CN102898543B - 一种水溶性碳纳米管及其应用 - Google Patents
一种水溶性碳纳米管及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及水溶性碳纳米管及其应用,可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题,其解决的技术方案是,在原始的碳纳米管经过纯化处理的基础上,首先经羧基化后,与氨化试剂反应,将碳纳米管表面连接上反应活性较强的氨基后,再与透明质酸反应,形成酰胺键,最终得到碳纳米管-透明质酸聚合物,即水溶性碳纳米管,其中,碳纳米管和透明质酸的质量比为0.15-0.25:1,本发明物理以及化学稳定性良好,制备条件容易满足,原料来源丰富,成本低,副作用小,是肿瘤治疗药物载体上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及化工领域,特别是一种水溶性碳纳米管及其应用。
背景技术
自1991年和1993年分别发现多壁碳纳米管(MWNTs)和单壁碳纳米管(SWNTs)以来,碳纳米管(CNTs)以其独特的电学、力学、光学和热力学性质引起了各学科的广泛关注。巨大的比表面积(~2600m2/g)、超高的机械强度、较低的密度、出众的化学和热稳定性和富电子等特性、独特的跨膜能力以及大离域π键,可以与许多生物医药分子之间形成较强的π-π键相互作用,使其在生物医药领域具有巨大的应用潜力。
生物膜的亲脂性限制了潜在药物和分子探针直接性的细胞内运输,并且使细胞内运输成为癌症治疗的关键问题。碳纳米管用作药物载体,主要是利用其细胞穿透能力,携带目标生物活性分子进入细胞。CNTs可以有效携带蛋白质、抗体、多肽、药物和核酸等生物活性物质进入细胞,从而成为人们关注的载体。
生物系统对700~1,100nm范围的近红外光具有高度透过性,而SWNTs在此范围内具有高吸收的特性,可以利用SWNTs在此范围内的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。将SWNTs肿瘤靶向给药系统和激光热疗联合应用可以达到更加有效的抗肿瘤作用。
碳纳米管被认为有巨大的分子量,其刚性结构及管束的存在形式导致纳米管不溶于水和许多有机溶剂,且在溶液中易聚集成束,难以分散,严重影响了其在各方面的应用。为此,迫切需要设计并合成出水溶性好、热敏活性高、毒性小、生物相容性好、适合作为药物载体的碳纳米管衍生物。
透明质酸(HA),又名玻尿酸,是一种酸性粘多糖,它是一种水溶性高分子聚合物,具有良好的生物可吸收性、生物兼容性、黏稠性及保水性。在细胞膜的表面有4类透明质酸的特定受体—CD44(CD分化群)、RHAMM(HA中介的游动性受体)、IVd4及LEC(肝内皮细胞受体),其中CD44在肿瘤细胞中的含量较高,而且不同的肿瘤细胞所含有的CD44的结构也不同。受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究。有报道证明,CD44可以抑制细胞的凋亡,其与单克隆抗体类(mAbs)或HA结合,不仅能抑NT淋巴细胞的凋亡,还能提高B淋巴细胞的存活率。它具有很好的靶向作用,无毒,并且能够抑制癌细胞扩张。
目前,将碳纳米管表面接枝一种高分子水溶性聚合物-透明质酸,从而得到一种新的水溶性碳纳米管,以及其作为热敏剂和药物转运载体在医学中的应用还未见有报道,因此,本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。
发明内容
针对上述情况,为解决现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种水溶性碳纳米管及其应用,可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。
本发明解决的技术方案是:在原始的碳纳米管经过纯化处理的基础上,首先经羧基化后,与氨化试剂反应,将碳纳米管表面连接上反应活性较强的氨基后,再与透明质酸反应,形成酰胺键,最终得到碳纳米管-透明质酸聚合物,即水溶性碳纳米管,其中,碳纳米管和透明质酸的质量比为0.15-0.25:1。
水溶性碳纳米管的制备方法,包括以下步骤:
1)称取110-125mg碳纳米管(CNTs),放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为300~400W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管(CNTs -COOH);
2)称取50mg羧基化的碳纳米管(CNTs -COOH)加入20ml氨化试剂,再加入1gN,N'-二环己基碳二亚胺 (DCC),置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤约10遍,用无水乙醇或丙酮洗去多余的DCC、氨化试剂以及其他的副产物,在40-80℃下,真空干燥24-56h,得氨基化的碳纳米管(CNTs);所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45mg与透明质酸90mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl) 173mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)103mg在15-20ml甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺中混合均匀,在50℃、100r/min下搅拌反应24h,再经无水乙醇或丙酮或甲醇抽滤洗涤18-20次,除去未反应的EDC·HCl、NHS和透明质酸,在20-60℃下,真空干燥24-72h,得碳纳米管-透明质酸聚合物,即水溶性碳纳米管。
碳纳米管-透明质酸聚合物作为热敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分:
1)将制得的碳纳米管-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液,加入到癌细胞A中进行培养,给药后3h后用光源B光照,光照1-5min,继续培养24小时,测定癌细胞A的存活率;
2)将制得的碳纳米管-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液,静脉注射到荷瘤小鼠C体内,给药后3h后用光源D光照,光照时间为1-5min,测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。
上述步骤1中的癌细胞A为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,阴茎癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,阴道恶性肿瘤,外阴恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤1中的光源B为:780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。
上述步骤2中的荷瘤小鼠C为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,阴茎癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,阴道恶性肿瘤,外阴恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤2中的光源D为:780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。
本发明的碳纳米管-透明质酸聚合物作为热敏剂来进行热敏治疗体内深度肿瘤时,808nm激光能够深度穿透生物体,可以用于治疗生物肿瘤。
本发明的碳纳米管-透明质酸聚合物作为热敏剂可以制成任意的药物制剂剂型,比如:注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的碳纳米管-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂,比如:生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为:静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。
碳纳米管-透明质酸聚合物作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用,分为以下几个步骤:
1)将制得的碳纳米管-透明质酸聚合物和抗肿瘤药物A通过方式B进行结合;
2)将装载药物的碳纳米管-透明质酸聚合物进行抗肿瘤细胞C和抑制体内肿瘤D的评价。
上述步骤1中的抗肿瘤药物A为:难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物,比如:多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。
上述步骤1中的方式B为:超声、搅拌、探超和旋转蒸发中的一种或几种。
上述步骤2中的肿瘤细胞C为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,阴茎癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,阴道恶性肿瘤,外阴恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤2中的肿瘤D为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,阴茎癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,阴道恶性肿瘤,外阴恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。
本发明的碳纳米管-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以更多的分布在肿瘤组织中,与正常组织相比,它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中,这样当采用适当的手段使用激光进行照射时能够在肿瘤组织中产生热,并且可以使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。但也会分布在正常的组织器官中,为了避免产生的热对正常组织产生损伤,可以通过一些手段来加以改善,比如:可以在碳纳米管-透明质酸聚合物上装载一些具有靶向性质的靶头,也可以使用抗体等手段介导,可以使用临床手段比如说内窥镜的方式来直接输送载药系统到达靶组织,聚焦光照面积等方式。
本发明碳纳米管-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以制成任意的药物制剂剂型,比如:注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的碳纳米管-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂,比如:生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为:静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射等。
本发明物理以及化学稳定性良好,制备条件容易满足,原料来源丰富,成本低,副作用小,是肿瘤治疗药物载体上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
1)称取119mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为300W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取50mg羧基化的碳纳米管加入20ml 乙二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物,在40℃下,真空干燥56h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管50mg与透明质酸98mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 180mg、N-羟基琥珀酰亚胺110mg在18ml甲酰胺中混合均匀,在50℃、100r/min下搅拌反应24h,再经丙酮抽滤洗涤18次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在40℃下,真空干燥48h,得水溶性碳纳米管35mg。
实施例2
1)称取110mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为350W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取45mg羧基化的碳纳米管加入20ml1,6-己二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、1,6-己二胺以及其他的副产物,在60℃下,真空干燥40h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45mg与透明质酸88mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 170mg、N-羟基琥珀酰亚胺100mg在15ml N,N-二甲基甲酰胺中混合均匀,在50℃、150r/min下搅拌反应24h,再经甲醇抽滤洗涤19次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在60℃下,真空干燥24h,得水溶性碳纳米管30mg。
实施例3
1)称取125mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为400W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取50mg羧基化的碳纳米管加入20ml1,3-丙二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、1,3-丙二胺以及其他的副产物,在80℃下,真空干燥24h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45mg与透明质酸93mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 175mg、N-羟基琥珀酰亚胺110mg在20ml甲酰胺中混合均匀,50℃,200r/min下搅拌反应24h,再经无水乙醇抽滤洗涤20次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在20℃下,真空干燥72h,得水溶性碳纳米管34mg。
相关试验资料如下:
一、本发明在具体实施中,使用光照射水溶性碳纳米管对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定:
将PC3前列腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%,青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中,培养箱条件为37℃、5% CO2,每2~3天传代一次。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板每孔加入200 μl,铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO2,37 ℃孵育24 h,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度(12.5、25、50、100μg/ml)的水溶性碳纳米管透明质酸,设置复孔为4~6个。光照组放置在808nm近红外光2W中2min,保持光照过程中温度在37℃,光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h,对于不光照组而言,则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h,终止培养,吸出含药培养基,每孔用150 μl PBS洗2遍,加入预冷的10% TCA 200 μl,4℃放置1 h。倒掉固定液,每孔用去离子水洗5遍,甩干,空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液,静置放置10 min,未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍,空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式:存活率=实验组OD值/对照组OD值,其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
结果表明,当用光照射2min,本发明水溶性碳纳米管的加入直接影响了PC3细胞的增殖。
二、光照射时,水溶性碳纳米管的体内抗肿瘤活性测定:
取小鼠S180腹水瘤细胞,用注射用生理盐水以3:1比例稀释后,每只小鼠于腹腔注射0.3 ml,小鼠喂养7天后,抽取小鼠S180腹水瘤细胞,计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液,皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后,取其中24只肿瘤体积≥100 mm3昆明小鼠,随机分为4组,每组6只。具体分组如下:(1)对照组(NS组):生理盐水;(2)生理盐水激光组;(3)水溶性碳纳米管组;(4)水溶性碳纳米管激光组。4组均采用静脉给药的方式,其中光照组使用的光源为808nm近红外光源,功率为2W,给药3h后激光照射肿瘤部位,一次照射时间为2min。每2天给药一次,每次注射生理盐水或者2mg/ml的水溶性碳纳米管-透明质酸100μl,共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态,每2天称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B),按公式肿瘤体积V=计算肿瘤体积。
结果表明,当给药水溶性碳纳米管合并激光照射时,小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。
三、水溶性碳纳米管作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用。
取水溶性碳纳米管10mg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg,加入超纯水2mL,混合均匀后,探头超声(工作3s,间隔6s,工作12次,功率为400W),将探超完成的样品进行离心(4000rpm,15min)除去大颗粒。得到了以水溶性碳纳米管为载体的抗肿瘤药物多西紫杉醇给药系统。通过40倍(体积比)乙醇提取出给药系统中包封的多西紫杉醇,紫外分光光度计测定以水溶性碳纳米管为载体包封的多西紫杉醇的含量,载药量为2.1 mg/mL。
结果表明,水溶性碳纳米管可以吸附抗肿瘤药物多西紫杉醇,提高了多西紫杉醇在水中的溶解度,可以作为抗肿瘤药物的载体使用。
四、水溶性碳纳米管多西紫杉醇给药系统的粒子大小和表面带电量的确定
使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定,折射率设置为1.590,吸收系数设置为0.010,温度设置为25 ℃,测量模式设置为自动,以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份,每份测量一次,取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79,黏度系数设置为0.8872,温度设置为25 ℃,测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份,每份测量一次,取三次测量值的平均值作为测量结果,所得结果为粒径为100~200nm,电位为-40mV。
五、水溶性碳纳米管多西紫杉醇给药系统的体外抗肿瘤活性
将PC3前列腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%,青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中,培养箱条件为37℃、5% CO2,每2~3天传代一次。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板每孔加入200 μl,铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO2,37 ℃孵育24 h,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8μg/ml)的水溶性碳纳米管多西紫杉醇,不加入水溶性碳纳米管多西紫杉醇为对照组,设置复孔为4~6个。光照组放置在808nm近红外光2W中2min,保持光照过程中温度在37 ℃,光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h,对于不光照组而言,则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h,终止培养,吸出含药培养基,每孔用150 μl PBS洗2遍,加入预冷的10% TCA 200 μl,4 ℃放置1 h。倒掉固定液,每孔用去离子水洗5遍,甩干,空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液,静置放置10 min,未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍,空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在808 nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式:抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值,其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
结果表明,水溶性碳纳米管作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部,更好的发挥出抗肿瘤药物的疗效,而且结合光照后,能够更明显的抑制肿瘤细胞的增殖。
六、水溶性碳纳米管多西紫杉醇给药系统的体内抗肿瘤活性
取小鼠S180腹水瘤细胞,用注射用生理盐水以3:1比例稀释后,每只小鼠于腹腔注射0.3 ml,小鼠喂养7天后,抽取小鼠S180腹水瘤细胞,计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液,皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后,取其中24只肿瘤体积≥100 mm3昆明小鼠,随机分为4组,每组6只。具体分组如下:(1)对照组(NS组):生理盐水; (2)多西紫杉醇注射液组;(3)水溶性碳纳米管多西紫杉醇;(4) 水溶性碳纳米管多西紫杉醇光照组。多西紫杉醇注射液组、水溶性碳纳米管多西紫杉醇和水溶性碳纳米管多西紫杉醇光照组的多西紫杉醇给药剂量相等,都为25.125mg/kg。4组均采用静脉给药的方式,其中光照组使用的光源为808nm近红外光源,功率为2W,给药3h后激光照射肿瘤部位,一次照射时间为2min。每2 天给药一次,共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态,每2天称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B),按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。
1] 结果表明,当给药水溶性碳纳米管多西紫杉醇时,小鼠的肿瘤体积的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明显的抑制。合并激光照射时,小鼠的肿瘤体积的增加得到了更加明显的抑制。
在做上述实验的同时,还采用抗肿瘤药物做了类似的实验,均取得了相同和相类似的结果,本发明分组科学,方法稳定可靠,其他实验结果不再一一列举。
本发明水溶性碳纳米管不会对碳纳米管本身的特性进行破坏,测试结果表明,本发明的新的碳纳米管水溶性衍生物,水分散性强,对生物体的毒性很低,物理以及化学稳定性良好,质量好,制备的条件容易满足,原料来源丰富,成本低。
本发明水溶性碳纳米管可以作为抗肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂,测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展,而在不光照的情况下本发明提供的新的水溶性碳纳米管对正常细胞以及组织毒副作用很小。
本发明水溶性碳纳米管可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体,本身有着极小的毒性,较强的水溶性,生物相容性好,比表面积大,化学惰性高等优点。测试结果表明,本发明提供的水溶性碳纳米管作为抗肿瘤药物的载体时,粒径均匀,能够提高水不溶性抗肿瘤药物的水溶性,能够起到一定的缓释作用,而且还能够更多的到达肿瘤组织中起到靶向给药的作用,结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。
预期可以用于治疗肿瘤的一种良好的热敏剂,还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体,是药物制备上的一大创新。
本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果:
1)本发明水溶性碳纳米管不会对碳纳米管本身的特性进行破坏,水分散性强,对生物体的毒性很低,物理以及化学稳定性良好,质量好,制备的条件容易满足,原料来源丰富,成本低;
2)本发明提供的水溶性碳纳米管可以作为抗肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂,光照时产生热能够发挥抗肿瘤活性,而不光照时则毒副副作用很小,可以根据光的聚焦等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞;
3)本发明水溶性碳纳米管可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体,有着极小的毒性,较强的水溶性,生物相容性好,比表面积大,化学惰性高,具有缓释性和靶向性,结合激光还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤效果。
Claims (4)
1.一种水溶性碳纳米管的制备方法,其特征在于,该水溶性碳纳米管是由碳纳米管分子通过化学键连接透明质酸组成,透明质酸和碳纳米管的质量比为0.15-0.25:1,所述的碳纳米管为多壁碳纳米管或单壁碳纳米管,具体包括以下步骤:
1)称取110-125mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液110-140ml,再加入10-15ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为300~400W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取45-50mg羧基化的碳纳米管加入20ml氨化试剂,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇或丙酮洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、氨化试剂以及其他的副产物,在40-80℃下,真空干燥24-56h,得氨基化的碳纳米管;所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45-50mg与透明质酸88-98mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 170-180mg、N-羟基琥珀酰亚胺100-110mg在15-20ml甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺中混合均匀,在50℃、100-200r/min下搅拌反应24h,再经无水乙醇或丙酮或甲醇抽滤洗涤18-20次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在20-60℃下,真空干燥24-72h,得碳纳米管-透明质酸聚合物,即水溶性碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的水溶性碳纳米管的制备方法,其特征在于,1)称取119mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为300W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取50mg羧基化的碳纳米管加入20ml 乙二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物,在40℃下,真空干燥56h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管50mg与透明质酸98mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 180mg、N-羟基琥珀酰亚胺110mg在18ml甲酰胺中混合均匀,在50℃、100r/min下搅拌反应24h,再经丙酮抽滤洗涤18次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在40℃下,真空干燥48h,得水溶性碳纳米管35mg。
3.根据权利要求1所述的水溶性碳纳米管的制备方法,其特征在于,1)称取110mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为350W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取45mg羧基化的碳纳米管加入20ml1,6-己二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、1,6-己二胺以及其他的副产物,在60℃下,真空干燥40h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45mg与透明质酸88mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 170mg、N-羟基琥珀酰亚胺100mg在15ml N,N-二甲基甲酰胺中混合均匀,在50℃、150r/min下搅拌反应24h,再经甲醇抽滤洗涤19次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在60℃下,真空干燥24h,得水溶性碳纳米管30mg。
4.根据权利要求1所述的水溶性碳纳米管的制备方法,其特征在于,1)称取125mg碳纳米管,放入烧瓶中,加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120ml,再加入12ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为400W的超声波清洗器中超声1h后,用超纯水稀释,使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80℃恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)称取50mg羧基化的碳纳米管加入20ml1,3-丙二胺,再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺,置于烧瓶中,超声分散10min后,放入油浴锅中,在120℃、100 r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍,用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、1,3-丙二胺以及其他的副产物,在80℃下,真空干燥24h,得氨基化的碳纳米管;
3)称取上述氨基化的碳纳米管45mg与透明质酸93mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 175mg、N-羟基琥珀酰亚胺110mg在20ml甲酰胺中混合均匀,50℃,200r/min下搅拌反应24h,再经无水乙醇抽滤洗涤20次,除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸,在20℃下,真空干燥72h,得水溶性碳纳米管34mg。
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