射CuPd TNP-1和CuPd TNP-2,阴性对照注射PBS缓冲液。24h后牺牲小鼠取心脏、肝、脾、肺、肾和脑等器官,进行切片HE染色观察。如图33所示,CuPd TNP-1与CuPd TNP-2不会对小鼠体内脏器造成明显影响。
实施例21、检测CuPd TNP在动物体内肿瘤水平上的杀伤
(1)在雌性Balb/c小鼠(体重约20g)的第二个乳垫处注射100μl 4T1细胞(5×105),构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。将获得的4T1荷瘤鼠分为五组,每组六只。每组分别进行以下处理,PBS缓冲液+NIR激光处理、CQ+NIR激光处理、CuPdTNP-1+NIR激光处理、CuPd TNP-1+CQ+NIR激光处理、CuPd TNP-1+CQ、CuPd TNP-2+NIR激光处理、CuPd TNP-2+CQ+NIR激光处理;其中,用量为:100ul PBS、25mg/kg CQ、1.5mg/kg CuPdTNP-1、1.5mg/kg CuPd TNP-2)。第1天和第4天注射材料,24h后使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下照射肿瘤处理3min。治疗过程中记录小鼠体重图34及肿瘤体积变化图35。治疗15天结束后,牺牲小鼠剥取肿瘤拍照(图36)并进行称重(图37)。可以看到,CuPdTNP-1+CQ+NIR处理组的治疗效果最好。
(2)在雌性NOD/SCID小鼠(体重约20g,购自于北京维通利华)的左侧皮下分别注射100μl HeLa细胞(5×106)或者Atg5-/-HeLa细胞(ATG5敲除的Hela细胞,5×106),构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。将HeLa荷瘤鼠分为三组,每组四只,每组分别尾静脉注射PBS缓冲液、1.5mg/kg CuPd TNP-1、1.5mg/kg CuPd TNP-2。Atg5-/-HeLa荷瘤鼠进行同样的处理。第1天和第4天注射材料,24h后使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下照射肿瘤处理3min。治疗15天结束后,牺牲小鼠剥取肿瘤拍照(图38)并进行称重(图39)。结果显示,在Atg5-/-HeLa肿瘤组中,因为ATG5的敲除,自噬受到抑制。相对于WTHeLa肿瘤组(即PBS缓冲液处理组),CuPd TNP-1联合光照后治疗效果最好。
(3)在雌性NOD/SCID小鼠(体重约20g)的第二个乳垫处注射100μl MCF7-MDR细胞(5×106),构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。将荷瘤鼠分为六组,每组四只,每组分别尾静脉注射PBS缓冲液+NIR激光处理、CQ+NIR激光处理、CuPd TNP1+NIR激光处理、CuPd TNP1+CQ、CuPd TNP1+CQ+NIR激光处理、CuPd TNP1+Dox+NIR激光处理;其中,各药物的注射量为:25mg/kg CQ、15mg/kg Dox、1.5mg/kg CuPd TNP-1、1.5mg/kg CuPd TNP-2)。第1天和第4天注射材料,24h后光照组使用808-nm的NIR激光器,在功率1W/cm2的条件下照射肿瘤处理3min。治疗过程中记录小鼠体重(图40)及肿瘤体积变化(图41)。治疗15天结束后,牺牲小鼠剥取肿瘤拍照图42并进行称重图43。结果显示,TNP-1在耐药细胞MCF7中,相对于联合Dox(阿霉素),联合自噬抑制剂CQ后治疗效果更佳。
实施例22、检测CuPd TNP动物水平治疗后肿瘤组织的凋亡水平
在实施例21中4T1荷瘤鼠15天治疗后,将每组的肿瘤冰冻切片,利用凋亡试剂盒进行TUNEL染色。结果如图44,与治疗后的肿瘤称重结果相符,TNP-1+3-MA+NIR处理组肿瘤细胞的凋亡水平最高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种;
所述的自噬抑制剂为3-MA、Baf A1和氯喹中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的四角棒铜钯合金纳米颗粒通过如下方法制备得到:
将氯钯酸钠、氯化亚铜、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、癸胺和N,N-二甲基甲酰胺混合均匀后,在70~80℃的油浴锅中搅拌反应,待反应结束后,将其冷却至室温,离心,洗涤,得到四角棒铜钯合金纳米颗粒;
所述的氯钯酸钠、氯化亚铜、聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖的质量比为3.5~11.2:3.1~5.7:300:250。
4.根据权利要求3所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K30;
所述的N,N-二甲基甲酰胺的用量按每3.5mg氯钯酸钠配比5mL N,N-二甲基甲酰胺计算;
所述的癸胺和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50;
所述的搅拌反应的时间为2~6h;
所述的洗涤为采用乙醇和去离子水进行洗涤。
5.根据权利要求2所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的球型铜钯合金纳米颗粒通过如下方法制备得到:
将H2PdCl4、CuCl2·H2O和癸胺分散到水中,常温搅拌过夜,再加入葡萄糖,在100~110℃油浴锅中搅拌反应,待反应结束后,将其冷却至室温,离心,洗涤,得到球型铜钯合金纳米颗粒;所述的H2PdCl4、CuCl2·H2O和葡萄糖的摩尔比为3:3:14。
6.根据权利要求5所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的癸胺与水的体积比为2:45;
所述的搅拌反应的时间为2~6h;
所述的洗涤为采用乙醇和去离子水进行洗涤。
7.根据权利要求1~6任一项所述的铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂在制备基于光热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒中的应用,其特征在于:所述的肿瘤为乳腺癌或胃癌。
8.一种基于光热效应杀伤肿瘤的药物,其特征在于:包括铜钯合金纳米颗粒和自噬抑制剂;所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种;所述的自噬抑制剂为3-MA、Baf A1和氯喹中的至少一种。
9.铜钯合金纳米颗粒在制备光热治疗的纳米材料中的应用,其特征在于:所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
10.铜钯合金纳米颗粒在制备提高细胞内ROS水平的药物中的应用,其特征在于:所述的铜钯合金纳米颗粒为四角棒铜钯合金纳米颗粒和球型铜钯合金纳米颗粒中的至少一种。
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