CN108187046A - 一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用 - Google Patents
一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用，改性透明质酸遮蔽的金属有机框架由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。该改性透明质酸遮蔽的金属有机框架能够通过孔隙吸附作用与化学吸附作用担载姜黄素，得到的纳米颗粒能够同时实现光热治疗、药物治疗与光声成像的诊疗一体功能。纳米颗粒还具有较强的光声成像信号，同时应用于光热治疗具有较高的细胞杀伤率，应用于光热和药物联合治疗具有较高的细胞杀伤率。聚多巴胺改性的透明质酸遮蔽在金属有机框架表面，使制备的纳米粒子具有良好的分散性以及肿瘤细胞CD44受体靶向性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用新材料技术领域，尤其是涉及一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用。
背景技术
癌症是危害人类健康的重大疾病之一。在癌症治疗的多种手段中，药物治疗(化疗)是应用较为广泛的方法之一。姜黄素是一种疏水化疗药，对其研究较为深入。然而，作为一种疏水药，如何提高它的水溶性以及体内循环能力至关重要。一般情况下，选择纳米载体将其运送至肿瘤位置并促进其被肿瘤细胞内吞，参见Zheng M,Liu S,Guan XG,et al.One-step synthesis of nanoscale zeolitic imidazolate frameworks with highcurcumin loading for treatment of cervical cancer,ACS Appl Mater Inter,2015,7,22181～22187。
肿瘤细胞表面大多过表达各种特异性受体，比如HeLa细胞和B16F10细胞表面的CD44受体，KB细胞表面的叶酸受体，HepG2细胞表面的半乳糖受体。透明质酸是一种生物相容性良好的天然多糖，很多研究表明：透明质酸对CD44 受体具有特异性靶向能力，参见Chen S,Rong L,Lei Q,et al.A surface charge-switchable and folate modifiedsystem for codelivery of proapoptosis peptide and p53plasmid in cancertherapy.Biomaterials,77,149～163。
精准的癌症诊断是癌症治疗的前提，精准的癌症诊断需要纳米诊断剂对肿瘤细胞的特异性识别。因此，需要开发一种能够肿瘤特异性识别的、同时具有诊断与治疗功能的肿瘤靶向性纳米诊疗试剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用，该改性透明质酸遮蔽的金属有机框架能够担载姜黄素，同时实现光热治疗、药物治疗以及光声成像。
本发明提供了一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
优选地，所述微波反应的温度为90～150℃；微波反应的时间为2～10min。
优选地，所述六水合三氯化铁和均苯三酸的质量比为0.5～10:0.1～2。
优选地，所述聚多巴胺改性的透明质酸由以下方法制得：
将氧化透明质酸与盐酸多巴胺在碱性条件下反应制得；
氧化透明质酸与盐酸多巴胺的质量比为0.1～5：1～10；反应的时间为 6～48h，反应的pH值为8～10。
优选地，所述氧化透明质酸由以下方法制得：
透明质酸与高碘酸钠氧化反应，得到氧化透明质酸；
透明质酸与高碘酸钠的质量比为0.1～5：0.13～0.52；氧化反应的温度为 20～45℃；氧化反应的时间为6～48h。
本发明提供了一种纳米粒子，由上述技术方案所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素制得。
优选地，所述聚多巴胺改性的透明质酸、金属有机框架和姜黄素的质量比为0.5～4:0.1～2:0.1～2。
本发明提供了一种上述技术方案所述纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将聚多巴胺改性的透明质酸和担载姜黄素的金属有机框架混合孵育，得到纳米粒子；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
优选地，所述担载姜黄素的金属有机框架由以下方法制得：
将金属有机框架和姜黄素在溶剂中进行担载，孵育，得到担载姜黄素的金属有机框架；
所述孵育的温度为25～40℃；孵育的时间为12～48h。
本发明提供了一种上述技术方案所述的纳米粒子或上述技术方案所述的制备方法制备的纳米粒子在制备光热治疗剂、药物治疗剂、光热药物联合治疗剂和光声成像剂中的应用。
本发明提供了一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。该改性透明质酸遮蔽的金属有机框架能够通过孔隙吸附作用与化学吸附作用担载姜黄素，得到的纳米颗粒能够同时实现光热治疗、药物治疗与光声成像的诊疗一体功能。纳米颗粒还具有较强的光声成像信号，同时应用于光热治疗具有较高的细胞杀伤率，应用于光热和药物联合治疗具有较高的细胞杀伤率。聚多巴胺改性的透明质酸遮蔽在金属有机框架表面，使制备的纳米粒子具有良好的分散性以及肿瘤细胞CD44受体靶向性。实验结果表明：以HeLa细胞为例，经光热治疗后，24h后细胞的存活率为30％～50％。经药物治疗后，24h后细胞的存活率为50％～60％；在同等条件下，经光热和药物联合治疗后，24h后的细胞存活率为10％～30％。
附图说明
图1为发明实施例5、实施例6、实施例7和实施例8制备的MIL-100的水合粒径测试结果；
图2为本发明实施例49、实施例50、实施例51和实施例52制备的纳米粒子的水合粒径测试结果；
图3为图3为本发明实施例50制备的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的透射电镜图；
图4为本发明实施例49在荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠体内24h的光声成像图；
图5为本发明实施例50在荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠体内24h的光声成像图；
图6为本发明实施例52在荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠体内24h的光声成像图；
图7为本发明提供的实施例49、实施例50及实施例52在荷瘤(HeLa) 裸鼠体内肿瘤部位的光声信号强度图；
图8为本发明实施例58中改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的纳米粒子的药物、光热、光热药物联合作用的细胞存活率测试结果；
图9为本发明实施例59对HeLa细胞光热治疗、药物治疗以及光热/药物联合治疗的细胞毒性测试结果；
图10为本发明实施例60对HeLa细胞光热治疗、药物治疗以及光热/药物联合治疗的细胞毒性测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
本发明提供的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架能够担载姜黄素，金属有机框架具有致密的孔隙，能够用于疏水药物姜黄素的担载，姜黄素以分子间相互作用担载在金属有机框架的孔隙中；由于聚多巴胺对纳米粒子的化学吸附作用，聚多巴胺改性的透明质酸遮蔽在担载姜黄素的金属有机框架纳米颗粒表面，使得到的纳米粒子能够同时实现光热治疗、药物治疗以及光声成像。本发明由于改性透明质酸遮蔽在纳米粒子的表面，使得纳米粒子具有良好的分散性与肿瘤表面CD44受体靶向性。
本发明提供的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得。
在本发明中，所述聚多巴胺改性的透明质酸优选为聚合改性的方式制备，多巴胺在碱性条件下发生聚合，聚多巴胺结构中的氨基(或亚氨基)与氧化透明质酸中的醛基进行反应，得到聚多巴胺改性的透明质酸。本发明对于所述具体的修饰方式不进行限定，本领域技术人员熟知的方式即可。
在本发明中，所述聚多巴胺改性的透明质酸优选由以下方法制得：
将氧化透明质酸与盐酸多巴胺在碱性条件下反应制得。
所述氧化透明质酸优选由以下方法制得：
透明质酸与高碘酸钠氧化反应，得到氧化透明质酸。
在本发明中，透明质酸与高碘酸钠的质量比优选为0.1～5：0.13～0.52，更优选为1：0.13～0.26，最优选为1:0.13；氧化反应的温度优选为20～45℃；氧化反应的时间优选为6～48h，更优选为12～24h，最优选为24h。
在本发明中，所述氧化透明质酸与盐酸多巴胺的质量比优选为0.1～5： 1～10；更优选为1：2～5，最优选为1：5。反应的时间优选为6～48h，，更优选为12～24h，最优选为24h。反应的pH值优选为8～10。
在本发明具体实施例中，聚多巴胺改性的透明质酸具体包括以下步骤：
A)制备氧化透明质酸：称取1g的透明质酸溶解在200mL一次水中，称取0.13g的高碘酸钠溶解在50mL一次水中，混合，室温反应24h，透析，冻干，得到氧化透明质酸；B)制备聚多巴胺改性的透明质酸：称取制备得到的氧化透明质酸30mg，溶解在20mL一次水中，称取150mL多巴胺盐酸盐溶解在一次水中，用0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节多巴胺盐酸盐的pH值至 8，将其与氧化透明质酸溶液迅速混合，搅拌反应24h，透析，冻干，得到聚多巴胺改性的透明质酸。
本发明对所述透明质酸、高碘酸钠、盐酸多巴胺的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的透明质酸、高碘酸钠、盐酸多巴胺即可，如均可采用其市售药品。
在本发明中，所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。本发明中将金属有机框架记为MIL-100。
本发明优选将六水合三氯化铁和均苯三酸加入到DMF中溶解，得到反应液；将所述反应液微波反应，得到的反应产物，冷却，离心，弃去上清液，沉淀物进行洗涤，得到金属有机框架。
在本发明种，所述六水合三氯化铁与均苯三酸质量比优选为0.5～10：1，更优选为2～10：1，最优选为5：1。在本发明中，所述微波反应温度优选为 90～150℃，更优选为110～130℃，最优选为130℃。本发明优选将反应产物冷却至室温；冷却后的反应产物的离心的转速优选为5000～12000rpm，更优选为8000～10000rpm，最优选为10000rpm；冷却后的反应产物的离心的时间优选为5～30min，更优选为10～20min，最优选为20min。本发明优选将沉淀物采用无水DMF洗涤两遍，一次水洗涤一遍。洗涤后优选进行一次水分散，再冻干，得到金属有机框架。
本发明提供了一种纳米粒子，由上述技术方案所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素制得。
在本发明中，所述聚多巴胺改性的透明质酸、金属有机框架和姜黄素的质量比优选为0.5～4:0.1～2:0.1～2，更优选为(0.5～2)：1：(0.125～1)，最优选为1：1：0.5。
本发明提供了一种上述技术方案所述纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将聚多巴胺改性的透明质酸和担载姜黄素的金属有机框架混合孵育，得到纳米粒子；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
本发明首先制备金属有机框架MIL-100，通过其孔隙对姜黄素进行担载；再通过聚合改性的方法得到聚多巴胺改性的透明质酸；最后通过化学吸附的方法得到纳米粒子。
在本发明中，所述担载姜黄素的金属有机框架优选由以下方法制得：
将金属有机框架和姜黄素在溶剂中进行担载，孵育，得到担载姜黄素的金属有机框架。
本发明优选将金属有机框架水溶液和姜黄素乙醇溶液混合，孵育，得到担载姜黄素的金属有机框架。
所述金属有机框架水溶液中的水和姜黄素乙醇溶液中的乙醇的体积比优选为1:1～1:5。在本发明中，所述金属有机框架和姜黄素质量比优选为1：0.1～2，更优选为1：0.125～1，最优选为1:0.5；所述孵育的温度优选为25～40℃；孵育的时间优选为12～48h，更优选为6～24h，最优选为12h。
孵育结束后，本发明将孵育产物离心，弃去上清液，沉淀物无水乙醇洗涤，一次水分散，冻干，得到担载姜黄素的金属有机框架。本发明优选采用离心的方式将未被担载的姜黄素除去。孵育产物离心的转速为 5000～12000rpm，更优选为8000～10000rpm，最优选为10000rpm；孵育产物离心的时间优选为5～30min，更优选为10～20min，最优选为20min。
在本发明具体实施例中，所述担载姜黄素的金属有机框架的制备过程包括以下步骤：
取10mgMIL-100超声分散在适量的一次水中，10mg姜黄素溶解在适量的无水乙醇中，二者完全混合均匀，37℃中孵育12h后，离心，弃去上清液，无水乙醇洗涤，一次水分散，冻干，得到担载姜黄素的金属有机框架。
担载姜黄素的金属有机框架后，本发明将聚多巴胺改性的透明质酸和担载姜黄素的金属有机框架混合孵育，得到纳米粒子。
本发明通过化学吸附的方法得到纳米粒子。在本发明中，所述聚多巴胺改性的透明质酸和担载姜黄素的金属有机框架混合孵育的时间优选为 5～60min，更优选为20～60min，最优选为30min。
本发明提供了一种上述技术方案所述的纳米粒子或上述技术方案所述制备方法制备的纳米粒子在制备光热治疗剂、药物治疗剂、光热药物联合治疗剂和光声成像剂中的应用。
根据本发明，所述改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载化疗药姜黄素，即纳米粒子将用于光声成像、光热治疗、药物治疗及光热与药物联合治疗。本发明优选按照以下进行：
A)细胞培养：选用HeLa，B16F10，CT26，HepG2，L929，MRC-5， CHO等细胞系，所述细胞培养方法按照本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。本发明中优选将细胞在37℃含有5％(v/v)的CO2的培养箱中培养，所用培养基优选为含有10％灭火胎牛血清的DMEM高糖培养基。
B)光声成像：本发明所述的光声成像以荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠作为模型进行测试。HeLa细胞以300万每只接种在裸鼠的右后腿上，待肿瘤长大到直径约为1cm时，尾静脉注射实施例50制备的纳米颗粒。24h后，对裸鼠进行光声成像。测试方法选用本技术领域人员熟知的方法即可，并无特殊限制。测试条件：设定波长范围为600～900nm，优选为850nm，背景吸收设置为900nm。
C)光热治疗测试：本发明所述的光热治疗测试按照本技术领域人员熟知的方法即可，并无特殊限制。光热治疗选用HeLa，B16F10，MRC-5，CHO 等细胞系进行实验。首先，细胞以1×104的密度接种于96孔板中，每孔添加 200μL的培养液(含有10％灭活胎牛血清的DMEM高糖培养液)。将96孔板置于37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24h。给细胞更换新鲜的培养液，每孔200μL。向孔中加入不同浓度的材料(比较例制备的纳米粒子)，在 37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养2h。利用红外半导体激光器 (MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，0.5～3W/cm2)3～10min。继续将 96孔板中的细胞在37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24～48h。细胞存活率采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法进行测定。先弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入新鲜培养液。向各个孔中加入20μL5mg/mL 的MTT溶液，培养箱中孵育4h后弃去孔中液体，向各个孔中加入150μL DMSO。用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，测定前需要震荡5min。细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100％
(D)药物治疗测试：本发明所述的光热治疗测试按照本技术领域人员熟知的方法即可，并无特殊限制。光热治疗选用HeLa，B16F10，MRC-5，CHO 等细胞系进行实验。首先，细胞以1×104的密度接种于96孔板中，每孔添加 200μL的培养液(含有10％灭活胎牛血清的DMEM高糖培养液)。将96孔板置于37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24h。给细胞更换新鲜的培养液，每孔200μL。向孔中加入不同浓度的材料，在37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24～72h。细胞存活率采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法进行测定。先弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入新鲜培养液。向各个孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，培养箱中孵育4h后弃去孔中液体，向各个孔中加入150μL DMSO。用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，测定前需要震荡5min。细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100％
(E)光热药物联合治疗测试：本发明所述的光热治疗测试按照本技术领域人员熟知的方法即可，并无特殊限制。光热治疗选用HeLa，B16F10，MRC-5， CHO等细胞系进行实验。首先，细胞以1×104的密度接种于96孔板中，每孔添加200μL的培养液(含有10％灭活胎牛血清的DMEM高糖培养液)。将96 孔板置于37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24h。给细胞更换新鲜的培养液，每孔200μL。向孔中加入不同浓度的材料，在37℃含有5％(v/v) CO2的培养箱中培养2h。利用红外半导体激光器(MXL-III-880)分别照射细胞(808nm，0.5～3W/cm2)3～10min。继续将96孔板中的细胞在37℃含有5％(v/v)CO2的培养箱中培养24～72h。细胞存活率采用本领域技术人员熟知的噻唑蓝比色法进行测定。先弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入新鲜培养液。向各个孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，培养箱中孵育4h后弃去孔中液体，向各个孔中加入150μL DMSO。用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，测定前需要震荡5min。细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100％。
结果表明：本发明提供的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载药物姜黄素，即纳米粒子可实现光声成像、光热治疗、药物治疗、光热和药物联合治疗一体功能。结果表明，以HeLa细胞为例，经光热治疗后，24h后细胞的存活率为30％～50％。经药物治疗后，24h后细胞的存活率为50％～60％。在同等条件下，经光热和药物联合治疗后，24h后的细胞存活率为10％～30％。进一步地，将改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素用于光声成像实验，结果表明，该纳米粒子具有较强的体内光声成像能力。该结果表明，改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素可实现光声成像指导的光热药物联合治疗。并且，相比于光热治疗或药物治疗这种单一的治疗方法，光热与药物联合治疗具有更强的细胞杀伤能力，能够更好的抑制肿瘤细胞的生长。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架、纳米粒子、纳米粒子的制备方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1～24
改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的纳米粒子的制备：
MIL-100的制备：配制反应液：室温搅拌条件下，将六水合三氯化铁和均苯三酸加入到DMF溶剂中，固定均苯三酸的浓度为20mg/mL，根据表1 调节六水合三氯化铁的浓度，搅拌溶解；2)微波反应：取适量反应液至微波反应管中，一定温度下微波反应5min；3)反应液冷却至室温，高速离心20min，弃去上清液，DMF洗涤两遍，一次水洗涤一遍，一次水分散，冻干，得到 MIL-100。
其中，六水合三氯化铁、均苯三酸用量、反应的温度与溶剂的选择见表1，表1为实施例1～24不同原料的用量与实验条件：
表1实施例1～24不同原料的用量与实验条件
本发明对实施例1～24制备的MIL-100进行粒径和TEM测试，对其粒径及粒子形态进行对比。经过优选，实施例7制备的MIL-100纳米粒子大小约为80nm，其水合粒径约为190nm。图1为本发明实施例5、实施例6、实施例7和实施例8制备的MIL-100的水合粒径测试结果。
实施例25～36：担载化疗药的MIL-100的制备：
采用实施例7制备的MIL-100对化疗药物进行担载，取MIL-100超声分散在适量的一次水中，浓度为1mg/mL，化疗药物溶解在适量的无水乙醇中，根据表2中的质量比调节化疗药的浓度。将二者完全混合均匀，37℃中孵育 12h后，离心，弃去上清液，无水乙醇洗涤，一次水分散，冻干，得到担载化疗药的MIL-100。
化疗药物在阿霉素盐酸盐、姜黄素、紫杉醇等进行优选。
其中，所选用药物的种类、MIL-100与药物的质量比的选择见表2：
表2实施例25～36载药过程中药物的种类及质量比
| 实施例 | 药物种类 | MIL-100与药物的质量比 |
| 25 | 阿霉素盐酸盐 | 1/0.25 |
| 26 | 阿霉素盐酸盐 | 1/0.5 |
| 27 | 阿霉素盐酸盐 | 1/1 |
| 28 | 阿霉素盐酸盐 | 1/2 |
| 29 | 姜黄素 | 1/0.25 |
| 30 | 姜黄素 | 1/0.5 |
| 31 | 姜黄素 | 1/1 |
| 32 | 姜黄素 | 1/2 |
| 33 | 紫杉醇 | 1/0.25 |
| 34 | 紫杉醇 | 1/0.5 |
| 35 | 紫杉醇 | 1/1 |
| 36 | 紫杉醇 | 1/2 |
对所制得的担载化疗药的MIL-100的载药量与载药效率进行测试并比较。经过优选，实施例30制备的纳米粒子载药量约为35％，载药效率为90％。
实施例37～48：聚多巴胺改性的透明质酸的制备
A)制备氧化透明质酸：称取1g的透明质酸钠溶解在200mL一次水中，根据表3，称取不同质量的高碘酸钠溶解在50mL一次水中，混合，室温反应 24h，透析，冻干；B)制备聚多巴胺改性的透明质酸：称取制备得到的氧化透明质酸30mg，溶解在20mL一次水中，称取150mL多巴胺盐酸盐溶解在一次水中，用0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节多巴胺盐酸盐的pH值至8，将其与氧化透明质酸溶液迅速混合，搅拌反应24h，透析，冻干，得到聚多巴胺改性的透明质酸。
其中透明质酸钠的分子量为40kDa。透明质酸钠与高碘酸钠的质量比，透明质酸钠与多巴胺盐酸盐的质量比的选择见表3：
表3实施例37～48透明质酸钠与高碘酸钠的质量比及透明质酸钠与多巴胺盐酸盐的质量比
实施例49～56：
将实施例43制备的聚多巴胺改性的透明质酸与实施例30制备的担载了姜黄素的MIL-100在室温下孵育不同时间，得到改性透明质酸遮蔽的担载了姜黄素的金属有机框架，即纳米粒子。
其中，聚多巴胺改性的透明质酸与担载了姜黄素的MIL-100的质量比与孵育时间如表4：
表4实施例49～56聚多巴胺改性的透明质酸与担载了姜黄素的MIL-100的质量比
参见图2，图2为本发明实施例49、实施例50、实施例51和实施例52 制备的纳米粒子的水合粒径测试结果；图2看出：实施例50中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素后的水合粒径为180nm。
本发明利用透射电镜对实施例50中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行分析，得到其透射电镜图片，如图3所示，图3为本发明实施例50制备的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的透射电镜图，图3表明：本发明实施例50制备的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的直径大小约为60nm。
比较例1～3：
采用实施例7制备的MIL-100与实施例43制备的聚多巴胺改性的透明质酸在室温下以不同的比例孵育，得到不担载姜黄素的纳米粒子(聚多巴胺改性的透明质酸遮蔽的金属有机框架)，即为比较例1、2、3。
表5比较例1～3聚多巴胺改性的透明质酸与MIL-100的质量比
实施例57
对改性透明质酸遮蔽的金属有机框架进行的光声成像应用
本发明所述光声成像实验采用荷瘤裸鼠进行实验。本发明所述的光声成像以荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠作为模型进行测试。HeLa细胞以300万每只接种在裸鼠的右后腿上，待肿瘤长大到直径约为1cm时，分别尾静脉注射实施例49、实施例50和实施例52制备的纳米粒子，24h后，对裸鼠进行光声成像。测试方法选用本技术领域人员熟知的方法即可，并无特殊限制。测试条件：设定波长范围为600～900nm，优选为850nm，背景吸收设置为900nm。测试结果见图4、图5和图6，图4为本发明实施例49在荷瘤(HeLa肿瘤) 裸鼠体内24h的光声成像图，图5为本发明实施例50在荷瘤(HeLa肿瘤) 裸鼠体内24h的光声成像图，本发明实施例52在荷瘤(HeLa肿瘤)裸鼠体内24h的光声成像图；图4、图5和图6均表明：本发明制备的纳米粒子具有体内光声成像能力。图7为本发明提供的实施例49、实施例50及实施例 52在荷瘤(HeLa)裸鼠体内肿瘤部位的光声信号强度图。图7表明：本发明制备的纳米粒子具有体内光声成像能力。
实施例58
以HeLa细胞为例，以实施例49中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热与药物联合治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热药物联合治疗测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以比较例1中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以实施例49中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行药物治疗测试。测试方法与上述技术方案所述药物测试方法一致。
参见图8，图8为本发明实施例58中改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素的纳米粒子的药物、光热、光热药物联合作用的细胞存活率测试结果，其中，低浓度为实施例58的浓度160μg/mL，比较例1的浓度120μg/mL；高浓度为实施例58的浓度320μg/mL，比较例1的浓度240μg/mL。图8表明：与单独的光热治疗或单独的药物治疗相比，光热与药物的联合治疗显示更高的细胞杀伤能力，治疗24h后，细胞存活率低至20％～40％，且随着实验浓度的增加，细胞存活率进一步降低，说明了光热/药物联合治疗显示了较好的治疗能力。
实施例59
以HeLa细胞为例，以实施例50中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热与药物联合治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热药物联合治疗测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以比较例2中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热治疗测试。测试方法与上述技术方案所述药物测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以实施例50中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行药物治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热测试方法一致。其中，低浓度为实施例59的浓度200μg/mL，比较例2的浓度 160μg/mL；高浓度为实施例59的浓度400μg/mL，比较例2的浓度320μg/mL。
测试结果见图9，图9为本发明实施例59对HeLa细胞光热治疗、药物治疗以及光热/药物联合治疗的细胞毒性测试结果，图9表明：与单独的光热治疗或单独的药物治疗相比，光热与药物联合治疗显示更高的细胞杀伤能力，治疗24h后细胞存活率降低至10％～30％，低于单独的光热治疗或单独的药物治疗的细胞存活率。该结果说明纳米颗粒具有光热药物联合治疗效果，并且随着浓度增加，治疗效果增强。
实施例60
以HeLa细胞为例，以实施例52中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热与药物联合治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热药物联合治疗测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以比较例3中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行光热治疗测试。测试方法与上述技术方案所述光热测试方法一致。
以HeLa细胞为例，以实施例52中得到的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素进行药物治疗测试。测试方法与上述技术方案所述药物测试方法一致。
测试结果见图10，图10为本发明实施例60对HeLa细胞光热治疗、药物治疗以及光热/药物联合治疗的细胞毒性测试结果，其中，低浓度为实施例 60的浓度440μg/mL，比较例3的浓度400μg/mL；高浓度为实施例60的浓度 880μg/mL，比较例3的浓度800μg/mL。图10表明：与单独的光热治疗或单独的药物治疗相比，光热与药物的联合治疗显示更高的细胞杀伤能力，治疗 24h后，细胞存活率低至10％～20％，且随着实验浓度的增加，细胞存活率进一步降低，并且材料的光热/药物联合治疗细胞毒性强于实施例58及实施例 59，具有较好的联合治疗能力。
由以上实施例可知，本发明提供了一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。该改性透明质酸遮蔽的金属有机框架能够担载姜黄素，通过孔隙吸附作用与化学吸附作用得到的纳米颗粒，能够同时实现光热治疗、药物治疗与光声成像的诊疗一体功能。纳米颗粒还具有较强的光声成像信号，同时应用于光热治疗具有较高的细胞杀伤率，应用于光热和药物联合治疗具有较高的细胞杀伤率。聚多巴胺改性的透明质酸遮蔽在金属有机框架表面，使制备的纳米粒子具有良好的分散性以及肿瘤细胞CD44受体靶向性。实验结果表明：以HeLa细胞为例，经光热治疗后，24h 后细胞的存活率为30％～50％。经药物治疗后，24h后细胞的存活率为 50％～60％；在同等条件下，经光热和药物联合治疗后，24h后的细胞存活率为10％～30％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，由聚多巴胺改性的透明质酸和金属有机框架制得；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
2.根据权利要求1所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，其特征在于，所述微波反应的温度为90～150℃；微波反应的时间为2～10min。
3.根据权利要求1所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，其特征在于，所述六水合三氯化铁和均苯三酸的质量比为0.5～10:0.1～2。
4.根据权利要求1所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，其特征在于，所述聚多巴胺改性的透明质酸由以下方法制得：
将氧化透明质酸与盐酸多巴胺在碱性条件下反应制得；
氧化透明质酸与盐酸多巴胺的质量比为0.1～5：1～10；反应的时间为6～48h，反应的pH值为8～10。
5.根据权利要求4所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架，其特征在于，所述氧化透明质酸由以下方法制得：
透明质酸与高碘酸钠氧化反应，得到氧化透明质酸；
透明质酸与高碘酸钠的质量比为0.1～5：0.13～0.52；氧化反应的温度为20～45℃；氧化反应的时间为6～48h。
6.一种纳米粒子，由权利要求1～5任意一项所述的改性透明质酸遮蔽的金属有机框架担载姜黄素制得。
7.根据权利要求6所述的纳米粒子，其特征在于，所述聚多巴胺改性的透明质酸、金属有机框架和姜黄素的质量比为0.5～4:0.1～2:0.1～2。
8.一种权利要求6所述纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将聚多巴胺改性的透明质酸和担载姜黄素的金属有机框架混合孵育，得到纳米粒子；
所述金属有机框架由六水合三氯化铁和均苯三酸微波反应制得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述担载姜黄素的金属有机框架由以下方法制得：
将金属有机框架和姜黄素在溶剂中进行担载，孵育，得到担载姜黄素的金属有机框架；
所述孵育的温度为25～40℃；孵育的时间为12～48h。
10.一种权利要求6～7任意一项所述的纳米粒子或权利要求8～9任意一项所述的制备方法制备的纳米粒子在制备光热治疗剂、药物治疗剂、光热药物联合治疗剂和光声成像剂中的应用。
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