CN104758931A

CN104758931A - 一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104758931A
Application number: CN201510116085.4A
Authority: CN
Inventors: 祝侠丽; 张英杰; 黄河清; 侯琳; 张慧娟; 张振中
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: CN104758931B

Abstract

本发明涉及基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法及其应用，有效解决功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备以及作为热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用，方法是，由负载药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶混合制成，负载抗肿瘤药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶的体积比为1-3:1，在原始的氧化石墨烯表面连接上反应活性较强的水溶性大分子壳聚糖，形成水溶性功能化载体，该载体与壳聚糖温敏水凝胶混合，制备成功能化氧化石墨烯温敏水凝胶，本发明原料丰富，成本低，效果好，使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高，是制备治疗肿瘤药物上的创新。

Description

一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域,特别是一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，恶性肿瘤严重威胁人类生命和健康，其治疗一直是人类关注的焦点。随着新型抗肿瘤药物的不断涌现，化疗显示出独特的优势和广阔的发展前景。但抗肿瘤药物并不是选择性地作用于肿瘤细胞，而是同时作用于正常细胞，特别是生长旺盛的细胞如骨髓和上皮组织等。泊洛沙姆原位凝胶作为一种智能化温敏给药系统，毒性低,刺激性小,生物相容性好；可提高药物生物利用度和治疗效果，并可降低药物的毒副作用。

温敏水凝胶是智能水凝胶的一种，它能够感知周围环境温度的变化并作出响应，主要表现为体积的变化。在用于药物缓控释中时可以通过改变温敏水凝胶的温度而使其产生相应的体积变化进而可以控制药物释放使药物按照患者病情需要进行脉冲式释放。而功能化纳米材料的发展则为在体外控制温敏水凝胶的温度提供了可行的方法。氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)具有单原子层结构，其比表面积很大，两个基面都可通过较高的物理吸附作用与芳香环类药物非共价结合，递送一些难溶性药物，因此非常适合用作药物载体。此外，氧化石墨烯在近红外处有较强的光吸收效果，可用于肿瘤的热疗。尽管氧化石墨烯易溶于水，但是它在生理盐水中由于电荷屏蔽效应的存在易团聚。众所周知，纳米材料的表面化学是改善纳米材料的生物相容性以及控制其在生物系统中行为的关键因素。壳聚糖(Chitosan,CS)是一种生物相容性较好的水溶性高分子材料，带有较强的正电荷，对细胞膜具有较强的吸附能力，因此被广泛应用于基因药物和化学药物转运系统。

目前，将功能化氧化石墨烯表面接枝一种天然高分子化合物-壳聚糖，并制备成一种温敏水凝胶，以及其作为功能化热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用还未见有报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法及其应用，可有效解决功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备以及作为热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用。

本发明解决的技术方案是：

该基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶是由负载药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶混合制成，负载抗肿瘤药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶的体积比为1-3:1，也就是说，本发明所称的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶是一种功能化氧化石墨烯-壳聚糖聚合物，它是在原始的氧化石墨烯表面连接上反应活性较强的水溶性大分子壳聚糖，形成水溶性功能化载体，该载体与壳聚糖温敏水凝胶混合，制备成功能化氧化石墨烯温敏水凝胶，具体由以下步骤实现：

1)称取氧化石墨烯(简称为GO，以下同)80-120mg和壳聚糖(简称为CS，以下同)400-600mg溶于40-60ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称为MES，以下同)缓冲液中，超声1h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称为EDC，以下同)480-720mg和N-羟基琥珀酰亚胺(简称为NHS，以下同)640-960mg，依次加入上述混合液中，继续超声6h；接着，将反应液室温下磁力搅拌16h，反应停止后，将混合液通过0.2μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用16-24ml超纯水重悬后，-20℃预冻，冷冻干燥48h，即得功能化氧化石墨烯(简称为GO-CS)；

所述的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液是由2-(N-吗啡啉)乙磺酸加水，调制成pH值为5的溶液；

2)称取功能化氧化石墨烯4-6mg溶于超纯水4-6ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5s探超一次，每次5s，成为功能化氧化石墨烯分散液；然后称取抗肿瘤药物多西他赛(Docetaxel，简称DTX，以下同)4-6mg，溶于200-300μl的二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，简称DMSO，以下同)中，制成多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；滴加完毕，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，然后，10000r/min离心10min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10mg/ml的泊洛沙姆188溶液4-6ml溶解，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，；4000r/min离心10min，取上清液，弃去沉淀，去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，制得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯(简称为GO-CS/DTX，以下同)；

3)采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆407(P₄₀₇)0.16-0.24g加入到4℃预冷的超纯水4-6ml中溶解，再加入泊洛沙姆188(P₁₈₈)0.88-1.32g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4)室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比1-3:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，成负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶，即基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

该功能化氧化石墨烯温敏水凝胶可有效用于肿瘤光热靶向治疗，实现作为热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用。

本发明的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶作为药物转运载体采用瘤内注射的方法给药，可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长时间的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用近红外激光照射时能够控制在肿瘤组织中温敏温敏水凝胶的温度使其发生形变，使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高，大大提高了肿瘤的治疗效果，本发明原料丰富，成本低，效果好，是制备治疗肿瘤药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明所述的一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，在具体实施中，由以下步骤实现：

1)称取氧化石墨烯80mg和壳聚糖400-600mg溶于40ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1h得到均匀分散的悬浮液，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐480mg和N-羟基琥珀酰亚胺640mg，依次加入悬浮液中，继续超声6h，得反应液；将反应液室温下磁力搅拌16h，然后通过0.2μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用16ml超纯水重悬后，-20℃预冻，冷冻干燥48h即得功能化氧化石墨烯(GO-CS)；

2)称取功能化氧化石墨烯4mg溶于超纯水4ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5s探超一次，每次5s，得功能化氧化石墨烯分散液；将4mg多西他赛溶于200μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液，将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，然后，10000r/min离心10min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10mg/ml的泊洛沙姆188溶液4ml溶解，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，4000r/min离心10min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3)采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆4070.16g加入到4℃预冷的超纯水4ml中溶解，加入泊洛沙姆1880.88g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4)室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比1:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

实施例2

1)称取氧化石墨烯100mg和壳聚糖500mg溶于50ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐600mg和N-羟基琥珀酰亚胺800mg，依次加入上述悬浮液中，继续超声6h，然后在室温下磁力搅拌16h，成混合液，混合液通过0.2μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用20ml超纯水重悬后，-20℃冰箱中预冻，冷冻干燥48h，得功能化氧化石墨烯(GO-CS)；

2)称取功能化氧化石墨烯5mg溶于超纯水5ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5s探超一次，每次5s，得功能化氧化石墨烯分散液；取5mg多西他赛溶于250μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，然后，10000r/min离心10min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物，沉淀物加入浓度为10mg/ml的泊洛沙姆188溶液5ml溶解，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，4000r/min离心10min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3)采用冷溶法制备原位凝胶溶液：将泊洛沙姆4070.20g加入到4℃预冷的超纯水5ml中溶解，再加入泊洛沙姆1881.1g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，即得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4)室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比2:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

实施例3

1)称取氧化石墨烯120mg和壳聚糖600mg溶于60ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐720mg和N-羟基琥珀酰亚胺960mg，依次加入上述悬浮液中，继续超声6h，得反应液；将反应液室温下磁力搅拌16h，然后通过0.2μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用24ml超纯水重悬后，-20℃预冻，冷冻干燥48h，即得功能化氧化石墨烯；

2)称取功能化氧化石墨烯6mg溶于超纯水6ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5s探超一次，每次5s，得功能化氧化石墨烯分散液；取6mg多西他赛溶于300μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，然后，10000r/min离心10min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10mg/ml的泊洛沙姆188溶液6ml溶解，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，4000r/min离心10min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3)采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆4070.24g加入到4℃预冷的超纯水6ml中溶解，再加入泊洛沙姆1881.32g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，即得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4)室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比3:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，即得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

上述制备的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶可有效用于肿瘤光热靶向治疗，实现作为热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用，其应用分为体外和体内两部分：

1)体外：将制得的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯溶液，加入到癌细胞A中进行培养，给药后4h后用780～1100nm波长的宽波长光源或者808nm激光光照，光照时间1～5min，继续培养24h，测定癌细胞的存活率。

2)体内：将本发明的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶注射到荷瘤小鼠瘤内，给药4h后用780～1100nm波长的宽波长光源或者808nm激光光照，光照时间为1～5min，测量荷瘤小鼠的肿瘤体积大小。

上述步骤2)中所述的抗肿瘤药物还可为：难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物，包括多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。

上述步骤中的癌细胞为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的荷瘤小鼠为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

本发明的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶作为肿瘤光热靶向治疗体内浅表肿瘤时，加热程度无法达到热疗要求时，可以通过调节功率和照射时间来改善升温范围进行肿瘤的治疗。

本发明的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶作为药物转运载体采用瘤内注射的方法给药，可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用近红外激光照射时能够控制在肿瘤组织中温敏水凝胶的温度使其发生形变，使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。并经实验取得了非常满意的有益技术效果，有关实验资料如下：

一、使用光照射本发明功能化氧化石墨烯对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定

将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(0.001、0.01、0.1、1μg/ml)的实施例1中的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯，设置复孔为4～6个。光照组放置在808nm近红外光2.5W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后将细胞板置于CO₂培养箱中孵育24h，对于无光照组而言，则直接将细胞板置于CO₂培养箱中孵育24h，终止培养，加入预冷的50％三氯乙酸(TCA)50μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入50μl的磺酰罗丹明B(SRB)溶液，静置放置30min，未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)碱溶解。在515nm处测定每孔的光密度(OD)值。存活率的计算公式：存活率＝实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

实验证明，于近红外光下照射2min，本发明药物转运系统可直接影响MCF-7细胞的增殖。

二、近红外激光照射时，功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的体内抗肿瘤活性测定

取小鼠S₁₈₀腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S₁₈₀腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100mm³昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水合并激光组；(3)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶组；(4)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并激光组。4组均采用瘤内注射的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2.5W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为1min，给药4h和第二天激光照射肿瘤部位各一次。每3天给药一次，每次注射生理盐水或者1mg/ml的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶200μl，共给药4次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积计算肿瘤体积。

当给予负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。

三、功能化氧化石墨烯温敏水凝胶理化性质考察

负载多西他赛的功能化氧化石墨烯给药系统的粒子大小和表面带电量的确定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为300-500nm，电位是25mV。

温敏水凝胶胶凝温度的测定，将一系列不同配比的P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，各取2ml置于试管中，放置于不同温度的水浴中恒温2min后，将试管倒置，当凝胶溶液倒置2min未发生流动，即形成凝胶，此时温度为此比例的凝胶溶液的胶凝温度。

温敏水凝胶体外释放度试验。试验分两组：(1)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶组(2)原料药多西他赛溶液组。每组各取2ml加入透析袋(8000-12000Da)中，释放介质为中性(pH7.4)和酸性(pH 5.0)的PBS 80ml，温度为体温(37℃)和模拟热疗时温度(42℃)。将透析袋放入释放介质中，置于恒温振荡器(转速100r/min)中，在不同时间点取出释放介质2ml，并补充等体积的新鲜释放介质。取出的样品通过紫外分光光度计进行测量定量，根据样品的药物含量可以计算不同时间点的累积释放量，直至释放完全，分别绘制不同组药物累计释放百分比曲线。由结果可见，负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶具有明显的缓释作用，且具有温度和pH依赖性，高温和酸性环境有利于药物释放。

五、负载多西他赛的功能化氧化石墨烯给药系统的体外抗肿瘤活性

将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(0.001、0.01、0.1、1μg/ml)的实施例1中的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯，设置复孔为4～6个。光照组放置在808nm近红外光2.5W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后将细胞板置于CO₂培养箱中孵育24h，对于无光照组而言，则直接将细胞板置于CO₂培养箱中孵育24h，终止培养，加入预冷的50％TCA 50μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入50μl的SRB溶液，静置放置30min，未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率＝实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

已经证实，功能化氧化石墨烯作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，更好的发挥出抗肿瘤药物的疗效，而且结合激光照射后，肿瘤细胞的增殖抑制率可增加10％左右。

六、负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性

负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性，取小鼠S₁₈₀腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S₁₈₀腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100mm³昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)多西他赛注射液组；(3)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶组；(4)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并交变磁场组。4组均采用瘤内注射的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2.5W，给药后激光照射肿瘤部位，照射时间为1min，给药后和第二天激光照射肿瘤部位各一次。每3天给药一次，每次注射生理盐水或者1mg/ml的负载阿霉素的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶200μl，共给药4次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积计算肿瘤体积。

实验结束时，负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶组小鼠的相对肿瘤体积为3.69，合并交变磁场组小鼠肿瘤体积的增加得到了更加明显的抑制，相对肿瘤体积为0.54。

同时，还采用了其他光源以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，本发明分组科学，方法稳定可靠。

本发明提供了一种基于功能化氧化石墨烯的温敏水凝胶，其制备方法以及其作为肿瘤光热靶向治疗中的应用。本发明功能化氧化石墨烯温敏水凝胶不会对氧化石墨烯本身的特性进行破坏，测试结果表明，本发明功能化氧化石墨烯，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。

本发明提供的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶可以作为抗肿瘤光热治疗的一种良好的载体，测试表明无论是体外还是体内在激光照射的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，本发明提供的新的功能化氧化石墨烯对正常细胞以及组织毒副作用很小。

本发明提供的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，本身有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高等优点。测试结果表明，本发明提供的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶能够在瘤内形变成为凝胶，具有一定的缓释作用，结合激光照射还可以发挥出更为显著的抗肿瘤活性。

预期可以用于肿瘤光热治疗的一种良好的介质，还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，是药物制备上的一大创新。

本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：

1)本发明功能化氧化石墨烯温敏水凝胶不会对氧化石墨烯本身的特性进行破坏，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低；

2)本发明功能化氧化石墨烯温敏水凝胶可以作为抗肿瘤磁热治疗的一种良好的磁热介质，光照时能够发挥抗肿瘤的活性，副作用很小，在实验中未发现有任何不良反应，表明用药安全，可以根据控制功率、时间等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞，可显著提高疗效；

3)本发明氧化石墨烯温敏水凝胶可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，水溶性强，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，具有缓释性，结合激光照射还可以发挥出更为突出的抗肿瘤活性，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。

Claims

1.一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，该水凝胶作为药物载体系统，是由负载药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶混合制成，负载抗肿瘤药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P₄₀₇/P₁₈₈凝胶的体积比为1-3:1，具体由以下步骤实现：

1）称取氧化石墨烯80-120 mg和壳聚糖400-600 mg溶于40-60 ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1 h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐480-720 mg和N-羟基琥珀酰亚胺640-960 mg，依次加入上述混合液中，继续超声6 h；接着，将反应液室温下磁力搅拌16 h，反应停止后，将混合液通过0.2 μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用16-24 ml 超纯水重悬后， -20℃预冻，冷冻干燥48 h，即得功能化氧化石墨烯；

2）称取功能化氧化石墨烯4-6 mg溶于超纯水4-6 ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，成为功能化氧化石墨烯分散液；然后称取抗肿瘤药物多西他赛4-6 mg，溶于200-300 μl的二甲基亚砜中，制成多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；滴加完毕，在功率400 w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5 s，然后，10000 r/min离心10 min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10 mg/ml的泊洛沙姆188溶液4-6 ml溶解，在功率400 w下探超20次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，；4000 r/min离心10 min，取上清液，弃去沉淀，去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，制得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3）采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆407 0.16-0.24 g加入到4 ℃预冷的超纯水4-6 ml中溶解，再加入泊洛沙姆188 0.88-1.32 g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4）室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比1-3:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，成负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶，即基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）称取氧化石墨烯80 mg和壳聚糖400-600 mg溶于40 ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1 h得到均匀分散的悬浮液，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐480 mg和N-羟基琥珀酰亚胺640 mg，依次加入悬浮液中，继续超声6 h，得反应液；将反应液室温下磁力搅拌16 h，然后通过0.2 μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用16 ml 超纯水重悬后，-20 ℃预冻，冷冻干燥48 h，即得功能化氧化石墨烯；

2）称取功能化氧化石墨烯4mg溶于超纯水4ml中，在功率400w下探超40次，每间隔5s探超一次，每次5s，得功能化氧化石墨烯分散液；将4mg 多西他赛溶于200μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液，将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，然后，10000r/min离心10min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10mg/ml的泊洛沙姆188溶液4ml溶解，在功率400w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5s，4000r/min离心10min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3）采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆407 0.16g加入到4℃预冷的超纯水4ml中溶解，加入泊洛沙姆188 0.88g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4）室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比1:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

3.根据权利要求1所述的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）称取氧化石墨烯100 mg和壳聚糖500 mg溶于50 ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐600 mg和N-羟基琥珀酰亚胺800 mg，依次加入上述悬浮液中，继续超声6 h，然后在室温下磁力搅拌16 h，成混合液，混合液通过0.2 μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用20 ml 超纯水重悬后，-20 ℃预冻，冷冻干燥48 h，得功能化氧化石墨烯；

2）称取功能化氧化石墨烯 5 mg溶于超纯水5 ml中，在功率400 w下探超40次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，得功能化氧化石墨烯分散液；取5 mg 多西他赛溶于250 μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400 w下探超20次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，然后，10000 r/min离心10 min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物，沉淀物加入浓度为10 mg/ml的泊洛沙姆188溶液5 ml溶解，在功率400 w下探超20次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，4000 r/min离心10 min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20℃预冻，冷冻干燥48 h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3）采用冷溶法制备原位凝胶溶液：将泊洛沙姆407 0.20 g加入到4 ℃预冷的超纯水5 ml中溶解，再加入泊洛沙姆188 1.1g，于4 ℃冰箱中过夜至充分溶胀，即得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4）室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比2:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

4.根据权利要求1所述的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）称取氧化石墨烯120 mg和壳聚糖600 mg溶于60 ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声1 h得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐720 mg和N-羟基琥珀酰亚胺960 mg，依次加入上述悬浮液中，继续超声6 h，得反应液；将反应液室温下磁力搅拌16 h，然后通过0.2 μm的水膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用24 ml 超纯水重悬后，-20℃预冻，冷冻干燥48h，即得功能化氧化石墨烯；

2）称取功能化氧化石墨烯6 mg溶于超纯水6 ml中，在功率400 w下探超40次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，得功能化氧化石墨烯分散液；取6 mg 多西他赛溶于300 μl的二甲基亚砜中，得多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；在功率400 w下探超20次，每间隔5s探超一次，每次5 s，然后，10000 r/min离心10 min，弃去上清，去除二甲基亚砜，得沉淀物；取沉淀物加入浓度为10 mg/ml的泊洛沙姆188溶液6 ml溶解，在功率400 w下探超20次，每间隔5 s探超一次，每次5 s，4000 r/min离心10 min，取上清液，弃去沉淀以去除游离的多西他赛，-20 ℃预冻，冷冻干燥48 h，得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯；

3）采用冷溶法制备原位凝胶溶液：称取泊洛沙姆407 0.24 g加入到4℃预冷的超纯水6ml中溶解，再加入泊洛沙姆188 1.32 g，于4℃冰箱中过夜至充分溶胀，即得P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液；

4）室温下，将负载多西他赛的功能化氧化石墨烯按体积比3:1缓慢滴加入P₄₀₇/P₁₈₈温敏水凝胶溶液，搅拌均匀，即得负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶。

5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶作为热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤光热靶向药物中的应用。