CN106983863B - 一种碳酸钙包裹的金纳米棒、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。本发明提供的由聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐由静电吸附形成层层结构，由钙盐和碱金属碳酸盐形成的碳酸钙外层包裹在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒可以同时实现光声增强、光热治疗及超声治疗功能。本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒应用于光声增强还可以明显提高光声信号，同时应用于超声治疗具有较高的细胞的杀伤率，应用于光热和超声联合治疗具有较高的细胞的杀伤率。同时，制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒分散性能良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用新材料技术领域，尤其是涉及一种碳酸钙包裹的金纳米棒、其制备方法及应用。
背景技术
光热治疗(Photothermal Therapy,PTT)是指光热转换材料在激光照射下，由光能转换为热能，从而损伤、杀死肿瘤细胞，达到治疗癌症的目的。一般来说，近红外波长在600～1000nm之间，由于血液和组织在近红外光区域基本是透明的，正常组织几乎对近红外光没有吸收，因此对机体正常组织副作用较小。目前，文献报道有多种材料可用于光热治疗，如金纳米材料、硫化铜纳米粒、碳纳米材料和钯纳米片等。金纳米材料是一种常见的光热纳米材料(参见Wang H,Huff T,Zweifel D,et al.In vitro and in vivo two-photonluminescence imaging of single gold nanorods.Proc Natl Acad Sci,2005,102(44),15752-15756.)，主要包括金纳米壳、金纳米粒、金纳米笼和金纳米棒等纳米结构。金纳米材料主要是通过金的表面等离子体共振现象(Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR)，可以产生高效的光热转换效率。在这些金纳米材料中，金纳米壳和金纳米笼的形成相对复杂，涉及一个复杂的金包裹的过程。而金纳米棒由于其结构通有两个LSPR峰，其中包括横向峰，其位置与金纳米粒的峰位置相同，而纵向峰可以随着近纳米棒的纵横比大小而发生改变，其中，纵横比越大，峰位置越靠近近红外区，因此，可以调节纵横比实现近红外的吸收。另外，金纳米棒合成采用传统的晶种生长法，合成比较简便且可以大规模的合成。但残留的CTAB带来的毒性影响金纳米棒的临床应用(参见Connor E,Mwamuka J,Gole A,etal.Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acutecytotoxicity.Small,2005,1(3),325-327.)。光声成像主要利用光声效应，由短脉冲激光发射器发射的近红外光照射机体组织，机体组织在吸收近红外光后，局部升温后发生热弹性膨胀，然后挤压周围组织产生超声波作用，经超声探头采集超声波信息，最后利用数学算法重建图像。由于组织中的水分和血红蛋白等对近红外光的吸收和散射均较弱，因此近红外光能深入穿透皮下组织5cm左右。与光学成像和超声成像相比，兼具了光学成像和超声成像的优点，具有较高的分辨率和对比度，同时具有较高的成像深度(参见Ntziachristos V,Razansky D.Molecular imaging by means of multispectral optoacoustictomography(MSOT).Chem Rev,2010,110(5),2783-2794.)。金纳米棒由于其对光的吸收和散射能力强于有机染料，且稳定性较好，可以用于光声成像。现有的金纳米棒仅仅能实现光声成像功能，并且效果不佳；同时无法实现超声治疗。为实现较好的抗肿瘤效果，对肿瘤进行精准治疗是比较有效的治疗方法之一。精准治疗的前提需要进行精准诊断，在此基础上，具有较好的治疗效果。因此，需要开发良好的诊疗一体的、能够同时实现光声增强、光热治疗和超声治疗功能的抗肿瘤材料。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种碳酸钙包裹的金纳米棒，本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒可以同时实现光声增强、光热治疗及超声治疗功能。应用于光声增强可以明显提高光声信号，同时应用于超声治疗具有较高的细胞的杀伤率，应用于光热和超声联合治疗具有较高的细胞的杀伤率。
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。
优选的，所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐的摩尔比为1：(0.5～50)：(20～80)：(20:80)。
优选的，所述聚乙烯亚胺与金纳米棒的摩尔比为1：0.1～50；所述聚乙烯亚胺的分子量为600～30000Da。
优选的，所述聚乙二醇与聚氨基酸的摩尔比为(1～10):1；所述聚氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸的一种或几种。
优选的，所述聚乙二醇的分子量为600～30000Da；所述聚氨基酸的分子量为10000～60000Da。
优选的，所述钙盐为氯化钙；所述碱金属碳酸盐为碳酸钠。
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒的制备方法，包括：
A)聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚氨基酸混合，得到混合液；
B)将混合液依次与钙盐、碱金属碳酸盐混合，分散得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
优选的，所述碱金属碳酸盐的混合方式为滴加；所述滴加的速度为0.5～2mL/min。
本发明提供了一种上述技术方案所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备治疗剂中的应用，所述治疗剂包括光热治疗剂、超声治疗剂和光热超声联合治疗剂。
本发明提供了一种上述技术方案所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备成像剂中的应用，所述成像剂包括光声成像剂。
与现有技术相比，本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。本发明提供的由聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐由静电吸附形成层层结构，由钙盐和碱金属碳酸盐形成的碳酸钙外层包裹在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒可以同时实现光声增强、光热治疗及超声治疗功能。本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒应用于光声增强可以明显提高光声信号，同时应用于超声治疗具有较高的细胞的杀伤率，应用于光热和超声联合治疗具有较高的细胞的杀伤率。同时，本发明由于聚乙二醇修饰的聚氨基酸吸附在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，使得制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒分散性能良好。
附图说明
图1为本发明实施例20得到的碳酸钙包裹的金纳米棒的透射电镜图片；
图2为本发明实施例31中得到的碳酸钙包裹的金纳米棒，在不同pH下的光声成像效果图；
图3为本发明实施例31与比较例1得到的碳酸钙包裹的金纳米棒与未经包裹的金纳米棒的光声成像信号比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。
本发明制备的碳酸钙包裹的金纳米棒由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。其中，最内层结构为聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒，然后是静电吸附在所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外层的聚乙二醇修饰的聚氨基酸层；而后为由钙盐和碱金属碳酸盐制备得到的碳酸钙外层，上述特定的层层结构使得本发明制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒可以实现同时实现光声增强、光热治疗及超声治疗功能。同时，本发明由于聚乙二醇修饰的聚氨基酸吸附在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，使得制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒分散性能良好。
本发明首先制备聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
本发明对于所述金纳米棒的制备方法不进行限定，本领域技术人员熟知的方法即可；优选采用本领域技术人员熟知的晶种生长法制备，具体包括：采用氯金酸和HAuCl4和硼氢化钠配制金纳米种；而后采用硝酸银、氯金酸、盐酸、CTAB和抗坏血酸混合制备种子生长液；最后将金纳米种与种子生长液混和，得到金纳米棒。
具体操作过程如下：1)金纳米种的配制：室温搅拌条件下，将氯金酸(HAuCl4)溶液加入到CTAB溶液中。并快速加入0℃预冷的新配制的硼氢化钠(NaBH4)溶液，加速搅拌1min后停止搅拌，取出搅拌子，置于30℃的恒温油浴锅中，避光静置2h后，得到褐色澄清的金纳米种溶液。2)种子生长液的制备：在室温搅拌下，按照顺序依次将硝酸银(AgNO3)溶液；氯金酸(HAuCl4)溶液；盐酸(HCl)溶液加入到CTAB溶液中。2min后停止搅拌，取出搅拌子，然后快速加入新配制的抗坏血酸(AA)溶液，晃动摇匀，此时溶液由黄色迅速变为无色。抗坏血酸(AA)的作用是可以将氯金酸(HAuCl4)还原为金纳米粒子，得到的无色澄清的溶液即为种子生长液。3)将金纳米种与种子生长液混合：取一定量的金种溶液加入到配制好的种子生长液中，震荡摇匀，取出搅拌子，避光30℃的恒温油浴12h。将得到的溶液离心15min除去上清液中过量的CTAB，用MilliQ水分散，反复3次，最后将得到的金纳米棒分散于MilliQ水中，得到金纳米棒。
得到金纳米棒后，优选采用聚乙烯亚胺对制备得到的金纳米棒进行修饰。
本发明对于所述修饰的具体方法不进行限定，本领域技术人员熟知的即可；优选具体为：采用N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和聚乙烯亚胺同时与巯基丙酸(MPA)溶液混合，而后与金纳米棒混合避光搅拌反应，得到聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
具体操作过程如下：取巯基丙酸(MPA)加入一定量的MilliQ水中。按照摩尔比1：1取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)分别溶于MilliQ水中。取一定量的聚乙烯亚胺溶于MilliQ水中。将NHS，EDC，聚乙烯亚胺同时加入巯基丙酸(MPA)溶液中，在30℃恒温油浴下搅拌反应过夜。将得到的溶液加入配制好的金纳米棒，在30℃恒温油浴下搅拌避光反应24h。最后将得到的溶液离心10～15min,去掉上层溶液，并将沉淀用MilliQ水洗3遍，最后将沉淀分散于一定体积的MilliQ水中。得到聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
在本发明中，所述聚乙烯亚胺的分子量优选为1800～30000Da，更优选为1800～25000Da。
在本发明中，所述金纳米棒与聚乙烯亚胺摩尔比优选为1：(0.5～50)；更优选为1：0.5～20，最优选为1：0.5～10。
在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠、硝酸银、抗坏血酸、巯基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、碳酰二亚胺盐酸盐等药品来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的药品即可，均可采用市售药品。
本发明所述的聚乙二醇修饰的聚氨基酸中，所述聚氨基酸优选选自天冬氨酸和谷氨酸的一种或几种。
所述聚乙二醇修饰的聚氨基酸优选为接枝的方式制备，聚乙二醇的羟基接枝到聚氨基酸的羧基上，从而修饰得到聚乙二醇修饰的聚氨基酸。本发明对于所述具体的修饰方式不进行限定，本领域技术人员熟知的方式即可。
在本发明中，所述聚乙二醇与聚氨基酸的摩尔比优选为(1～10)：1；更优选为(3～10)：1，最优选为(3～9)：1；所述聚天冬氨酸分子量优选为20000～60000Da，更优选为25000～50000Da，所述聚谷氨酸分子量优选为20000～60000Da，更优选为25000～50000Da。所述聚乙二醇的分子量优选为600～30000Da；更优选为2000～10000Da。上述分子量均为数均分子量。
本发明所述钙盐优选为氯化钙；所述碱金属碳酸盐优选为碳酸钠。本发明对于上述组分的来源不进行限定，优选为市售。
在本发明中，所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐的摩尔比为1：(0.5～50)：(20～80)：(20:80)；更优选为1：(0.5～20)：(20～50)：(20～50)。
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒的制备方法，包括：
A)聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚氨基酸混合，得到混合液；
B)将混合液依次与钙盐、碱金属碳酸盐混合，分散得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒的制备方法首先将聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚氨基酸混合，得到混合液。
按照本发明，将一定量的分散于MillQ水中的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚天冬氨酸/或聚谷氨酸在水中混合，在室温下搅拌2～24h，优选为2～12h，更优选为2～6h。
本发明对于所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒以及聚乙二醇修饰的聚天冬氨酸/或聚谷氨酸的具体制备方法上述已经有清楚的描述，在此不再赘述。
得到混合液后，将混合液依次与钙盐、碱金属碳酸盐混合，分散得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
本发明对于所述钙盐和碱金属碳酸盐的具体组分上述已经有清楚的描述，在此不再赘述。
将混合液首先与钙盐混合，所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与可溶性钙盐的摩尔比优选为1：(0.5～50)，更优选为1：(0.5～20)。加入可溶性钙盐后，优选混合搅拌的时间2～12h，更优选为3～6h，最后优选为3h。
混合后，再与碱金属碳酸盐混合；本发明所述碱金属碳酸盐与氯化钙的摩尔比优选为1:1。
本发明所述碱金属碳酸盐的混合方式为滴加；优选为快速搅拌的情况下滴加；所述搅拌的速度优选为5000～16000rpm；所述滴加的速度优选为0.5～2mL/min；更优选为1～2mL/min；最优选为1～1.5mL/min。所述混合搅拌的时间优选为6～24h，更优选为6～12h，最后优选为12h。
本发明所述与碱金属碳酸盐的混合混合后优选经过离心、超声分散得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
所述离心速率优选为6000～8000rpm/min；所述离心的时间优选为5～10min。离心后，进行超声分散，所述超声分散时间优选为5min～15min，更优选为5min～10min，最优选为10min。所述超声功率优选为100～300w。
本发明提供了一种上述技术方案所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备治疗剂中的应用，所述治疗剂包括光热治疗剂、超声治疗剂和光热超声联合治疗剂。
本发明提供了一种上述技术方案所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备成像剂中的应用，所述成像剂包括光声成像剂。
本发明提供了一种碳酸钙包裹的金纳米棒，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到。本发明提供的由聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐由静电吸附形成层层结构，由钙盐和碱金属碳酸盐形成的碳酸钙外层包裹在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒可以实现同时实现光声增强、光热治疗及超声治疗功能。本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒应用于光声增强可以明显提高光声信号，同时应用于超声治疗具有较高的细胞的杀伤率，应用于光热和超声联合治疗具有较高的细胞的杀伤率。。同时，本发明由于聚乙二醇修饰的聚氨基酸吸附在聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外，使得制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒分散性能良好。
根据本发明，所述碳酸钙包裹的金纳米棒将应用于光声增强、光热治疗、超声治疗及光热和超声联合诊疗。本发明优选按照以下进行：
1)细胞培养：选用HeLa，MCF-7，HepG2，B16F10，4T1等细胞系，所述细胞培养方法按照本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。本发明中优选将细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，所述培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养。
2)光声成像：本发明所述光声成像实验采用假体来进行模拟老鼠体内实验，所述假体制备方法按照本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。采用琼脂和脂肪乳混合的方法来制备。配制不同pH值的碳酸钙包裹的金纳米棒，置于假体中，进行测试。测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。测试条件设定波长范围为700nm～800nm，优选为800nm，背景吸收设置为900nm。
3)光热治疗测试：本发明所述的光热治疗测试方法按照本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。光热治疗测试选用HeLa，MCF-7，HepG2，B16F10，4T1等细胞系。首先将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μl新培养液，将不同浓度材料分别加入到96孔板中。培养4h后，利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.0～3.0W/cm2)，每孔照射3～10min。照射完成后，继续培养24h，采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μl二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
4)超声治疗实验：超声治疗测试选用HeLa，MCF-7，HepG2，B16F10，4T1等细胞系。首先将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μl新培养液，将不同浓度材料分别加入到96孔板中。培养4h后，将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为3～10min。超声完成后，继续培养24h，采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μl二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
5)光热和超声联合治疗实验：光热和超声联合治疗测试选用HeLa，MCF-7，HepG2，B16F10，4T1等细胞系。首先将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μl新培养液，将不同浓度材料分别加入到96孔板中。培养4h后，先将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为3～10min。然后利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.0～3.0W/cm2)，每孔照射3～10min。超声和光热完成后，继续培养24h，采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米颗粒用于实现光声增强、光热治疗、超声治疗、光热和超声联合治疗等诊疗一体功能。结果表明，采用HeLa和B16F10细胞为例，经光热治疗后，碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达60％以上；经超声治疗后，细胞碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达20％以上；在同等条件下，经光热和超声联合治疗后，碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达80％以上。进一步地，将碳酸钙包裹的金纳米颗粒和未经包裹的金纳米颗粒(Au-PEI)在不同pH条件下进行光声成像实验，结果表明，不同条件下制备的碳酸钙包裹的金纳米颗粒在弱酸性条件下，均实现了光声信号增强，如在pH6.8条件下，碳酸钙包裹的金纳米颗粒比未经包裹的金纳米颗粒的光声信号提高了3～6倍，在pH5.0条件下，碳酸钙包裹的金纳米颗粒比未经包裹的金纳米颗粒的光声信号提高了4～10倍。光声信号的极大提高，为肿瘤精准定位提供了基础，在此指导下，可以对肿瘤进行精准的光热和超声治疗。
本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米颗粒可用于实现光声增强、光热治疗、超声治疗、光热和超声联合治疗等诊疗一体功能。首先，碳酸钙包裹的金纳米颗粒和未经包裹的金纳米颗粒在不同pH条件下进行光声成像实验结果表明，在弱酸性条件下，碳酸钙包裹的金纳米颗粒比未经包裹的金纳米颗粒的光声信号提高了3～10倍，说明光声信号的放大，奠定了肿瘤精准定位的基础，在此指导下，可以对肿瘤进行精准的光热和超声治疗。以HeLa细胞为例，经光热治疗后，碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达60％以上；经超声治疗后，细胞碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达20％以上；在同等条件下，经光热和超声联合治疗后，碳酸钙包裹的金纳米颗粒组细胞杀伤率达80％以上。说明碳酸钙包裹的金纳棒经光热和超声联合治疗后，比单一的光热治疗或单一的超声治疗，均显著增强了肿瘤细胞的抑制率。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的碳酸钙包裹的金纳米棒进行详细描述。
实施例1～18
碳酸钙包裹的金纳米颗粒的制备
首先，金纳米棒的制备同上所述，具体为：1)金纳米种的配制：室温搅拌条件下，将氯金酸(HAuCl4)溶液加入到CTAB溶液中。并快速加入0℃预冷的新配制的硼氢化钠(NaBH4)溶液，加速搅拌1min后停止搅拌，取出搅拌子，置于30℃的恒温油浴锅中，避光静置2h后，得到褐色澄清的金纳米种溶液。2)种子生长液的制备：在室温搅拌下，按照顺序依次将硝酸银(AgNO3)溶液；氯金酸(HAuCl4)溶液；盐酸(HCl)溶液加入到CTAB溶液中。2min后停止搅拌，取出搅拌子，然后快速加入新配制的抗坏血酸(AA)溶液，晃动摇匀，此时溶液由黄色迅速变为无色。抗坏血酸(AA)的作用是可以将氯金酸(HAuCl4)还原为金纳米粒子，得到的无色澄清的溶液即为种子生长液。3)将金纳米种与种子生长液混合：取一定量的金种溶液加入到配制好的种子生长液中，震荡摇匀，取出搅拌子，避光30℃的恒温油浴12h。将得到的溶液离心15min除去上清液中过量的CTAB，用MilliQ水分散，反复3次，最后将得到的金纳米棒分散于MilliQ水中，得到金纳米棒。
对金纳米棒进行修饰，取巯基丙酸(MPA)加入10mL MilliQ水中。按照摩尔比1:1取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶于5mL MilliQ水中。取聚乙烯亚胺溶于10mL MilliQ水中。将NHS、EDC、聚乙烯亚胺同时加入巯基丙酸(MPA)溶液中，在30℃恒温油浴下搅拌反应过夜。将得到的溶液加入配制好的金纳米棒，在30℃恒温油浴下搅拌避光反应24h。最后将得到的溶液6000rpm/min离心15min，去掉上层溶液，并将沉淀用MilliQ水洗3遍，最后将沉淀分散于10mL的MilliQ水中。得到聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
其中，巯基丙酸用量、聚乙烯亚胺的用量及分子量、金纳米棒的用量见表1。
表1实施例1～6不同原料的用量
取聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚谷氨酸在水中混合，在室温下搅拌6h，再加入0.33M氯化钙溶液，混合搅拌3h，然后缓慢滴加0.33M的碳酸钠溶液，碳酸钠滴加速度优选为1mL/min，混合搅拌12h。最后进行离心，离心速率8000rpm/min，离心的时间10min。离心后，进行超声分散，超声分散时间为10min。超声结束后，得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
其中，选择聚谷氨酸分子量27000Da，聚乙二醇与聚氨基酸的摩尔比3：1，氯化钙与碳酸钠的摩尔比为1：1；聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚谷氨酸、氯化钙与碳酸钠的摩尔比1：1：20：20。
实施例19～30
根据实施例11制备出的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒，与聚乙二醇修饰的聚谷氨酸在水中混合，在室温下搅拌6h，再加入0.33M氯化钙溶液，混合搅拌3h，然后缓慢滴加0.33M的碳酸钠溶液，碳酸钠滴加速度优选为1mL/min，混合搅拌12h。最后进行离心，离心速率8000rpm/min，离心的时间10min。离心后，进行超声分散，超声分散时间为10min。超声结束后，得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
其中，聚谷氨酸的分子量、聚乙二醇与聚氨基酸的摩尔比、聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚谷氨酸、氯化钙与碳酸钠的摩尔比见表2。
表2实施例18-30不同原料的用量
利用透射电镜对实施例20中得到碳酸钙包裹的金纳米棒进行分析，得到其透射电镜图片，如图1所示。图1为本发明实施例20得到的碳酸钙包裹的金纳米棒的透射电镜图片。采用比例尺对材料的横向平均长度和纵向平均长度进行测量，显示碳酸钙包裹的金纳米颗粒的纵向平均长度为148nm，横向平均长度为46nm。
比较例1
对实施例11得到的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒进行光声成像实验，采用琼脂和脂肪乳混合的方法来制备假体。配制不同pH值(pH＝5.0，6.8，7.4)的碳酸钙包裹的金纳米棒，置于假体中，进行测试。测试条件设定波长范围为800nm，背景吸收设置为900nm。
实施例31
对碳酸钙包裹的金纳米棒进行光声成像应用。
光声成像采用假体来进行模拟老鼠体内实验，采用琼脂和脂肪乳混合的方法来制备假体。配制不同pH值(pH＝5.0，6.8，7.4)的碳酸钙包裹的金纳米棒，置于假体中，进行测试。测试条件设定波长范围为800nm，背景吸收设置为900nm。在不同pH下，其测试结果见图2，随着pH的降低，光声信号增强。并对测试结果进行定量分析，与比较例1中相比(图3)，在pH值为7.4时，其光声信号值分别为2.12×103，2.02×103，实施例31与比较例1在pH值为7.4时，没有显著性差异。但当pH值为6.8时，实施例31和比较例1的光声信号分别为1.21×104和2.21×103，经碳酸钙包裹后，金纳米棒的光声信号增强了5倍。当pH值为5.0时，实施例31与比较例1相比，光声信号提高了8倍。结果表明，对金纳米棒表面修饰上碳酸钙纳米颗粒，显著增强光声成像效果。
实施例32
对碳酸钙包裹的金纳米棒进行光热治疗应用。
以HeLa细胞为例，采用实施例20制备的碳酸钙包裹的金纳米棒进行光声成像测试。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μl新培养液，将不同浓度碳酸钙包裹的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.5W/cm2)，每孔照射6min。照射完成后，继续培养24h。采用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
比较例2
以HeLa细胞为例，采用对实施例11得到的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μL新培养液，将不同浓度的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.5W/cm2)，每孔照射6min。照射完成后，继续培养24h。采用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
经光热治疗后，结果显示，碳酸钙包裹的金纳米棒经激光照射后，能显著抑制细胞存活率，且与浓度呈现依赖关系，其肿瘤细胞抑制率达60％以上。说明碳酸钙包裹的金纳棒有较好的光热治疗效果。与比较例2相比，与碳酸钙包裹的金纳米棒与未包裹的金纳米棒相比，其光热治疗效果基本一致，说明碳酸钙对金纳米棒包裹后，并不影响其光热效果。
实施例33
对碳酸钙包裹的金纳米棒进行超声治疗治疗应用。
以HeLa细胞为例，采用实施例20制备的碳酸钙包裹的金纳米棒进行光声成像测试。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μL新培养液，将不同浓度碳酸钙包裹的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为10min。超声完成后，继续培养24h。用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
比较例3
以HeLa细胞为例，采用对实施例11得到的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μL新培养液，将不同浓度聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为10min。超声完成后，继续培养24h。用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
经超声治疗后，结果显示，碳酸钙包裹的金纳米棒经超声后，能在一定程度上抑制细胞存活率，且与浓度呈现一定的依赖关系，其肿瘤细胞抑制率达20％以上。说明碳酸钙包裹的金纳棒可以起到超声治疗的效果。超声治疗的主要原理是碳酸钙包裹的金纳米棒在肿瘤组织微酸性的环境下，会发生化学反应，产生二氧化碳气体，生成的二氧化碳气体由小的气泡变成大气泡，经超声后，气泡会发生胀破，类似于“气体炸弹”，从而对肿瘤细胞起到杀伤作用。因此，与比较例3相比，未包裹碳酸钙的金纳米棒没有超声治疗效果。
实施例34
对碳酸钙包裹的金纳米棒进行光热和超声联合治疗应用。
以HeLa细胞为例，采用实施例20制备的碳酸钙包裹的金纳米棒进行光热和超声联合治疗。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μL新培养液，将不同浓度碳酸钙包裹的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，先将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为10min。然后利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.5W/cm2)，每孔照射6min。超声和光热完成后，继续培养24h，采用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
比较例4
以HeLa细胞为例，采用对实施例11得到的聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
首先HeLa细胞的培养，细胞在含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃含体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养。
将细胞按每孔1×104细胞的密度种植于96孔板中，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养过夜，小心吸去上清液，加入100μL新培养液，将不同浓度聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒材料分别加入到96孔板中。培养4h后，先将96孔板用保鲜膜包好置于超声波振荡器中，采用间歇式超声，超声3s，停止工作2s，超声时间为10min。然后利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，1.5W/cm2)，每孔照射6min。超声和光热完成后，继续培养24h，采用噻唑蓝比色法测定细胞存活率。每孔分别加入20μL噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。细胞继续在37℃培养4h，加入200μL二甲基亚砜溶解。用酶标仪在490nm处测试每孔的吸收，测试前需要震荡5min。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100
经光热和超声联合治疗后，结果显示，碳酸钙包裹的金纳米棒经光热和超声治疗后，能显著抑制细胞存活率，且与浓度呈现一定的依赖关系，其肿瘤细胞抑制率达80％以上。说明碳酸钙包裹的金纳棒经光热和超声联合治疗后，比单一的光热治疗或单一的超声治疗，均显著增强了肿瘤细胞的抑制率。但对于比较例4，其肿瘤抑制率与单一光热治疗的肿瘤抑制率差别不大。
以上实施例的说明只是用于帮助和理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种碳酸钙包裹的金纳米棒，其特征在于，由包括聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐制备得到；所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒、聚乙二醇修饰的聚氨基酸、钙盐和碱金属碳酸盐的摩尔比为1：(0.5～50)：(20～80)：(20:80)；
最内层结构为聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒，然后是静电吸附在所述聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒外层的聚乙二醇修饰的聚氨基酸层；而后为由钙盐和碱金属碳酸盐制备得到的碳酸钙外层。
2.根据权利要求1所述的金纳米棒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺与金纳米棒的摩尔比为1：0.1～50；所述聚乙烯亚胺的分子量为600～30000Da。
3.根据权利要求1所述的金纳米棒，其特征在于，所述聚乙二醇与聚氨基酸的摩尔比为(1～10):1；所述聚氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的金纳米棒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为600～30000Da；所述聚氨基酸的分子量为10000～60000Da。
5.根据权利要求1所述的金纳米棒，其特征在于，所述钙盐为氯化钙；所述碱金属碳酸盐为碳酸钠。
6.一种权利要求1～5任意一项所述的碳酸钙包裹的金纳米棒的制备方法，其特征在于，包括：
A)聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与聚乙二醇修饰的聚氨基酸混合，得到混合液；
B)将混合液依次与钙盐、碱金属碳酸盐混合，分散得到碳酸钙包裹的金纳米棒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碱金属碳酸盐的混合方式为滴加；所述滴加的速度为0.5～2mL/min。
8.一种权利要求1～5任意一项所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或权利要求6～7任意一项所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备治疗剂中的应用，所述治疗剂为光热治疗剂、超声治疗剂和光热超声联合治疗剂。
9.一种权利要求1～5任意一项所述的碳酸钙包裹的金纳米棒或权利要求6～7任意一项所述的制备方法制备得到的碳酸钙包裹的金纳米棒在制备成像剂中的应用，所述成像剂为光声成像剂。
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| CN201710378983.6A CN106983863B (zh) | 2017-05-25 | 2017-05-25 | 一种碳酸钙包裹的金纳米棒、其制备方法及应用 |
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| CN103239738A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-08-14 | 东华大学 | 一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法 |
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| CO2 bubbling-based ‘Nanobomb’ System for Targetedly Suppressing Panc-1 Pancreatic Tumor via Low Intensity Ultrasound-activated Inertial Cavitation;Kun Zhang et al.;《Theranostics》;20150912;第5卷(第11期);第1291-1302页 * |
| pH-Controlled Gas-Generating Mineralized Nanoparticles: A Theranostic Agent for Ultrasound Imaging and Therapy of Cancers;Kyung Hyun Min et al.;《ACSNANO》;20150105;第9卷(第1期);第134-145页 * |
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